KR20220142500A

KR20220142500A - 화합물 및 그 제조방법과 이의 항암치료약물의 제조에서의 응용

Info

Publication number: KR20220142500A
Application number: KR1020227032105A
Authority: KR
Inventors: 청 양; 광 양; 홍강 저우; 량 장; 지엔 리; 동차오 룬
Original assignee: 톈진 지쿤 메디컬 테크놀로지 컴퍼니 리미티드
Priority date: 2020-12-16
Filing date: 2021-09-24
Publication date: 2022-10-21
Also published as: US20230159537A1; JP2023516483A; EP4116302A4; AU2021398802B2; AU2021398802A1; WO2022127261A1; CA3196572A1; EP4116302A1; CN112574216A; CN112574216B

Abstract

본 발명은 피라졸로[3,4_d]피리미딘류 화합물, 제조방법과 항종양 약물의 제조에서의 응용에 관한 것이다. 해당 화합물은 FGFR1-3에 대하여 억제효과가 있고, NCI-H1581과 SNU-16 암세포라인에 대해 항증식 효과를 나타낸다.

Description

화합물 및 그 제조방법과 이의 항암치료약물의 제조에서의 응용

본 출원은 2020년 12월 16일에 중국 특허청에 제출된, 출원번호가 202011483614.1이고, 발명의 명칭이 "화합물 및 그 제조방법과 이의 항암치료약물의 제조에서의 응용"인 중국 특허출원의 우선권을 주장하며, 그 전부 내용은 인용에 의해 본 출원에 포함된다.

기술분야

본 발명은 제약기술 분야에 관한 것으로, 특히, 2H-피라졸로[3,4-d]피리미딘 유도체와 그 제조방법 및 이의 항암치료약물의 제조에서의 응용에 관한 것이다.

발명의 배경이 되는 기술

섬유아세포 성장인자 수용체(FGFR)는 수용체 티로신 키나제(RTK)패밀리의 구성원이고, 수용체형 단백질 티로신 키나제에 속하며, 그중에는 네개의 고도로 보존된 막관통 티로신 키나제: FGFR1, FGFR2, FGFR3과 FGFR4가 포함된다. FGFR의 신호 전달 경로는 리간드와 수용체의 결합으로 FGFR의 이량체화를 유도하고, 하류신호통로(예를 들어 Ras-MAPK, PI3K-Akt, STAT와 PLCγ)의 직렬을 활성화한다. FGFR은 예를 들어 세포증식과 분화 및 발육, 혈관신생, 항상성과 상처복구를 포함하는 생물학적 과정 등 다종세포기능에서 중요한 작용을 한다. 연구 조사^(1-3)에 의하면, 7.1%의 암환자의 FGFR은 비정상적이다. 예를 들어, 편평 NSCLC 환자의 FGFR1 증폭 비율이 20%로 제일 높고, 유방암이 10%, 난소암이 5%, 방광암이 3%이다. 현재, 위암(10%), 자궁내막암(12%), 편평 NSCLC(5%)와 삼중음성 유방암(4%)에서 모두 FGFR2돌연변이를 발견하였고, 방광암(50%-60%)와 골수종(15%-20%)중의 FGFR3 돌연변이는 모두에게 알려져 있다. 비정상적인 FGF19/FGFR4와 간세포암(HCC)은 밀접하게 연관되어 있다. 따라서, FGF/FGFR 신호전달 경로를 차단하는 새로운 FGFR 선택적 억제제의 개발은 FGFR 관련 암에 대한 유망한 치료전략^(4-6)을 제시한다.

