KR100984951B1 - Ｄｎａ 손상 유도된 세포 주기 ｇ2 체크포인트를폐기시키고/시키거나 ｄｎａ 손상 처리의 항암 활성을증강시키는 화합물 - Google Patents

Ｄｎａ 손상 유도된 세포 주기 ｇ2 체크포인트를폐기시키고/시키거나 ｄｎａ 손상 처리의 항암 활성을증강시키는 화합물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인간 세포를 비롯한 포유류 세포에서 세포 주기 G2 체크포인트, 특히 DNA 손상 유도된 G2 체크포인트를 억제하는 조성물 및 방법을 제공한다. 보다 상세하게는, 본 발명은 세포 주기 G2 체크포인트를 폐기시켜 DNA 손상제에 대해 세포를 감작시키는 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명의 화합물은 암과 같은 증식 질환의 치료에 유용하다. 본 발명은 또한 DNA 손상제 및 DNA 손상 처리에 대해 G1 체크포인트 장애성 암세포를 선택적으로 감작시키는 조성물 및 방법을 제공한다.

Description

ＤＮＡ 손상 유도된 세포 주기 Ｇ2 체크포인트를 폐기시키고/시키거나 ＤＮＡ 손상 처리의 항암 활성을 증강시키는 화합물{COMPOUNDS THAT ABROGATE DNA-DAMAGE-INDUCED CELL CYCLE G2 CHECKPOINT AND/OR AUGMENT THE ANTI-CANCER ACTIVITY OF DNA-DAMAGING TREATMENTS}
관련 출원
본 출원은 2002년 6월 6일에 출원된 미국 출원 일련번호 60/386,930호를 우선권으로 주장한다.
본 발명은 항-세포 증식 활성을 지닌 화합물, 이의 제조방법, 이를 함유하는 약학적 조성물 및 상기 화합물과 조성물을 사용하여 증식 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 세포 증식을 억제하는데 유용하고, 그 자체로 암을 비롯한 세포 증식 장애를 치료하는데 유용하다. 특히, 본 발명은 DNA 손상 유도된 G2 체크포인트를 포함하는 세포 주기 G2 체크포인트를 폐기하는 화합물에 관한 것이며, 이러한 화합물은 전이성 및 비전이성 고형 종양 및 액체 종양을 치료하는 것을 포함하여 암과 같은 증식 장애를 치료하는데 유용하다.
세포 주기는 S기(DNA 복제), M기(유사분열) 및 이러한 S기와 M기 사이의 2개의 간기(G1기 및 G2기)를 포함한다. 세포 주기 중의 체크포인트는 세포 주기 스테이지를 통해 정확한 진행이 이루어지게 하며, DNA 완전성, DNA 복제, 세포 크기 및 주위 환경 상태를 모니터하는 것을 포함한다 (Maller(1991) Curr. Opin. Cell Biol., 3:26). 다세포 생물체는 게놈의 완전성을 유지하는 것이 특히 중요하며, 게놈의 상태를 모니터하는 다수의 체크포인트가 존재한다. 그 중에서, G1 체크포인트와 G2 체크포인트는 각각 DNA 복제와 유사분열 전에 존재한다. 손상된 DNA가 복제되면 이는 종종 돌연변이를 유발하기 때문에 S기에 진입하기 전에 DNA 손상을 복구하거나 교정하는 것이 중요하다 (Hartwell(1992) Cell, 71:543). 대규모의 DNA 손상을 복구하지 않고 G1 및 G2 체크포인트를 통해 진행되면 유사분열 대변동(catastrophe) 및/또는 아폽토시스(apoptosis)가 유도된다.
대부분의 암세포는 G1 체크포인트 관련 단백질, 예컨대 p53, Rb, MDM-2, p16INK4 및 p19ARF에 이상을 갖고 있다 (Levine (1997) Cell, 88:323). 또한, 돌연변이는 종양유전자 산물, 예컨대 Ras, MDM-2 및 사이클린 D의 과잉발현 및/또는 과다활성화를 일으킬 수 있으며, 이는 G1 체크포인트의 엄격도를 감소시킨다. 이러한 돌연변이 외에도, 과도한 성장 인자 시그널링이 성장인자의 과잉발현으로 유발되어, G1 체크포인트의 엄격도를 감소시킬 수 있다. 기능상실 돌연변이 및 기능획득 돌연변이와 함께, 성장 인자 수용체 또는 다운스트림 시그널 전달 분자에 의한 연속 활성화는 G1 체크포인트를 압도함으로써 세포 형질전환을 일으킬 수 있다. 또한, 파괴되거나 폐기된 G1 체크포인트는 보다 높은 돌연변이율 및 암세포에서 관찰되는 다수의 돌연변이에 기여한다. 결과적으로, 대부분의 암세포는 과도한 DNA 손 상에 대한 생존을 위해 G2 체크포인트에 의존한다 (O'Connor and Fan(1996) Prog. Cell Cycle Res., 2:165).
G2 세포 주기 체크포인트는 DNA 복제 및 복구가 완료될 때까지 유사분열의 개시를 제한한다. G2 체크포인트의 기능장애는 DNA 복제 및 복구의 완료 전에 유사분열을 조기 개시시켜, 게놈 DNA의 상당부가 결실되거나 돌연변이를 보유한 딸세포를 생산하게 한다. G2 체크포인트의 기능은 DNA 손상을 검출하고, DNA 손상이 검출된 경우에 세포 주기를 정지시킬 수 있는 시그널을 발생시키는 것을 포함한다. DNA 손상 후에 세포 주기 G2 정지를 촉진하는 메커니즘은 효모에서 인간에 이르는 종 사이에서 보존되는 것으로 믿어진다. 손상된 DNA가 존재하는 경우, Cdc2/사이클린 B 키나제가 Cdc2 키나제상의 트레오닌-14와 티로신-15 잔기의 인산화에 의해 비활성화 상태로 유지되고; 대안적으로, 사이클린 B 단백질의 수준이 감소될 수 있다. 유사분열이 개시될 때, Cdc25 포스파타제는 Cdc2/사이클린 B 키나제로부터 억제성 인산염을 제거하여, Cdc2/사이클린 B 키나제를 활성화시킨다. Cdc2/사이클린 B 키나제의 활성화는 M기의 개시에 상응한다.
분열 효모에서, 단백질 키나제 Chk1가 손상된 DNA에 반응하여 나타나는 세포 주기 정지에 필요하다. Chk1 키나제는 수 개의 rad 유전자 산물의 다운스트림에서 작용하며, DNA 손상시에 인산화에 의해 변형된다. 출아 효모의 키나제 Rad53 및 분열 효모의 Cds1은 복제되지 않은 DNA로부터 시그널을 전도하는 것으로 알려져 있다. Chk1 및 Cds1 둘 모두의 제거가 손상된 DNA에 의해 유도된 G2 정지의 붕괴를 절정에 이르게 하기 때문에 Chk1과 Cds1 사이에 약간의 여유가 존재하는 것으로 여 겨진다. 흥미롭게도, Chk1과 Cds1는 둘 모두 Cdc25를 인산화하고 Rad24가 Cdc25에 결합하는 것을 촉진하는데, 이는 Cdc25를 세포질에 격리시키고 Cdc2/사이클린 B 활성화를 억제한다. 따라서, Cdc25는 이들 키나제의 공통 표적인 것으로 여겨지며, 이는 이러한 분자가 G2 체크포인트에서 필수불가결한 인자임을 암시한다.
인간의 경우, 분열 효모 Chk1의 인간 동족체인 hChk1과, 발아 효모 Rad53과 분열 효모 Cds1의 인간 동족체인 Chk2/HuCds1이 둘 모두 DNA 손상에 반응하여 중요한 조절 부위인 세린-216에서 Cdc25C를 인산화한다. 이러한 인산화는 분열 효모의 Rad24 및 Rad25의 인간 동족체인 작은 산성 단백질인 14-3-3s에 대한 결합 부위를 생성시킨다. 이러한 인산화의 조절 역할은 Cdc25C 상에서 세린-216을 알라닌으로 치환하면 인간 세포에서 세포 주기 G2 정지가 붕괴된다는 사실에 의해 분명히 나타났다. 그러나, G2 체크포인트의 메커니즘이 완전히 이해된 것은 아니다.
발명의 개요
본 발명은 세포 증식 장애, 예컨대 양성 및 악성 암세포와 관련된 장애를 치료하는데 사용될 수 있는 화합물 및 이를 함유하는 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 화합물은 임의의 특정 메커니즘에 한정되지 않지만, G2 체크포인트를 억제, 붕괴 또는 폐기, 특히 DNA 손상 유도된 G2 체크포인트를 폐기시킴으로써 기능할 수 있는 것으로 믿어진다. 본 발명의 화합물은 DNA 손상의 효과에 대해 DNA 손상을 지닌 세포, 예를 들어 암세포를 선택적으로 감작시킴으로써 항암제로서 작용할 수 있다. 본 발명의 화합물은 DNA 손상제 또는 DNA 손상 처리의 효과에 대해 세포, 특 히 암세포를 감작시킬 수 있다. 본 발명의 화합물은 임의의 추가적인 DNA 손상 처리 없이 세포 성장을 억제할 수 있고, 정상 세포에 대한 세포독성 활성이 거의 없거나 전혀 없다. 따라서, 본 발명의 화합물은 임의의 추가적인 DNA 손상 처리의 존재 또는 부재하에서 항암제로서 사용되고, 항암 약물로 사용되는 약학적 조성물에 활성 성분으로서 사용될 수 있다.
본 발명은 증식 장애를 지닌 세포를 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 세포의 G2 체크포인트를 폐기시키는 방법, 특히 세포를 G2 체크포인트 폐기시키기에 충분한 양의 본 발명의 화합물 또는 본 발명의 약학적 조성물과 접촉시킴으로써 DNA 손상 유도된 G2 체크포인트를 폐기시키는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 G1 체크포인트가 손상된 세포를 DNA 손상제에 대해 선택적으로 감작시키는 방법으로서, 세포를 G2 체크포인트의 폐기시키기에 충분한 양의 본 발명의 화합물 또는 본 발명의 약학적 조성물과 접촉시켜서 세포를 DNA 손상제에 대해 감작시키는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 세포는 포유류 세포, 특히 인간 세포, 더욱 특히 인간 암세포일 수 있다.
본 발명은 세포에서 G2 체크포인트 폐기시키기에 충분한 양의 본 발명의 화합물 또는 본 발명의 약학적 조성물을 투여하여, 세포를 DNA 손상제에 대해 감작시키고, DNA 손상제를 투여함으로써, 개체의 세포에서 유사분열 대변동 및/또는 아폽토시스를 유도하는 방법을 제공한다. 세포는 포유류 세포, 특히 인간 세포, 더욱 특히 인간 암세포일 수 있다. 암세포는 손상된 G1 세포 주기 정지 체크포인트를 지닐 수 있다. DNA 손상제는 5-플루오로우라실(5-FU), 레베카마이신, 아드리아마이 신, 블레오마이신, 시스플라틴, 고열(hyperthermia), UV 조사 또는 감마선 조사일 수 있거나, DNA 손상을 유발하는 것으로 공지되어 있고/있거나 미국 특허 출원 일련번호 09/667,365호에 기술된 바와 같은 스크리닝 방법에 의해 확인되는 임의의 적합한 화합물일 수 있다.
도 1은 블레오마이신(40㎍/ml) 또는 다양한 농도(0.2, 0.39, 0.78, 1.56, 3.125, 6.25, 12.5, 25 및 50㎍/ml)의 CBDC402+블레오마이신으로 24시간 동안 처리한 후 쥬르카트(쥬르카트) 세포의 DNA 함량을 유동세포측정 분석한 결과를 도시한다.
도 2는 콜히친(5㎍/ml) 또는 다양한 농도(0.2, 0.39, 0.78, 1.56, 3.125, 6.25, 12.5, 25 및 50㎍/ml)의 CBDC402+콜히친으로 24시간 동안 처리한 후 쥬르카트 세포의 DNA 함량을 유동세포측정 분석한 결과를 도시한다.
도 3a 및 도 3b는 다양한 CBDC 화합물의 활성을 도시하는데, 도 3a는 다양한 CBDC 화합물에 의한 G2 체크포인트 폐기의 용량 반응 곡선을 도시하고, 도 3b는 CBDC 화합물의 구조-활성 관계를 도시한다.
도 4는 특정 CBDC 화합물에 대한 구조식, 화학명 및 CBDC 코드를 도시한다.
도 5는 특정 CBDC 화합물에 대한 구조식 및 상대적 활성을 도시한다.
도 6은 특정 CBDC 화합물에 의한 G2 체크포인트 폐기를 위한 IC50 값을 도시한다.
도 7은 아드리아마이신(ADR), 블레오마이신(Bleo), 캄프토테신(Campto) 및 시스플라틴(CDDP)으로 24시간 동안 처리한 후, 세포를 CBDC004 0μM, 2μM, 10μM 또는 50μM로 처리한 후의 HCT116 세포의 DNA 함량을 유동세포측정 분석한 결과를 도시한다.
도 8은 블레오마이신(10㎍/ml), 아드리아마이신(1㎍/ml), 캄프토테신(1㎍/ml) 또는 시스플라틴(CDDP, 10㎍/ml)으로 처리하고, 각 처리법내에서 CBDC004 0μM, 2μM, 10μM 또는 50μM로 처리한 HCT116 세포에 대한 세포독성 결과(서브G1 집단의 비율(%))를 유동세포측정 분석한 결과를 도시하며, 서브G1 집단은 크리스한(Krishan) 용액으로 세포를 염색시킴으로써 결정하였다.
도 9는 인간 결장암 세포주인 HCT116 세포를 SCID 마우스에게 피하이식한 경우에 CPT-11, CBDC402 또는 CPT-11과 CBDC402의 조합물이 종양 성장에 미치는 효과를 도시하며, 각 처리군의 평균 종양 크기는 처리 후의 일수에 대해 플롯팅하였다(n=4).
도 10a 내지 도 10c는 CBDC402가 DNA 손상 유도된 세포 주기 G2 체크포인트를 특이적으로 폐기함을 보여주는 유동세포분석의 결과를 도시하는데, 도 10a는 CBDC402가 G2기에서 활성화된 정상 T 세포의 블레오마이신 유도된 증가를 폐기시킴을 도시하고, 도 10b는 CBDC402가 G2기에서 백혈병 T 세포(쥬르카트 세포)의 블레오마이신 유도된 커다란 증가를 폐기시킴을 도시하며, 도 10c는 CBDC402가 M기에서 활성화된 정상 T 세포의 콜히친 유도된 증가에 영향을 미치지 않음을 도시한다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 세포 증식 장애를 치료하는 조성물 및 방법을 제공한다. 상세하게는, 본 발명은 세포 주기 G2 체크포인트를 폐기시키는 화합물을 제공하며, 이러한 화합물은 암 관련 장애와 같은 세포 증식 장애를 치료하는데 사용될 수 있다. 본 발명은 1종 이상의 본 발명의 화합물을 적합한 담체 또는 부형제 중에 함유하는 약학적 조성물을 제공하며, 이러한 조성물은 DNA 손상제와 같은 추가의 활성 성분을 포함할 수 있다. 본 발명은 증식성 세포, 특히 증식 장애를 지닌 세포를 억제하거나 사멸시키기 위해 본 발명의 화합물 및 이를 함유하는 약학적 조성물을 사용하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 세포를 다른 작용제의 효과 또는 DNA 손상제를 포함하는 처리에 대해 선택적으로 감작시키기 위해 본 발명의 화합물을 사용하는 방법을 제공한다.
