KR101104980B1

KR101104980B1 - 효소처리에 의한 연자육 추출물의 제조방법

Info

Publication number: KR101104980B1
Application number: KR1020090029839A
Authority: KR
Inventors: 최선주; 조은아; 조은혜; 유지민; 김소영; 채희정
Original assignee: 호서대학교 산학협력단
Priority date: 2009-04-07
Filing date: 2009-04-07
Publication date: 2012-01-16
Also published as: KR20100111413A

Abstract

본 발명은 연자육(Nelumbinis semen) 추출물의 제조방법에 대한 것으로, 보다 구체적으로는 연자육에 세포벽 분해효소 또는 단백질 분해효소를 첨가하여 효소처리를 한 다음, 이것을 열수추출하는 것을 특징으로 하는 연자육 추출물의 제조방법에 대한 것이며, 이러한 제조방법에 의하면 폴리페놀 함량이 높고, DPPH 라디컬 소거능 및 Tyrosinase 활성 억제 효과가 우수한 연자육 추출물을 얻을 수 있어서, 피부 미백 및 노화방지 효과가 우수하다.

연자육, 세포벽 분해효소, 단백질 분해효소, 미백, 주름개선

Description

효소처리에 의한 연자육 추출물의 제조방법{Manufacturing Method of Nelumbinis Semen Extract by Enzyme Treatment}

본 발명은 연자육 추출물에 대한 것으로, 특히 연자육에 포함된 활성성분의 추출 수율이 높고, DPPH 라디컬 소거능 및 Tyrosinase 활성 억제 효과가 우수하여, 피부 미백 및 노화방지용 화장료 조성물로 사용가능한 추출물을 제조하는 방법에 대한 것이며, 더욱 자세하게는 연자육을 세포벽 분해효소 또는 단백질 분해효소로 효소처리하고 열수추출하는 것을 특징으로 하는 연자육 추출물의 제조방법과 이에 따른 연자육 추출물에 대한 것이다.

시간이 지남에 따라 인간의 피부에서는 신진대사를 조절하는 각종 호르몬의 분비가 감소하게 되고, 피부가 자외선에 노출되면 그 파장에 따라 멜라닌 세포에 의해 주근깨, 기미, 밀크 커피색 반점, 모반, 흑자 등이 발생하게 되며, 이는 즉시형 또는 지연형 색소침착으로 구분될 수 있다.

멜라닌은 피부, 머리카락 및 눈동자의 색에 관여하는 색소중 하나인데, 종래의 피부 미백제는 주로 멜라노사이트(melanocyte)의 성장을 억제하거나, 타이로시나제(tyrosinase)의 활성을 억제함으로서, 멜라닌의 합성을 억제하는 효과를 가지고 있다.

구체적으로, 종래의 피부 미백제들은, 멜라닌 생성에 관여하는 효소인 타이로시나제(tyrosinase)의 활성부위 필수요소인 구리(Cu)를 제어하거나, 타이로시나제 관련단백질ⅠTRP-1: tyrosinase related protein Ⅰ) 및 타이로시나제 관련단백질Ⅱ(TRP-2: tyrosinase related protein Ⅱ)의 필수요소인 철이온(Fe)을 제어하여 효소활성을 불활성화시키거나, 멜라닌 생성 중간체의 생성을 억제함으로서, 멜라닌의 합성을 억제하고 있다.

한편, 최근에는 천연물에서 추출하고 분리한 흡수 작용을 가지는 물질들이 보통 피부에 자극이 적고, 수렴 작용, 항균 작용과 같은 기타의 약리작용을 가지고 있다는 사실이 널리 알려짐에 따라, 천연물을 이용하여 화장품 조성물을 제조하는 다양한 시도가 연구되고 있다.

이에 따라, 본 발명자들은 천연물을 이용한 화장품 조성물을 연구하던 중, 천연물로부터의 추출 수율을 높이고, 항산화 효과 및 미백 효과가 있는 연자육 추출물의 제조방법을 발명하여 본 발명을 완성하였다.

상기한 문제점을 해결하기 위한 본 발명은, 폴리페놀 함량이 높고, DPPH 라디컬 소거능 및 Tyrosinase 활성 억제 효과가 우수한 연자육 추출물을 얻을 수 있는 연자육 추출물의 제조방법을 제공하기 위한 것이다. 특히, 상기 연자육에 적합한 분해효소를 이용함으로서, 다른 분해효소보다 연자육에 대하여 더욱 높은 추출 수율을 달성할 수 있는 제조방법을 제공하는 것이 목적이다.

