PT769296E - Utilizacao de derivados de isoxazole e de amidas de acido crotonico para o tratamento de doencas cancerosas - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "UTILIZAÇÃO DE DERIVADOS DE ISOXAZOLE E DE AMIDAS DE ÁCIDO CROTÓNICO PARA O TRATAMENTO DE DOENÇAS CANCEROSAS"

Para a terapia de receptores de hormonas avançados de tumores malignos negativos existe hoje em dia à disposição a quimioterapia. Esta forma de terapia caracteriza-se, para além da sua limitada eficiência, pela ocorrência frequente de graves efeitos secundários. Como causa da eficácia e dos efeitos secundários tem de considerar-se o principio activo dos quimioterapêuticos (a inibição da proliferação). Uma vez que não só as células tumorais, mas também as células normais, se encontram em divisão, as células em divisão normal no corpo do paciente são também inibidas na sua divisão tal como as verdadeiras células alvo, as células tumorais. Particularmente atingidas pelos efeitos secundários indesejados da terapia antiproliferativa, são as células em divisão rápida do foliculo capilar, do tracto gastrointestinal e da medula óssea. 0 efeito antiproliferativo dos quimioterapêuticos consegue-se por exemplo atingindo o metabolismo dos ácidos nucleicos das células. Agentes antiproliferativos particularmente eficazes são os inibidores de di-hidroorotato-desidrogenase (DHODH). A DHODH é um enzima de tipo único na síntese de novo dos nucleótidos de pirimidina (Peters et al., 1990, Biochemical Pharmacology 39: N° 1, 135-144). O enzima encontra-se na parte externa da membrana mitocondrial interna. A inibição do enzima pelo ingrediente activo DUP-785 (Brequinar) leva a uma deplecção de pirimidino-ribo- e desoxi-ribo-nucleótidos, mas não de nucleótidos das 1 Γ L-i purinas (Schwartsman et al., 1988, Biochem. Pharmacol. 37: 3257-3266). A deplecção de dTTP e dCTP é proporcional à de UTP e CTP e pode ser impedida pela adição de uridina. A inibição de crescimento provocada pelo Brequinar em linhas celulares in vitro pode ser suprimida pela adição de uridina ou de citidina, mas não por adição de desoxitimidina ou de desoxicitidina. Daqui pode concluir-se que a inibição da síntese de UMP é decisiva para o efeito anti-proliferação em linhas celulares in vitro (Peters et al., 1987, Invest. New Drugs, 5: 235-244). A WO 95/19169 descreve amidas de ácido crotónico de fórmula geral II, bem como a sua utilização para o tratamento de doenças cancerosas.

No âmbito de investigações clínicas pôde demonstrar-se que o Brequinar diminui significativamente os valores de uridina no plasma (Peters et al., Proc. Am. Ass. Câncer Res. 29: 350 (Abstract 1392)) (esta descoberta está em concordância com as observações in vitro em várias linhas celulares). Além disso, a intensidade dos efeitos sobre a concentração de uridina in vivo correlaciona-se com a toxicidade na medula óssea e no tracto gastrointestinal (efeitos secundários).

Estas observações clínicas indicam que existe a necessidade urgente de desenvolver terapêuticos para o cancro, cujo princípio antitumoral não tenha a ver com uma inibição geral da proliferação, como no caso do Brequinar, mas sim com a inibição dos mecanismos metabólicos específicos do tumor.

Verificou-se então que os compostos de fórmulas I e II inibem apenas muito fracamente a DHODH humana, mas bloqueiam de forma muito eficiente na sua divisão linhas celulares tumorais bem determinadas. 2 (p U ^^ A adição de quantidades crescentes de uridina no teste MTT altera muito pouco o valor de IC50 das substâncias de acordo com a invenção na linha celular Lo-Vo, em claro contraste com o massivo aumento do valor de IC50 do Brequinar na mesma linha celular (Exemplo 7).

Estas observações experimentais apoiam a tese de que o efeito antiproliferativo das substâncias de acordo com a invenção assenta num principio de eficácia diferente do da inibição da DHODH, como no caso do Brequinar.

Por meio de técnicas microscópicas de fluorescência conseguiu mostrar-se que as linhas celulares que sobre-exprimem fortemente o receptor de PDGF e o receptor de VEGF são também inibidas de forma eficiente na divisão (Exemplo 6) por meio de concentrações muito baixas das substâncias de acordo com a invenção (baixo IC50) . Esta observação indica que as substâncias de acordo com a invenção poderiam bloquear determinadas tirosinoquinases receptoras, como por exemplo o receptor de PDGF, isto é, influenciam vantajosamente a transtucção anormal de sinal em células tumorais.

