WO2023169554A1 - 甲硫氨酸腺苷转移酶抑制剂、其制备方法及应用 - Google Patents

甲硫氨酸腺苷转移酶抑制剂、其制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本申请提供了一种甲硫氨酸腺苷转移酶抑制剂、包含其的药物组合物及应用。本申请的化合物具有优异的MAT2a酶抑制活性，同时对癌症细胞的生长具有优异的抑制作用，因此本申请的化合物可在MAT2a相关的癌症或肿瘤疾病中具有优异的治疗效果。

Description

甲硫氨酸腺苷转移酶抑制剂、其制备方法及应用 技术领域
本申请涉及医药化学领域，具体涉及一种甲硫氨酸腺苷转移酶抑制剂、其制备方法及在制药领域的应用。
背景技术
肿瘤抑制基因的功能缺失突变非常普遍，但却很少有根据肿瘤抑制基因缺失突变来实现选择性靶向的疗法，这很容易理解，即缺失的蛋白很难被直接抑制来获得疗效。由纯合缺失而失活的抑癌基因的靶向治疗尤为困难，因为缺乏残留蛋白，使得直接激活、稳定或修复抑癌基因的治疗策略失效。
甲硫氨酸腺苷转移酶(MAT)也称为S-腺苷甲硫氨酸合成酶，是催化甲硫氨酸和ATP合成S-腺苷甲硫氨酸(SAM或AdoMet)的细胞酶，被认为是甲硫氨酸循环的限速步骤。SAM是多胺生物合成中的丙氨基供体，并且是用于DNA甲基化的主要甲基供体，其参与基因转录和细胞增殖以及次级代谢产物的生成。MAT基因可以分为MAT1A基因与MAT2A基因，编码唯一能催化合成SAM的酶——MAT。MAT有三种同工酶，分别是MAT I、MAT III和MAT Ⅱ，前两种是MAT1A基因编码的产物，后一种是MAT2A基因编码的产物。MAT1A基因主要在成人肝脏中表达，而MAT2A基因在除肝脏外的人体组织中广泛表达。越来越多的研究发现，MAT2a蛋白在其他癌症组织或细胞中也存在高表达，如乳腺癌、肠癌、白血病及淋巴瘤等，而MAT2A基因的沉默导致相应癌细胞死亡，表明MAT2a蛋白具有作为治疗靶点的潜力。
甲基硫代腺苷磷酸化酶(Methylthioadenosine phosphorylase，MTAP)是一种在所有正常组织均有表达的酶，它催化甲基硫代腺苷(Methylthioadenosine，MTA)转化为腺嘌呤和5-甲基硫代糖苷-1-磷酸。许多恶性肿瘤细胞系缺乏MTAP活性，同时，在神经胶质瘤、黑色素瘤、胰腺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、星形细胞瘤、骨肉瘤、头部和颈部癌症、黏液样软骨肉瘤、卵巢癌、子宫内膜癌、乳腺癌、软组织肉瘤及非霍奇金淋巴瘤等大量原发病灶中也检测到了MTAP的活性丢失。当MTAP缺失时，细胞中MTA将累积到约100μM，并且细胞会开始排出MTA。MTA的异常积累导致了蛋白精氨酸甲基转移酶-5(Protein Arginine Methyltransferase 5，PRMT5)的脆弱性。由于PRMT5利用SAM作为甲基供体底物，因此抑制MAT2a活性降低了细胞内SAM的浓度，从而使MTAP缺失细胞中的PRMT5甲基化活性选择性降低，低于生长所需的阈值水平。因此抑制MAT2a活性可通过抑制PRMT5活性在MTAP缺失的细胞中产生联合杀伤力，可为多种癌症提供治疗益处。
发明内容
本申请的目的之一是提供一种具有MAT2a抑制活性的化合物。
具体的，本申请提供下式Ⅰ结构所示的化合物，其药学上可接受的盐、水合物、异构体、前药及混合物：
其中，R1、R2各自独立的选自H、-OH、-OR3、-CN、-NR4R5、3至6元脂杂环基、
R3选自-CH3、-CH2CH2OH、-CH2CH2NH2；
R4、R5各自独立地选自H、C1-C3烷基、环烷基、-CH2CH2OH、-CH2CH2NH2。
在某些具体的实施方式中，本申请的上述式Ⅰ结构所示的化合物不为
在某些具体的实施方式中，本申请所述R1、R2各自独立的选自H、-OH、-OR3、-CN、-NR4R5、3至6元脂杂环基、且R1和R2不同时为H。
在某些具体的实施方式中，本申请所述R1选自H、-OH、-OR3、-CN、-NR4R5、3至6元脂杂环基、 且所述R2选自-OH、-OR3、-CN、-NR4R5、3至6元脂杂环基、或者本申请所述R1选自-OH、-OR3、-CN、-NR4R5、3至6元脂杂环基、且所述R2选自H、-OH、-OR3、-CN、-NR4R5、3至6元脂杂环基、
在某些具体的实施方式中，本申请所述R1、R2各自独立的选自H、-OH、-OCH3、-OCH2CH2OH、-OCH2CH2NH2、-CN、-NH2、-NHCH3、-NHCH2CH3、-NHCH2CH2CH3、-N(CH3)2、-N(CH2CH3)2、-N(CH2CH2CH3)2、-NH-(C3-C6环烷基)、-NHCH2CH2OH、-NHCH2CH2NH2、
在某些具体的实施方式中，本申请所述R1选自H、-OH、-OR3或-CN，且所述R2选自-OH、-OR3或-CN；或者本申请所述R1选自-OH、-OR3或-CN，且所述R2选自H、-OH、-OR3或-CN。
在某些具体的实施方式中，本申请所述R1选自H、-OH、-OCH3、-OCH2CH2OH、-OCH2CH2NH2或-CN，且所述R2选自-OH、-OCH3、-OCH2CH2OH、-OCH2CH2NH2或-CN；或者本申请所述R1选自-OH、-OCH3、-OCH2CH2OH、-OCH2CH2NH2或-CN，且所述R2选自H、-OH、-OCH3、-OCH2CH2OH、-OCH2CH2NH2或-CN。
在某些具体的实施方式中，本申请所述R1选自H、-OH、-OCH2CH2OH或-CN，且所述R2选自-OH、-OCH2CH2OH或-CN；或者本申请所述R1选自-OH、-OCH2CH2OH或-CN，且所述R2选自H、-OH、-OCH2CH2OH或-CN。
在某些具体的实施方式中，本申请提供如下式II、式III、式IIa、式IIIa、式IV、式V、式VI结构所示的化合物及其药学上可接受的盐、水合物、异构体、前药及混合物：
本申请的另一目的是提供前述化合物及其药学上可接受的盐、水合物、异构体、前药或混合物用于制备治疗MAT2a相关疾病的药物的用途。或者，本申请提供用于治疗MAT2a相关疾病的前述化合物及其药学上可接受的盐、水合物、异构体、前药或混合物。或者，本申请提供一种治疗MAT2a相关疾病的方法，包括向有需要的受试者给予前述化合物及其药学上可接受的盐、水合物、异构体、前药或混合物。
本申请的另一目的是提供一种药物组合物，其中含有治疗有效剂量的前述任意一个或多个本申请的化合物，或包含前述本申请化合物的药学上可接受的盐、水合物、异构体、前药或混合物，以及药学上可接受的载体。或者，本申请的前述化合物及其药学上可接受的盐、水合物、异构体、前药或混合物以药物组合物的形式存在。
本申请进一步提供上述药物组合物用于制备治疗MAT2a相关疾病的药物的用途。或者，本申请提供用于治疗MAT2a相关疾病的上述药物组合物。或者，本申请提供一种治疗MAT2a相关疾病的方法，包括向有需要的受试者给予上述药物组合物。