그리고, 본 발명은 연자육으로부터 유용한 추출물을 추출하는데 있어서, 1차 및 2차 이상에 걸쳐서 더욱 많은 양의 추출물을 얻을 수 있는 연자육 추출물의 다른 제조방법을 제공하기 위한 것이다.

또한, 본 발명은 상기와 같은 제조방법에 의해 제조되어, 종래보다 많은 양의 유용성분을 포함하는 연자육 추출물을 제공하고, 이러한 추출물을 유효성분으로 함유하여 미백효과 및 노화방지 효과가 우수한 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명은 연자육(Nelumbinis semen)을 준비하는 단계; 상기 준비된 연자육에 증류수를 가하고, 세포벽 분해효소 또는 단백질 분 해효소를 첨가하여 효소처리물을 얻는 단계; 상기 효소처리물을 열수추출하는 단계; 및, 상기 열수추출한 열수추출물을 원심분리하는 단계;를 포함하는 연자육 추출물의 제조방법이다.

여기서, 상기 분해효소는 베타-글루카나제(β-glucanase) 또는 알카라아제(alcalase)를 주성분으로 포함하는 단일효소인 것이 가능하다.

그리고, 상기 분해효소를 첨가하는 것은, 상기 연자육에 증류수가 가해진 연자육 증류수의 중량에 대비하여 1~3%(w/w) 범위 내로 세포벽 분해효소를 첨가하는 것이 바람직하고, 상기 열수추출하는 단계는, 상기 효소처리물을 40~70℃ 범위 내의 온도로 1~4시간 동안 열수추출하는 것이 더욱 바람직하며, 상기 원심분리하는 단계 이후에는, 상기 원심분리된 상등액을 얻는 단계;를 더 포함하는 것이 가장 바람직하다.

또한, 본 발명에 따른 연자육 추출물의 제조방법은, 상기 원심분리하는 단계 이후에, 상기 원심분리된 침전물을 얻고, 상기 얻은 침전물에 에탄올을 가하여 에탄올 추출하는 단계;를 더 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 에탄올 추출하는 단계 이후에는, 상기 에탄올 추출물을 원심분리해서, 상등액을 얻는 단계;를 더 포함하는 것도 가능하다.

한편, 본 발명의 다른 실시형태는, 상술한 연자육 추출물의 제조방법에 따라 제조되어, 폴리페놀을 함유하는 것을 특징으로 하는 연자육 추출물일 수 있고, 이러한 연자육 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 또는 피부 노화방지용 화장료 조성물도 가능하다.

기타 실시예들의 구체적인 사항들은 상세한 설명 및 도면들에 포함되어 있다.

상기한 본 발명은 연자육에 분해효소를 첨가하여 효소처리를 한 다음, 이것을 열수추출하는 과정을 포함함으로서, 폴리페놀 함량이 높고, DPPH 라디컬 소거능 및 Tyrosinase 활성 억제 효과가 우수한 연자육 추출물을 얻을 수 있는 연자육 추출물의 제조방법을 제공할 수 있다.

특히, 상기 분해효소로서 베타-글루카나제(β-glucanase) 또는 알카라아제(alcalase)를 주성분으로 포함하는 단일효소를 이용함으로서, 다른 분해효소보다 연자육에 대하여 더욱 높은 추출 수율을 달성할 수 있는 제조방법을 제공할 수 있다.

그리고, 본 발명은 상기와 같이 연자육에 분해효소를 첨가하고 열수추출하여 1차로 추출물을 얻은 다음, 상기 열수추출물의 침전물을 다시 에탄올 추출함으로서 2차로 추출물을 다시 얻을 수 있는 연자육 추출물의 다른 제조방법을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기와 같은 제조방법에 의해 제조되어, 종래보다 많은 양의 유용성분을 포함하는 연자육 추출물을 제공할 수 있고, 이러한 추출물은 피부 미백용 또는 피부 노화방지용 화장료 조성물로 사용되기에 적합하다.

이하에서는, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구체적인 실시형태를 상세하게 설명하기로 한다.

도 1은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 연자육 추출물의 제조방법을 나타내는 흐름도이고, 여기에 도시된 바와 같이, 본 발명은 연자육을 효소처리하고 열수추출함으로서, 유용성분의 추출 수율이 높고, 항산화 효과 및 미백 효과가 있는 연자육 추출물을 제조하는 방법에 대한 것이다.