정의
다른 정의가 없는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 용어와 과학 용어는 본 발명이 속하는 당해 기술분야의 숙련된 자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 다음과 같은 용어는 다른 정의가 없는 한 이들에 속하는 의미를 갖는다.
"세포 주기 G2 체크포인트를 폐기시키는" 또는 "세포 주기 G2 체크포인트를 억제하는" 또는 "세포 주기 G2 체크포인트를 붕괴시키는" 또는 "G2 체크포인트 폐기"와 같은 용어 및 이러한 용어의 임의의 문법적으로 동등한 표현은 G2 체크포인트에서 세포 주기를 정지시키는 세포의 능력을 폐기시키는 본 발명에 따른 화합물의 능력을 의미한다. 세포 주기 G2 체크포인트의 폐기는 예컨대 특정 항암제, X선 조사, 감마선 조사, UV 조사 또는 고열에 의한 DNA 손상의 축적과 같은 G2 세포 주기 정지를 일으키는 세포내 조건하의 폐기를 포함한다. 이러한 조건하의 G2 체크포인트의 폐기는 "G2 체크포인트의 폐기"로 간주되나, 더욱 특히 "DNA 손상 유도된 G2 체크포인트"의 폐기로 간주되며, 여기서 DNA 손상 유도된 G2 체크포인트는 DNA 손상의 인식 및 정상적으로 G2 세포 주기 정지를 일으키는 시그널의 발생을 포함하는 것으로 이해된다. 세포 주기 G2 체크포인트가 폐기된 세포는, G2 체크포인트가 전무한 상태(G2 체크포인트 정지)에서 적당한 조건하의 수 분, 수 시간, 수 일, 수 주 이상의 기간의 감소를 지닌 G2 체크포인트에 이를 수 있는, 세포가 G2 체크포인트에 존재하는 시간 길이의 감소를 나타낸다. 따라서, 본 발명의 화합물과 접촉하는 세포는 세포가 화합물의 부재시에 정상적으로 지니는 시간 보다 짧은 G2 체크포인트 시간을 지닌다. 예를 들어, G2 체크포인트 시간 길이의 감소는 G2에 특정 시간, 예컨대 4시간 동안 존재하는 세포가, 본 발명의 화합물과 접촉한 경우에 4시간 보다 적은 시간, 예컨대 3.5시간, 3시간, 2.5시간, 2시간, 1시간 또는 그 이하의 시간 동안 G2에 존재하게 됨을 의미한다. "G2 폐기" 또는 "G2 체크포인트 폐기" 또는 "G2 체크포인트 억제 활성" 또는 이와 문법적으로 동등한 임의의 표현은 임의량의 G2 체크포인트의 폐기 또는 억제를 의미한다.
본 명세서에 사용된 "아폽토시스"란 용어는 당 분야에 이해되어 있는 바와 같이 프로그래밍된 세포 사멸 및 핵산 단편화, 카스파제 활성화, 염색체 축합 등을 포함하는 세포 생리학의 관련된 변화를 의미한다. "유사분열 대변동"이란 용어는 유사분열 과정의 오류로 초래되는 세포 사멸을 의미한다.
본 명세서에 사용된 "DNA 손상 처리" 및 "DNA 손상제"란 용어는 DNA를 직접 또는 간접적으로 손상시키는 임의의 처리법을 의미한다. DNA 손상제의 구체적 예로는 알킬화제, 니트로소우레아, 항-대사산물, 식물 알칼로이드, 식물 추출물 및 방사성동위원소가 있다. 작용제의 특정 예로는 DNA 손상 약물, 예를 들어 5-플루오로우라실(5-FU), 카페시타빈, S-1(Tegafur, 5-클로로-2,4-디하이드록시피리딘 및 옥손산), 5-에티닐우라실, 아라비노실 시토신(ara-C), 5-아자시티딘(5-AC), 2',2'-디플루오로-2'-데옥시시티딘(dFdC), 퓨린 항-대사산물(머캅토퓨린, 아자티오퓨린, 티오구아닌), 젬시타빈 하이드로클로린(Gemzar), 펜토스타틴, 알로퓨리놀, 2-플루오로-아라비노실-아데닌(2F-ara-A), 하이드록시우레아, 황 머스타드(비스클로로에티힐설파이드), 메클로레타민, 멜파란, 클로람부실, 사이클로포스파미드, 이포스파미드, 티오테파, AZQ, 미토마이신 C, 디안하이드로갈락티톨, 디브로모듀시톨, 알킬 설포네이트(부설판), 니트로소우레아(BCNU, CCNU, 4-메틸 CCNU 또는 ACNU), 프로카바진, 데카바진, 레베카마이신, 안트라사이클린, 예컨대 독소루비신(아드리아마이신; ADR), 다우노루빕신(세루비신), 이다루비신(이다마이신) 및 에피루비신(엘렌스), 안트라사이클린 유사체, 예컨대 미토크산트론, 악티니마이신 D, 비-인터칼레이팅 토포이소머라제 억제제, 예컨대 에피포도필로톡신(에포토사이드=VP16, 테니포사이드=VM-26), 포도필로톡신, 블레오마이신(Bleo), 페플레오마이신, 핵산과 부가물을 형성하는 화합물, 예컨대 백금 유도체, 예를 들어 시스플라틴(CDDP), 시스플라틴의 트란스 유사체, 카르보플라틴, 이프로플라틴, 테트라플라틴 및 옥살리플라틴, 뿐만 아니라 캄프토테신, 토포테칸, 이리노테칸(CPT-11) 및 SN-38이 있다. 핵 산 손상 처리의 특정 예로는 방사선, 예를 들어 자외선(UV), 적외선(IR) 또는 α선, β선 또는 γ선 뿐만 아니라 환경 쇼크, 예컨대 고열이 있다. 당업자라면 기타 다른 DNA 손상제 및 DNA 손상 처리를 확인하고 사용할 수 있다.
"본 발명의 화합물"이란 용어는 본 명세서에 개시된 구조식과 활성을 지닌 분자를 의미한다. 본 발명의 화합물은 순수한 형태, 실질적으로 순수한 형태로 분리될 수 있거나, 그 밖의 성분의 혼합물을 함유하는 조성물에 존재할 수 있다. 본 발명의 화합물을 함유하는 조성물의 순도는, 예를 들어 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)와 같은 분석화학 기법을 사용하여 측정될 수 있다. 본 명세서에 제공된 조성물은 1종 이상의 본 발명의 화합물을 적당한 담체, 부형제, DNA 손상제를 포함하는 추가의 활성 성분 등과의 혼합물로 함유할 수 있다.
"약학적 조성물"이란 용어는 피검체에 약학적 용도, 예컨대 항암제로서 사용하기에 적합한 조성물을 의미한다. 피검체는 세포 증식 장애의 치료가 필요한 인간일 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 약리학적 유효량의 1종 이상의 본 발명의 화합물과 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 제형이다.
본 명세서에 사용된 "증식 장애" 및 "증식 질환"이란 용어는 바람직하지 않거나 원하지 않는 세포 증식을 특징으로 하는 상태 또는 결함성 또는 비정상적 또는 결합성 아폽토시스를 특징으로 하는 세포 생존 상태 뿐만 아니라 비정상적이거나 바람직하지 않거나 원하지 않는 세포 생존을 특징으로 하는 상태를 포함하는 하나 이상의 세포의 비정상적 또는 원하지 않는 증식을 특징으로 하는 임의의 병리적 또는 비병리적 생리 상태를 의미한다. "분화 장애"란 용어는 비정상적 또는 결함성 분화를 특징으로 하는 임의의 병리적 또는 비병리적 생리 상태를 의미한다.
"피검체"란 용어는 동물, 전형적으로 포유류, 예컨대 영장류(인간, 원숭이, 긴팔원숭이, 침팬지, 오랑우탄, 짧은꼬리원숭이), 애완 동물(개 및 고양이), 가축(말, 소, 염소, 양, 돼지) 및 실험 동물(마우스, 래트, 토끼, 기니피그)을 의미한다. 피검체는 동물 질환 모델(예, 종양 함유 마우스)을 포함한다.
본 명세서에 사용된 모든 단수적 표현은 특별한 다른 표시가 없는 한 복수 대상물을 포함하는 것이다. 즉, 예를 들어 "화합물"이란 표현은 다수의 화합물을 포함하며, "잔기" 또는 "아미노산"이란 표현은 1종 이상의 잔기 및 아미노산들을 포함한다.
본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 본 명세서에 모든 목적을 위해 참조로 명백히 포함된다.
G2 체크포인트 폐기
본 발명은 특정 작용 메커니즘에 한정되는 것은 아니지만, 본 발명의 화합물이 증식성 세포에서 G2 체크포인트를 폐기할 수 있는 것으로 관찰되었다. G2 세포 주기 체크포인트는 DNA 복제와 복구가 완료될 때까지 유사분열의 개시를 제한하며, G2 체크포인트의 붕괴는 DNA 복제와 복구가 완료되기 전에 유사분열을 조기 개시시킬 것이다. 이러한 이론에 국한시키고자 하는 것은 아니지만, 본 발명의 화합물에 의한 G2 체크포인트의 폐기는 DNA 손상 축적을 보유한 세포인 경우 이 세포가 G2 체크포인트의 DNA 손상을 교정하거나 복구할 기회가 없고, 대신 DNA 복구 없이 G2를 통과하여 유사분열 대변동, 아폽토시스 또는 세포 억제 또는 세포 사멸을 초래 하는 다른 상태에 이르는 것을 의미하는 것으로 믿어진다.
하나의 양태에 따르면, 본 발명은 DNA 손상에 의해 유도된 G2 세포 주기 정지를 폐기시키는 방법을 제공한다. 정상 세포와 DNA 손상된 세포에서 세포 주기 반응, 특히 G2 체크포인트의 반응은 유의적 차이가 있다. 손상 유도된 G2 체크포인트는 DNA 손상의 인식 및 세포 주기 정지를 일으키는 시그널의 발생을 포함한다. 본 발명은 DNA 손상 유도된 G2 체크포인트를 선택적으로 폐기시키는 화합물을 제공한다.
또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 세포를 DNA 손상제 또는 DNA 손상 처리에 대해 감작시키는 화합물 및 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명은 세포를 DNA 손상제 및 DNA 손상 처리에 대해 감작시키는 방법을 제공한다.
또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 DNA 손상을 지닌 세포를 선택적으로 표적화하는 화합물 및 약학적 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 DNA 손상이 있는 세포를 DNA 손상 유도된 G2 체크포인트를 폐기시키기에 충분한 양의 1종 이상의 본 발명의 화합물과 접촉시킴으로써 DNA 손상을 지닌 세포를 선택적으로 표적화하는 방법을 제공한다. 한 가지 구체예에 있어서, 기존의 DNA 손상을 지닌 세포가 G2 체크포인트를 폐기시키는 본 발명의 화합물로 처리되고, DNA 손상된 세포가 G2기를 통해 진행되면, 세포 사멸 또는 억제가 일어난다(일반적으로, 유사분열 대변동 또는 아폽토시스). 또 다른 구체예에서, 세포가 1종 이상의 DNA 손상제와 1종 이상의 본 발명의 화합물의 조합물로 처리되며, 이는 DNA 손상제만을 사용하는 경우에 관찰되는 비율 보다 더 높은 비율로 세포 사멸이나 억제를 일으킨다.
또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 G1 세포 주기 체크포인트가 손상된 세포, 특히 암세포를 선택적으로 표적화하는 화합물 및 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명은 G1 세포 주기 체크포인트가 손상된 세포, 특히 암세포를, G2 세포 주기 체크포인트를 폐기시키기에 충분한 양의 1종 이상의 본 발명의 화합물과 접촉시킴으로써 상기 세포를 선택적으로 표적화하는 방법을 제공한다. 이론에 한정시키고자 하는 것은 아니지만, G1 세포 주기 체크포인트가 손상된 세포는 G1 이전에 DNA 손상을 복구하지 못하며, 본 발명의 화합물에 의한 G2 체크포인트의 폐기는 이들 세포가 축적된 DNA 손상을 복구함이 없이 유사분열을 통해 진행한다는 것을 의미한다. DNA 손상 후의 유효한 G2 체크포인트의 결여는 G1 체크포인트 결함이 있는 세포에게 치명적이다. 세포가 충분한 DNA 손상의 복구 없이 G2를 통해 진행된다면 손상은 유사분열 대변동 또는 아폽토시스를 유도할 수 있다.