本申请中所述MAT2a相关疾病为癌症或肿瘤，进一步，所述癌症或肿瘤包括成神经细胞瘤、肠癌(如直肠癌、结肠癌、家族性腺瘤性息肉病癌和遗传性非息肉病结肠直肠癌)、食管癌、唇癌、喉癌、鼻咽癌、下咽癌、舌癌、唾液腺癌、胃癌、腺癌、甲状腺髓样癌、乳头状甲状腺癌、肾癌、肾实质癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫体癌、子宫内膜癌、绒毛膜癌、胰腺癌、前列腺癌、睾丸癌、乳腺癌、泌尿系统癌、黑色素瘤、脑肿瘤(如成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、脑膜瘤、成神经管细胞瘤和外周神经外胚层肿瘤)、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、成人T-细胞白血病、肝细胞癌、胆囊癌、支气管癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、多发性骨髓瘤、基底细胞瘤、畸胎瘤、成视网膜细胞瘤、脉络膜黑色素瘤、精原细胞瘤、横纹肌肉瘤、颅咽管瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、肌肉瘤、脂肉瘤、纤维肉瘤、尤因肉瘤和浆细胞瘤。在一个实施方案中，癌症是肺癌、非小细胞肺癌(NSLC)、支气管肺泡细胞肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、膀胱癌、肾癌或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、间皮瘤、肝细胞癌、胆道癌、慢性或急性白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、中枢神经系统(CNS) 肿瘤、脊柱肿瘤、脑干神经胶质瘤、多形性胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、神经鞘瘤、室管膜瘤、成神经管细胞瘤、脑膜瘤、鳞状细胞癌、垂体腺瘤，包括任何上述癌症的难治性形式，或一种或多种上述癌症的组合。
本申请的另一目的是提供一种治疗癌症或肿瘤疾病的方法，包括给予所需要的患者一种或多种前述的药物组合物或式Ⅰ化合物或其药学上可接受的盐、水合物、异构体、前药或混合物。
术语定义
除非另有说明，本文所用的下列术语和短语旨在具有下列含义。一个特定的术语或短语在没有特别定义的情况下不应该被认为是不确定的或不清楚的，而应该按照普通的含义去理解。当本文中出现商品名时，意在指代其对应的商品或其活性成分。
这里所采用的术语“药学上可接受的”是指适用于与人类和动物的组织接触使用，而没有过多的毒性、刺激性、过敏性反应或其它问题或并发症，与合理的利益/风险比相称。
术语“药学上可接受的盐”是指本申请化合物的盐，由本申请发现的具有特定取代基的化合物与相对无毒的酸或碱制备。当本申请的化合物中含有相对酸性的功能团时，可以通过在纯的溶液或合适的惰性溶剂中用足够量的碱与这类化合物的中性形式接触的方式获得碱加成盐。当本申请的化合物中含有相对碱性的官能团时，可以通过在纯的溶液或合适的惰性溶剂中用足够量的酸与这类化合物的中性形式接触的方式获得酸加成盐。
本申请的化合物可以存在特定的互变异构体。除非另有说明，术语“互变异构体”是指在室温下，不同官能团异构体处于动态平衡，并能很快的相互转化。若互变异构体是可能的(如在溶液中)，则可以达到互变异构体的化学平衡。例如，质子互变异构体(proton tautomer)(也称质子转移互变异构体(prototropic tautomer))包括通过质子迁移来进行的互相转化，如酮-烯醇异构化和亚胺-烯胺异构化。价键异构体(valence tautomer)包括一些成键电子的重组来进行的相互转化。本申请中代表性的互变异构体示例如：式II与式IIa结构所示化合物互为互变异构体，式III与式IIIa结构所示化合物互为互变异构体。
本文中的术语“异构体”可包括互变异构体、几何异构体、立体异构体和阻转异构体。
本申请的化合物可以存在特定的几何或立体异构体或阻转异构体形式。本文中的术语“立体异构体”是指由于分子中的原子在空间上排列方式不同所产生的异构体。本申请设想所有的这类化合物，包括顺式和反式异构体、(-)-和(+)-对映体、(R)-和(S)-对映体、非对映异构体、(D)-异构体、(L)-异构体，及其外消旋混合物和其他混合物，所有这些异构体或其混合物都属于本申请的范围之内。
“烷基”是指直链或含支链的饱和脂族烃基，例如：C1-C3烷基是指含有1到3个(包括1个、2个或3个)碳原子的饱和脂肪族烃基，包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基等及他们的各种异构体。
“环烷基”是指饱和或部分不饱和的单环或多环环状烃取代基。例如，“C3-C6环烷基”指包含3至6(例如3个、4个、5个或6个)个碳原子的环烷基，典型的C3-C6环烷基包括但不限于：环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基等。
“脂杂环基”可以指饱和的单环烃取代基，其中一个或多个环原子被选自N、O、S的杂原子取代，其余环原子为碳，或者该术语还可包括不饱和脂杂环基。例如，“3-6元脂杂环”可以是指包含3-6个环原子的饱和环状烃取代基，其中一个或多个环原子被选自N、O、S的杂原子取代，其余环原子为碳。具体的示例包括但不限于：氧杂环丁基、吡咯烷基、四氢呋喃基、吗啉基等。
本申请中的缩写均为本领域技术人员已知的，除另有说明外，均代表本领域所通知的含义。例如：DMF是指N,N-二甲基甲酰胺；THF是指四氢呋喃；Me是指甲基。
除非另有说明，本文使用的术语“包含、包括和含有(comprise、comprises和comprising)”或其等同物(contain、contains、containing、include、includes、including)为开放式表述，意味着除所列出的要素、组分和步骤外，还可涵盖其它未指明的要素、组分和步骤。
除非另有说明，本文所使用的表示成分的量、测量值或反应条件的所有数字应理解为在所有情况下均由术语“约”修饰。当与百分比相连时，术语“约”可以表示例如±1％、优选±0.5％、更优选±0.1％。
除非上下文另有明确指示，本文中的单数术语涵盖复数的指示对象，反之亦然。类似地，除非上下文另有明确指示，本文中的词语“或”意在包括“和”。
试验证明，本申请化合物可具有优异的MAT2a酶抑制活性，可对癌症细胞的生长具有优异的抑制作用，通过MTAP缺失(即MTAP-/-)和野生型细胞实验对比结果发现，本申请化合物(尤其是式IV化合物)可对MTAP缺失的癌细胞具有高度选择活性。同时，本申请化合物在肝脏中代谢稳定性优异，生物利用度高，安全性好，溶解性好，具有极佳的成药性，因此本申请化合物将在MAT2a相关的癌症或肿瘤疾病中具有优异的应用前景。
具体实施方式
下面通过举例说明本申请的化合物和中间体的合成方法，下述举例仅作为本申请的示例，而不应作为对本申请范围的限制。除特殊说明外，本申请中所涉及的原料和试剂均可通过商业化渠道获得，具体渠道来源并不影响本申请技术方案的实施。
制备例1：2-((4-氯苯基)氨基)-6-(三氟甲基)烟腈的制备
将2-氯-6-(三氟甲基)烟腈(1.0g)溶于1,4-二氧六环(10mL)，加入4-氯苯胺(1.0g)，120℃下由微波引发反应12小时，LCMS显示大部分原料反应完全。将反应体系加入乙酸乙酯中，用饱和碳酸氢钠调节至弱碱性，分液，水相再用乙酸乙酯萃取两次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，所得粗品经硅胶柱层析纯化，得标题化合物1.0g。
MS(ESI)m/z(M+H)+＝298.1.