연구원들은 FGFR 관련 암치료를 위한 새로운 항암제로 FGFR 억제제를 개발하기 위해 노력중이다. 우선, 초기에는, 예를 들어 dovitinib(TKI-258), lucitanib(E-3810)⁽⁸⁾, nintedanib (BIBF-1120)⁽⁹⁾, 및 ponatinib(AP-24534)⁽¹⁰⁾과 같은 여러 종류의 다중표적 티로신 키나제 억제제(TKIs)를 채용하여 FGFR 비정상과 관련된 암을 치료하였다. 이러한 초기에 개발된 FGFR 억제제는 비선택적이였다⁽¹¹⁾. 나중에, 스캐폴드를 갖는 여러가지 선택적 FGFR 티로신 키나제 억제제가 개발되었다. AZD-4547 (III기) ⁽¹²⁾, BGJ-398(II기) ⁽¹³⁾, LY-2874455(II기) ⁽¹⁴⁾ 와 JNJ-42756493(II기) ⁽¹⁵⁾와 같은 티로신 키나제 억제제는 현재 서로 다른 임상연구단계에 있고, 이러한 선택적 FGFR 억제제는 FGFR 활성 형태와 결합하는 ATP 경쟁성억제제이다. 또한, 많은 의약화학실험실에서 FGFR 억제제^(16-22)의 개발을 보고하였다.

본 발명이 해결하고자 하는 기술적 과제/목표는 적어도 종래기술의 단점을 극복하고, 2H-피라졸로[3,4-d]피리미딘유도체 및 그 제조방법과 이의 항암치료약물의 제조에서의 응용을 포함한다.

상기 목적을 실현하기 위하여, 본 발명은 아래 기술방안을 공개하였다.

본 발명은 식I에 표시된 화합물 혹은 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다:

;

상기 식I에서, Ar은 치환된 방향족 고리그룹과 치환된 방향족 헤테로고리그룹중의 어느 하나이고;

R은 H, 알킬기, 아릴기, -CF₃와 알킬3차아민구조중의 어느 하나이고;

Linker는 알킬기, 알콕시기, 헤테로원자 치환기, 치환된 N 헤테로고리중의 어느 하나이다.

바람직하게는, 상기 R은 H, CF₃, (CH₃)₂NCH₂ 혹은 CH₃이다.

바람직하게는, 상기 화합물은 화합물 1~40 중의 한가지이다:

본 발명은 상기 기술방안에서 서술한 화합물 혹은 이의 약학적으로 허용가능한 염의 제조방법을 제공하고, 그 합성경로는:

.

바람직하게는, 다음 절차를 포함한다:

식a에서 표시된 구조화합물과 식b에서 표시된 구조화합물을 미츠노부(Mitsunobu)반응시켜, 식c에서 표시된 구조화합물을 얻고; 상기 미츠노부(Mitsunobu)반응의 온도는 실온이고, 시간은 4시간이고;

상기 식c에서 표시된 구조화합물과 식d에서 표시된 구조화합물을 스즈키 커플링(Suzuki coupling)반응시켜, 식e에서 표시된 구조화합물을 얻고; 상기 스즈키 커플링(Suzuki coupling)반응의 온도는 80℃이고;

상기 식e에서 표시된 구조화합물과 트리플루오로아세트산을 탈보호반응시켜, 식f에서 표시된 구조화합물을 얻고; 상기 탈보호반응의 반응의 온도는 0℃이고;

상기 식f에서 표시된 구조화합물을 아실화반응시켜, 식I에서 표시된 구조화합물을 얻고; 상기 아실화반응의 온도는 실온이며;

본 발명은 또한 상기 기술방안에서 서술한 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염의 종양세포 증식 억제제의 제조에서의 응용을 제공하고, 상기 종양세포는 FGFR 비정상 관련 종양세표이다.

바람직하게는, 상기 종양세포는 NCI-H1581 혹은 SNU-16을 포함한다.

본 발명은 또한 상기 기술방안에서 서술한 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염의 종양세포중의 FGF/FGFR 신호경로를 차단에서의 응용을 제공하고, 상기 종양세포는 FGFR 비정상 관련 종양세표이다.

본 발명은 또한 상기 기술방안에서 서술한 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염의 약학조성물을 제공하고, 한가지 또는 여러가지 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하고;

상기 약학조성물의 제형은 약학적으로 허용가능한 임의의 제형이다.

본 발명은 또한 상기 기술방안에서 서술한 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염 혹은 상기 기술방안에서 서술한 약학조성물의 암치료와/혹은 암예방약물의 제조에서의 응용을 제공한다.