본 발명자들은 천연물을 이용한 화장품 조성물을 연구하던 중, 연자육에 세포벽 또는 단백질 분해효소를 첨가하고, 이를 열수수출하는 방법에 의하는 경우, 폴리페놀 함량이 높고, DPPH 라디컬 소거능 및 Tyrosinase 활성 억제 효과가 우수한 연자육 추출물을 제조할 수 있다는 것을 알게되어 본 발명을 완성하였다.

이러한 본 발명은 기본적으로 연자육을 이용하는 것이며, 연자육은(Nelumbinis semen)은 일반적으로 수련과의 여러해살이 수생 식물의 과실 및 종자로서 보비, 진정, 지사 및 불면증에도 효능이 있다고 알려져 있다. 연자육에는 전분, raffinose, 단백질 16.6%, 지방 2%, 당질 23%, 칼슘 0.09%, 인 0.29% 등 함유되어 있다(정 보섭, 신 alsr, 항약대사전, 영림사, p154, 1998).

또한, 연자육의 화학성분으로는 Anonaine, Armepavine, Asimilobine (R-form), beta-Sitosterol, Dehydroanonaine, Dehydronuciferine, Dehydroroemerine, Demethylcoclaurine, Hyperoside, Isoliensinine, Isoquercitrin, Kaempferol-3-O-beta-D-glucuronide, Liensinine, Linaloo 등이 알려져 있다.

구체적으로, 본 발명에 따른 연자육 추출물의 제조방법은, 먼저 연자육을 건조하여 준비한다(S110). 상기 연자육은 건조한 후, 연자육의 유효성분 추출 수율을 높일 수 있는 적당한 크기, 예를 들면 50~200메쉬(mesh)의 크기로 분쇄하는 것이 바람직하며, 120메쉬 정도로 분쇄하는 것이 가장 바람직하다.

그리고, 상기 준비된 연자육 잎에 증류수를 가하고, 분해효소를 첨가하여 효소처리물을 얻는 단계(S120)를 거친다. 연자육 잎에 증류수를 첨가하는 이유는 이어서 첨가되는 분해효소의 작용을 쉽도록 하기 위한 것으로, 첨가되는 증류수의 양은 상기 준비된 연자육 부피의 10~20배 정도인 것이 바람직하다. 또한, 상기 분해효소 의 작용을 더욱 증진시키기 위하여, 증류수의 pH를 조절하는 것이 바람직한데, 상기 pH는 효소의 활성이 가장 활발한 pH5~pH8로 조절하는 것이 바람직하며, pH의 조절시에는 특별히 제한되지는 않으나, 1M의 HCl과 0.1N의 NaOH를 이용하는 것이 바람직하다.

본 발명은 상기와 같은 과정을 거쳐서 연자육을 포함하는 증류수(선택적으로 pH가 조절된 증류수)에 세포벽 분해효소 또는 단백질 분해효소를 가하여 효소 처리하는 것이 특징이다. 식물의 유효성분들은 세포내에 함유되어 있고, 주로 섬유소로 구성되어 있으므로, 이들은 식물의 세포벽 분해효소에 의해 분해될 수 있다. 또한 연자육에는 16% 이상의 단백질이 함유되어 단백질 분해효소의 사용으로 연자육으로부터 유효물질의 추출수율 향상효과를 기대할 수 있다. 즉, 상기 효소처리는 식물세포 분해효소, 단백질 분해효소 또는 이들의 조합에 따른 분해효소를 작용시켜 연자육의 세포벽 및 단백질 성분을 분해함으로서, 유효성분이 잘 추출되게 하려는 것이다.

본 발명의 연자육 잎 추출물 제조방법에 사용되기에 바람직한 세포벽 분해효소로는

세레믹스 6X MG ^TM(Ceremix 6X MG), 셀룰클라스트 ^TM(celluclast), 튜니카아제 FN ^TM, 프로모자임(PROMOZYME), 알카라아제(ALCALASE) 등이 있고, 상기 세레믹스 6X MG은 베타-글루카나제(β-glucanase)에 셀룰라제(celullase), 프로테인나 제(proteinase), 알파-아밀라제(alpha-amylase), 펜토산나제(pentosanase)의 4종의 효소가 각각 동일한 중량비로 혼합한 효소이고, 셀룰클라스트는 셀룰라제(cellulase) 단일효소이며, 튜니카아제FN은 베타-글루카나제(β-glucanase) 단일효소이고, 프로모자임(PROMOZYME)은 플루라나제(Pullulansase) 단일효소이며, 알카라아제(ALCALASE)는 알카라아제(alcalase) 단일효소이다.