实施例1：4-氨基-1-(4-氯苯基)-3-(3-羟基喹喔啉-6-基)-7-(三氟甲基)-1,8-萘啶-2(1H)-酮的制备
步骤1：4-氨基-3-硝基苯乙酸的制备
将4-氟-3-硝基苯乙酸(1g)溶于25％氨水(20mL)中，升温至回流搅拌过夜。LCMS监测原料消失后，将反应体系减压浓缩，残留物经反相柱层析纯化目标化合物800mg。
MS(ESI)m/z(M+H)+＝197.1.
步骤2：2-乙氧基-2-氧代乙基2-(4-((2-乙氧基-2-氧代乙基)氨基)-3-硝基苯基)乙酸酯的制备
将4-氨基-3-硝基苯乙酸(800mg)加入到溴乙酸乙酯(8mL)中，再加入碳酸钾(0.8g)，升温至140℃搅拌反应过夜。LCMS监测原料大部分消失后，加水淬灭反应，乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，残留物经硅胶柱层析纯化得到目标化合物950mg。
MS(ESI)m/z(M+H)+＝369.1.
步骤3：2-乙氧基-2-氧代乙基2-(3-氧代-1,2,3,4-四氢喹喔啉-6-基)乙酸酯的制备
将2-乙氧基-2-氧代乙基2-(4-((2-乙氧基-2-氧代乙基)氨基)-3-硝基苯基)乙酸酯(950mg)溶于四氢呋喃(30mL)中，再加入10％钯碳(0.2g)，氢气置换三次，室温搅拌反应4小时，过滤，再将滤液升温至60℃搅拌反应1小时，LCMS监测原料消失，减压浓缩，残留物经硅胶柱层析纯化得到目标化合物680mg。
MS(ESI)m/z(M+H)+＝293.1.
步骤4：2-乙氧基-2-氧代乙基2-(3-羟基喹喔啉-6-基)乙酸酯的制备
将2-乙氧基-2-氧代乙基2-(3-氧代-1,2,3,4-四氢喹喔啉-6-基)乙酸酯(680mg)溶于二氯甲烷(20mL)中，再加入2,3-二氯-5,6-二氰基苯醌(750mg)，室温搅拌反应1小时，LCMS监测原料消失后，停止反应，体系加入饱和亚硫酸氢钠溶液淬灭，二氯甲烷萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，残留物经硅胶柱层析纯化得到目标化合物550mg。
MS(ESI)m/z(M+H)+＝291.1.
步骤5:2-(3-羟基喹喔啉-6-基)乙酸的制备
将2-乙氧基-2-氧代乙基2-(3-羟基喹喔啉-6-基)乙酸酯(550mg)溶于四氢呋喃和水(THF:H2O＝1:1(v/v),20mL)的混合溶液中，再加入氢氧化锂一水合物(400mg)，室温搅拌反应1小时，LCMS监测原料消失，停止反应，体系减压浓缩，残留物经反相柱层析纯化得到目标化合物350mg。
MS(ESI)m/z(M+H)+＝205.1.
步骤6:4-氨基-1-(4-氯苯基)-3-(3-羟基喹喔啉-6-基)-7-(三氟甲基)-1,8-萘啶-2(1H)-酮的制备
将2-(3-羟基喹喔啉-6-基)乙酸(110mg)溶于四氢呋喃(10mL)中，再加入1-羟基苯并三唑(110mg)和N,N'-二异丙基碳二亚胺(100mg)，室温搅拌反应6小时。另取2-((4-氯苯基)氨基)-6-(三氟甲基)烟腈(制备例1)(80mg)溶于四氢呋喃(10mL)中，于冰浴下加入氢化钠(110mg)，搅拌30分钟后，然后将2-(3-羟基喹喔啉-6-基)乙酸体系滴加到2-((4-氯苯基)氨基)-6-(三氟甲基)烟腈体系中，滴加完毕，继续搅拌反应30分钟后，LCMS监测原料消失，停止反应，体系加入4M盐酸水溶液调节pH至弱酸性，减压浓缩，残留物经Prep-HPLC纯化得到目标化合物30mg。
MS(ESI)m/z(M+H)+＝484.1.
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.50(s,1H),8.87(d,J＝8.2Hz,1H),8.19(s,1H),7.84(d,J＝8.2Hz,1H),7.78(d,J＝8.2Hz,1H),7.57-7.53(m,2H),7.36-7.32(m,2H),7.31-7.26(m,2H),6.74(s,2H).
实施例2：4-氨基-1-(4-氯苯基)-3-(2-羟基喹喔啉-6-基)-7-(三氟甲基)-1,8-萘啶-2(1H)-酮的制备
步骤1：2-(4-氨基-3-硝基苯基)乙酸乙酯的制备
将2-(4-氨基-3-硝基苯基)乙酸(500mg)溶于乙醇(10mL)中，加入浓硫酸(1mL)，升温至60℃搅拌反应4小时。LCMS监测原料消失后，减压浓缩除去乙醇，向残留物中加入30mL水，用饱和碳酸钠调节至弱碱性，乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，残留物经硅胶柱层析纯化得目标化合物450mg。
MS(ESI)m/z(M+H)+＝225.1.