한 가지 양태에 따르면, 본 발명은 암세포를 선택적으로 표적화하여 암세포를 사멸시키거나 또는 암세포의 성장을 억제하는 화합물을 제공한다. 또한, 본 발명은 암세포를 G2 체크포인트를 폐기시키기에 충분한 양의 1종 이상의 본 발명의 화합물과 접촉시킴으로써, 암세포를 선택적으로 표적화하여 이를 사멸시키거나 이의 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 많은 암세포는 p53, Rb, p16INK4 및 p19ARF와 같은 손상된 종양 억제 유전자를 포함하는 G1 세포 주기 정지 체크포인트에 관여하는 유전자의 돌연변이 및/또는 MDM -2 및 사이클린 D와 같은 종양유전자의 발현을 유발시키는 돌연변이를 지닌다. 또한, G1 체크포인트를 압도하면 정상 세포가 암세포로 형질전환될 수 있는데, 이는 성장 인자의 과잉발현에 의해 유도된 과도한 성장 인자 시그널링이, 성장 인자 수용체 또는 다운스트림 시그널 전달 분자가 G1 체크포인트를 압도함으로써 세포 형질전환을 유도하는 상태를 초래할 수 있기 때문이다. 대조적으로, G2 세포 주기 정지 체크포인트를 붕괴시키는 암은 거의 없다. 따라서, G2 체크포인트는 G1 체크포인트가 손상된 암세포에서 일반적으로 보유된다. G2 체크포인트의 선택적 붕괴는 온전한 G1 체크포인트를 지닌 정상 세포와 비교하여 G1 체크포인트가 손상된 암세포를 DNA 손상 처리에 대해 보다 감작성이 되게 만드는데, 그 이유는 이러한 손상을 복구하지 않고 G1 및 G2를 통해 진행이 이루어지면 아폽토시스 또는 유사분열 대변동이 유도되기 때문이다. 이론에 국한시키고자 하는 것은 아니지만, 본 발명의 화합물은 암세포에서 G2 체크포인트를 선택적으로 붕괴(폐기)시켜서, G1 체크포인트가 손상된 암세포가 DNA 손상 처리에 대해 보다 감작성이 되게 만드는 것이다. 따라서, 본 발명은 G1 체크포인트가 손상된 암세포를 DNA 손상제 및 DNA 손상 처리에 대해 감작시키는 화합물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명의 화합물은 정상 세포에 대한 세포독성 효과가 거의 없거나 전혀 없이 암세포를 선택적으로 표적화 할 수 있다. 이론에 국한시키고자 하는 것은 아니지만, G2 체크포인트가 본 발명의 화합물에 의해 폐기된 정상 세포는 기능성 G2 체크포인트 없이 G2기로 진입하여 유사분열을 일으켜도 이에 따른 유해 결과를 거의 또는 전혀 초래하지 않지만, 대조적으로 본 발명의 화합물에 의한 DNA 손상된 세포에서 DNA 손상된 G2 체크포인트의 폐기는 심각한 독성 효과를 지녀서 아폽토시스 또는 유사분열 대변동을 일으킬 것으로 예측된다. 따라서, 본 발명은 암세포와 같은 DNA 손상된 세포를 G2 체크포인트를 폐기시키기에 충분한 양의 1종 이상의 본 발명의 화합물과 접촉시킴으로써, 정상(미손상) 세포에는 세포독성 효과를 거의 또는 전혀 나타냄이 없이, 암세포와 같은 DNA 손상된 세포를 선택적으로 표적화하는 방법을 제공한다. 본 발명은 정상(미손상) 세포에는 세포독성 효과를 거의 또는 전혀 나타냄이 없이 암세포와 같은 DNA 손상된 세포를 선택적으로 표적화하는 방법에 사용하기에 적합한 1종 이상의 본 발명의 화합물을 함유하는 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명의 화합물은 정상 세포에 대해 세포독성 효과를 거의 또는 전혀 나타냄이 없이, DNA 손상제의 세포 사멸 효과에 대해 세포, 특히 암세포를 선택적으로 감작시킬 수 있다. 대부분의 통상적인 항암제는 암세포인지 정상 세포인지의 여부에 관계없이 증식성 세포를 표적화하며, 그 결과, 대부분의 통상적인 항암 약물은 구토, 설사 또는 탈모 등의 부작용을 유발한다. 대조적으로, 본 발명의 화합물은 G1 체크포인트가 손상되거나 다른 유형의 DNA 손상을 지닌 세포를 선택적으로 표적화하므로, 정상 세포에 대해 세포독성 효과를 거의 또는 전혀 나타내지 않는다.
본 발명은 세포를 G2 체크포인트를 폐기시키기에 충분한 양의 1종 이상의 본 발명의 화합물과 접촉시킴으로써, 세포의 아폽토시스 또는 유사분열 대변동을 유도하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 세포를 G2 체크포인트를 폐기시키기에 충분한 양의 1종 이상의 본 발명의 약학적 조성물과 접촉시킴으로써, 세포의 아폽토시스 또는 유사분열 대변동을 유도하는 방법을 제공한다. 세포는 DNA 손상을 지닌 세포, 특히 암세포일 수 있다.
본 발명은 세포를 G2 체크포인트를 폐기시키기에 충분한 양의 1종 이상의 본 발명의 화합물 및 DNA 손상제 또는 DNA 손상 처리와 접촉시킴으로써, 세포를 DNA 손상제 또는 DNA 손상 처리에 대해 감작시킴으로써 세포의 아폽토시스 또는 유사분열 대변동을 유도하는 방법을 제공한다. 세포는 암세포일 수 있다. 암세포는 손상된 G1 세포 주기 체크포인트를 지닐 수 있다. DNA 손상제 또는 DNA 손상 처리는 5-플루오로우라실(5-FU), 레베카마이신, 아드리아마이신, 블레오마이신, 시스플라틴, 고열, UV 조사, 감마선 조사 또는 손상을 유발하기에 충분한 다른 DNA 손상제 또는 DNA 손상 처리를 포함한다.
한 가지 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 시험 화합물을 제공하고; (b) 세포 집단을 제공하고; (c) 세포 집단에, 처리 후에 G2/M기 세포를 축적시키는 작용제를 투여하고; (d) G2/M기 세포를 축적시키는 작용제로 처리된 집단의 일부에 시험 화합물을 투여하고; (e) 시험 화합물로 처리된 집단에서 G2/M기에 있는 세포수를 측정하고; (f) G2/M기 세포를 축적시키는 작용제로만 처리된 집단에서 G2/M기에 있는 세포수를 측정하고; (g) 상기 단계 (e)에서의 세포수와 단계 (f)에서의 세포수를 비교하여 시험 화합물이 G2 세포 주기 체크포인트를 폐기시켰는 지의 여부를 측정함으로써, G2 체크포인트를 폐기시킬 수 있는 화합물을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따르면, G2/M기에 있는 세포의 축적은 G2 세포 주기 정지의 지표로서 사용된다. 하나의 구체예에서, 작용제는 DNA 손상을 유도하고, 방법은 DNA 손상 유도된 G2 체크포인트를 폐기시킬 수 있는 화합물을 스크리닝하는 데에 유용하다. 또 다른 구체예에서, DNA의 양은 각 세포의 DNA 함량을 측정함으로써 세포 주 기 스테이지를 결정하기 위해 예컨대 DNA 염색을 위한 프로피듐 요오다이드와 FACS™분석 또는 이의 등가물을 사용하는 유동 세포측정법을 이용하여 측정된다. 한 가지 구체예에서, DNA의 양은 접촉 단계 이후 약 10 내지 약 72 시간 후에 측정된다.
본 발명은 세포에 투여된 경우에 G2 체크포인트, 특히 DNA 손상 유도된 G2 체크포인트를 폐기시키고, DNA 손상 처리의 유무에 관계없이 세포를 사멸시키거나 억제하는 화합물로서, 하기 구조식을 지닌 화합물을 제공한다:
Figure 112004057309912-pct00001
상기 식에서, 두 벤젠 중 어느 하나 또는 두 벤젠 모두는 피라진, 피리미딘, 피페라진, 모르폴린, 사이클로헥산, 피페리진 또는 피리딘으로 치환될 수 있고; R1은 할로겐, 브롬(Br), 염소(Cl), 불소(F), 요오드(I), 아미노(NH2), 니트로(NO2), 하이드록시(OH), O-메틸(OCH3), 메틸(CH3) 또는 수소(H)이고, R2, R3, R4, R5 및/또는 R6은 브롬(Br), 염소(Cl), 불소(F), 요오드(I), 아미노(NH2), 니트로(NO2), 메틸(CH3), O-메틸(OCH3), 하이드록시(OH), CH(CH3)2, CHO, CHOCH 3, O(CH2)nCH3, OCO(C6H12)Cl, COOCH3 또는 수소이며; X1은 질소(NH), 산소(O) 또는 황산염(S)이고; X2는 산소(O) 또는 황산염(S)이다. 예시적 구체예는 도면, 특히 도 3 내지 도 6에 나타나 있지만, 본 발명의 화합물은 이들 구체예에 한정되지 않는다.
본 발명은 세포에 투여된 경우에 G2 체크포인트, 특히 DNA 손상 유도된 G2 체크포인트를 폐기시키고 DNA 손상 처리의 유무에 관계없이 세포를 사멸시키거나 억제하는 화합물로서, 하기 구조식을 지닌 화합물을 제공한다:
Figure 112004057309912-pct00002
상기 식에서, 두 벤젠 중 어느 하나 또는 둘 모두는 피라진, 피리미딘, 피페라진, 모르폴린, 사이클로헥산, 피페리진 또는 피리딘으로 치환될 수 있고; R1은 브롬(Br), 염소(Cl), 불소(F), 요오드(I), 아미노(NH2), 니트로(NO2), 하이드록시(OH), O-메틸(OCH3), 메틸(CH3) 또는 수소(H)이고, R2는 브롬(Br), 염소(Cl), 불소(F), 요오드(I), 아미노(NH2), 니트로(NO2), 메틸(CH3), O-메틸(OCH3 ), 하이드록시(OH), CH(CH3)2, CHO, CHOCH3, O(CH2)nCH3, OCO(C 6H12)Cl, COOCH3 또는 수소이며; X1은 질소(NH), 산소(O) 또는 황산염(S)이고; X2는 산소(O) 또는 황산염(S)이다. 예시적 구체예는 도면, 특히 도 3 내지 도 6에 나타나 있다.
본 발명은 DNA 손상 처리의 유무에 관계없이 G2 체크포인트를 폐기시키고/거나 암세포를 억제하거나 사멸시키는 화합물로서, 하기 구조식을 지닌 화합물을 제 공한다:
Figure 112004057309912-pct00003
상기 식에서, R1 내지 R6 위치에서의 다양한 분자의 치환은 생성된 화합물의 G2-체크포인트 폐기 활성에 영향을 미친다. 하기 구조-활성 관계가 결정되었다.
R1에서, 브롬(Br)은 염소(Cl), 불소(F) 또는 메틸(CH3) 보다 높은 활성을 제공한다.
R2에서, 메틸(CH3) 또는 O-메틸(OCH3)은 하이드록사이드(OH), 브롬(Br), 염화물(Cl), CH(CH3)2, CHO, CHOCH3, O(CH2)nCH3, OCO(C6H12)Cl 또는 COOCH3 또는 H 보다 높은 활성을 제공한다.
R3에서, 메틸(CH3)은 H 또는 O-메틸(OCH3) 보다 높은 활성을 제공한다.
R4에는 브롬(Br), 불소(F), 염소(Cl) 또는 H가 사용될 수 있다.
R5에는 브롬(Br), 불소(F), 염소(Cl) 또는 H가 사용될 수 있다.
R6에는 브롬(Br), 불소(F), 염소(Cl) 또는 H가 사용될 수 있다.
이상의 설명은 단지 예시한 것이며, 이에 한정되는 것은 아니다. 예시적 구체예는 도 3 내지 도 6에 나타나 있다. 당업자라면 본 명세서의 교시에 따라 추가 치환 및 활성 결정을 수행하여, 또 다른 본 발명의 화합물을 수득할 수 있다. 특정 치환이 DNA 손상 유도된 G2 체크포인트 폐기에 대해 다른 구조 보다 높은 활성을 나타내는 구조를 생성시키는 것으로 관찰되었지만, 본 발명이 모든 치환과 모든 활성 수준을 지닌 화합물을 제공한다는 것이 당업자에 의해 이해된다. 특정 구체예와 관련하여, 당업자는 특정 표적에 대한 화합물의 활성 외에도 그러한 구체예에 사용되는 화합물을 선택하는데 있어서 다수의 인자를 고려할 것이다. 당업자는 화합물의 활성, 유용성, 안정성, 합성의 용이성 또는 효율, 약학적 조성물로의 제형화에 대한 적합성, 약물성, 생체내, 생체외 또는 시험관내에서의 다른 화합물과의 상호작용, 세포 사멸 능력, 세포 성장 억제 능력, 정상 세포에 미치는 영향 및 기타 다른 활성을 고려할 것이다.
본 발명은 G2 체크포인트를 폐기시키는 화합물, 특히 DNA 손상 유도된 세포 주기 G2 체크포인트를 선택적으로 폐기시키는 화합물을 제공한다. 화합물은 암세포와 같은 G1 체크포인트 결함성 세포에서 DNA 손상 유도된 세포 주기 G2 체크포인트를 선택적으로 폐기시키고, DNA 손상제로 처리된 세포에서 DNA 손상 유도된 G2 체크포인트를 선택적으로 폐기시키는 화합물이다. 본 발명은 DNA 손상 처리에 대해 암세포를 감작시키는 화합물을 제공한다. 또한, 이종이식편 종양 성장을 단독으로 또는 항암제와 함께 억제하는 화합물이 제공된다. 본 발명은 단독으로 또는 항암제와 함께 암세포에서 시험관내 콜로니 형성을 억제하는 화합물을 제공한다. 특히, 본 발명은 DNA 손상 처리의 여부에 관계없이 G2 체크포인트를 폐기하고/하거나 암세포를 억제하거나 사멸시키는 화합물을 제공하며, 그 예로는 다음과 같은 것이 있지만 이들에 제한되지 않는다:
CBDC004: 4-클로로-벤조산 4-메톡시-페닐 에스테르
CBDC401: 4-클로로-벤조산 p-톨릴 에스테르
CBDC402: 4-브로모-벤조산 p-톨릴 에스테르
CBDC403: 3,4,5-트리플루오로-벤조산 p-톨릴 에스테르
CBDC404: 4-플루오로-벤조산 4-브로모-페닐 에스테르; 에탄과의 화합물.
CBDC405: 3,4-디클로로-벤조산 p-톨릴 에스테르; 에탄과의 화합물.
CBDC406: 2,4-디클로로-벤조산 p-톨릴 에스테르; 에탄과의 화합물.
CBDC407: 4-플루오로-벤조산 p-톨릴 에스테르; 에탄과의 화합물.
CBDC408: 2,3,4,5,6-펜타플루오로-벤조산 p-톨릴 에스테르; 에탄과의 화합물.
CBDC409: 4-클로로-벤조산 3,4-디메틸-페닐 에스테르; 에탄과의 화합물.
CBDC410: 4-클로로-벤조산 4-하이드록시-페닐 에스테르; 에탄과의 화합물.
CBDC411: 4-플루오로-벤조산 4-하이드록시-페닐 에스테르; 에탄과의 화합물.
CBDC412: 4-브로모-벤조산 4-플루오로-페닐 에스테르
CBDC413: 4-브로모-벤조산 4-트리플루오로메틸-페닐 에스테르
CBDC414: 4-브로모-벤조산 4-하이드록시-페닐 에스테르
CBDC415: 4-브로모-벤조산 4-트리플루오로메톡시-페닐 에스테르
CBDC418: 4-브로모-벤조산 6-메틸-피리딘-3-일 에스테르
CBDC440: 4-브로모-티오벤조산 O-p-톨릴 에스테르
CBDC441: 4-브로모-디티오벤조산 p-톨릴 에스테르
CBDC442: 4-브로모-티오벤조산 S-p-톨릴 에스테르
이들 화합물의 구조는 도 3 내지 6 및 청구의 범위에 제공되어 있다.
본 발명은 DNA 손상 유도된 세포 주기 체크포인트를 선택적으로 폐기시키는 조성물을 제공한다. 한 가지 구체예에서, 화합물 CBDC402는 하기 실시예 1에 기술된 바와 같이 G1 체크포인트 결함성 암세포에서 DNA 손상 유도된 세포 주기 G2 체크포인트를 선택적으로 폐기시켰다. 항암제로서 사용되는 DNA 손상제인 블레오마이신으로 쥬르카트 세포(인간 T 세포 백혈병 유래 세포주)를 처리하면 G2/M기 세포의 축적이 나타났는데, 이는 블레오마이신 유도된 DNA 손상으로 인한 G2 세포 주기 정지를 나타낸다. CBDC402는 용량 의존적 방식으로 G2/M 세포의 블레오마이신 유도된 축적을 폐기시켰다(도 1). 콜히친은 G2 세포 주기 정지를 유도하지 못하며, 다른 구체예에서 CBDC402는 모든 CBDC402 농도에서 콜히친에 의해 유도되는 G2/M기 세포의 축적을 억제하지 못했다(도 2). 따라서, CBDC402는 DNA 손상 유도된 세포 주기 체크포인트를 선택적으로 폐기시켰다.