이러한 효소들 중에서, 본 발명자들은 후술하는 실시예에서와 같이 연자육의 경우에는 베타-글루카나제(β-glucanase) 또는 알카라아제(alcalase)를 주성분으로 포함하는 단일효소가 가장 유용한 것을 확인하였다. 또한, 상기 효소들은 단독으로, 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있고, 상기 분해효소를 첨가하는 것은, 상기 연자육에 증류수가 가해진 연자육 증류수의 중량에 대비하여 1~3%(w/w) 범위 내로 분해효소를 첨가하는 것이 추출 수율면에서 가장 바람직하다. 그리고, 상기와 같이 분해효소를 첨가한 후에는 추출 수율을 더욱 높이기 위하여, 30~70℃의 온도에서 1시간 내지 4시간 동안 침지하는 것도 가능하다.

이어서, 본 발명은 상기 효소처리한 효소처리물에 대하여 열수추출하는 단계(S130)를 수행하는 것이 특징이다. 상술한 효소처리를 통하여 세포벽이 분해된 연자육 잎에 대하여, 열수추출을 행함으로서, 유용한 성분들을 더욱 높은 추출 수율로 얻기 위한 것이다. 상기 열수추출하는 방법은 이 기술분야에서 널리 알려진 다양한 열수추출방법을 이용할 수 있고, 본 발명에서는 특별히 상기 효소처리물을 40~70℃ 범 위 내의 온도로 1~4시간 동안 열수추출하는 것이 바람직하다.

다음으로, 본 발명은 상기 열수추출한 열수추출물을 여과하거나 원심분리하는 단계(S140);를 포함하여 그 상등액을 얻음으로서 본 발명에 따른 연자육 추출물을 수득한다. 이에 따라, 상기 원심분리하는 단계(S140) 이후에는, 상기 원심분리된 상등액을 얻는 단계(S150);를 더 포함하는 것도 가능하다. 여과시에는 예를 들면 왓맨(Whatman) No. 41로 여과하는 것이 바람직하고, 원심분리시에는 특별히 제한되지는 않으나 2000×G 이상의 원심력으로 20~30분간 원심분리하는 것이 바람직하다.

도 2는 본 발명의 다른 바람직한 일 실시예에 따라, 열수추출 및 에탄올추출에 의해 연자육 추출물을 제조하는 방법을 나타내는 흐름도이고, 여기에 도시된 본 발명은 상기 원심분리하는 단계(S140) 이후에, 상기 원심분리된 침전물을 얻고(S210), 상기 얻은 침전물에 에탄올을 가하여 에탄올 추출하는 단계(S220);를 더 포함하는 것일 수 있다.

즉, 본 발명은 상술한 바와 같이 연자육에 세포벽 분해효소를 첨가하고 열수추출하여 1차로 추출물을 얻은 다음, 상기 열수추출물의 침전물(S210)을 다시 에탄올 추출(S220)함으로서 2차로 추출물을 다시 얻을 수 있는 연자육 추출물의 다른 제조방법이다.

여기서, 상기 에탄올 추출방법은 이 기술분야에서 알려진 다양한 에탄올 추출방법을 사용할 수 있고, 본 발명에서는 특별히 열수추출(S130) 후 원심분리(S140)에 의해 얻은 상등액(S150)으로부터 1차로 추출물을 얻고, 상기 원심분리(S140)에 의해 얻은 침전물(S210)을 다시 에탄올 추출(S220)한 후 원심분리(S230)함으로서 그 상등액(S240)으로부터 2차로 원하는 추출물을 얻는 것이 특징이다. 이에 따라, 본 발명은 상기 에탄올 추출하는 단계(S220) 이후에는, 상기 에탄올 추출물을 원심분리해서(S230), 상등액을 얻는 단계(S240);를 더 포함하는 것도 가능하다.

이러한 본 발명에 따른 제조방법에 의하는 경우, 일정한 원료로부터 종래보다 많은 양의 유용성분을 포함하는 연자육 추출물을 얻을 수 있는 효과가 있다.

상기한 본 발명에 따른 연자육 추출물의 제조방법에 의하면, 연자육 추출물의 추출 수율이 높아, 폴리페놀 함량이 종래보다 높고, 미백 활성 및 항산화 효과가 더욱 우수한 연자육 잎 추출물을 획득할 수 있는 효과가 있다.

또한, 상기 연자육 추출물은 Tyrosinase 활성억제 및 항산화 활성이 우수하고, 피부에 적용시 안정성에도 문제가 없어서, 피부 미백용 또는 피부 노화방지용 화장료 조성물로 사용하는 것도 가능하다.