바람직하게는, 상기 암은 FGFR 비정상 관련 암이다.

본 발명은 또한 상기 기술방안에서 서술한 약학조성물의 비가역적 범섬유아세포 성장인자 수용체 억제제의 제조에서의 응용을 제공한다.

본 발명은 또한 암의 치료방법을 제공하고, 다음과 같은 절차를 포함한다:

경구혹은 복강내 주사의 방식으로, 암치료 약물을 환자에게 투여하고;

상기 암치료 약물은 상기 기술방안에서 서술한 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함한다.

바람직하게는, 상기 암치료 약물은 화합물10 혹은 화합물36을 포함한다.

바람직하게는, 상기 약투여량은 50mg/kg 혹은 100mg/kg이고;

상기 약투여량은 상기 화합물10 혹은 화합물36의 사용량을 기준으로 한다.

바람직하게는, 상기 암치료 약물이 상기 화합물10을 포함할 경우, 상기 약투여 방식은 경구이다.

바람직하게는, 상기 암치료 약물이 상기 화합물36을 포함할 경우, 상기 약투여 방식은 복강내 주사이다.

본 발명에서, 용어"약학적으로 허용가능한 보조제"는 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 희석제 등을 포함하고, 이들은 약학적 활성성분과 상용한다. 약학적으로 허용가능한 보조제를 사용하여 약물제제를 제조하는 것은 당업자에게 잘 알려져 있다.

본 발명은 약학조성물과 약학적으로 허용가능한 보조제(예를 들어 당업자에게 잘 알려진 담체, 부형제, 희석제 등)를 함께 조합하여, 여러 제제를 제조하고, 바람직하게는 정제, 환제, 캡슐, 분제, 현탁제, 과립제, 시럽제, 유액제, 현탁액 등 제형 및 각종 서방제형과 같은 고체제제와 액체제제이며, 바람직하게는 경구 투여형식이다.

도1은 화합물10이 농도 기울기에 의존하여 NCI-H1581 세포의 FGFR1 및 하류신호통로의 활성화를 억제하고 SNU-16 세포의 FGFR2 및 하류신호통로의 활성화를 억제하는 것을 보여주며, 여기서 A는 NCI-H1581 세포의 FGFR1 및 하류신호통로의 활성화를 억제하는 것이고, B는 SNU-16세포의 FGFR2 및 하류신호통로의 활성화를 억제하는 것이고;
도2는 화합물36이 농도 기울기에 의존하여 NCI-H1581 세포의 FGFR1 및 하류신호통로의 활성화를 억제하고 SUN-16 세포의 FGFR2 및 하류신호통로의 활성화를 억제하는 것을 보여주며, 여기서 A는 NCI-H1581 세포의 FGFR1 및 하류신호통로의 활성화를 억제하는 것이고, B는SUN-16 세포의 FGFR2 및 하류신호통로의 활성화를 억제하는 것이고;
도3은 NCI-H1581 종양세포의 피하이식 종양모델에서, 화합물10이 종양증식을 억제하는 종양부피 곡선그래프(A)이고, 처리 26일 후 마우스 체내의 종양중량 통계그래프(B)이고, 처리과정에서 마우스의 체중변화 곡선그래프(C)와 처리 26일 후 마우스 체내 종양의 사진도(D)이며;
도4는 NCI-H1581 종양세포의 피하이식 종양모델에서, 화합물36이 종양증식을 억제하는 종양부피 변화곡선그래프(A)이고, 처리 26일 후 마우스 체내의 종양중량 통계그래프(B)이고, 처리과정에서 마우스의 체중변화 곡선그래프(C)와 처리 26일 후 마우스 체내 종양의 사진도(D)와 면역조직화학검출된 서로 다른 처리 조직중의 FGFR1의 인산화수준(E)이다.

달리 정의하지 않는 한, 하기 실시예에서 사용되는 기술용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적인 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 다음 실시예에서 사용되는 시험시약은, 달리 명시되지 않는 한 통상적인 생화학적 시약이고, 실험방법은 달리 명시하지 않는 한 통상적인 방법이다.