A invenção refere-se assim à utilização de um sal de sódio ou de lisinio do composto de fórmula II

e/ou a uma eventual forma estereoisomérica do sal de sódio ou de lisinio do composto de fórmula II, para a preparação de um medicamento para o tratamento de doenças cancerosas, 3 \

u em que R1 significa a) cicloalquilo-(C3“C5), b) alcenilo-(C2-C6) ou c) alcinilo-(C2-C6) , R2 significa a) -CF3, b) -O-CF3, c) -S-CF3, d) -OH, e) -NO2, f) halogéneo, g) benzilo, h) fenilo, i) -CN, j) -O-fenilo, k) -O-fenilo, mono- ou poli-substituído por 1) alquilo-(C1-C4) , 2) halogéneo, 3) -O-CF3 ou 4) -O-CH3, R3 significa a) alquilo-(C1-C4) , b) halogéneo ou c) um átomo de hidrogénio, e X significa a) um grupo -CH ou b) um átomo de azoto.

Prefere-se a utilização de um sal de sódio ou de lisinio composto de fórmula II, em que 4 R1 significa ciclopropilo, alcenilo-(C2-C3) ou alcinilo-(C3- C5), R2 significa -0-CF3, -S-CF3, O-fenilo, fenilo, -CF3, -CN ou 0-fenilo mono- ou poli-substituído por alquilo- (C1-C4) ou halogéneo, R3 significa um átomo de hidrogénio ou metilo, e X significa um grupo -CH, para a preparação de um medicamento para o tratamento de doenças cancerosas.

Particularmente preferida é a utilização de um sal de sódio ou de lisinio do composto de fórmula II, em que R1 significa ciclopropilo, alcenilo-C3 ou alcinilo-C4, R2 significa -S-CF3, -CN, 2-metil-4-clorofenilo ou CF3, R3 significa um átomo de hidrogénio, e X significa um grupo -CH, para a preparação de um medicamento para o tratamento de doenças cancerosas.

Muito preferencial é a utilização de sal de lisina ou de sódio de amida do ácido N-(4-trifluorometilfenil)-2-ciano-3-hidroxi-hept-2-eno-6-ino-carboxílico ou de sal de lisina ou de sódio de (4-cianofenil)-amida do ácido 2-ciano-3-ciclopropil-3-hidroxi-acrílico. A preparação dos compostos de fórmula II efectua-se de acordo com processos conhecidos, como os que se encontram descritos nas EP 13 376; EP 484 223; EP 538 783; EP 551 230 ou US 4 061 767.

Pela designação alquilo, alcenilo ou alcinilo entendem-se grupos cuja cadeia de carbono pode ser linear ou ramificada. Além disso, os grupos alcenilo ou alcinilo podem ainda conter várias ligações duplas ou triplas respectivamente. Os grupos alquilo cíclicos são por exemplo monociclos de 3 a 5 membros como ciclopropilo, ciclobutilo ou ciclopentilo. Os reagentes de partida para as reacções químicas são conhecidos ou podem preparar-se facilmente de acordo com métodos conhecidos da literatura. Às doenças cancerosas pertencem por exemplo as leucemias, em especial leucemias crónicas das células dos tipos T e B, linfoma de Hodgkin ou não Hodgkin, carcinomas, cancro do pulmão, cancro do ovário, cancro dos nódulos linfáticos, sarcomas, sarcoma de Kaposi, meninginoma, cancro do intestino, tumores cerebrais, cancro da mama, cancro do estômago, cancro do pâncreas, cancro da próstata ou cancro da pele.

Os medicamentos podem aplicar-se por via oral, tópica, rectal, intravenosa ou ainda parenteral.

Formas de administração galénica sólidas ou líquidas adequadas são por exemplo granulados, pós, drageias, comprimidos, (micro)cápsulas, supositórios, xaropes, sumos, suspensões, emulsões, gotas ou soluções injectáveis, bem como preparados com libertação retardada de ingrediente activo, em cuja preparação se empregam aditivos usuais como veículos, agentes desintegrantes, agentes ligantes, agentes de revestimento, agentes humectantes, agentes de polimento ou lubrificantes, sabores, adoçantes ou solubilizantes. Como aditivos utilizados frequentemente referem-se por exemplo carbonato de magnésio, dióxido de titânio, lactose, manite e outros açúcares, talco, albumina láctea, gelatina, amido, celulose e seus derivados, óleos animais e vegetais, polietilenoglicois e solventes, como por exemplo água esterilizada e álcoois mono- ou poli-funcionais, por exemplo glicerina. 6

De preferência, preparam-se e administram-se as composições farmacêuticas em unidades de dosagem, contendo cada unidade como componente activo uma determinada dose de um sal de lisina ou de sódio do composto de fórmula II. No caso de unidades de dosagem sólidas, como comprimidos, cápsulas ou supositórios, esta dose pode ir até cerca de 300 mg, de preferência contudo de 10 a 200 mg.