본 발명은 하기의 실시예에 의해 보다 잘 이해될 수 있으며, 하기의 실시예는 본 발명의 예시일 뿐, 첨부된 특허 청구범위에 의하여 한정되는 보호범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.

실시예 1: 효소처리를 이용한 연자육 추출물 제조방법

연자육을 건조시키고, 120메쉬 크기로 분쇄하여 준비하였다. 그리고, 준비된 연자육 부피의 10배에 해당하는 증류수를 가한 후, 1M HCl과 0.1N NaOH를 이용하여 pH 5~8로 조절하였다.

여기에 세포벽 분해효소인 세레믹스^TM(CEREMIX), 셀룰클라스트^TM(CELLUCLAST), 튜니카아제^TM(TUNICASE), 프로모자임(PROMOZYME) 및 알카라아제(ALCALASE) 5종의 효소를 각각 2%(w/w)씩 첨가하였다.

그리고, 각 시료를 항온수조에 넣고 50℃에서 1시간 동안 쉐이킹(shaking)해서, 열 수 추출한 후, 각 시료를 Whatman No. 41로 여과하여, 그 상등액을 연자육 추출물로 수득하였다.

실험예 1: 분해효소의 종류에 따른 연자육 추출물의 폴리페놀 함량, 항산화 효과 및 Tyrosinase 활성 억제 효과 측정

실험예 1-1: 수율확인을 위한 연자육 추출물의 총 폴리페놀 함량 측정

상기 실시예 1에서 수득한 추출물을 Folin-Denis assay 방법을 사용하여 총 폴리페놀 함량을 측정하였다. 먼저, 실시예 1에서 얻은 연자육 추출물 0.1㎖에 Folin-ciocalteu 시약(phosphomolybdate-phosphotungstate) 50㎕을 가하여 반응시킨 후, 20% 탄산나트륨 무수물(Sodium carbonate Anhydrous) 1.5㎖를 첨가하여 반응시킨 다음 760nm에서 흡광도를 측정하였다.

이렇게 측정된 분해효소의 종류에 따른 연자육 추출물의 폴리페놀 함량을 하기 표 1에 나타내었다.

[표 1: 분해효소의 종류에 따른 연자육 추출물의 폴리페놀 함량]

효소 처리조건	총 폴리페놀 함량(ug/ml)	효소 무처리구 대비 수율(%)
효소 무처리구	274.90±10.4	100
세레믹스 6X MG	339.52±11.3	123.5(+23.5)
셀룰클라스트	278.79±5.0	65.0(-35.0)
튜니카아제 FN	353.32±6.9	128.5(+28.5)
프로모자임	322.78±7.2	117.4(+17.4)
알카라아제	368.90±5.7	134.1(+34.1)

* 세레믹스 6X MG^TM(Ceremix 6X MG)는 베타-글루카나제(β-glucanase)에 셀룰라제(celullase), 프로테인나제(proteinase), 알파-아밀라제(alpha-amylase), 펜토산나제(pentosanase) 등의 4종의 효소를 각각 동일한 중량비로 혼합한 효소이다.

* 셀룰클라스트^TM(celluclast)는 셀룰라제(cellulase) 단일효소이다.

* 튜니카아제 FN^TM은 베타-글루카나제(β-glucanase) 단일효소이다.

* 프로모자임(PROMOZYME)는 플루라나제(Pullulansase) 단일효소이다.

* 알카라아제(ALCALASE)는 알카라아제(alcalase) 단일효소이다.

상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 실시예 1에서 사용한 분해효소 중 튜니카아제 FN^TM, 알카라아제(alcalase)를 사용한 경우, 효소 무처리구에 비해 28.5-34.1% 정도 폴리페놀 함량이 높았다.

실험예 1-2: 효소 처리한 연자육 추출물의 항산화 활성

실시예 1에서 얻은 연자육 추출물의 DPPH 라디칼 소거능(%)을 측정하여 상기 연자육 추출물의 항산화 활성을 확인하였다. 이때, 양성대조군으로는 Vitamine E를 사용하였다.

실험 결과, 하기 표 2에 나타낸 바와 같이 프로모자임(promozyme)을 제외한 모든 효소 처리구에서의 연자육 추출물이 효소 무처리군보다 높은 항산화 활성을 나타냈다.