본 발명은 세포에 투여된 경우에 DNA 손상 유도된 G2 체크포인트를 폐기시키는 조성물을 제공한다. 다양한 구체예에서, 화합물 CBDC004, CBDC402, CBDC403, CBDC404, CBDC405, CBDC406, CBDC407, CBDC408, CBDC409, CBDC410 및 CBDC411은 블레오마이신 처리된 쥬르카트 세포의 G2 세포 주기 체크포인트를 용량 의존적 방식으로 폐기시켰다(도 3a). 각종 CBDC 화합물에 의한 G2 체크포인트 폐기에 대한 용량 반응 곡선은 CBDC402가 이러한 구체예에서 최대 활성을 보이며, 시험된 모든 CBDC 화합물이 최고 농도(50㎍/ml)에서 G2 세포 주기 체크포인트를 폐기시킬 수 있 음을 보여주었다. 다양한 활성 수준에 상응하는 구조는 도 3b에 도시되어 있고; 도 3b에 개시된 구조에 상응하는 CBDC 표시는 도 4를 참조할 수 있다.
본 발명의 방법은 다양한 G2 체크포인트 폐기 활성을 가진 조성물을 제공하며, 또한 이러한 활성을 측정하는 방법을 제공한다. 추가의 구체예에서, CBDC 화합물이 G2 체크포인트 폐기 활성에 대해 측정되었다. 도 5에 도시한 바와 같이 CBDC 화합물은 높은 활성; 중간 활성; 활성; 약한 활성; 및 비활성으로 분류되었다. 쥬르카트 세포에서 G2 체크포인트 폐기의 IC50은 상기 활성에 대해 기술한 바와 같이 수행된 용량 반응 실험에 의해 측정되고 도 6에 도시한 바와 같이 이들의 활성에 따라 분류되었다. 도 5와 도 6에는, CBDC 화합물이 이들의 화학 구조를 개시함으로써 완전히 개시되어 있고, 일부의 경우에 CBDC 화합물은 CBDC 지정 번호에 의해 추가로 확인된다.
본 발명은 각종 DNA 손상제에 의해 유도된 DNA 손상 유도된 G2 체크포인트를 폐기시키는 조성물을 제공한다. 하나의 구체예에서, 화합물 CBDC004는 각종 항암제에 의해 활성화된 DNA 손상 유도된 G2 체크포인트를 폐기시켰다. 인간 암세포(HCT116 인간 결장 암종 세포)를 화합물 CBDC004 유무에 관계없이 블레오마이신, 아드리아마이신, 캄프토테신 또는 시스플라틴(CDDP)으로 처리하였다. 이들 항암제 각각은 세포 주기 G2/M의 세포를 축적시켰고, CBDC004와 공동인큐베이션한 경우에는 G2/M기에 있는 세포수가 감소하였는 바, 이는 CBDC004가 블레오마이신, 아드리아마이신, 캄프토테신 또는 시스플라틴에 의해 활성화된 DNA 손상 유도된 G2 체크포인트를 폐기시켰음을 나타낸다.
본 발명은 DNA 손상 처리에 대해 세포를 감작시키는 조성물 및 방법을 제공한다. 또 다른 구체예에서, CBDC004는 항암제로서 사용된 각종 DNA 손상 처리의 세포독성 효과에 대해 인간 세포를 감작시켰다. 인간 암 세포(HCT116 세포)가 CBDC004의 존재 여부에 관계없이 블레오마이신, 아드리아마이신, 캄프토테신 또는 시스플라틴으로 처리되고, 처리 후 사멸된 세포수가 측정되었다. CBDC004는 각각의 DNA 손상 처리의 세포독성 효과에 대해 세포를 감작시켰다(도 8). 세포에 본 발명의 화합물이 투여되면 DNA 손상 처리에 대해 세포를 감작시켜서, DNA 손상 처리가 보다 효과적이 되게 한다.
본 발명은 이종이식편 종양의 성장을 억제하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 또 다른 구체예에서, CBDC402는 이종이식편 종양의 성장을 억제했다. HCT-116 인간 결장 암종 세포가 중증 복합 면역결핍증(SCID) 마우스에 피하 이식된 후, 각종 화합물이 투여되고 종양 성장이 모니터되었다. CBDC402 단독은 종양 성장을 약간 감소시켰고, CBDC402와 CPT-11(CAMPTOSAR??, Irinotecan, 토포이소머라제 억제제) 조합은 종양 성장을 유의적으로 감소시키거나 억제하였다.
본 발명은 증식 장애를 지닌 세포를 치료하는 조성물 및 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 시험관내에서 암세포에 의한 콜로니 형성을 억제하는 것을 비롯하여, 증식 장애를 지닌 세포의 다양한 양태를 억제하는 화합물 및 방법을 제공한다. 본 발명의 화합물은 단독으로 또는 항암제와의 조합물로서 시험관내에서 암세포에 의한 콜로니 형성을 억제했다. 하나의 구체예에서, 인간 위암 유래의 세포주로부터의 MK-45 세포를 다중웰 평판에 시딩하고, CBDC402, CBDC412, CBDC413 및 CBDC418로 처리하였다. CBDC402 단독 처리는 MK-45 세포에 의한 콜로니 형성을 유의적으로 억제하였고, CBDC412 처리는 콜로니 형성을 약간 억제하였다. CPT-11을 추가로 포함하는 구체예에서, CBDC402 첨가는 CPT-11의 효과를 증강시켜서, 콜로니 형성을 거의 완벽하게 억제하는 것으로 나타났다.
본 발명은 M 체크포인트에 영향을 미침이 없이 DNA 손상 유도된 G2 체크포인트를 선택적으로 폐기시키는 조성물 및 방법을 제공한다. 하나의 구체예에서, CBDC402는 DNA 손상 유도된 G2 체크포인트를 선택적으로 폐기시킨다. 블레오마이신은 G2기에 있는 활성화된 정상 T세포의 축적을 중간 정도로 증가시켰고(도 10a), G2기에 있는 쥬르카트 세포(백혈병 T 세포)는 다량으로 축적시켰다(도 10b). CBDC는 두 세포주 모두에서 블레오마이신 유도된 G2기 세포의 증가를 폐기시켰다(도 10a, 도 10b). 수용된 활성화된 정상 T 세포가 콜히친으로 처리된 경우, M기 세포의 축적이 일어났고, CBDC402는 콜히친 유도된 M기의 활성화된 정상 T 세포의 증가에 영향을 미치지 않았다. 이러한 구체예는 CBDC402가 M기 체크포인트가 아닌 G2 세포 주기 체크포인트를 선택적으로 폐기시킴을 입증하는 것이다.
본 발명은 본 발명의 화합물을 합성하는 방법을 제공한다. 하나의 구체예에서, CBDC 412(4-브로모-벤조산 4-플루오로-페닐 에스테르)는 다음과 같이 합성된다. 하나의 구체예로서, 디옥산 10ml, 4-브로모-벤조산 클로린 5mmol(1.1g) 및 4-플루오로-페놀 5mmol(0.56g)을 순서대로 50ml 4구 플라스크에 첨가하고 실온에서 용해시켰다. 이 용액에 디옥산에 용해시킨 트리에틸아민을 서서히 적가하고, 용액을 실온에서 3시간 동안 교반했다. 침전된 결정을 여과하고 벤젠으로 추출했다. 추출된 용액을 탄산수소나트륨으로 여러 차례 세척하고 마그네슘 무수물을 첨가한 뒤, 생성된 용액을 건조시키고 여과했다. 용액을 저압하에 증류시키고 결정화하였다. 미정제 결정은 황색을 띤 백색으로서 중량은 1.37g이었다. 이 결정의 일부(0.5g)를 벤젠에 용해하고 실리카겔 100g으로 정제했다. 정제된 산물은 백색이었고, 순도는 액체크로마토그래피(LC)에 의해 99.93%로 확인되었다. 구조는 NMR로 확인하였다(실시예 6 참조).
스크리닝
본 발명은 G2 체크포인트를 억제하거나 폐기시킬 수 있는 잠재적인 치료 화합물("시험 화합물" 또는 "후보 화합물")을 스크리닝하는 조성물 및 방법을 제공한다. 스크리닝에 사용될 수 있는 검정 포맷은 널리 공지되어 있다. 결합 검정을 위한 다양한 포맷의 일반적인 설명은 다음과 같은 문헌을 참조할 수 있다: BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY, 7th Ed., Stiles and Terr, eds.(1991); ENZYME IMMUNOASSAY, Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida(1980); and "Practice and Theory of Enzyme Immunoassays" in Tijssen, LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY, Elsevier Science Publishers, B.V. Amsterdam(1985).
표적
치료에 적당한 피검체는 현재 증식 장애 또는 분화 장애의 치료(예, 항암 치 료)를 받고 있거나 그 치료의 후보인 피검체를 포함한다. 또 다른 후보 피검체는, 예컨대 세포 증식 장애가 발생할 위험이 있는 피검체를 포함한다. 따라서, 본 발명의 방법은 세포 증식 장애가 발생할 위험이 있으나, 장애의 명백한 증상은 아직 보이지 않는 피검체의 치료에도 적용할 수 있다. 위험 피검체는 세포 증식 장애를 발생시킬 유전적 소인을 갖고 있거나 가족력이 있는 것으로 확인될 수 있다. 예를 들어, 활성화된 종양유전자를 지니거나 종양 억제 유전자의 변이 또는 결실이 있는 피검체는 후보 피검체이다. 따라서, 위험 피검체는 유전자 병변의 존재에 대한 통상적인 유전자 스크리닝을 사용하여 확인되거나 피검체의 가족력의 조사를 통해 장애의 위험이 있는 지를 확인할 수 있다. 위험 피검체의 구체예는 가족력이 있거나 신생물 또는 약물 내성 신생물 세포가 CD40을 발현하는 암에 대한 소인을 나타내는 다른 유전자 특성이 있는 피검체일 수 있다. 유전 질환의 구체예로는 Rb 종양 억제인자 유전자의 결함이 원인인 망막모세포종이 있다.
일반적으로, "유효량" 또는 "충분량"의 본 발명의 화합물이 투여되는데, 여기서 이러한 양은 원하는 효과를 생성시키기에 충분한 양이다. 따라서, 유효량은 증식성 세포를 포함하는 세포의 적어도 일부(예컨대, 표적 세포의 적어도 일부)에 대한 세포 증식의 감소, 세포수 감소, 증식 증가의 억제, 세포수 증가 억제, 아폽토시스 증가, 또는 생존율 감소 중의 1가지 이상을 측정함으로써 결정된다. 따라서, 예를 들어 세포 증식 억제를 원하는 경우에, 유효량은 세포 증식이나 증식성 세포의 수를 검출가능할 정도로 감소시키거나, 세포 아폽토시스를 증가시키거나 세포 생존율을 감소시키는 양이다. 따라서, 이러한 양은 표적 세포수 감소, 표적 세 포수 안정화 또는 표적 세포수 증가의 억제를 수행하기에 충분할 수 있다. 예를 들어, 장애가 고형 종양을 포함하는 경우, 종양의 적어도 일부의 종양 크기 감소, 종양 크기 안정화 또는 종양 추가 성장의 억제(예컨대, 종양 질량을 구성하는 세포의 5 내지 10% 또는 10 내지 20% 이상의 성장 억제)가 만족스러운 임상적 결과이다. 장애가 액체암을 포함하는 경우, 종양 세포의 적어도 서브집단(subpopulation) 중의 종양 세포수의 감소, 종양 세포수의 안정화 또는 종양 세포수 추가 증가의 억제(예, 세포의 5 내지 10% 또는 10 내지 20% 이상의 억제)는 만족스러운 임상적 결과이다.
또한, 유효한 것으로 간주되는 양은 질환 또는 장애의 진행을 방해하거나 억제할 수 있다. 예를 들어, 특정 종양은 진행함에 따라 전이성 형태로 진행하는 것을 비롯하여 점차 공격성이 된다. 따라서, 또한 유효한 것으로 간주되는 양은 종양이 점차 공격성이 되거나 전이성이 되지 않도록 할 것이다. 따라서, 장애 또는 질환이 악화되지 않도록 억제하거나 방해하는 것, 즉 질환을 안정화시키는 것이 또 다른 만족스러운 임상적 결과이다.
액체암을 함유하는 생물 시료(예, 혈액 또는 조직 시료)의 검사는 종양 세포 질량 또는 수가 감소하거나 종양 세포 증식의 억제가 일어나는 지를 입증할 수 있다. 고형암의 경우에는 침습 및 비침습 영상 방법을 이용하여 종양 크기의 감소 또는 종양 크기의 증가 억제를 확인할 수 있다. 수용체 양성 종양의 수용체 수의 감소는 종양 세포 증식의 감소 또는 억제를 평가하는데 사용될 수 있다. 호르몬 생산 종양, 예컨대 유방암, 고환암 또는 난소암의 호르몬 양은 종양 증식의 억제 또는 감소를 평가하는데 사용할 수 있다.
또한, 유효량은 장애 또는 질환과 관련 있는 증상의 정도 또는 빈도를 주관적 또는 객관적으로 감소 또는 저하시킬 수 있다. 예를 들면, 통증, 구토 또는 다른 불편을 감소시키거나 또는 식욕이나 주관적 행복을 증가시키는 본 발명의 화합물의 양은 만족스러운 임상적 결과이다.
유효량은 또한 또 다른 프로토콜을 이용한 치료의 양(예, 투여량) 또는 빈도를 감소시키는 것을 포함하며, 이 또한 만족스러운 임상적 결과로 간주된다. 예를 들어, 본 발명의 화합물로 치료한 암환자는 암세포 증식 억제를 위한 핵산 손상 처리를 보다 적게 필요로 할 수 있다. 이러한 예에서, 유효량은 피검체에게 투여되는 핵산 손상제의 투여 횟수 또는 양을, 본 발명의 화합물로 처리함이 없이 투여되는 투여 횟수 또는 양에 비해 감소시키는 양을 포함한다.
피검체의 질환이나 치료 이익을 개선시키는 본 발명의 방법은 기간은 비교적 짧거나 (예를 들어, 개선이 수시간, 수일 또는 수주간 지속될 수 있음) 장시간, 예컨대 수개월이나 수 년에 걸쳐 연장될수 있다. 유효량은 질환이나 장애의 임의의 또는 모든 증상을 완전히 제거할 정도일 필요는 없다. 따라서, 단기간이나 장기간 동안 앞서 설명한 기준 또는 상기 장애나 질환의 상태 측정에 적당한 당해 기술분야에 공지된 다른 기준 중 어느 하나를 사용하여 측정했을 때 피검체 질환의 주관적 또는 객관적 개선이 있을 때 유효량의 만족스러운 임상적 결과가 달성된다. 본 명세서에 기술되거나 당해 기술분야에 공지된 바와 같은, 1 이상의 이로운 효과를 제공하는 유효량은 피검체 질환의 "개선" 또는 피검체에 "치료적 이익"으로 언급된 다.