Para o tratamento de um paciente (70 kg) é indicado nas fases iniciais um tratamento por infusão intravenosa no máximo de 1200 mg por dia e na fase posterior de reabilitação uma administração oral de 3 vezes 300 mg por dia de um sal de lisina ou de sódio do composto de fórmula II.

Em casos especiais podem contudo aplicar-se doses mais elevadas ou mais baixas. A administração da dose pode efectuar-se tanto como uma só toma na forma de uma unidade de dosagem única ou ainda em várias unidades de dosagem mais pequenas, como também em tomas múltiplas de doses parciais a intervalos determinados.

Finalmente, podem combinar-se os sais de lisina ou de sódio do composto de fórmula II, na preparação das formas galénicas de administração acima referidas, juntamente com outros ingredientes activos adequados, por exemplo antiuricopáticos, inibidores da agregação de trombócitos, analgésicos e antiflogísticos esteróides ou não esteróides. 7

V

Exemplo 1

Sal de sódio da amida do ácido N-(4-trifluorometilfenil)-2-ciano-3-hidroxi-hept-2-eno-6-ino (composto 1)

Dissolvem-se 50 g de amida do ácido N-(4-trifluorometilfenil)-2-ciano-3-hidroxi-hept-2-eno-6-ino num sistema de duas fases constituído por 50 ml de hidróxido de sódio 5N e 500 ml de acetato de etilo, separa-se a fase orgânica, lava-se duas vezes com um pouco de água, seca-se sobre sulfato de sódio e concentra-se. 0 resíduo oleoso toma-se em 500 ml de éter tert-butilmetílico e agita-se durante 4 horas à temperatura ambiente para cristalização completa, filtra-se e seca-se sob pressão reduzida. Para a remoção completa dos resíduos de solvente suspende-se o produto cristalino em 500 ml de tolueno durante 10 minutos sob refluxo, arrefece-se com agitação, filtra-se novamente e seca-se sob pressão reduzida. Rendimento: 41,1 g [11%); ponto de fusão >244°C com decomposição.

CisHioFsNaOzNa (330,24 g/mol):

Calculado: C: 54,0 H: 3,5 N: 8,4 Na: 6,88 (calculado para 1,1% de água)

Encontrado: C: 54,4 H: 3,4 N: 8,4 Na: 6,65 (água 1,1%)

Exemplo 2

Sal de sódio da (4-cianofenil)-amida do ácido 2-ciano-3-ciclopropil-3-hidroxi-acrílico (composto 2)

Suspendem-se 15 g (0,050 mol) de (4-cianofenil)-amida do ácido 2-ciano-3-ciclopropil-3-hidroxi-acrílico em 120 ml de água e 100 ml de acetona e dissolvem-se por adição de 60 ml de NaOH IN. Após filtração de vestígios de material não dissolvido concentra-se no evaporador rotativo sob pressão reduzida até 8 cerca de 200 ml e cristaliza-se durante a noite a 0°C, filtra-se e seca-se sob pressão reduzida.

Rendimento: 13 g; ponto de fusão >280°C.

Ci4Hi0N3O2Na (275,24):

Calculado: C: 60,7 H: 3,7 N: 15,2 (calculado de água) Encontrado: C: 60,8 H: 3,6 N: 15, 3 (água 0,7%)

Exemplo 3

Sal de lisina da amida do ácido N-(4-trifluorometilfenil)-2-ciano-3-hidroxi-hept-2-eno-6-ino

Dissolvem-se 30 g (0, 097 mol) de amida do ácido N-(4- trifluorometilfenil)-2-ciano-3~hidroxi-hept-2-eno-6-ino juntamente com 17,3 g (0,097 mol) de hidrato de L-lisina em 1 1 de água e 25 ml de etanol, filtra-se e liofiliza-se. As quantidades residuais de etanol ainda presentes removem-se por nova liofilização.