[표 2: 분해효소의 종류에 따른 연자육 추출물의 항산화 활성]

효소 처리조건	항산화 활성(%)
효소 무처리구	76.76±4.2
세레믹스 6X MG	81.60±1.8
셀룰클라스트	78.97±1.3
튜니카아제 FN	87.30±0.5
프로모자임	70.30±3.5
알카라아제	88.91±0.5

상기 표 3에 나타낸 바와 같이, 효소별 DPPH 라디칼 소거능(%)을 비교한 결과, 튜니카아제 FM과, 알카라아제(alcalase)에서 다른 효소보다 높은 항산화 활성을 보였다.

실험예 1-3: 효소 처리한 연자육 추출물의 Tyrosinase 활성 억제

실시예 1에서 얻은 연자육 추출물의 Tyrosinase 활성 억제 효과를 측정하였다. 이때, 양성대조군으로는 Kojic acid를 사용하였다. 타이로시나제 저해 활성은 0.5M 인산완충용액(pH 6.5) 0.5㎖에 10mM L-DOPA를 녹인 기질액 0.2㎖을 가하고, 실시예 1과 같은 방법으로 얻은 각각의 연자육 추출물을 0.1㎖를 첨가하여 혼합한 혼합액에, 버섯 타이로시나제(mushroom tyrosinase)(100U/㎖) 0.2㎖을 첨가한 다음, 25℃에서 2분간 반응시킨 후, 반응액 중에 생성된 도파크롬(dopachrome)을 효소 분광흡도 분석기(microplate reader)를 이용하여 475nm에서 흡광도를 측정하여 비교하였다.

상기 Tyrosinase 활성 억제 효과를 측정한 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

[표 3: 분해효소의 종류에 따른 연자육 추출물의 미백 활성]

효소 처리조건	미백 활성(%)
효소 무처리구	26.70±3.3
세레믹스 6X MG	43.49±3.4
셀룰클라스트	40.14±4.6
튜니카아제 FN	48.60±3.3
프로모자임	39.38±2.4
알카라아제	38.20±3.8

상기 표 3에 나타낸 바와 같이, Tyrosinase 활성 억제 효과가 가장 우수한 것은 튜니카아제 FN로 처리하여 얻은 연자육 추출물이었으며, 각각의 효소를 처리하여 얻은 모든 연자육 추출물들이 효소 무처리군보다 훨씬 높은 Tyrosinase 억제 활성을 나타내었다.

상술한 바와 같이, 실험예 1에 의하는 경우, 세포벽 분해효소 중에서도 튜니카아제 FN와 알카라아제(alcalase)가 연자육에 적합하고, 상기 2효소를 이용한 연자육 추출물의 제조방법에 가장 우수하다는 것을 확인할 수 있다.

실시예 2: 효소농도에 따른 연자육 추출물의 제조방법

상기 실시예 1 및 실험예 1에 따라 가장 우수한 것으로 선정된 튜니카아제 FN와 알카라아제(alcalase) 효소를 이용하여, 효소 농도에 따른 연자육 추출물의 제조방법을 연구하였다.

즉, 본 실시예에서는 연자육 잎이 포함된 증류수의 pH를 8로 조절하고, 상기 2가지 효소를·0-4%(w/w)씩, 다시 말해서 0%(무첨가), 1%, 2%, 3%, 4%(w/w)로 각각 시료에 첨가하여 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1에서와 동일한 방법으로 연자육 추출물을 수득하였다.

실험예 2: 분해효소의 농도에 따른 연자육 추출물의 폴리페놀 함량, 항산화 효과 및 Tyrosinase 활성 억제 효과 측정

실험예 2-1: 분해효소의 농도에 따른 연자육 추출물의 폴리페놀 함량

상기 실시예 2에 따라 튜니카아제 FN 효소와 알카라아제(alcalase) 효소를 각각 이용하여, 수득한 연자육 추출물을 대상으로 폴리페놀 함량을 측정하였으며, 구체적인 폴리페놀 함량 측정 방법은 실험예 1-1에서와 같다. 그 결과는 하기 표 4에 나타내었다.

[표 4: 분해효소의 농도에 따른 연자육 추출물의 폴리페놀 함량]

효소 처리농도	0%	0.5%	1%	2%	4%
튜니카아제 FN	325.33±28.8	354.77±7.6	375.96±2.0	393.75±12.4	364.59±29.3
알카라아제	325.33±28.8	416.87±14.3	435.43±11.8	445.57±11.12	445.55±12.97

상기 표 4에 나타낸 바와 같이, 전체적으로 튜니카아제 FN보다 알카라아 제(ALCALASE)로 효소처리 하였을 때, 폴리페놀 함량이 높게 나타났으며, 두 가지 효소 모두 연자육 유효성분 추출시에는 1~3%, 특히 3% 농도 범위로 효소를 사용하는 것이 추출 수율면에서 바람직하다는 것을 확인할 수 있다.