본 발명에 따른 화합물의 유효량은 동물 연구 또는 경우에 따라 인간 임상 시험을 기초로 하여 측정할 수 있다. 당업자라면, 각종 요인에 따라 특정 피검체의 치료에 필요한 투여량과 시간이 달라질 수 있음을 잘 알고 있을 것이며, 그 예로는 피검체의 전반적 건강, 연령 또는 성별, 장애나 질환의 정도 또는 단계, 치료 이력, 바람직하지 않은 부작용에 대한 민감성, 원하는 임상적 결과 및 다른 질환이나 증상의 존재 등이 있다. 이러한 요인들은 치료적 이익을 얻기에 충분한 양을 제공하는데 필요한 투여량과 시간에 영향을 미칠 수 있다. 투여량 요법은 또한 약동학, 즉 약학적 조성물의 흡수 속도, 생체이용률, 대사 및 제거 등을 고려하여 결정한다. 또한, 용량이나 치료 프로토콜은 특별하게 피검체에 맞추거나 파마코제노믹(pharmacogenomic) 데이터에 기초하여 변형될 수 있다.
본 발명의 화합물로 치료될 수 있는 세포에는 시험관내, 생체외 또는 생체내에서 증식의 억제 또는 방해를 필요로 하는 모든 세포가 포함된다. 특정 표적 세포는 정상 세포 주기 G1 체크포인트 시간 보다 짧은 체크포인트 시간을 나타내거나 세포 주기 G1 체크포인트가 손상되어 핵산이 완전하게 복구되는데 충분한 시간이 지나기 전에 G1 체크포인트를 통과한다. 또한, 후보 세포는 시험 세포를 오로지 본 발명의 화합물과 접촉시키거나 DNA 손상 처리와 함께 접촉시키고, 접촉된 세포가 증식 감소 또는 세포 사멸 증가, 특히 아폽토시스 또는 유사분열 대변동을 나타내는지를 측정하여 확인될 수 있다.
따라서, 본 발명의 화합물은 시험관내, 생체외 및 생체내에서 세포 증식을 억제하는데 유용하다. 따라서, 비정상적이거나 바람직하지 않거나 원하지 않는 세포 증식 또는 세포 생존이나, 또는 비정상적 또는 결함성 세포 분화를 특징으로 하는 장애 또는 생리적 질환이 있거나 이에 걸릴 위험이 있는 피검체는 본 발명의 화합물 단독으로 치료되거나 또는 DNA 손상을 직접 또는 간접적으로 유발하는 치료나 증식억제 치료와 함께 본 발명의 화합물을 사용하여 치료될 수 있다.
따라서, 본 발명에 따르면, 세포 증식의 억제 방법, DNA 손상제 또는 DNA 손상 처리에 대해 세포의 감작성을 증가시키는 방법 및 시험관내, 생체외 및 생체내에서 세포에 대한 핵산 손상을 증가시키는 방법을 제공한다. 하나의 구체예에서, 방법은 세포(예, 배양된 세포 또는 피검체 내에 존재하는 세포)를 G2 체크포인트를 폐기시키기에 충분한 양의 본 발명의 화합물과 접촉시키는 것을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 방법은 DNA 손상제 또는 DNA 손상 처리에 대해 상기 세포의 감작성을 증가시키기에 충분한 양의 본 발명의 화합물과 상기 세포를 접촉시키는 것을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 방법은 세포의 핵산 손상을 증가시키기에 충분한 양의 본 발명의 화합물과 상기 세포를 접촉시키는 것을 포함한다. 다양한 양태에서, 방법은 추가로 세포를 DNA 손상제와 접촉시키거나 세포를 DNA 손상 처리에 노출시키는 것을 포함한다.
또한, 바람직하지 않거나 원하지 않는 세포 증식이나 세포 생존을 특징으로 하는 질환, 결함성 또는 비정상적 아폽토시스를 특징으로 하는 질환, 비정상적 또는 결함성 세포 생존을 특징으로 하는 질환, 및 비정상적 또는 결함성 세포 분화를 특징으로 하는 질환을 비롯한 피검체의 세포 증식 장애 또는 분화 장애를 치료하는 방법이 제공된다. 하나의 구체예로서, 방법은 세포 증식 장애가 있거나 있을 위험이 있는 피검체에게, 세포 증식 질환 장애 치료에 유효한 양의 본 발명의 화합물을 투여하는 것을 포함한다. 한 가지 양태에서, 상기 양은 피검체의 질환을 개선시키기에 충분하다. 특정 양태에서, 개선은 표적 세포(예컨대, 비정상적 증식 세포)의 적어도 일부에서의 세포 증식 감소, 세포수 감소, 세포수 증가의 억제, 아폽토시스 증가 또는 생존율 감소를 포함한다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 화합물은 세포 증식을 억제하는 치료 이전이나, 이 치료와 동시에 또는 이 치료 이후에 피검체에게 투여된다. 또 다른 특정 양태에서, 세포 증식 장애가 있는 세포의 적어도 일부는 혈액, 유방, 폐, 갑상선, 두경부, 뇌, 림프, 위장관, 비뇨관, 신장, 췌장, 간, 골, 근육 또는 피부에 위치한다.
또 다른 구체예에서, 방법은 고형암을 치료하기 위해 피검체에게 일정량의 본 발명의 화합물을 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 방법은 액체암을 치료하기 위해 피검체에게 일정량의 본 발명의 화합물을 투여하는 것을 포함한다. 다양한 양태에서, 종양이 있는 피검체에 대한 본 발명의 화합물의 투여는 다른 항암 치료 이전이나, 다른 항암 치료와 동시에 또는 다른 항암 치료 이후에 수행되다.
증식 장애 또는 분화 장애를 치료하기 위한 본 발명의 화합물의 용도
본 명세서에 제시한 조성물과 방법을 이용하여 치료하기 쉬운 증식 또는 분화 장애에는 비정상적이거나 바람직하지 않은 세포수, 세포 성장 또는 세포 생존을 특징으로 하는 양성 및 신생물성인 질병 및 비병리적 생리 질환이 포함된다. 따라 서, 이러한 장애 또는 질환은 질환 상태를 구성하고 모든 종류의 암성 성장이나 종양유전자 프로세스, 전이 조직이나 악성으로 형질전환된 세포, 조직 또는 기관을 포함하거나, 비병리적, 즉 전형적으로 질환과 관련은 없으나 정상에서 일탈된 것 일 수 있다. 본 발명에 따라 치료될 수 있는 비병리적 질환의 특정 예는 흉터를 남기는 상처 복구로부터의 조직 재성장이다.
증식 또는 분화 장애를 포함하는 세포는 세포 덩어리로 응집하거나 분산될 수 있다. "고형 종양"이란 용어는 일반적으로 함께 응집하여 덩어리를 형성하는 신생물이나 전이물을 의미한다. 특정 예로는 내장 종양, 예컨대 위암이나 결장암, 간암, 정맥 암종, 폐 및 뇌종양/암이 있다. "액체 종양"은 조혈계의 신생물, 예컨대 림프종, 골수종 및 백혈병, 또는 사실상 확산성인 신생물을 의미하는데, 이는 전형적으로 고형 덩어리를 형성하지 않기 때문이다. 백혈병의 특정 예로는 급성 및 만성 림프모세포 골수종, 골수모세포 골수종 및 다발성 골수종이 있다.
이러한 장애는 사실상 임의의 세포 또는 조직 유형에 영향을 미칠 수 있는 신생물이나 암, 예컨대 암종, 육종, 흑색종, 전이암이나 조혈성 신생물 질환을 포함한다. 전이성 종양은 유방, 폐, 갑상선, 두경부, 뇌, 림프, 위장(입, 식도, 위, 소장, 결장, 직장), 비뇨관(자궁, 난소, 경부, 방광, 고환, 음경, 전립선), 신장, 췌장, 간, 골, 근육 또는 피부를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다수의 원발성 종양 유형으로부터 유발될 수 있다.
암종은 상피 또는 내분비 조직의 악성 종양을 의미하는 것으로서, 그 예로는 호흡기계 암종, 위장계 암종, 비뇨계 암종, 고환 암종, 유방 암종, 전립선 암종, 내분비계 암종 및 흑색종이 있다. 예시적 암종으로는 경부, 폐, 전립선, 유방, 두경부, 결장, 간 및 난소에서 형성되는 암종을 포함한다. 암종이란 용어는 또한 예컨대 암종성 및 육종성 조직으로 이루어진 악성 종양을 포함하는 암육종을 포함한다. 샘암종은 샘 조직의 암종 또는 종양이 샘 유사 구조를 형성하는 샘 조직을 포함한다.
육종은 중간엽 세포 기원의 악성 종양을 의미한다. 육종의 예로는 림프육종, 지방육종, 골육종 및 섬유육종이 있다.
본 명세서에 사용된 "조혈성 증식 장애"란 용어는 조혈세포 기원, 예컨대 골수, 림프 또는 적혈구 계통이나 이의 전구 세포 유래의 과다형성/신생물 세포를 수반하는 질병을 의미한다. 전형적으로, 이 질병은 불량하게 분화된 급성 백혈병, 예컨대 적혈구모세포 백혈병 및 급성 거대핵모세포 백혈병에서 유래한다. 골수 질환의 다른 예로는 비제한적으로 풋골수세포 백혈병(APML), 급성 골수 백혈병(AML) 및 만성 골수 백혈병(CML)을 포함하고, 림프 악성 종양의 예로는 비제한적으로 B 계통의 급성 림프모세포 백혈병(ALL)과 T 계통의 ALL을 비롯한 급성 림프모세포 백혈병, 만성 림프구 백혈병(CLL), 프로림프구 백혈병(PLL), 유모 세포 백혈병(HLL) 및 왈덴스트롬 거대글로불린혈증(WM)을 포함한다. 또 다른 악성 림프종으로는 비호지킨 림프종 및 이의 변종, 말초 T 세포 림프종, 성체 T 세포 백혈병/림프종(ATL), 피부 T 세포 림프종(CTCL), 대형 과립 림프구 백혈병(LGF), 호지킨 질병 및 리드-스턴버그(Reed-Sternberg) 질병이 있지만, 이에 국한되는 것은 아니다.
본 발명의 화합물과 함께 사용할 수 있는 치료로는 본 명세서에 개시되거나 당해 기술분야에 공지된 모든 증식억제 치료, DNA 손상 처리 또는 항암 치료를 포함한다. 예를 들어, 세포 증식억제 치료 또는 항암 치료는 방사선 치료 또는 외과적 절제와 함께 경우에 따라 약물 치료를 포함할 수 있다. 이러한 치료는 방사성동위원소와 같은 화학 물질이나, 화학치료제와 같은 약물의 투여 또는 항종양유전자(예, Rb, DCC, p53 등), 주요 음성 종양유전자 또는 종양유전자에 대한 안티센스 등을 이용한 유전자 요법을 포함할 수 있다. 본 발명의 화합물은 다른 치료 요법 이전에 또는 다른 치료 요법과 동시에 또는 다른 치료 요법 이후에 투여될 수 있다. 예를 들어, 세포증식 억제 치료(예, 방사선요법, 화학요법, 유전자요법, 외과적 절제 등)의 후보 피검체는 세포증식 억제 치료를 개시하기 전에 본 발명에 따른 화합물을 투여받을 수 있다. 따라서, 예방적 치료법이 제공된다.
조합 화학 라이브러리
조합 화학 라이브러리는 G2 세포 주기 정지 체크포인트를 억제하거나 폐기시키는 화합물과 같은 새로운 화학적 화합물의 생성에 보조적 역할을 하는 하나의 수단이다. 조합 화학 라이브러리는 시약과 같은 다수의 화학적 "빌딩 블록(building block)"을 조합하여 화학적 합성이나 생물학적 합성 중 어느 하나의 방식으로 제조된 다양한 화합물의 집합체이다. 예를 들어, 폴리펩타이드 라이브러리와 같은 선형 조합 화학 라이브러리는 아미노산으로 불리는 일군의 화학적 빌딩 블록을 소정의 화합물 길이(즉, 폴리펩타이드 화합물을 형성하는 아미노산의 수)로 가능한 모든 방식으로 조합함으로써 형성된다. 이와 같은 화학적 빌딩 블록의 조합 혼합을 사용하면 수백만 개의 화합물이 합성될 수 있다. 예를 들어, 100가지의 상호교환가능한 화학적 빌딩 블록을 가지고 체계적으로 조합 혼합하는 경우, 이론적 합성 결과는 100x106개의 4량체 화합물 또는 10x108개의 5량체 화합물이 얻어진다. 이와 같은 조합 화학 라이브러리의 제조와 스크리닝은 당해 기술분야에, 예컨대 미국 특허 제6,004,617호 및 제5,985,356호에 공지되어 있다. 이와 같은 조합 화학 라이브러리에는 펩타이드 라이브러리(예컨대, 미국 특허 제5,010,175호; Furka(1991) Int.J.Pept.Res., 37:487-493, Houghton et al.(1991) Nature, 354:84-88 참조)가 있지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 화학적 다양성 라이브러리의 제조에 유용한 다른 화학으로는 펩토이드(예, WO91/19735), 엔코딩된 펩타이드(예, WO93/20242), 랜덤 바이오 올리고머(예, WO92/00091), 벤조디아제핀(예, 미국 특허 제5,288,514호), 다이버소머(diversomer), 예컨대 하이단토인, 벤조디아제핀 및 디펩타이드(예, Hobbs(1993) Proc.Nat.Acad.Sci. USA 90:6909-6913), 비닐위치 폴리펩타이드(예, Hagihara(1992) J.Amer.Chem.Sci. 114:6568), 베타 D 글루코스 골격을 보유한 비펩타이드성 펩타이드모방체(예, Hirschmann(1992) J.Amer.Chem.Soc. 114:9217-9218), 소형 화합물 라이브러리의 유사 유기 합성(예, Chen(1994) J. Amer. Chem. Soc. 116:2661), 올리고카르바메이트(예, Cho(1993) Science 261:1303) 및/또는 펩타이드 포스폰산염(예, Campbell(1994) J.Org.Chem. 59:658)이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 또한, [Gordon(1994) J.Med.Chem. 37:1385]을 참조하고; 핵산 라이브러리, 펩타이드 핵산 라이브러리에 대해서는 미국 특허 제5,539,083호 등을 참조하며; 항체 라이브러리에 대해서는 [Vaughn(1996) Nature Biotechnology 14:309-314]를 참조하고; 탄수화물 라이브러리에 대해서는 [Liang et al.(1996) Science 274:1520-1522], 미국 특허 제5,569,853호를 참조하며; 소형 유기 분자 라이브러리에 대해서는 예컨대 이소프레노이드의 경우 미국 특허 제5,569,588호를 참조하고; 티아졸리디논(thiazolidinone) 및 메타티아자논(metathiazanone)에 대해서는 미국 특허 제5,549,974호를 참조하고; 피롤리딘에 대해서는 미국 특허 제5,525,735호 및 제5,519,134호를 참조하고; 모르폴리노 화합물에 대해서는 미국 특허 제5,506,337호를 참조하고; 벤조디아제핀에 대해서는 미국 특허 제5,288,514호를 참조할 수 있다.