步骤2：2-氯-2-氧代乙烷-1,1-二乙酸二酯的制备
将乙醛酸水溶液(5.2g,50％w/w)加入到冰乙酸(8mL)中，再加入醋酸酐(35mL)，升温至回流搅拌2小时，减压浓缩除去溶剂，再向残留物中加入甲苯(100mL)，减压浓缩除去低挥发溶剂，再向残留物中加入二氯甲烷(50mL)和氯化亚砜(9mL)，升温至回流搅拌1小时，减压浓缩除去溶剂，再向残留物中加入二氯甲烷(100mL)，减压浓缩除去低挥发溶剂，得目标化合物(5.5g)，粗品未经纯化直接用于下步反应。
步骤3：2-((4-(2-乙氧基-2-氧乙基)-2-硝基苯基)氨基)-2-氧代乙烷-1,1-二乙酸二酯的制备
将2-(4-氨基-3-硝基苯基)乙酸乙酯(450mg)溶于二氯甲烷(10mL)中，冰浴下加入吡啶(480mg)和2-氯 -2-氧代乙烷-1,1-二乙酸二酯(500mg)，搅拌反应0.5小时。LCMS监测原料消失后，向反应体系中加入水(30mL)，用二氯甲烷萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，残留物经硅胶柱层析纯化得目标化合物400mg。
步骤4：2-(2-氧代-1,2,3,4-四氢喹喔啉-6-基)乙酸乙酯的制备
将2-((4-(2-乙氧基-2-氧乙基)-2-硝基苯基)氨基)-2-氧代乙烷-1,1-二乙酸二酯(400mg)溶于乙醇和水(EtOH:H2O＝2:1(v/v),10mL)的混合溶液中，再加入氯化铵(100mg)和锌粉(300mg)，升温至回流搅拌反应2小时。LCMS监测原料消失后，垫硅藻土过滤，滤液减压浓缩，残留物经硅胶柱层析纯化得到目标化合物180mg。
MS(ESI)m/z(M+H)+＝235.1.
步骤5：2-(2-羟基喹喔啉-6-基)乙酸乙酯的制备
将2-(2-氧代-1,2,3,4-四氢喹喔啉-6-基)乙酸乙酯(180mg)溶于二氯甲烷(10mL)中，再加入2,3-二氯-5,6-二氰基苯醌(200mg)，室温搅拌反应1小时，LCMS监测原料消失后，停止反应，体系加入饱和亚硫酸氢钠溶液淬灭，二氯甲烷萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，残留物经硅胶柱层析纯化得到目标化合物150mg。
MS(ESI)m/z(M+H)+＝233.1.
步骤6：2-(2-羟基喹喔啉-6-基)乙酸的制备
将2-(2-羟基喹喔啉-6-基)乙酸乙酯(150mg)溶于四氢呋喃和水(THF:H2O＝1:1(v/v),10mL)的混合溶液中，再加入氢氧化锂一水合物(130mg)，室温搅拌反应1小时，LCMS监测原料消失，停止反应，体系减压浓缩，残留物经反相柱层析纯化得到目标化合物100mg。
MS(ESI)m/z(M+H)+＝205.1.
步骤7：4-氨基-1-(4-氯苯基)-3-(2-羟基喹喔啉-6-基)-7-(三氟甲基)-1,8-萘啶-2(1H)-酮的制备
将2-(2-羟基喹喔啉-6-基)乙酸(100mg)溶于四氢呋喃(10mL)中，再加入1-羟基苯并三唑(100mg)和N,N'-二异丙基碳二亚胺(100mg)，室温搅拌反应6小时。另取2-((4-氯苯基)氨基)-6-(三氟甲基)烟腈(制备例1)(80mg)溶于四氢呋喃(10mL)中，于冰浴下加入氢化钠(110mg)，搅拌30分钟后，然后将2-(2-羟基喹喔啉-6-基)乙酸体系滴加到2-((4-氯苯基)氨基)-6-(三氟甲基)烟腈体系中，滴加完毕，继续搅拌反应30分钟后，LCMS监测原料消失，停止反应，体系加入4M盐酸水溶液调节pH至弱酸性，减压浓缩，残留物经Prep-HPLC纯化得到目标化合物35mg。
MS(ESI)m/z(M+H)+＝484.1.
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.98(brs,1H),8.86(d,J＝8.2Hz,1H),8.21(s,1H),7.77(d,J＝8.2Hz,1H),7.73(d,J＝1.8Hz,1H),7.59-7.49(m,3H),7.38(d,J＝8.4Hz,1H),7.36-7.30(m,2H),6.67(s,2H).
实施例3：7-(4-氨基-1-(4-氯苯基)-2-氧代-7-(三氟甲基)-1,2-二氢-1,8-萘啶-3-基)喹喔啉-2-甲腈的制备
步骤1：2-乙氧基-2-氧代乙基2-(3-(((三氟甲基)磺酰基)氧基)喹喔啉-6-基)乙酸酯的制备
将2-乙氧基-2-氧代乙基2-(3-羟基喹喔啉-6-基)乙酸酯(合成见实施例1中步骤4)(0.4g)加入到N,N-二甲基甲酰胺(12mL)中，然后加N-苯基双(三氟甲烷磺酰)亚胺(0.74g)和三乙胺(0.21g)，于室温搅拌反应1小时后。LCMS监测原料大部分消失后，加水淬灭反应，乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，残留物经硅胶柱层析纯化得到目标化合物粗品0.32g
MS(ESI)m/z(M+H)+＝423.1.
步骤2：2-乙氧基-2-氧乙基-2-氰基喹喔啉-6-乙酸酯的制备
将2-乙氧基-2-氧代乙基2-(3-(((三氟甲基)磺酰基)氧基)喹喔啉-6-基)乙酸酯(0.32g)溶于N,N-二甲基甲酰胺(10mL)中，然后加入氰化锌(0.17g)和四(三苯基膦)钯(0.04g)，氩气置换保护，100℃搅拌反应4小时后。LCMS监测大部分原料消失，停止反应，体系减压浓缩，残留物经硅胶柱层析纯化得到目标化合物0.15g。
MS(ESI)m/z(M+H)+＝300.1.
步骤3：2-(3-氰基喹啉-6-基)乙酸的制备
将2-乙氧基-2-氧乙基-2-氰基喹喔啉-6-乙酸酯(150mg)溶于乙酸(10mL)中，再加入4M盐酸水溶液(2mL)，然后于油浴锅80℃反应2小时后，LCMS监测原料消失，停止反应，体系冷却后加入碳酸氢钠调节pH至弱酸性，体系略作浓缩，残留物经反相柱层析纯化得到目标化合物85mg。
MS(ESI)m/z(M+H)+＝214.1.
步骤4：7-(4-氨基-1-(4-氯苯基)-2-氧代-7-(三氟甲基)-1,2-二氢-1,8-萘啶-3-基)喹喔啉-2-甲腈的制备
将2-(3-氰基喹啉-6-基)乙酸(50mg)溶于四氢呋喃(6mL)中，再加入1-羟基苯并三唑(63mg)和N,N'-二异丙基碳二亚胺(59mg)，于室温搅拌反应8小时后，观察到体系变黄，另取2-((4-氯苯基)氨基)-6-(三氟甲基)烟腈(制备例1)(104mg)溶于四氢呋喃(10mL)中，于冰浴下加入钠氢(47mg)，搅拌30分钟后，将2-(3-氰基喹啉-6-基)乙酸体系滴加到2-((4-氯苯基)氨基)-6-(三氟甲基)烟腈体系中，滴加完毕，继续搅拌反应30分钟后，LCMS监测原料消失，停止反应，体系加入4M盐酸水溶液调节pH至弱酸性，乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，减压浓缩，残留物经Prep-HPLC纯化得到目标化合物15mg。
MS(ESI)m/z(M+H)+＝493.1.