실험예 2-2: 분해효소의 농도에 따른 연자육 추출물의 항산화 활성

상기 실시예 2에 따라 튜니카아제 FN 효소와 알카라아제(alcalase) 효소를 각각 이용하여, 수득한 연자육 추출물을 대상으로 항산화 활성을 측정하였으며, 구체적인 항산화 활성 측정 방법은 실험예 1-2에서와 같다. 그 결과는 하기 표 5에 나타내었다.

[표 5: 분해효소의 농도에 따른 연자육 추출물의 항산화 활성]

효소 처리농도	0%	1%	2%	3%	4%
튜니카아제 FN	77.22±0.4	80.60±2.4	82.17±1.9	82.81±1.4	82.39±0.7
알카라아제	77.22±0.4	90.40±1.8	90.15±3.0	90.98±3.4	90.35±1.7

상기 표 5에나타낸 바와 같이, 튜니카아제 FN보다 알카라아제(ALCALASE)로 효소처리 하였을 때, 항산화 활성이 높게 나타났으며, 농도별로 처리하였을 시에는 함량의 차이가 미비하였다.

실험예 2-3: 분해효소 농도에 따른 연자육 추출물의 Tyrosinase 활성 억제

상기 실시예 2에 따라 튜니카아제 FN 효소와 알카라아제(alcalase) 효소를 각각 이용하여, 수득한 연자육 추출물을 대상으로 Tyrosinase 활성 억제 효과를 측 정하였으며, 구체적인 측정방법은 실험예 1-3에서와 같다. 그 결과는 하기 표 6에 나타내었다.

[표 6: 분해효소의농도에 따른 연자육 추출물의 미백 활성]

효소 처리농도	0%	1%	2%	3%	4%
튜니카아제 FN	42.0±8.8	55.33±24.3	57.77±15.8	57.12±1.4	61.12±1.5
알카라아제	42.0±8.8	60.40±2.1	63.65±31.5	64.02±3.5	62.5±12.5

억제 효과를 측정한 결과, 무처리구보다 높은 활성을 나타내었으나, 농도에 따라 차이는 미비하였다.

실시예 3: 효소 처리 후, 에탄올 추출한 연자육 추출물의 제조방법

상기 실시예 1에 따라 열수추출을 거친 시료를 Whatman No. 41로 여과하고, 그 침전물을 대상으로, 상기 침전물에 대하여 20~30배 중량의 에탄올을 가한 후, 4시간동안 에탄올 추출하였다. 에탄올 추출 후에는, 각 시료를 왓맨 No.41로 여과하고 그 상등액을 연자육 추출물을 수득하였다.

실험예 3: 효소 처리 후, 에탄올 추출한 연자육 추출물의 폴리페놀 함량, 항산화 효과 및 Elastase 저해 활성 측정

실험예 3-1: 효소 처리한 연자육 에탄올 추출물의 총 폴리페놀 함량 측정

상기 실시예 3에 따라 수득한 추출물에 대하여 Folin-Denis assay 방법을 사 용하여 총 폴리페놀 함량을 측정하였고, 상기 측정된 분해효소의 종류에 따른 연자육 추출물의 폴리페놀 함량을 하기 표 7에 나타내었다.

[표 7: 효소 처리한 연자육 에탄올 추출물의 폴리페놀 함량]

효소 처리조건	총 폴리페놀 함량(ug/ml)
세레믹스 6X MG	417.94±5.0
셀룰클라스트	295.81±9.8
튜니카아제 FN	410.54±8.1
프로모자임	306.97±10.4
알카라아제	266.30±10.4

상기 표 7에서 효소 처리군의 폴리페놀 함량은, 상기 실시예 1에 따라 열수추출을 거친 시료를 여과한 상등액으로부터 얻은 1차 추출물과는 별도로, 상기 시료를 여과한 침전물로부터 실시예 3에 따라 얻은 2차 추출물에 대한 것이라는 점에서, 이러한 본 발명에 의하면 일정한 원료로부터 종래보다 많은 양의 유용성분을 포함하는 연자육 추출물을 얻을 수 있다.