조합 라이브러리의 제조 장치는 시판되고 있다(예, 미국 특허 제6,045,755호; 제5,792,431호; 357MPS, 390MPS, Advanced Chem Tech, Luisville KY, Symphony, Rainin, Woburn, MA, 433A Applied Biosystems, Foster City, CA, 9050 Plus, Millipore, Bedford, MA). 또한, 용액상 화합물에 대한 다수의 로봇식 시스템이 개발되어 있다. 이러한 시스템으로는 자동 워크스테이션, 예컨대 다케다 케미칼 인더스트리스, 엘티디(Osaka, Japan)에서 개발한 자동 합성 장치 및 화학자에 의해 수행되는 수동 합성 조작과 유사한 로봇의 팔을 이용하는 다수의 로봇식 시스템(Zymate II, Zymark Corporation, Hopkinton, Mass.; Orca, Hewlett Packard, Palo Alto, Calif.)이 있다. 이와 같은 장치는 모두 본 발명에 사용하기에 적합하다. 이러한 장치를 본 명세서에서 논의한 바와 같이 작동할 수 있도록 성질 및 성능을 변형시키는 작업(필요한 경우)은 관련 기술분야의 숙련된 자에게는 명백한 것이다. 또한, 수많은 조합 라이브러리는 그 자체로 시판되고 있다(예, ComGenex, Princeton, N.J., Asinex, Moscow, Ru, Tripos, Inc., St.Louis, MO, ChemStar, Ltd, Moscow, RU, 3D Pharmaceuticals, Exton, PA, Partek Biosciences, Columbia, MD, 등).
약학적 조성물의 제형화 및 투여
하나의 구체예로서, 본 발명의 화합물은 약리학적 조성물로 만들기 위하여 약학적으로 허용되는 담체(부형제)와 배합된다. 약학적으로 허용되는 담체는 본 발명에 따른 약학적 조성물의 흡수율이나 제거율을, 예컨대 안정화하거나 증가시키거나 감소시키는 작용을 하는 생리학적으로 허용되는 화합물을 함유할 수 있다. 생리학적으로 허용되는 화합물은 예컨대, 글루코스, 슈크로스 또는 덱스트란과 같은 탄수화물, 아스코르브산이나 글루타치온과 같은 항산화제, 킬레이트화제, 저분자량 단백질, 화합물의 제거 또는 가수분해를 감소시키는 조성물, 부형제 또는 다른 안정화제 및/또는 완충제를 포함할 수 있다. 또한, 리포좀 담체를 비롯한 약학적 조성물의 흡수를 안정화, 증가 또는 감소시키기 위한 세정제가 사용될 수 있다. 본 명세서에 개시한 바와 같은 화합물에 대한 약학적으로 허용되는 담체 및 제형화는 당업자에게 공지된 것이며, 학술 문헌과 특허 문헌에 상세하게 설명되어 있다(참조: 최신판 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania("Remington's")).
다른 생리적 허용성 화합물에는 습윤화제, 유화제, 분산제 또는 미생물의 성장이나 작용을 차단하는데 특히 유용한 방부제가 있다. 각종 방부제가 공지되어 있고, 그 예로는 페놀과 아스코르브산이 있다. 당업자라면 생리적으로 허용되는 화합 물을 비롯한 약학적으로 허용되는 담체의 선택이 예를 들어 본 발명의 화합물의 투여 경로 및 이의 물리화학적 특성에 좌우된다는 것을 인식할 것이다.
하나의 구체예에서, 1종 이상의 본 발명의 화합물의 용액은 약학적으로 허용되는 담체, 예컨대 조성물이 수용성인 경우에는 수성 담체에 용해된다. 장이나, 비경구 또는 경점막을 통한 약물 전달용 제형에 사용될 수 있는 수용액의 예로는 물, 식염수, 인산염 완충 식염수, 행크 용액, 링거액, 덱스트로스/식염수, 글루코스 용액 등이 있다. 제형은 생리적 조건과 유사하게 만드는데 필요한 약학적으로 허용되는 보조 물질, 예컨대 완충제, 긴장 조정제, 습윤제, 세정제 등을 포함할 수 있다. 또한, 첨가제는 추가의 활성 성분, 예컨대 살균제, 또는 안정화제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 용액은 아세트산나트륨, 젖산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 소르비탄 모노라우레이트 또는 트리에탄올아민 올레이트를 함유할 수 있다. 이러한 조성물은 통상의 널리 공지된 멸균 기법으로 멸균되거나 멸균 여과될 수 있다. 생성된 수용액은 그대로 패키징되거나 동결 건조되며, 동결 건조된 제제는 투여 전에 멸균 수용액과 혼합된다. 이러한 제형 중의 펩타이드의 농도는 매우 다양할 수 있으며, 선택한 특정 투여 방식과 환자의 요구에 따라 주로 유체 부피, 점도, 체중 등에 기초하여 선택된다.
고체 제형은 장(경구) 투여용으로 사용될 수 있다. 이 제형은 예컨대 환제, 정제, 산제 또는 캡슐로서 제형화할 수 있다. 고체 조성물의 경우에, 통상적인 비독성 고체 담체로는 예컨대 약학적 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 스테아르산마그네슘, 사카린나트륨, 탈컴, 셀룰로스, 글루코스, 슈크로스, 탄산마그네슘 등이 사 용될 수 있다. 경구 투여 시, 약학적으로 허용되는 비독성 조성물은 전술한 담체와 같은 통상 사용되는 부형제 중 어느 하나와 일반적으로 10% 내지 95%의 활성 성분(예, 펩타이드)을 혼합하여 형성된다. 비고체 제형 역시 장 투여용으로 사용될 수 있다. 담체는 페트롤리움, 동물이나 식물 또는 합성 기원의 오일, 예컨대 땅콩유, 대두유, 광유, 참깨유 등을 비롯하여 각종 오일 중에서 선택될 수 있다. 적합한 약학적 부형제로는, 예컨대 전분, 셀룰로스, 탈컴, 글루코스, 락토스, 슈크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 초크, 실리카겔, 스테아르산마그네슘, 스테아르산나트륨, 글리세롤 모노스테아레이트, 염화나트륨, 탈지분유, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 물, 에탄올 등이 있다.
본 발명의 화합물은 경구 투여 시 소화로부터 보호받을 수 있다. 이것은, 본 발명의 화합물을 산 및 효소적 가수분해에 대해 내성을 부여하는 조성물과 결합시키거나 펩타이드나 복합체를 리포좀과 같은 적당한 내성 담체에 패키징하여 수행할 수 있다. 소화로부터 화합물을 보호하는 수단은 당해 기술분야에 공지되어 있고, 예컨대 [Fix(1996) Pharm Res. 13:1760-1764; Samanen(1996) J.Pharm.Pharmacol. 48:119-135]; 미국 특허 제5,391,377호(치료제의 경구 전달을 위한 지질 조성물을 개시함(리포좀 전달은 이하에 보다 상세히 설명함))를 참조할 수 있다.
전신 투여는 또한 경점막 또는 경피 수단을 통해 수행될 수 있다. 경점막 또는 경피 투여의 경우에는 장벽 침투에 적당한 침투제를 제형에 사용될 수 있다. 이러한 침투제는 당해 기술분야에 공지되어 있으며, 그 예로는 경점막 투여용으로서 담즙염과 후시드산 유도체가 있다. 또한, 침투를 용이하게 하기 위해 세정제가 사 용될 수 있다. 경점막 투여는 코 분무를 통한 투여이거나 좌약을 이용한 투여일 수 있다. [참조: Sayani(1996) "Systemic delivery of peptides and proteins across absorptive mucosae" Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 13:85 184]. 국소, 경피 투여의 경우, 작용제들은 연고, 크림, 고약, 산제 및 겔로 제형화된다. 또한, 경피 전달 시스템은 예컨대 패치를 포함할 수 있다.
본 발명의 화합물은 제형을 내부로 전달할 수 있는 지속 전달 기구 또는 지속 방출 기구를 통해 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 개시한 바와 같이 화합물을 지속 전달할 수 있는 생분해성 마이크로스피어 또는 캡슐이나 기타 다른 생분해성 고분자 형태가 본 발명의 제형에 포함될 수 있다(참조: Putney(1998) Nat.Biotechnol. 16:153-157).
흡입형인 경우에, 본 발명의 화합물은 당해 기술분야에 공지된 임의의 시스템, 예컨대 무수 분말 에어로졸, 액상 전달 시스템, 공기 제트 분무기, 추진제 시스템 등을 통해 전달될 수 있다. 예를 들어, 약학적 제형은 에어로졸이나 미스트 형태로 투여될 수 있다. 에어로졸 투여에서는 제형이 계면활성제 및 추진제와 함게 미분형으로 공급될 수 있다. 다른 구체예에서, 제형을 호흡 조직으로 전달하는 장치에는 제제를 기화시키는 흡입기가 있다. 다른 액상 전달 시스템으로는, 예컨대 공기 제트 분무기가 있다.
본 발명의 약제를 제조하는데 있어서, 약동학 및 생체분포를 변화시키도록 각종 제형의 변형이 사용되고 조작될 수 있다. 약동학 및 생체분포를 변화시키는 다양한 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 이러한 방법의 예로는 단백질, 지질(예, 리포좀, 하기 참조), 탄수화물 또는 합성 고분자(상기 참조) 등의 물질로 만들어진 소포로 복합체를 보호하는 방법을 포함한다. 약동학의 개괄적인 설명은 문헌 [Remington's, Chapters 37-39]을 참조할 수 있다.
본 발명의 방법에 사용되는 화합물 및 조성물은 단독으로 또는 약학적 조성물로서, 당해 기술분야에 공지된 임의의 수단, 예컨대 전신적으로, 국지적으로 또는 국소적으로(예컨대, 종양 내로 직접 또는 종양으로 직접); 동맥내, 경막내(IT), 정맥내(IV), 비경구, 흉막강내, 국부, 경구 또는 국소 투여를 통해, 피하, 기관지내(예, 에어로졸을 통해) 또는 경점막(예, 협측, 방광, 질, 자궁, 직장, 비점막)으로 전달될 수 있다. 투여가능한 조성물을 제조하는 실제 방법은 당업자에게 공지되어 있거나 명백한 것으로서, 학술 문헌 및 특허 문헌에 상세하게 설명되어 있다(예, Remington's). "국지적 효과", 예컨대 특정 기관을 목표로 하고자 하는 경우에는, 1가지 투여 방식으로서, 예컨대 뇌 및 CNS와 같은 특정 기관을 목표로 하는 동맥내 또는 경막내(IT) 주사를 포함한다(예, Gurun(1997) Anesth Analg. 85:317-323). 예를 들어, 본 발명의 펩타이드 또는 폴리펩타이드 복합체를 뇌로 직접 전달하고자 하는 경우에는 목동맥내 주사가 바람직하다. 비경구 투여는 높은 전신 투여량이 필요한 경우에 바람직한 전달 경로이다. 비경구 투여용 조성물을 제조할 수 있는 실제 방법은 당업자에게 공지되거나 명백한 것으로서, 예컨대 문헌[Remington's, 및 Bai(1997) J.Neuroimmunol. 80:65-75; Warren(1997) J.Neurol.Sci. 152:31-38; Tonegawa(1997) J.Exp.Med. 186:507-515]에 상세하게 설명되어 있다.
하나의 구체예로서, 본 발명의 화합물을 포함하는 약학적 제형은 지질 단층이나 이중층, 예컨대 리포좀에 포함될 수 있다[예컨대, 미국 특허 제6,110,490호; 제6,096,716호; 제5,283,185호; 제5,279,833호 참조]. 리포좀 제형은 임의의 수단, 예컨대 정맥내, 경피(예, Vutla(1996) J.Pharm.Sci. 85:58), 경점막 또는 경구로의 투여를 통해 전달될 수 있다. 따라서, 본 발명은 미셀 및/또는 리포좀에 포함된 본 발명의 펩타이드 및/또는 복합체를 함유하는 약학적 제제를 제공한다(예, Suntres(1994) J.Pharm.Pharmacol. 46:23-28; Woodle(1992) Pharm.Res. 9:260-265). 리포좀 및 리포좀 제제는 표준 방법에 따라 제조할 수 있으며, 당해 기술분야에 익히 알려져 있다(예, Remington's; Akimaru(1995) Cytokines Mol.Ther. 1:197-210; Alving(1995) Immunol.Rev. 145:5-31; Szoka(1980) Ann.Rev.Biophys.Bioeng. 9:467, 미국 특허 제4,235,871호, 제4,501,728호 및 제4,837,028호).
약학적으로 허용되는 제형은 약 1% 내지 99.9%의 활성 성분(예, 본 발명의 화합물)을 포함할 수 있다. 약학적 조성물은 통상적인 공지의 멸균 기법으로 멸균되거나 멸균 여과될 수 있다. 또 다른 약학적 제형 및 전달 시스템은 당해 기술분야에 공지되어 있고, 본 발명의 방법 및 조성물에 적용될 수 있다(예, Remington's Pharmaceutical Sciences(1990) 18th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA; The Merck Index(1996) 12th ed., Merck Publishing Group, Whitehouse, NJ; Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms, Technonic Publishing Co., Inc., Lancaster, Pa.,(1993); 및 Poznansky et al., Drug Delivery Systems, R.L.Juliano, ed., Oxford, N.Y.(1980), pp.253-315).
약학적 제형은 투여 용이성과 투여량의 균일성을 위해 단위 투여 형태로 포장할 수 있다. 본 명세서에 사용된 "단위 투여 형태"란 치료받을 피검체에 투여하기 위한 물리적으로 분리된 단위 투여량을 의미하며; 각 단위는 약학적 담체 또는 부형제와 함께, 목적한 효과를 제공하는 소정량의 화합물을 함유한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 화합물 및 이의 약학적 제형을, 경우에 따라 적합한 패키징 물질로 패키징하여 포함하는 키트를 제공한다. 키트는 일반적으로 성분의 설명이나 함유된 성분의 시험관내, 생체내 또는 생체외 사용 지침서를 포함하는 라벨이나 패키징 삽입물을 포함한다. 키트는 이러한 성분, 예컨대 2종 이상의 본 발명의 화합물 또는 핵산 손상제 또는 증식억제제와 조합된 본 발명의 화합물의 집합체를 함유할 수 있다.
"패키징 물질"이란 용어는 키트의 성분을 수용하는 물리적 구조를 의미한다. 패키징 물질은 성분을 멸균적으로 유지시킬 수 있는 것으로서, 이러한 목적에 일반적으로 사용되는 재료로 제조될 수 있다(예, 종이, 파형 섬유, 유리, 플라스틱, 호일, 앰풀 등). 라벨이나 패키징 삽입물은 적당한 서면 사용설명서를 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 키트는 본 발명의 모든 방법에 키트 성분을 사용할 수 있다는 라벨이나 사용설명서를 추가로 포함할 수 있다. 사용설명서는 본 명세서에서 설명한 바와 같은 본 발명의 모든 방법, 예컨대 치료, 검출, 모니터링 또는 진단 방법 등을 수행하기 위한 설명을 포함할 수 있다. 즉, 예를 들어, 키트는 본 발명의 치료 방법에 본 발명의 화합물을 투여할 수 있다는 설명서와 함께 팩이나 디스펜서 에 본 발명의 화합물을 함유한 것일 수 있다. 사용설명서는 또한 만족스러운 임상적 결과의 징후 또는 발생가능한 임의의 부작용, 또는 인체용인 경우 식약청과 같은 관리 관청이 요구하는 추가 정보를 포함할 수 있다.