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.39(s,1H),8.91(d,J＝8.2Hz,1H),8.26(d,J＝8.7Hz,1H),8.18(d,J＝1.8Hz,1H),8.04(dd,J＝8.8,1.9Hz,1H),7.82(d,J＝8.1Hz,1H),7.59–7.53(m,2H),7.40–7.33(m,2H),6.95(s,2H).
实施例4：6-(4-氨基-1-(4-氯苯基)-2-氧代-7-(三氟甲基)-1,2-二氢-1,8-萘啶-3-基)喹喔啉-2-甲腈的制备
步骤1：2-(2-(((三氟甲基)磺酰基)氧基)喹喔啉-6-基)乙酸乙酯的制备
将2-(2-羟基喹喔啉-6-基)乙酸乙酯(合成见实施例2中步骤5)(300mg)、N-苯基双(三氟甲烷磺酰)亚胺(690mg)、N,N-二异丙基乙胺(250mg)溶于N,N-二甲基甲酰胺(5mL)中，体系于室温下搅拌过夜，LCMS监测原料消失，乙酸乙酯稀释反应液，有机相用水洗后干燥浓缩，经硅胶柱层析纯化得到淡黄色固体250mg。
MS(ESI)m/z(M+H)+＝365.0
步骤2：2-(2-氰基喹喔啉-6-基)乙酸乙酯的制备
将2-(2-(((三氟甲基)磺酰基)氧基)喹喔啉-6-基)乙酸乙酯(300mg)、氰化锌(690mg)、四(三苯基膦)钯(250mg)溶于N,N-二甲基甲酰胺(5mL)中，体系于无水无氧氮气保护下100℃搅拌4小时，LCMS监测原料消失。乙酸乙酯稀释反应液，有机相用水洗后干燥浓缩，经硅胶柱层析纯化得到淡黄色固体160mg。
MS(ESI)m/z(M+H)+＝242.0.
步骤3：2-(2-氰基喹喔啉-6-基)乙酸乙酸的制备
将2-(2-氰基喹喔啉-6-基)乙酸乙酯(160mg)溶于乙酸(5mL)和盐酸(1mL,4M)的混合溶剂中，体系于80℃搅拌2小时，LCMS监测原料消失，旋干反应液，经Prep-HPLC纯化得到白色固体65mg。
MS(ESI)m/z(M+H)+＝214.0.
步骤4：6-(4-氨基-1-(4-氯苯基)-2-氧代-7-(三氟甲基)-1,2-二氢-1,8-萘啶-3-基)喹喔啉-2-甲腈的制备
将2-(2-氰基喹啉-6-基)乙酸(65mg)溶于四氢呋喃(10mL)中，再加入1-羟基苯并三唑(81mg)和N,N'-二异丙基碳二亚胺(75mg)，于室温搅拌反应8小时后，观察到体系变黄，另取2-((4-氯苯基)氨基)-6-(三氟甲基)烟腈(制备例1)(270mg)溶于四氢呋喃(15mL)中，于冰水浴下加入钠氢(36mg)，搅拌30分钟后，将2-(2-氰基喹啉-6-基)乙酸体系滴加到2-((4-氯苯基)氨基)-6-(三氟甲基)烟腈体系中，滴加完毕，继续搅拌反应30分钟后，LCMS监测原料消失，停止反应，体系加入4M盐酸水溶液调节pH至弱酸性，乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，减压浓缩，残留物经Prep-HPLC纯化得到目标化合物(5mg,3％)。
MS(ESI)m/z(M+H)+＝493.1.
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.40(s,1H),8.91(d,J＝8.2Hz,1H),8.26(d,J＝8.7Hz,1H),8.20(d,J＝1.8Hz,1H),8.01(dd,J＝8.7,1.9Hz,1H),7.82(d,J＝8.2Hz,1H),7.61–7.51(m,2H),7.43–7.30(m,2H),6.99(s,2H).
实施例5：4-氨基-1-(4-氯苯基)-3-(3-(2-羟基乙氧基)喹喔啉-6-基)-7-(三氟甲基)-1,8-萘啶-2(1H)-酮的制备
步骤1：2-乙氧基-2-氧代乙基2-(3-(2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)喹喔啉-6-基)乙酸酯的制备
取三苯基膦(499mg)溶于四氢呋喃(15mL)，滴加偶氮二甲酸二异丙酯(385mg)，加毕室温搅拌15分钟，随后加入2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙烷-1-醇(278mg)。15分钟后将反应液滴加至2-乙氧基-2-氧代乙基2-(3-羟基喹喔啉-6-基)乙酸酯(合成见实施例1中步骤4)(370mg)的四氢呋喃溶液(10mL)中并搅拌4小时。LCMS显示无原料剩余。加水淬灭反应，乙酸乙酯萃取三次。合并滤液干燥浓缩后，粗品柱色谱纯化得到目标化合物(360mg)。
MS(ESI)m/z(M-84)+＝335.1
步骤2：2-(3-(2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)喹喔啉-6-基)乙酸的制备
将2-乙氧基-2-氧代乙基2-(3-(2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)喹喔啉-6-基)乙酸酯(360mg)溶于四氢呋喃和水(20mL,3:1)的混合溶液中，再加入一水合氢氧化锂(361mg)，室温搅拌反应1小时，LCMS监测原料消失，停止反应，体系减压浓缩，2M盐酸调节pH值至4，收集固体并洗涤，得目标产物(320mg)，粗品直接用于下一步反应。
MS(ESI)m/z(M-84)+＝249.1.
步骤3：4-氨基-1-(4-氯苯基)-3-(3-(2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)喹喔啉-6-基)-7-(三氟甲基)-1,8-萘啶-2(1H)-酮的制备
将2-(3-(2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)喹喔啉-6-基)乙酸(120mg)溶于四氢呋喃(10mL)中，再加入N,N'-二异丙基碳二亚胺(59mg)和1-羟基苯并三唑(63mg)，室温搅拌反应2小时备用。另取2-((4-氯苯基)氨基)-6-(三氟甲基)烟腈(制备例1)(107mg)溶于四氢呋喃(10mL)中，于冰浴下加入氢化钠(72mg,60％)，搅拌30分钟后，加入前述反应液，滴加完毕，继续搅拌反应30分钟，LCMS监测原料消失，停止反应，体系加入2M盐酸水溶液调节pH至弱酸性。乙酸乙酯萃取三次，饱和食盐水洗涤，合并有机相并干燥浓缩得到目标产物(150mg)。粗品直接用于下一步反应
MS(ESI)m/z(M-84)+＝528.1
步骤4：4-氨基-1-(4-氯苯基)-3-(3-(2-羟基乙氧基)喹喔啉-6-基)-7-(三氟甲基)-1,8-萘啶-2(1H)-酮的制备
4-氨基-1-(4-氯苯基)-3-(3-(2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)喹喔啉-6-基)-7-(三氟甲基)-1,8-萘啶-2(1H)-酮(150mg)用4M氯化氢/1,4-二氧六环(10mL)处理1小时。反应液浓缩后prep-HPLC纯化得到目标产物(2mg)。
MS(ESI)m/z(M+1)+＝528.1
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.89(d,J＝8.3Hz,1H),8.61(s,1H),8.05(d,J＝8.5Hz,1H),7.83–7.74(m,2H),7.59(dd,J＝8.5,1.9Hz,1H),7.58–7.52(m,2H),7.37–7.32(m,2H),6.74(s,2H),4.95(s,1H),4.49(t,J＝5.0Hz,2H),3.81(t,J＝5.1Hz,2H).