Rendimento: 44,4 g de produto maioritariamente amorfo; ponto de fusão: 135-138°C. 1H-NMR (DMSO-d6) : 1,23-1,77 (m, 6H) ; 2,3-2,45 (m, 2H) ; 2,50-2,65 (m, 2H); 2,7-2,85 (m, 3H); 3,25 (t largo, 1H); 5,7-7,4 (s largo, 6H); 7,55 e 7,73 (AA'BB', cada 2H); 12,35 (s, 1H).

Exemplo 4

Sal de lisina da (4-cianofenil)-amida do ácido 2-ciano-3- ciclopropil-3-hidroxi-acrílico

Dissolvem-se 15 g (0,054 mol) de (4-cianofenil)-amida do ácido 2-ciano-3-ciclopropil-3-hidroxi-acrílico juntamente com 9,6 g (0,054 mol) de hidrato de L-lisina em 900 ml de água e 10 ml de etanol, filtra-se e liofiliza-se. As quantidades residuais de 9 etanol ainda presentes removem-se por secagem sob pressão reduzida.

Rendimento: 21,8 g de produto maioritariamente amorfo; ponto de fusão >100°C (decomposição). XH-NMR (DMSO-de) : 0,6-0,82 (m, 4H) ; 1,27-1,75 (m, 6H) ; 2,17 (m compl., 1H); 2,77 (t largo, 2H); 3,28 (t largo, 1H); 4,8-7,5 (s largo, 6H); 7,63 e 7,7 (AA/BB', cada 2H); 12,6 (s, 1H).

Exemplo 5 A actividade enzimática de DHODH (de baço) determina-se de acordo com o método de Williamson et al. (The Journal of Biological Chemistry, 270 (1995), pags. 22467-22472). Indicam-se em cada caso os valores de IC5o em nM.

Tabela 1:

DHODH

IC50 em nM

Composto 1 292 Composto 2 625 Composto 12 539 Brequinar 4

Exemplo 6

Inibição da proliferação de células tumorais (Teste MTT)

Numa placa de microtitulação de 96 orifícios colocam-se lxlO4 células por orifício. Após 24 horas adicionam-se as substâncias a testar em várias concentrações. Cada grupo consiste em 4 orifícios e o controle incuba-se apenas com o meio. Após 65 horas adicionam-se 50 μΐ de MTT (brometo de 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2H-tetrazólio; 2,5 mg/ml em PBS) e após 7 horas remove-se o sobrenadante. 0 corante formado pelas células 10

V vivas dissolve-se por adição de 100 μΐ de sulfóxido dimetílico / orifício. Mede-se a extinção para cada orifício por meio de um fotómetro multiscan 340 CC (firma Flow) a 4 92 nm. As linhas celulares utilizadas, como se indica a seguir, são fornecidas pela American Type Culture Collection: HUV-EC-C é ATCC CRL 1730; A-172 é ATCC CRL 1620; L 1210 é ATCC CCL 219; LoVo é ATCC CCL 229; C 6 é ATCC CCL 107 e uma linha celular de glioblastoma de ratazana. A partir dos 4 orifícios de cada grupo calcula-se o valor médio e da curva dose-efeito determina-se o valor de IC50 com o Software 3.0 (Erthacus Software Ltd). A Tabela 2 apresenta os resultados.

Tabela 2:

Teste MTT IC50 em μΜ Célula Origem (humana) Composto 1 Composto 2 Brequinar LoVo Carcinoma de cólon 137 392 0,388 HUV-EC-C Célula endotelial 164 360 9,4 A-172 Glioblastoma 78 169 0,2 L1210 Leucemia (rato) 9,1 6,1 1,0 C6 Glioblastoma de ratazana 68 20 9 11 t' u

Exemplo 7

Procedeu-se como no exemplo 6, mas acrescentou-se ainda uridina a cada mistura. A Tabela 3 apresenta os resultados.

Tabela 3:

Teste MTT em células LoVo IC50 em μΜ

Uridina [μΜ] Composto 1 Composto 2 Brequinar 0 168,0 359,2 0, 388 1000 277,7 560,0 128,0

Os compostos referidos na Tabela 4 (pags. seguintes) preparam-se como nos exemplos 1 a 4. 0 teste dos compostos efectua-se como descrito no exemplo 6. 12 f ^ K—t

Composto Estrutura A172 C 6 LoVo HUVEC 1 N ° 0 Na* F F 78 68 137 164 2 N II TYNY^1 Na* 0 0 k^V 169 20 392 360 5 cTT'^ 0 OH N 30 5 34 94 6 O p — y° OH I ^ M 25 11 24 >400 7 Br^rv. tkL I I OH I 37 11 37 267 8 C^^0v^X- ° 0H II N 28 18 13 138 9 I N OH A^-CH, 193 21 400 >400 13