아래 실시예와 결합하여 본 발명을 상세히 설명한다.

실시예1: 화합물1의 제조

구체적인 제조방법은:

1)화합물(1-1)의 제조:

3-브로모-1H-피라졸로[3,4-D]피리미딘-4-아민(500 mg, 2.34 mmol)을 건조한 THF(23 mL)에 용해하고, 트리페닐포스핀(2.08 g, 7.94 mmol), 1-Boc-3-아제티딘메탄올을 추가한다. 다음 0℃에서, 아르곤의 보호하에, 디이소프로필 아조디카르복실레이트(1.60g, 7.94 mmol)를 적가한다. 적가 완료 후, 온도를 실온으로 천천히 올리고 4시간 반응을 계속한다. 반응액을 회전 건조하고, 컬럼 크로마토그래피 정제(석유 에테르: 에틸 아세테이트= 5:1 내지 2:1)하여 화합물1-1(황색 유성 액체, 685 mg, 69%)을 얻는다.

화합물1-1의 NMR 테스트의 결과는:

2)화합물(1-2)의 제조

화합물1-1(5.01 mg, 6.74 mmol), 3,5-디메톡시페닐보론산(1.59 g, 8.76 mmol)을 1,4-디옥산: 물(9 mL, v: v =3:1)의 혼합용액에 용해하고, 다음 탄산 칼륨(1.87 g, 13.5 mmol), Pd(PPh₃)₄(778 mg, 0.674 mmol)을 추가한다. 시스템을 아르곤으로 3회 치환하고, 유욕하에 80℃까지 온도를 높이고, 밤새 반응시키고, 반응이 완료된 후 포화 염화나트륨으로 세척(270 mL), 에틸 아세테이트 추출(90 mL), 유기상 건조농축, 컬럼 크로마토그래피 정제(디클로로메탄: 메탄올= 70: 1 내지 30:1)하여 화합물1-2(황색 유성 액체, 4.3 g, 60%)를 얻는다.

화합물1-2의 NMR 테스트의 결과는:

3)화합물(1-3)의 제조

0℃에서, 화합물1-2(450 mg, 0.587 mmol)를 디클로로메탄(5 mL)에 용해하고, 천천히 트리플루오로아세트산(5 mL)를 적가한다. 30분뒤 반응이 완료된다. 반응액을 포화NaHCO₃로 알칼리조정하고, 유기상을 농축건조하여 황갈색 유상 중간체를 얻는다. 0℃에서, 상기 중간체를 5 mL 디클로로메탄에 용해하고, 다음 TEA(98.2 μL, 0.704 mmol)를 추가하고, 아크릴로일 클로라이드(52.2 μL, 0.646 mmol)를 적가한다. 실온에서 1시간 반응을 계속하고, TLC로 반응이 완료된 것이 검측한다. 반응액을 포화 NaCl로 세척, 에틸 아세테이트 추출, 유기상 건조농축, 컬럼 크로마토그래피 분리 및 정제(디클로로메탄: 메탄올= 30: 1 내지 10: 1)하여 화합물1-3(황색 유성 액체, 78 mg, 72%)를 얻는다.

4)화합물1의 제조: 화합물1-3(100 mg, 0.189 mmol)에 아세트산: 테트라히드로푸란: 물(3 mL, 3:1:2)의 혼합용액을 추가한다. 실온에서 18시간 반응하고, TLC로 반응이 완료된 것을 검측한다. 반응액을 포화중탄산나트륨 용액으로 PH 7~8(15 mL)로 알칼리조정하고, 에틸 아세테이트 추출(10 mL×2), 유기상 건조농축, 컬럼 크로마토그래피 정제(디클로로메탄: 메탄올= 15: 1 내지 7: 1)하여 화합물5a(황색 고체, 57.8 mg, 70%)를 얻는다.