生物试验
相关生物试验研究表明，本申请化合物可具有优异的MAT2a抑制活性，明显优于现有同靶点化合物。本申请发明人在前期研究中发现，现有的同靶点小分子化合物在细胞抑制活性试验中表现不佳，在MTAP缺失和MTAP野生型细胞中的选择活性不理想。少数化合物虽在上述活性上取得一定突破，但化合物本身存在水溶性差，代谢稳定性差，对肝微粒体酶抑制较强，不利于药物联用，透膜性较差，不利于口服给药，或有潜在的肝毒性和心脏毒性等诸多问题，无法满足成药性要求。本发明人经过反复试验考察，意外发现本申请具体实施例中的MAT2a小分子抑制剂能够兼顾性的解决上述缺陷，具有药学活性好、安全性好，成药性佳等优势，具有极大的临床应用前景。
实验例1：酶学活性测试
利用Colorimetric assay的方法检测受试化合物对MAT2a的IC50值。
具体步骤为：化合物测试起始浓度为1μM或10μM，3倍梯度稀释成10个浓度点(包含浓度为0的点，作为阳性对照)。分别取10个不同浓度的待测化合物溶液250nL，加入384孔板备用。用Assay buffer(50mM Tris,50mM KCl,10mM MgCl2,0.05％聚氧乙烯月桂醇醚,pH 8.0)配制20μg/mL的MAT2a酶(BPS Bioscience Inc.，货号#71401-1)溶液，在不同浓度的待测化合物孔中分别加入20μg/mL的MAT2a酶溶液15μL；在阴性对照孔中加15μL的Assay buffer。振荡混匀后孵育15分钟。用Assay buffer配制底物混合溶液(含400μM ATP及600μM L-Methionine)，在阳性对照孔、待测化合物孔、阴性对照孔中分别加入10μL的底物混合溶液，开始反应，反应时间150分钟。随后加入50μL终止反应液(BIOMOL GreenTM  Reagent，Enzo lifesciences，货号BML-AK111-1000)终止反应，1000rpm离心60秒后孵育15分钟。读取OD620，处理数据。
计算公式：
Inhibition％＝(OD620阳性对照孔-OD620待测化合物孔)/(OD620阳性对照孔-OD620阴性对照孔)×100
以浓度的log值作为X轴，百分比抑制率(Inhibition％)为Y轴，采用分析软件GraphPad Prism 8的log(inhibitor)vs.response-Variable slope拟合量效曲线，从而得出各个化合物对酶活性的IC50值。实验结果如下表1所示：
表1本申请化合物对MAT2a的IC50值
结论：上述试验表明本申请化合物具有优异的MAT2a酶抑制活性。
实验例2：HCT116 MTAP基因纯合缺失细胞(来源：Horizon公司)活性测试
第1天，细胞铺板：胰蛋白酶消化下细胞后，用完全培养基(含10％FBS的RPMI-1640。FBS品牌为EXCELL，货号FND500；RPMI-1640品牌为ATCC，货号30-2001。)将细胞重悬成所需的密度，混合均匀，100μL/孔加入到96孔板中，细胞密度1000～3000个细胞每孔，放回培养箱待细胞贴壁生长，同时，设置仅加入完全培养基而无细胞的孔作为对照。第2天，加入待测化合物：加化合物前先用无血清培养基饥饿处理细胞4小时，然后加入含相应浓度化合物的完全培养基，37℃、5％CO2培养120小时，同时，设置有细胞但加入相同体积DSMO的孔作为对照。第7天，取出化合物处理后的细胞平衡至室温，每孔加入50μL的CellTiter-Glo(Promega公司，货号G7571)试剂，室温振荡2分钟使细胞充分裂解，再孵育60分钟，检测荧光强度。百分比抑制率的计算公式：
Inhibition％＝100％-(待测化合物孔信号-无细胞仅含培养基孔信号)/(有细胞但不加化合物孔信号-无细
胞仅含培养基孔信号)×100％。
采用分析软件GraphPad Prism 5的拟合量效曲线，从而得出各个化合物对细胞活性的IC50值。实验结果表明，本申请化合物具有突出的抑制癌细胞的活性，本申请化合物普遍具有低于200nM的IC50值，优选可具有低于100nM的IC50值，尤其是实施例3的化合物活性更优异，结果如下表2所示：
表2：HCT116 MTAP基因纯合缺失细胞抑制活性

NA表示未测定。
实验例3：HCT116WT细胞(来源：南京科佰)活性测试
第1天，细胞铺板：胰蛋白酶消化下细胞后，用完全培养基(含10％FBS的McCoy5A。FBS品牌为EXCELL，货号FND500；McCoy5A品牌为BOSTER，货号PYG0025。)将细胞重悬成所需的密度，混合均匀，100μL/孔加入到96孔板中，细胞密度500～1000个细胞每孔，放回培养箱待细胞贴壁生长，同时，设置仅加入完全培养基而无细胞的孔作为对照。第2天，加入待测化合物：加化合物前先用无血清培养基饥饿处理细胞4小时，然后加入含相应浓度化合物的完全培养基，37℃、5％CO2培养120小时，同时，设置有细胞但加入相同体积DSMO的孔作为对照。第7天，取出化合物处理后的细胞平衡至室温，每孔加入50μL的CellTiter-Glo(Promega公司，货号G7571)试剂，室温振荡2分钟使细胞充分裂解，再孵育60分钟，检测荧光强度。百分比抑制率的计算公式：
Inhibition％＝100％-(待测化合物孔信号-无细胞仅含培养基孔信号)/(有细胞但不加化合物孔信号-无细胞仅含培养基孔信号)×100％。
采用分析软件GraphPad Prism 5的拟合量效曲线，从而得出各个化合物对细胞活性的IC50值。本申请实施例的化合物对HCT116WT细胞均具有大于10μM的IC50值。
实验例4：肝微粒体代谢稳定性测试
肝微粒体来源信息如下表3：
将待测化合物用DMSO配制成10mM，取2μL加入198μL 50％乙腈/50％水溶液，得到100μM溶液。取肝微粒体，用1×PBS配制成0.5mg/mL，加入NADPH辅因子(终浓度为1mM)，混合物在37℃预热10分钟。取配制好的待测化合物2.5μL，分别加入222.5μL前述预热的混合物后置于37℃水浴槽开始反应。在0.5、15、30和45分钟时间点将孵育的离心管取出后分别吸取25μL孵育后的肝微粒体悬液(含化合物)，加入5倍体积终止液终止反应，3220g离心40分钟，取上清后采用LC-MS/MS检测各时间点样品中剩余化合物含量。将％剩余药量-时间做非线性线性回归后，计算化合物在肝微粒体中的半衰期(t1/2)。