사용설명서는 예컨대 키트내에 존재하거나 키트에 부착된 종이 또는 판지 위에서, 또는 키트나 패키징 물질에 부착된 라벨 위에서, 또는 키트의 성분을 함유하는 바이엘이나 튜브에 부착된 "인쇄물"에 제공될 수 있다. 사용설명서는 또한 디스크(플로피 디스켓 또는 하드 디스크), CD 또는 DVD-ROM/RAM과 같은 광CD, 자기 테이프, RAM 및 ROM과 같은 전기 저장 매체, IC 팁 및 이들의 하이브리드, 예컨대 자기/광 저장 매체 등과 같은 컴퓨터 판독가능한 매체로 포함될 수 있다.
본 발명의 키트는 추가로 약학적 제형 중에 완충제, 방부제 또는 안정화제를 함유할 수 있다. 키트의 각 성분은 각각의 용기에 봉인되고 이 용기들이 함께 하나의 패키지내에 들어 있을 수 있다. 본 발명의 키트는 저온 저장용으로 고안될 수 있다.
치료법: 약동학
본 발명의 약학적 조성물은 투여 방법에 따라 다양한 단위 투여 형태로 투여될 수 있다. 일반적인 약학적 조성물의 투여량은 당업자에게 공지되어 있다. 이러한 투여량은 일반적으로 본래 권고사항으로서, 특정 치료 상황, 환자 내성 등에 따라 조정될 수 있다. 본 발명의 방법을 수행하기에 적당한 본 발명의 화합물의 양은 "치료적 유효량"이라 한다. 이러한 용도에 효과적인 투여 계획 및 양, 즉 "치료 요법"은 각종 요인, 예컨대 질환이나 증상 단계, 질환이나 증상 정도, 일반적인 환자 건강 상태, 환자의 신체 상태, 연령, 활성 제제의 약학적 제형 및 농도 등에 따라 달라질 수 있다. 환자의 투여 요법을 계산할 때에는 투여 방식도 고려되어야 한다. 투여 요법은 또한 약동학, 즉 약학적 조성물의 흡수 속도, 생체이용율, 대사, 제거 등도 고려해야 한다. [참조: 최신판 Remington's; Egleton(1997) "Bioavailability and transport of peptides and peptide drugs into the brain" , Peptides 18:1431-1439; Langer(1990) Science 249:1527-1533].
치료적 적용에 있어서, 조성물은 암을 앓는 환자에게 이 질환 및/또는 이의 합병증을 적어도 부분적으로 정지시키기에 충분한 양으로 투여한다. 예를 들어, 하나의 구체예로서, 정맥내(IV) 투여용의 가용성 약학적 조성물 투여량은 수시간(일반적으로 1시간, 3시간 또는 6시간)에 걸쳐 투여되는 약 0.01mg/hr 내지 약 1.0mg/hr 범위이며, 이것은 간헐적 주기로 수주간 반복될 수 있다. 특히, 약물이 차단된 부위에 투여되어 혈류로 유입되지 않는, 체강이나 기관의 루멘, 예컨대 뇌척수액(CSF)으로의 투여인 경우에는 상당히 높은 투여량(예컨대 약 10mg/ml 이하)이 사용될 수 있다.
다른 표시가 없는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 용어 및 학술 용어는 당업자에게 일반적으로 이해되는 것과 같은 동일한 의미를 뜻한다. 본 명세서에 기술한 것과 유사하거나 동등한 방법 및 재료는 본 발명의 수행이나 시험에 사용할 수 있지만, 적합한 방법과 재료를 본 명세서에 예시하였다.
본 명세서에 인용된 모든 공개 문헌, 특허 및 기타 다른 문헌은 그 전체가 참고인용된 것이다. 대립시, 정의를 비롯한 본 명세서가 우선한다.
다음 실시예는 본 발명을 제한함이 없이 예시하는 것일 뿐이다.
실시예 1: G1 체크포인트 결함성 세포(암세포)에서 DNA 손상 유도된 세포 주기 G2 체크포인트의 선택적 폐기
화합물 및 시약. 블레오마이신, 아드리아마이신 및 콜히친은 와코 퓨터 케미칼 코. (Wako Pure Chemical Co.)(일본 오사카 소재)에서 구입하였다. 이 화합물은 10mg/ml로 증류수에 용해한 뒤 4℃에서 보관하였다. 시스플라틴은 니혼 가야쿠 코. (Nihon Kayaku Co.)(일본 도쿄 소재)에서 구입하여 증류수에 5mg/ml 농도로 용해하고 4℃에서 보관하였다. 캄프토테신(Campto)은 시그마 케미칼 코. (Sigma Chemical Co.)(미국 미주리주 세인트루이스 소재)에서 구입하였다. 프로피듐 요오드(PI)는 시그마에서 구입하였다. 피토헤마글루티닌은 라이프 테크놀로지스, 인크.(Life Technologies, Inc.)(미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재)에서 구입하였다. 인터루킨 2(IL-2)는 헤마겐 다이애그노스틱스 인크.(Hemagen Diagnostics Inc.)에서 구입하였다.
세포 배양. 인간 T-세포 백혈병 유래 세포주인 쥬르카트는 10% 우태아 혈청(IBL: Immuno-Biological Laboratories, Gunma, Japan)을 보충한 RPMI 1640 배지(시그마)에서 37℃/5% CO2 하에 배양하였다. 인간 결장암 유래 세포주인 HCT116은 10% 우태아 혈청을 보충한 맥코이 5A 변형 배지(Gibco BRL)에서 37℃/5% CO2 하에 배양하였다. 정상인의 말초 혈액 림프구는 Ficoll-Paque??(파마시아 제품)에 의해 분리하여 0.1㎍/ml PHA와 1㎍/ml IL-2의 존재하에서 배양하였다.
세포 주기 분석. 본 발명의 화합물 및/또는 블레오마이신, 아드리아마이신, 콜히친 또는 시스플라틴으로 처리된 세포의 세포 주기 상태를 본질적으로 문헌[Kawabe(1997) Nature 385:454-458]에 기술된 바와 같이 유동 세포측정법으로 분석했다. 간략히 설명하면, 2x106개의 세포를 재현탁시키고 300㎕ 크리스한 용액(0.1% 구연산나트륨, 50㎍/ml PI, 20㎍/ml RNase A 및 0.5% NP-40)에서 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음, CELLQuest™ 프로그램(Beckton Dickinson)을 갖춘 FACScan™ 유동 세포계수기(Beckton Dickinson, 미국 캘리포니아 마운틴 뷰 소재)를 사용하여 유동 세포측정법에 의해 분석하였다.
CBDC 402는 쥬르카트 세포의 블레오마이신 유도된 세포 주기 G2 축적을 폐기시켰다.
쥬르카트 세포(인간 T 세포 백혈병 유래 세포주)를 블레오마이신(40㎍/ml) 또는 블레오마이신+다양한 농도(0.2㎍/ml, 0.39㎍/ml, 0.78㎍/ml, 1.56㎍/ml, 3.125㎍/ml, 6.25㎍/ml, 12.5㎍/ml, 25㎍/ml 및 50㎍/ml)의 화합물 CBDC402(4-브로모-벤조산 p-톨릴 에스테르)로 24시간 동안 처리하였다. 처리된 쥬르카트 세포의 DNA를 프로피듐 요오드로 염색하고 각 세포의 세포 주기 상태를 유동 세포측정법에 의해 평가하였다. 도 1에 도시한 바와 같이, 블레오마이신 처리는 세포 주기 G2/M기 상태인 세포의 축적을 유도했다. CBDC402 처리는 용량 의존적 방식으로 블레오마이신 유도된 G2/M 세포의 축적을 폐기시켰다.
쥬르카트 세포의 M기 체크포인트는 CBDC402 처리에 의해 폐기되지 않았다.
쥬르카트 세포를 콜히친(5㎍/ml) 및 콜히친+다양한 농도(0.2㎍/ml, 0.39㎍/ml, 0.78㎍/ml, 1.56㎍/ml, 3.125㎍/ml, 6.25㎍/ml, 12.5㎍/ml, 25㎍/ml 및 50㎍/ml)의 화합물 CBDC402로 24시간 동안 처리하였다. 처리된 쥬르카트 세포의 DNA를 프로피듐 요오드로 염색하고 각 세포의 세포 주기 상태를 유동 세포측정법에 의해 평가하였다. 도 2에 도시한 바와 같이, 콜히친 처리는 세포 주기 G2/M기 상태인 세포의 축적을 유도했고, CBDC402 처리는 어떠한 CBDC402 농도에서도 이러한 G2/M 세포 축적을 폐기시키지 않았다.
각종 CBDC 화합물은 세포 주기 G2 체크포인트를 폐기시켰다.
쥬르카트 세포를 블레오마이신(40㎍/ml) 및 각종 CBDC 화합물(0.2㎍/ml, 0.39㎍/ml, 0.78㎍/ml, 1.56㎍/ml, 3.125㎍/ml, 6.25㎍/ml, 12.5㎍/ml, 25㎍/ml 및 50㎍/ml)로 처리하고 24시간 동안 배양시켰다. CBDC 화합물 004, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410 및 411을 시험하였다. 세포를 수거하고, DNA는 프로피듐 요오드로 염색하고, G2/M기 상태의 세포 비율(G2/M%)을 유동 세포측정법에 의해 측정하였다. 도 3은 각 CBDC 화합물의 각 농도에 대해 검출되는 G2/M 세포%를 도시하며, 이는 각종 CBDC 화합물에 의한 G2 체크포인트 폐기의 용량 반응 곡선을 제공한다. CBDC402는 최대 활성을 보였다. 시험된 모든 CBDC 화합물은 최고 농도(50㎍/ml)에서 G2 세포 주기 체크포인트를 폐기시켰다. 이 실험에서 시험된 CBDC 화합물의 구조는 도 4에 도시하였다.
추가의 CBDC 화합물을 이들의 G2 체크포인트 폐기 활성에 대해 전술한 바와 같이 시험하였다. 도 5에 도시한 바와 같이, 화합물은 다음과 같이 분류되었다: 높은 활성; 중간 활성; 활성; 약한 활성; 및 비활성. 도 6에 도시한 바와 같이, 쥬르카트 세포에서의 G2 체크포인트 폐기의 IC50은 전술한 바와 같이 수행되는 용량 반응 실허멩 의해 측정했다.
CBDC 004는 다양한 항암제에 의해 유도된 세포 주기 G2 체크포인트를 폐기시켰다.
HCT116 인간 결장 암종 세포를 10㎍/ml의 블레오마이신(Bleo), 1㎍/ml의 아드리아마이신(ADR), 10㎍/ml의 캄프토테신(Campto), 또는 2㎍/ml의 시스플라틴(CDDP) 및 0, 2μM, 10μM 또는 50μM의 CBDC004로 24시간 동안 처리하였다. DNA를 프로피듐 요오드로 염색하고 각 세포의 세포 주기 상태를 유동 세포측정법에 의해 평가하였다. 도 7에 도시한 바와 같이, 이러한 항암제들은 각각 세포 주기 G2/M기에서 세포의 축적을 유도했고, CBDC004와의 공동인큐베이션은 G2/M 세포수를 감소시켰다. 이것은 CBDC004가 블레오마이신, 아드리아마이신, 캄프토테신 또는 시스플라틴에 의해 활성화된 G2 체크포인트를 폐기시켰음을 나타낸다.
실시예 2: DNA 손상 처리에 대한 암세포의 감작화
조합 처리의 세포독성 활성을 블레오마이신, 아드리아마이신, 캄프토테신 또는 시스플라틴으로 2μM, 10μM 또는 50μM의 CBDC004와 함께 또는 CBDC004 없이 처리된 HCT116 세포의 서브G1 집단을 분석함으로써 측정하였다. 서브G1 집단은 크리스한 용액으로 HCT116을 염색하여 측정하고, 유동 세포측정기에 의해 분석했다. 사멸 세포는 DNA 함량에 근거하여 확인했고, 서브G1 중의 세포 비율(subG1%)을 계산했다. 도 8에 도시된 바와 같이, 블레오마이신, 아드리아마이신, 캄프토테신 또는 시스플라틴은 HCT116 세포에 세포독성 효과를 나타냈고, CBDC004는 용량 의존적 방식으로 이러한 항암제의 세포독성 활성을 증가시켰다.
실시예 3: CBDC 402는 SCID 마우스에서 이종이식편 종양 성장을 억제했다.
HCT-116 인간 결장 암종 세포는 중증 복합 면역결핍증(SCID) 마우스의 피하에 이식했다. 원발성 종양의 크기가 0.1㎤(7mm 또는 8mm, 1일째로 표시됨)에 도달하면 처리를 시작했다.
항암제 CPT-11(CAMPTOSAR??, Irinotecan, 토포이소머라제 억제제) 및 CBDC402를 다음과 같은 처리 계획으로 복강내 주사에 의해 투여했다: CPT-11 20mg/kg, 1주에 1회; CBDC402 20mg/kg, 1주에 2회; CBDC402 40mg/kg, 1주에 2회; CBDC402 20mg/kg, 1주에 2회 + CPT-11 20mg/kg 1주에 1회; 및 CBDC402 40mg/kg, 1주에 2회 + CPT-11 20mg/kg, 1주에 1회. DMSO는 대조 처리로서 투여했다. 종양 크기는 1주에 3회씩 칼리퍼스로 측정하고, 부피는 다음과 같은 식에 따라 계산했다: 중량(mg) = [너비(mm)2x길이(mm)]/2. 각 처리 그룹(n=4)의 평균 종양 크기를 처리일에 대해 플롯팅했다. 도 9에 도시한 바와 같이, DMSO 처리된 대조 마우스에서 종양이 계속 성장했고, CBDC402 단독(두 농도 모두에서)은 종양 성장을 약간 감소시켰으며, CPT-11 단독은 종양 성장을 감소시키고, CBDC402 + CPT-11의 복합처리는 종양 성장을 유의적으로 감소 또는 억제했다.