Composto Estrutura A172 C 6 LoVo HUVEC 10 F+F °Ύ*ί'>ι O OH ΧΧ.γτ> N 25 4 21 186 11 F *χχχ. ^ N N 1 OH 1 Ί 55 57 160 187 12 c F CH, 1 c HO í^> 43 6 55 322 13 ÇHj ΡνΤιϊ1 ° oh II N • 32 13 15 >400 14 N. \o °N.* M F ch3 58 7 61 197 15 •V'‘XX.xx II N 13 2 21 98 16 0 OH C.^CH^N^V^ II N 17 36 7 299 14

L·, W

Composto Estrutura A172 C 6 LoVo HUVEC 17 K I H OH 1 YO* F 55 186 75 127 18 N II OH 0 v 0 v 190 84 110 159 19 0 HO F P kAN^X^CHi U 118 32 171 135 20 F-Cr°ia„y^ 11 ^ N 158 182 119 >400 21 1 OH 'J 1 Yçc 63 69 27 339 22 Fr^ o oh li' ^ >400 103 149 >400 23 1 /TV HON___ V"vH F ^=N p—(f ^ 94 7 75 >400 15

Composto Estrutura. A172 C 6 LoVo HUVEC 24 HO ° XXN 22 34 6 74 25 I 1 HjC OH 95 87 306 301 26 OH M W, F F 200 24 146 378 27 F 1 OH í 1 vn o »<Aa 142 126 153 >400

Lisboa, 28 de Agosto de 2001 O AGENTE OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL 16

Claims (4)

1. REIVINDICAÇÕES 1. utilização de um sal de sódio ou de lisinio do composto de fórmula II

   e/ou a uma eventual forma estereoisomérica do sal de sódio ou de lisinio do composto de fórmula II, para a preparação de um medicamento para o tratamento de doenças cancerosas, em que R1 significa a) cicloalquilo-(C3-C5), b) alcenilo-(C2~C6) ou c) alcinilo-(C2-C6), R2 significa a) -CF3, b) -O-CF3, c) -S-CF3, d) -OH, e) -NO2, f) halogéneo, g) benzilo, h) fenilo, i) -CN, 3) -O-fenilo ou k) -O-fenilo, mono- ou poli-substituído por 1) alquilo- (C1-C4), 2) halogéneo, \

   U. ^*· t 3) -O-CF3 ou 4) -0-CH3, R1 significa a) alquilo- (C1-C4) , b) halogéneo ou c) um átomo de hidrogénio, e X significa a) um grupo -CH ou b) um átomo de azoto.
2. 2. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que R1 significa a) ciclopropilo, b) alcenilo-(C2-C3) ou c) alcinilo-(C3-C5), R2 significa a) -CF3, b) -0-CF3, c) -S-CF3, d) -O-fenilo, e) fenilo, f) -CN ou g) -O-fenilo, mono- ou poli-substituido por alquilo-(Ci-C4) ou halogéneo, R1 significa um átomo de hidrogénio ou metilo, e X significa um grupo -CH. 2 1 Utilização de acordo com as reivindicações 1 ou 2, em que R1 significa ciclopropilo, alcenilo-C3 ou alcinilo-C4, R2 significa -S-CF3, -CN, 2-metil-4-clorofenilo ou CF3, R1 significa um átomo de hidrogénio, e X significa um grupo -CH.
3. 4. Utilização de acordo com uma ou mais das reivindicações 1 a 3, caracterizada por se empregar um sal de lisina ou de sódio de amida do ácido N-(4-trifluorometilfenil)-2-ciano-3-hidroxi-hept-2-eno-6-ino-carboxílico ou um sal de lisina ou de sódio de (4-cianofenil)-amida do ácido 2-ciano-3- ciclopropil-3-hidroxi-acrílico.
4. 5. Utilização de acordo com uma ou mais das reivindicações 1 a 4, para a preparação de um medicamento para o tratamento de leucemias, leucemias crónicas das células dos tipos T e B, linfoma de Hodgkin ou não Hodgkin, carcinomas, cancro do pulmão, cancro do ovário, cancro dos nódulos linfáticos, sarcomas, sarcoma de Kaposi, meninginoma, cancro do intestino, tumores cerebrais, cancro da mama, cancro do estômago, cancro do pâncreas, cancro da próstata ou cancro da pele. Lisboa, 28 de Agosto de 2001 0 AGENTE OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL

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