表4待测化合物在人、犬、大鼠和小鼠肝微粒体的代谢稳定性
上表中代谢半衰期t1/2＝∞代表在该实验条件下化合物不被肝微粒代谢。
实验例5：肝细胞代谢稳定性测试
肝细胞来源信息：

将待测化合物用DMSO配制成10mM，取2μL加入198μL 50％乙腈/50％水溶液，得到100μM溶液。冻存的肝细胞复苏后，用培养基(William's E培养基，Gibco，货号：22551032)重悬成50万细胞每毫升的密度。取198μL肝细胞悬液至96孔板，加入2μL配制好的100μM待测化合物溶液，置于培养箱进行孵育。在0.5、15、30、60、90和120分钟时间点将孵育的96孔板取出后分别吸取25μL孵育后的细胞悬液(含化合物)，加入6倍体积终止液终止反应，3220g离心45分钟，取上清后采用LC-MS/MS检测各时间点样品中剩余化合物含量。将％剩余药量-时间做非线性线性回归后，计算化合物在肝细胞中的半衰期(t1/2)。
表5待测化合物在人、犬、大鼠和小鼠肝细胞的代谢稳定性
上表中代谢半衰期t1/2＝∞代表在该实验条件下化合物不被肝细胞代谢。
实验例6：SD大鼠体内药代动力学研究
1、试验动物
种属：SD大鼠。来源：维通利华实验动物技术有限公司。数量：每种剂型3只。
2、供试品配制：
准确称取适量的供试品，依次加入5％DMSO、10％聚乙二醇-15羟基硬脂酸酯、85％生理盐水(均为体积百分比)，涡旋或超声使充分混匀，得到供试品浓度为0.2mg/mL的给药溶液，用于静脉注射(IV)给药。
准确称取适量的供试品，依次加入5％DMSO、10％聚乙二醇-15羟基硬脂酸酯、85％生理盐水(均为体积百分比)，涡旋或超声使充分混匀，得到供试品浓度为0.5mg/mL的给药溶液，用于口服灌胃(PO)给药。
3、实验设计
4、给药方式
给药前称重，根据体重，计算给药量。通过静脉或灌胃口服给药。
5、采血时间点
给药前及给药后0.083h、0.25h、0.5h、0.75h、1h、2h、4h、8h、24h。
6、样品采集和处置
实验当天，分别于各设定时间点经由颈静脉窦采血150μL，全血样品置于含EDTA-K2的抗凝管中。全血样品于1500g条件下离心10分钟分离血浆，收集上层血浆样品至样品管中。生物样品于-40至-20℃ 条件保存待分析。
7、生物分析和数据处理
根据苏州圣苏新药开发有限公司SOP-BA-002(液质联用法生物样品分析)的要求，建立测定大鼠血浆中化合物浓度的LC-MS/MS分析方法，并用于测定本实验获得的生物样品中化合物的浓度。
采用Pharsight Phoenix 8.0中的非房室模型计算药代动力学参数。
表6 SD大鼠静脉和口服给予受试化合物的体内药代动力学研究数据
实验例7：ICR小鼠体内药代动力学研究
1、试验动物
种属：ICR小鼠，SPF级。来源：上海西普尔-必凯实验动物有限公司。数量：每种剂型3只。
2、供试品配制
准确称取适量的供试品，依次加入5％DMSO、10％聚乙二醇-15羟基硬脂酸酯、85％生理盐水(均为体积百分比)，涡旋或超声使充分混匀，得到供试品浓度为0.2mg/mL的给药溶液，用于静脉注射(IV)给药。
准确称取适量的供试品，依次加入5％DMSO、10％聚乙二醇-15羟基硬脂酸酯、85％生理盐水(均为体积百分比)，涡旋或超声使充分混匀，得到供试品浓度为1mg/mL的给药溶液，用于口服灌胃(PO)给药。
3、实验设计
4、给药方式
给药前称重，根据体重，计算给药量。通过静脉或灌胃口服给药。
5、采血时间点
给药前及给药后0.083h、0.25h、0.5h、1h、2h、4h、6h、8h、24h。
6、样品采集和处置
经颌下静脉或其它合适方式采血，每个样品采集约0.04mL，全血样品置于含EDTA-K2的抗凝管中。全血样品于1500g条件下离心10分钟分离血浆，收集上层血浆样品至样品管中。生物样品于-40至-20℃条件保存待分析。
7、生物分析和数据处理
检测受试物血药浓度，进行血浆药物浓度-时间曲线绘制时，BLQ(最低检测限)均记为0。进行药代参数计算时，给药前的浓度按照0计算；Cmax之前的BLQ(包括“No peak”)按照0计算；Cmax之后出现的BLQ(包括“No peak”)一律不参与计算。通过不同时间点的血药浓度数据，运用WinNonlin计算药代动力学参数，如AUC(0-t)、T1/2、Cmax等。
表7 ICR小鼠鼠静脉和口服给予受试化合物的体内药代动力学研究数据
实验例8：Caco-2细胞体外渗透性测试
1.细胞培养及接种铺板
在HTS TranswellTM细胞培养板(品牌：康宁；货号：3391)中接种Caco-2细胞，板孔中培养基体积为50μL，每24h更换一次培养基。
2.检测电阻
Caco-2细胞培养14～16天后形成融合的单细胞层，检测电阻。单细胞层的跨膜电阻达到230Ω·cm2，可用于下一步渗透性测试。
3.渗透性测试
首先配制化合物工作溶液，用DMSO将待测化合物配制成2mM，再以HBSS缓冲液(含4％BSA的10mM HEPES缓冲液，pH 7.4)进一步稀释到10μM获得测试工作溶液。弃去TranswellTM细胞培养板中培养液，用37℃HBSS缓冲液清洗细胞表面3次，然后加入37℃HBSS缓冲液，置于37℃孵箱中孵育30分钟。A→B渗透性测试：吸去缓冲溶液，在上层小室(顶端，Apical，A面)加入含有受试药物的工作溶液，作为供给液，下层小室(基底端；Basolateral，B面)加入空白的HBSS缓冲液作为接收液。B→A渗透性(外排)测试：吸去缓冲溶液，在A面加入空白的HBSS缓冲液作为接收液，在B面加入含化合物的工作溶液作为给药端溶液。
4.采样和检测
在TranswellTM板中取适量的给药溶液作为T0样品，然后置于37℃培养箱中温孵2h。孵育结束后，在接收端取样。样品采用LC-MS/MS方法进行检测。
5.数据分析
表观渗透系数(Papp，单位：×10-6cm/s)：