실시예 4: 인간 위암 유래 세포주 MK -45의 콜로니 형성 분석
인간 위암 유래 세포주로부터의 MK-45 세포를 1000 세포/ml로 6웰 평판에 시딩했다. 하룻밤 배양한 후, 세포를 각종 CBDC 화합물 10μM, CPT-11 10㎍/ml 또는 CBDC 화합물과 CPT-11의 조합물로 3시간 동안 처리했다. 시험된 CBDC 화합물은 다음과 같다: CBDC402, CBDC412, CBDC413 및 CBDC418. 배양 배지를 교환한 뒤, 세포를 14일 동안 배양한 다음, 메탄올을 이용하여 콜로니를 고정시키고 0.1% 크리스탈 바이올렛으로 염색했다. 10μM CBDC402 단독으로의 3시간 처리는 MK-45 세포에 의한 콜로니 형성을 유의적으로 억제한 반면, 10μM CBDC412로의 처리는 콜로니 형성을 약간 억제했고, 10μM CBDC413 또는 CBDC418로의 처리는 콜로니 형성에 대한 인지할 수 있는 효과를 나타내지 않았다. 10㎍/ml CPT-11로의 처리는 콜로니 형성을 유의적으로 억제한 반면, 10μM CBDC402 첨가는 10㎍/ml CPT-11의 효과를 증강시켜 콜로니 형성을 거의 완전하게 억제하는 것으로 나타났다. 10㎍/ml CPT-11과 10μM CBDC412의 조합은 CPT-11 단독 처리에서 관찰되는 것 이상으로 콜로니 형성을 약간 억제시켰고, 10㎍/ml CPT-11과 10μM CBDC413, CBDC418과의 조합도 마찬가지였다.
실시예 5: CBDC 402는 세포 주기 G2 체크포인트를 특이적으로 폐기시킨다.
활성화된 정상 T 세포 및 백혈병 T 세포(쥬르카트 세포)를 G2 또는 M기인 세포의 축적을 유도하는 작용제로 처리하고, 세포 주기 체크포인트를 통해 세포의 진행에 미치는 CBDC402의 효과를 측정했다. 처리 후 세포를 수거하고, DNA를 염색한 뒤, 각 세포의 세포 주기 단계를 전술한 바와 같이 유동 세포측정법으로 측정했다. 하나의 실험에서 활성화된 정상 T 세포를 무처리(대조군)하거나, 블레오마이신, CBDC402 또는 블레오마이신과 CBDC402의 조합으로 처리했다. 도 10a에 도시한 바와 같이, 블레오마이신 처리는 G2기의 세포의 소수 집단을 축적시켰고, CBDC402는 G2기인 활성화된 정상 T 세포의 블레오마이신 유도된 증가를 폐기시켰다. 또 다른 실험에서, 백혈병 T 세포(쥬르카트 세포)를 무처리(대조군)하거나, 블레오마이신, CBDC402 또는 블레오마이신과 CBDC402의 조합으로 처리했다. 도 10b에 도시한 바와 같이, 블레오마이신 처리는 G2기 세포의 주요 집단을 축적시켰고, CBDC402는 G2기 백혈병 T 세포(쥬르카트 세포)의 블레오마이신 유도된 커다란 증가를 폐기시켰다. 또 다른 실험에서, 활성화된 정상 T 세포를 무처리(대조군)하거나, 콜히친, 또는 CBDC402와 콜히친의 조합으로 처리했다. 도 10c에 도시한 바와 같이, 콜히친 처리는 M기 세포를 축적시켰고, CBDC402는 M기인 활성화된 정상 T 세포의 콜히친 유도된 증가에 영향을 미치지 않았다. 이러한 결과는 G2 축적(M기 체크포인트이 아닌)에 대한 CBDC402의 특이성을 나타내고, 암세포에 대한 CBDC402의 특이성을 나타낸다.
실시예 6: 4- 브로모 - 벤조산 4- 플루오로 -페닐 에스테르의 합성
디옥산 10ml, 4-브로모-벤조산 클로린 5mmol(1.1g) 및 4-플루오로-페놀 5mmol(0.56g)을 순서대로 50ml 4구 플라스크에 주입하고, 실온에서 용해시켰다. 디옥산에 용해된 트리에틸아민을 상기 용액에 서서히 적가하고, 용액을 실온에서 3시간 동안 교반했다. 침전되는 결정을 여과하고 벤젠으로 추출했다. 추출된 용액을 탄산수소나트륨으로 수 차례 세척하고, 마그네슘 안하이드레이트(anhydrate)를 첨가하고, 생성된 용액을 건조시키고, 여과했다. 용액을 저압하에 증류시키고 결정화 시켰다. 미정제 결정은 황색을 띠는 백색이고, 중량은 1.37g이었다. 이 결정 중 일부(0.5g)를 벤젠에 용해하고, 100g의 실리카겔(Wako gel C-300, Japan)을 이용하여 정제했다. 정제된 산물은 백색이고, 순도는 액체 크로마토그래피(LC)로 분석 시 99.93%였다. 구조를 NMR로 확인한 결과 다음과 같았다. 1H NMR(400MHz, DMSO-d6) δ8.05(2H, d, J=8.8Hz), 7.83(2H, d, J=8.8Hz), 7.38∼7.29(4H, m). 13C NMR(100MHz, DMSO-d6) δ159.72(C-F, d, J=240Hz) 163.95(C=O).

Claims (50)

  1. 3,4,5-트리플루오로-벤조산 p-톨릴 에스테르(CBDC403); 3,4-디클로로-벤조산 p-톨릴 에스테르(CBDC405); 2,4-디클로로-벤조산 p-톨릴 에스테르(CBDC406); 4-플루오로-벤조산 p-톨릴 에스테르(CBDC407); 2,3,4,5,6-펜타플루오로-벤조산 p-톨릴 에스테르(CBDC408); 4-플루오로-벤조산 4-하이드록시-페닐 에스테르(CBDC411); 4-브로모-벤조산 4-트리플루오로메틸-페닐 에스테르(CBDC413); 4-브로모-벤조산 4-하이드록시-페닐 에스테르(CBDC414); 4-브로모-벤조산 4-트리플루오로메톡시-페닐 에스테르(CBDC415); 4-브로모-벤조산 6-메틸-피리딘-3-일 에스테르(CBDC418); 4-브로모-티오벤조산 O-p-톨릴 에스테르(CBDC440); 4-브로모-디티오벤조산 p-톨릴 에스테르(CBDC441); 및 4-브로모-티오벤조산 S-p-톨릴 에스테르(CBDC442)로부터 선택된 화합물.
  2. 제 1항에 있어서, 하기 구조식을 지닌 3,4,5-트리플루오로-벤조산 p-톨릴 에스테르(CBDC403)를 포함하는 화합물:
    Figure 112010018589455-pct00038
  3. 제 1항에 있어서, 하기 구조식을 지닌 3,4-디클로로-벤조산 p-톨릴 에스테르(CBDC405)를 포함하는 화합물:
    Figure 112010018589455-pct00067
  4. 제 1항에 있어서, 하기 구조식을 지닌 2,4-디클로로-벤조산 p-톨릴 에스테르(CBDC406)를 포함하는 화합물:
    Figure 112010018589455-pct00068
  5. 제 1항에 있어서, 하기 구조식을 지닌 4-플루오로-벤조산 p-톨릴 에스테르(CBDC407)를 포함하는 화합물:
    Figure 112010018589455-pct00041
  6. 제 1항에 있어서, 하기 구조식을 지닌 2,3,4,5,6-펜타플루오로-벤조산 p-톨릴 에스테르(CBDC408)를 포함하는 화합물:
    Figure 112010018589455-pct00042
  7. 제 1항에 있어서, 하기 구조식을 지닌 4-플루오로-벤조산 4-하이드록시-페닐 에스테르(CBDC411)를 포함하는 화합물:
    Figure 112010018589455-pct00043
  8. 제 1항에 있어서, 하기 구조식을 지닌 4-브로모-벤조산 4-트리플루오로메틸-페닐 에스테르(CBDC413)를 포함하는 화합물:
    Figure 112010018589455-pct00044
  9. 제 1항에 있어서, 하기 구조식을 지닌 4-브로모-벤조산 4-하이드록시-페닐 에스테르(CBDC414)를 포함하는 화합물:
    Figure 112010018589455-pct00045
  10. 제 1항에 있어서, 하기 구조식을 지닌 4-브로모-벤조산 4-트리플루오로메톡시-페닐 에스테르(CBDC415)를 포함하는 화합물:
    Figure 112010018589455-pct00046
  11. 제 1항에 있어서, 하기 구조식을 지닌 4-브로모-벤조산 6-메틸-피리딘-3-일 에스테르(CBDC418)를 포함하는 화합물:
    Figure 112010018589455-pct00047
  12. 제 1항에 있어서, 하기 구조식을 지닌 4-브로모-티오벤조산 O-p-톨릴 에스테르(CBDC44O)를 포함하는 화합물:
    Figure 112010018589455-pct00048
  13. 제 1항에 있어서, 하기 구조식을 지닌 4-브로모-디티오벤조산 p-톨릴 에스테르(CBDC441)를 포함하는 화합물:
    Figure 112010018589455-pct00049
  14. 제 1항에 있어서, 하기 구조식을 지닌 4-브로모-티오벤조산 S-p-톨릴 에스테르(CBDC442)를 포함하는 화합물:
    Figure 112010018589455-pct00050
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 세포에 투여된 경우에 세포 주기 G2 체크포인트를 폐기시키는 하기 구조식의 화합물을 유효량으로 포함하는, 암을 치료하기 위한 약제:
    Figure 112010018589455-pct00051
    상기 식에서,
    두 번째 벤젠은 피리딘으로 대체될 수 있고;
    R1은 브롬(Br), 염소(Cl) 또는 불소(F)이고;
    R2는 불소(F) 또는 수소이고;
    R3는 염소(Cl), 불소(F) 또는 수소이고;
    R4는 브롬(Br), 염소(Cl), 불소(F), 메틸(CH3), 0-메틸(OCH3), 하이드록시(OH), 트리플루오로메틸 (CF3) 또는 트리플루오로메톡시 (OCF3)이고;
    R5는 메틸(CH3) 또는 수소이고;
    R6는 수소이고;
    X1은 산소(0)이고;
    X2는 산소(0)이다.
  18. 제 17항에 있어서, 하기 구조식을 지닌 4-클로로-벤조산 4-메톡시-페닐 에스테르(CBDC004)를 포함하는 약제:
    Figure 112010018589455-pct00052
  19. 제 17항에 있어서, 하기 구조식을 지닌 4-클로로-벤조산 p-톨릴 에스테르(CBDC401)를 포함하는 약제:
    Figure 112010018589455-pct00053
  20. 제 17항에 있어서, 하기 구조식을 지닌 4-브로모-벤조산 p-톨릴 에스테르(CBDC402)를 포함하는 약제:
    Figure 112010018589455-pct00054
  21. 제 17항에 있어서, 하기 구조식을 지닌 3,4,5-트리플루오로-벤조산 p-톨릴 에스테르(CBDC403)를 포함하는 약제:
    Figure 112010018589455-pct00055
  22. 제 17항에 있어서, 하기 구조식을 지닌 4-플루오로-벤조산 4-브로모-페닐 에스테르(CBDC404)를 포함하는 약제:
    Figure 112010018589455-pct00056
  23. 제 17항에 있어서, 하기 구조식을 지닌 3,4-디클로로-벤조산 p-톨릴 에스테르(CBDC405)를 포함하는 약제:
    Figure 112010018589455-pct00069
  24. 제 17항에 있어서, 하기 구조식을 지닌 4-플루오로-벤조산 p-톨릴 에스테르(CBDC407)를 포함하는 약제:
    Figure 112010018589455-pct00058
  25. 제 17항에 있어서, 하기 구조식을 지닌 4-클로로-벤조산 3,4-디메틸-페닐 에스테르(CBDC409)를 포함하는 약제:
    Figure 112010018589455-pct00059
  26. 제 17항에 있어서, 하기 구조식을 지닌 4-클로로-벤조산 4-하이드록시-페닐 에스테르(CBDC410)를 포함하는 약제:
    Figure 112010018589455-pct00060
  27. 제 17항에 있어서, 하기 구조식을 지닌 4-플루오로-벤조산 4-하이드록시-페닐 에스테르(CBDC411)를 포함하는 약제:
    Figure 112010018589455-pct00061
  28. 제 17항에 있어서, 하기 구조식을 지닌 4-브로모-벤조산 4-플루오로-페닐 에스테르(CBDC412)를 포함하는 약제:
    Figure 112010018589455-pct00062
  29. 제 17항에 있어서, 하기 구조식을 지닌 4-브로모-벤조산 4-트리플루오로메틸-페닐 에스테르(CBDC413)를 포함하는 약제:
    Figure 112010018589455-pct00063
  30. 제 17항에 있어서, 하기 구조식을 지닌 4-브로모-벤조산 4-하이드록시-페닐 에스테르(CBDC414)를 포함하는 약제:
    Figure 112010018589455-pct00064
  31. 제 17항에 있어서, 하기 구조식을 지닌 4-브로모-벤조산 4-트리플루오로메톡시-페닐 에스테르(CBDC415)를 포함하는 약제:
    Figure 112010018589455-pct00065
  32. 제 17항에 있어서, 하기 구조식을 지닌 4-브로모-벤조산 6-메틸-피리딘-3-일 에스테르(CBDC418)를 포함하는 약제:
    Figure 112010018589455-pct00066
  33. 삭제
  34. 삭제
  35. 삭제
  36. 제 17항 내지 제 32항중 어느 한 항에 있어서, DNA 손상된 세포에 투여된 경우에 세포 주기 G2 체크포인트를 폐기시켜서 DNA 손상된 세포에 대해 심각한 세포독성 효과를 발생시키는 화합물을 유효량으로 포함하는, 하나 이상의 DNA 손상된 세포의 이상 증식 또는 원하지 않는 증식을 특징으로 하는 암을 치료하는 약제.
  37. 제 36항에 있어서, 정상 세포 및 DNA 손상된 세포에 투여된 경우에 세포 주기 G2 체크포인트를 폐기시켜서 정상 세포에 대해서는 세포독성 효과가 거의 없거나 전혀 없고, DNA 손상된 세포에 대해서는 심각한 세포독성 효과를 발생시키는 화합물을 유효량으로 포함하는, 정상 세포 및 DNA 손상된 세포를 포함하는 세포 집단에서 DNA 손상된 세포를 선택적으로 억제하거나 사멸시킴으로써 암을 치료하는 약제.
  38. 제 36항에 있어서, 세포 주기 G1 체크포인트에 결함이 있는 DNA 손상된 세포에 투여된 경우에 세포 주기 G2 체크포인트를 폐기시키는 화합물을 유효량으로 포함하는, 세포 주기 G1 체크포인트에 결함이 있는 하나 이상의 DNA 손상된 세포의 이상 증식 또는 원하지 않는 증식을 특징으로 하는 암을 치료하는 약제.
  39. 제 36항에 있어서, DNA 손상된 세포에 투여된 경우에 세포 주기 G2 체크포인트를 폐기시킴으로써 DNA 손상 작용제 또는 DNA 손상 처리에 대해 DNA 손상된 세포를 감작시키는 화합물을 유효량으로 포함하는, DNA 손상 작용제 또는 DNA 손상 처리에 대해 DNA 손상된 세포를 감작시킴으로써 암을 치료하는 약제.
  40. 제 36항에 있어서, DNA 손상된 세포가 암 세포인 약제.
  41. 제 36항에 있어서, DNA 손상된 세포가 이종이식편 종양 세포인 약제.
  42. 제 39항에 있어서, 하나 이상의 DNA 손상 작용제를 추가로 포함하는 약제.
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