실험예 3-2: 효소 처리한 연자육 에탄올 추출물의 항산화 활성

실시예 3에서 얻은 연자육 추출물의 DPPH 라디칼 소거능(%)을 측정하여 상기 연자육 추출물의 항산화 활성을 확인하였고, 구체적인 항산화 활성 측정 방법은 실험예 1-2에서와 같으며, 그 결과는 하기 표 8에 나타내었다.

[표 8: 효소 처리한 연자육 에탄올 추출물의 항산화 활성]

효소 처리조건	항산화 활성(%)
효소 무처리구	71.24±3.0
세레믹스 6X MG	71.36±1.9
셀룰클라스트	71.69±2.3
튜니카아제 FN	91.43±0.1
프로모자임	75.10±1.8
알카라아제	77.83±1.2

상기 표 8에서 나타낸 바와 같이, 에탄올 추출물에서는 튜니카아제 FN 효소를 처리하여 얻은 에탄올 추출물이 90%이상 높은 항산화 활성을 나타냈다.

실험예 3-3: 효소 처리한 연자육 에탄올 추출물의 Elastase 저해활성

상기 실시예 3에서 획득한 추출물에 대하여 elastase 저해활성을 측정하였다. 이 때, 대조군은 Ursolic acid을 사용하였으며, 0.256M Tris-HCl(pH 8.0) 10㎖에 8.8mM Suc-Ala(3)-NA를 녹인 기질액 0.1㎖을 가하고, 실시예 3에서 얻은 연자육 추출물을 0.05㎖를 첨가하여 혼합한 혼합액에 elastase(10㎍/㎖) 0.05㎖를 첨가하고 25℃에서 10분간 반응시킨 후, 반응액 중에 유리된 nitroanilide을 정량하기 위해 효소 분광흡도 분석기(microplate reader)를 이용하여 410nm에서 흡광도를 측정하여 비교하였다.

[표 9: 효소 처리한 연자육 에탄올 추출물의 Elastase 저해활성]

효소 처리조건	Elastase 저해활성(%)
효소 무처리구	75.37±3.6
세레믹스 6X MG	77.40±2.4
셀룰클라스트	74.89±3.5
튜니카아제 FN	77.60±2.1
프로모자임	74.92±6.0
알카라아제	76.06±1.8

상기 표 9에서 나타낸 바와 같이, 연자육 에탄올 추출물에서 elastase 저해활성이 높은 것을 알 수 있다.

상기한 바에 따르면, 본 발명에 따라 효소처리한 연자육 추출물은 항산화 효 과 및 미백 효과가 우수하고, 효소처리 및 에탄올 추출한 연자육 추출물은 항산화 효과 및 elastase 저해 활성 즉, 주름 효과가 우수하다는 것을 확인할 수 있다.

도 1은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따라, 열수추출에 의해 연자육 추출물을 제조하는 방법을 나타내는 흐름도이고,

도 2는 본 발명의 다른 바람직한 일 실시예에 따라, 열수추출 및 에탄올추출에 의해 연자육 추출물을 제조하는 방법을 나타내는 흐름도이다.

Claims

삭제
연자육(Nelumbinis semen)을 준비하는 단계;

상기 준비된 연자육에 증류수를 가하고, 세포벽 분해효소 또는 단백질 분해효소를 첨가하여 효소처리물을 얻는 단계;

상기 효소처리물을 열수추출하는 단계; 및,

상기 열수추출한 열수추출물을 원심분리하는 단계;를 포함하고,

상기 분해효소는 베타-글루카나제(β-glucanase) 또는 알카라아제(alcalase)를 주성분으로 포함하는 단일효소이며,

상기 분해효소를 첨가하는 것은, 상기 연자육에 증류수가 가해진 연자육 증류수의 중량에 대비하여 1~3%(w/w) 범위 내로 분해효소를 첨가하는 것이고,

상기 열수추출하는 단계는, 상기 효소처리물을 40~70℃ 범위 내의 온도로 1~4시간 동안 열수추출하는 것이며,

상기 원심분리하는 단계 이후에, 상기 원심분리된 상등액을 얻는 단계;와 상기 원심분리된 침전물을 얻고, 상기 얻은 침전물에 에탄올을 가하여 에탄올 추출하는 단계;를 포함하고, 상기 에탄올 추출하는 단계 이후에, 상기 에탄올 추출물을 원심분리해서, 상등액을 얻는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 연자육 추출물의 제조방법.
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제2항의 제조방법에 따라 제조되어, 폴리페놀을 함유하는 것을 특징으로 하는 연자육 추출물.
제8항의 연자육 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 또는 피부 노화방지용 화장료 조성물.