VR为接收端溶液(即，接收液)的体积(A→B：接收端为基底端；B→A：接收端为顶端)，Area为Transwell-96孔板膜面积(0.0804cm2)，Time为孵育时间(单位：s)，CR为样品接收端的药物浓度，C0为样品最初T0点时的药物浓度。
外排率(ER)：
Papp(B→A)为由基底端到顶端的表观渗透系数，Papp(A→B)为由顶端到基底端的表观渗透系数。表8 Caco-2细胞体外渗透性测试数据
注：从A→B接收端无法检测到待测化合物，即低于检测限，截止值根据待测化合物的检测限计算获得。
实验例9：化合物溶解性测试
1.化合物准备
用DMSO将待测化合物配制成10mM溶液待用。
2.溶解度测试
取15μL浓度为10mM的待测化合物于96孔板，加入485μL的1×PBS(pH 7.4)。板孔密封后置于摇床中，在25℃、1100rpm的条件下孵育2h。2h后，将孵育后的500μL样品转移到过滤板，使用真空歧管对样品进行过滤。从滤液中取5μL，与5μL DMSO混匀后，再加入490μL超纯水混匀，采用LC-MS测试化合物浓度。
3.标准品
取6μL浓度为10mM的待测化合物于96孔板，加入194μL DMSO溶液，混合均匀后，取5μL所得溶液与5μL的PBS缓冲液混匀，再加入490μL超纯水混匀，与步骤2样品同步采用LC-MS测试化合物浓度。
4.数据分析
已知标准品进样浓度为10μM，比较待测化合物与标准品在LC-MS中峰面积计算溶解度，具体公式如下：
表9溶解度测试数据
因此，本申请的化合物可表现出期望的溶解度。
为了描述和公开的目的，以引用的方式将所有的专利、专利申请和其它出版物在此明确地并入本文。这些出版物仅因为它们的公开早于本申请的申请日而提供。所有关于这些文件的日期的声明或这些文件的内容的表述是基于申请者可得的信息，并且不构成任何关于这些文件的日期或这些文件的内容的正确性的承认。而且，在任何国家，在本中对这些出版物的任何引用并不构成关于该出版物成为本领域的公知常识的一部分的认可。
本领域技术人员将认识到，本申请的范围并不限于上文描述的各种具体实施方案和实施例，而是能够在不脱离本申请的精神的情况下，进行各种修改、替换、或重新组合，这些调整后的方案都落入了本申请的保护范围内。

Claims (10)

  1. 式Ⅰ结构所示的化合物、其药学上可接受的盐、水合物、异构体、前药及混合物：
    其中，R1、R2各自独立的选自H、-OH、-OR3、-CN、-NR4R5、3至6元脂杂环基、
    R3选自-CH3、-CH2CH2OH、-CH2CH2NH2；
    R4、R5各自独立地选自H、C1-C3烷基、环烷基、-CH2CH2OH、-CH2CH2NH2。
  2. 根据权利要求1所述的化合物、其药学上可接受的盐、水合物、异构体、前药及混合物，其中，所述R1、R2各自独立的选自H、-OH、-OCH3、-OCH2CH2OH、-OCH2CH2NH2、-CN、-NH2、-NHCH3、-NHCH2CH3、-NHCH2CH2CH3、-N(CH3)2、-N(CH2CH3)2、-N(CH2CH2CH3)2、-NH-(C3-C6环烷基)、-NHCH2CH2OH、-NHCH2CH2NH2、
  3. 根据权利要1所述的化合物、其药学上可接受的盐、水合物、异构体、前药及混合物，其中，所述R1选自H、-OH、-OR3、-CN、-NR4R5、3至6元脂杂环基、 且所述R2选自-OH、-OR3、-CN、-NR4R5、3至6元脂杂环基、 或者所述R1选自-OH、-OR3、-CN、-NR4R5、3至6元脂杂环基、 且所述R2选自H、-OH、-OR3、-CN、-NR4R5、3至6元脂杂环基、
  4. 根据权利要求1-3中任一项所述的化合物、其药学上可接受的盐、水合物、异构体、前药及混合物，其中，所述化合物为式II、式III、式IIa、式IIIa、式IV、式V或式VI结构所示的化合物：
  5. 根据权利要求1-4中任一项所述的化合物、其药学上可接受的盐、水合物、异构体、前药或混合物用于制备治疗MAT2a相关疾病的药物的用途。
  6. 一种药物组合物，含有治疗有效剂量的权利要求1-4中任一项所述的化合物、其药学上可接受的盐、水合物、异构体、前药或混合物，以及药学上可接受的载体。
  7. 权利要求6所述的药物组合物用于制备治疗MAT2a相关疾病的药物的用途。
  8. 根据权利要求5或7所述的用途，其中，所述MAT2a相关疾病为癌症或肿瘤。
  9. 根据权利要求8所述的用途，其中，所述癌症或肿瘤包括肠癌、食管癌、唇癌、喉癌、下咽癌、舌癌、唾液腺癌、胃癌、甲状腺癌、肾癌、卵巢癌、宫颈癌、绒毛膜癌、胰腺癌、前列腺癌、睾丸癌、乳腺癌、黑色素癌、脑肿瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、慢性或急性白血病、肝细胞癌、胆囊癌、支气管癌、多发性骨髓瘤、基底细胞瘤、畸胎瘤、成视网膜细胞瘤、颅咽管癌、骨肉瘤、软骨肉瘤、肌肉瘤、脂肉瘤、纤维肉瘤、尤因肉瘤、浆细胞瘤、肺癌、骨癌、皮肤癌、头颈癌、肛门癌、子宫癌、输卵管癌、阴道癌、外阴癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、膀胱癌、输尿管癌、肾盂癌、间皮瘤、胆道癌、中枢神经系统肿瘤、神经鞘瘤、室管膜瘤、成神经管细胞瘤、外周神经外胚层肿瘤、垂体腺瘤，任何上述癌症或肿瘤的难治形式，或一种或多种上述癌症或肿瘤的组合。
  10. 根据权利要求9所述的用途，其中，所述肠癌包括直肠癌、结肠癌、家族性腺瘤性息肉病癌和遗传性非息肉病结肠直肠癌、小肠癌，所述甲状腺癌包括甲状腺髓样癌、乳头状甲状腺癌，所述黑色素瘤包括皮肤或眼内黑色素瘤，所述脑肿瘤为脑膜瘤，所述慢性或急性白血病包括急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、成人T-细胞白血病，所述肌肉瘤为横纹肌肉瘤，所述肺癌包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌，所述中枢神经系统肿瘤包括成神经细胞瘤、脊柱肿瘤、脑干神经胶质瘤、多形性角质母细胞瘤、星形细胞瘤。
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