화합물1의 NMR 테스트의 결과는:

실시예2: 화합물2의 제조

구체적인 제조방법은: 화합물1의 제조방법과 유사하며, 다른 점은 사용하는 원료중의 하나가 1-Boc-3-히드록시메틸피롤리딘인 것이고, 화합물(1-1)의 제조방법중의1-Boc-3-아제티딘메탄올을 등몰 대체하고, 화합물2의 NMR 테스트의 결과는:

실시예3: 화합물3의 제조

구체적인 제조방법은: 화합물1의 제조방법과 유사하며, 다른 점은 사용하는 원료중의 하나가 N-Boc-4-히드록시피페리딘인 것이고, 화합물(1-1)의 제조방법중의 1-Boc-3-아제티딘메탄올을 등몰 대체하고, 화합물3의 NMR 테스트의 결과는:

실시예4: 화합물4의 제조

구체적인 제조방법은: 화합물1의 제조방법과 유사하며, 다른 점은 사용하는 원료중의 하나가 N-Boc-4-피페리딘메탄올인 것이고, 화합물(1-1)의 제조방법중의 1-Boc-3-아제티딘메탄올을 등몰 대체하고, 화합물4의 NMR 테스트의 결과는:

실시예5: 화합물5의 제조

구체적인 제조방법은: 화합물1의 제조방법과 유사하며, 다른 점은 사용하는 원료중의 하나가 N-Boc-4-피페리딘에탄올인 것이고, 화합물(1-1)의 제조방법중의 1-Boc-3-아제티딘메탄올을 등몰 대체하고, 화합물5의 NMR 테스트의 결과는:

실시예6: 화합물6의 제조

구체적인 제조방법은: 화합물1의 제조방법과 유사하며, 다른 점은 사용하는 원료중의 하나가 1-Boc-3-히드록시메틸피페리딘인 것이고, 화합물(1-1)의 제조방법중의 1-Boc-3-아제티딘메탄올을 등몰 대체하고, 화합물6의 NMR 테스트의 결과는:

실시예7: 화합물7의 제조

구체적인 제조방법은: 화합물1의 제조방법과 유사하며, 다른 점은 사용하는 원료중의 하나가 터트-부틸-4-(2-히드록시에틸)피페라진-1-카르복실레이트인 것이고, 화합물(1-1)의 제조방법중의 1-Boc-3-아제티딘메탄올을 등몰 대체하고, 화합물7의 NMR 테스트의 결과는:

실시예8: 화합물8의 제조

구체적인 제조방법은: 화합물1의 제조방법과 유사하며, 다른 점은 사용하는 원료중의 하나가 1-BOC-4-(3-히드록시프로판)피페라진인 것이고, 화합물(1-1)의 제조방법중의 1-Boc-3-아제티딘메탄올 등몰 대체하고, 화합물8의 NMR 테스트의 결과는:

실시예9: 화합물9의 제조

구체적인 제조방법은: 화합물1의 제조방법과 유사하며, 다른 점은 사용하는 원료중의 하나가 1-BOC-4-(4-히드록시부탄)피페라진인 것이고, 화합물(1-1)의 제조방법중의 1-Boc-3-아제티딘메탄올을 등몰 대체하고, 화합물9의 NMR 테스트의 결과는:

실시예10: 화합물10의 제조

구체적인 제조방법은: 화합물1의 제조방법과 유사하며, 다른 점은 사용하는 원료중의 하나가 1-BOC-4-(5-히드록시펜탄)피페라진인 것이고, 화합물(1-1)의 제조방법중의 1-Boc-3-아제티딘메탄올을 등몰 대체하고, 화합물10의 NMR 테스트의 결과는:

실시예11: 화합물11의 제조

구체적인 제조방법은: 화합물1의 제조방법과 유사하며, 다른 점은 사용하는 원료중의 하나가 1-BOC-4-(6-히드록시헥산)피페라진인 것이고, 화합물(1-1)의 제조방법중의 1-Boc-3-아제티딘메탄올을 등몰 대체하고, 화합물11의 NMR 테스트의 결과는:

실시예12: 화합물12의 제조

구체적인 제조방법은: 화합물1의 제조방법과 유사하며, 다른 점은 사용하는 원료중의 하나가 1-BOC-4-(7-히드록시헵탄)피페라진인 것이고, 화합물(1-1)의 제조방법중의 1-Boc-3-아제티딘메탄올을 등몰 대체하고, 화합물12의 NMR 테스트의 결과는:

실시예13: 화합물13의 제조

구체적인 제조방법은: 화합물1의 제조방법과 유사하며, 다른 점은 사용하는 원료중의 하나가 3,4-메틸렌페닐보론산인 것이고, 화합물(1-2)의 제조방법중의 3,5-디메톡시페닐보론산을 등몰 대체하는 것이고, 화합물13의 NMR 테스트의 결과는:

실시예14: 화합물14의 제조

구체적인 제조방법은: 화합물1의 제조방법과 유사하며, 다른 점은 사용하는 원료중의 하나가 벤조푸란-2-붕소산인 것이고, 화합물(1-2)의 제조방법중의 3,5-디메톡시페닐보론산을 등몰 대체하고, 화합물14의 NMR 테스트의 결과는:

실시예15: 화합물15의 제조

구체적인 제조방법은: 화합물1의 제조방법과 유사하며, 다른 점은 사용하는 원료중의 하나가 p-메톡시붕소산인 것이고, 화합물(1-2)의 제조방법중의 3,5-디메톡시페닐보론산을 등몰 대체하고, 화합물15의 NMR 테스트의 결과는:

실시예16: 화합물16의 제조

구체적인 제조방법은: 화합물1의 제조방법과 유사하며, 다른 점은 사용하는 원료중의 하나가 4-아세틸아미노페닐보론산인 것이고, 화합물(1-2)의 제조방법중의 3,5-디메톡시페닐보론산을 등몰 대체하고, 화합물16의 NMR 테스트의 결과는:

실시예17: 화합물17의 제조

구체적인 제조방법은: 화합물1의 제조방법과 유사하며, 다른 점은 사용하는 원료중의 하나가 4-트리플루오로메톡시페닐보론산인 것이고, 화합물(1-2)의 제조방법중의 3,5-디메톡시페닐보론산을 등몰 대체하고, 화합물17의 NMR 테스트의 결과는:

실시예18: 화합물18의 제조

구체적인 제조방법은: 화합물1의 제조방법과 유사하며, 다른 점은 사용하는 원료중의 하나가 2-나프탈렌붕소산인 것이고, 화합물(1-2)의 제조방법중의 3,5-디메톡시페닐보론산을 등몰 대체하고, 화합물18의 NMR 테스트의 결과는:

실시예19: 화합물19의 제조

구체적인 제조방법은: 화합물1의 제조방법과 유사하며, 다른 점은 사용하는 원료중의 하나가 4-메틸나프탈렌 보론산인 것이고, 화합물(1-2)의 제조방법중의 3,5-디메톡시페닐보론산을 등몰 대체하고, 화합물19의 NMR 테스트의 결과는:

실시예20: 화합물20의 제조

구체적인 제조방법은: 화합물1의 제조방법과 유사하며, 다른 점은 사용하는 원료중의 하나가 4-브로모나프탈렌 보론산인 것이고, 화합물(1-2)의 제조방법중의 3,5-디메톡시페닐보론산을 등몰 대체하고, 화합물20의 NMR 테스트의 결과는:

실시예21: 화합물21의 제조

구체적인 제조방법은: 화합물1의 제조방법과 유사하며, 다른 점은 사용하는 원료중의 하나가 2,5-디메톡시페닐보론산인 것이고, 화합물(1-2)의 제조방법중의 3,5-디메톡시페닐보론산을 등몰 대체하고, 화합물21의 NMR 테스트의 결과는:

실시예22: 화합물22의 제조

구체적인 제조방법은: 화합물1의 제조방법과 유사하며, 다른 점은 사용하는 원료중의 하나가 3,4-디메톡시페닐보론산인 것이고, 화합물(1-2)의 제조방법중의 3,5-디메톡시페닐보론산을 등몰 대체하고, 화합물22의 NMR 테스트의 결과는:

실시예23: 화합물23의 제조

구체적인 제조방법은: 화합물1의 제조방법과 유사하며, 다른 점은 사용하는 원료중의 하나가 3,4,5-트리메톡시페닐보론산인 것이고, 화합물(1-2)의 제조방법중의 3,5-디메톡시페닐보론산을 등몰 대체하고, 화합물23의 NMR 테스트의 결과는:

실시예24: 화합물24의 제조

구체적인 제조방법은: 화합물1의 제조방법과 유사하며, 다른 점은 사용하는 원료중의 하나가 3-트리플루오로메틸페닐보론산인 것이고, 화합물(1-2)의 제조방법중의 3,5-디메톡시페닐보론산을 등몰 대체하고, 화합물24의 NMR 테스트의 결과는:

실시예25: 화합물25의 제조

구체적인 제조방법은: 화합물1의 제조방법과 유사하며, 다른 점은 사용하는 원료중의 하나가 3-이소프로폭시페닐보론산인 것이고, 화합물(1-2)의 제조방법중의 3,5-디메톡시페닐보론산을 등몰 대체하고, 화합물25의 NMR 테스트의 결과는:

실시예26: 화합물26의 제조

구체적인 제조방법은: 화합물1의 제조방법과 유사하며, 다른 점은 사용하는 원료중의 하나가 3-벤질옥시페닐보론산인 것이고, 화합물(1-2)의 제조방법중의 3,5-디메톡시페닐보론산을 등몰 대체하고, 화합물26의 NMR 테스트의 결과는:

실시예27: 화합물27의 제조

구체적인 제조방법은: 화합물1의 제조방법과 유사하며, 다른 점은 사용하는 원료중의 하나가 2-클로로-5-메톡시페닐보론산인 것이고, 화합물(1-2)의 제조방법중의 3,5-디메톡시페닐보론산을 등몰 대체하고, 화합물27의 NMR 테스트의 결과는:

실시예28: 화합물28의 제조

구체적인 제조방법은: 화합물1의 제조방법과 유사하며, 다른 점은 사용하는 원료중의 하나가 p-플루오로페닐보론산인 것이고, 화합물(1-2)의 제조방법중의 3,5-디메톡시페닐보론산을 등몰 대체하고, 화합물28의 NMR 테스트의 결과는:

실시예29: 화합물29의 제조

구체적인 제조방법은: 화합물1의 제조방법과 유사하며, 다른 점은 사용하는 원료중의 하나가 3-플루오로-4-히드록시페닐보론산인 것이고, 화합물(1-2)의 제조방법중의 3,5-디메톡시페닐보론산을 등몰 대체하고, 화합물29의 NMR 테스트의 결과는:

실시예30: 화합물30의 제조

구체적인 제조방법은: 화합물1의 제조방법과 유사하며, 다른 점은 사용하는 원료중의 하나가 6-메톡시나프탈렌-2-붕소산인 것이고, 화합물(1-2)의 제조방법중의 3,5-디메톡시페닐보론산을 등몰 대체하는 것이고, 화합물30의 NMR 테스트의 결과는:

실시예31: 화합물31의 제조

구체적인 제조방법은: 화합물1의 제조방법과 유사하며, 다른 점은 사용하는 원료중의 하나가 p-니트로페닐보론산인 것이고, 화합물(1-2)의 제조방법중의 3,5-디메톡시페닐보론산을 등몰(equimolar) 대체하는 것이고, 화합물31의 NMR 테스트의 결과는:

실시예32: 화합물32의 제조

구체적인 제조방법은: 화합물1의 제조방법과 유사하며, 다른 점은 사용하는 원료중의 하나가 3-플루오로-5-메톡시페닐보론산인 것이고, 화합물(1-2)의 제조방법중의 3,5-디메톡시페닐보론산을 등몰 대체하는 것이고, 화합물31의 NMR 테스트의 결과는:

실시예33: 화합물33의 제조

구체적인 제조방법은: 화합물1의 제조방법과 유사하며, 다른 점은 사용하는 원료중의 하나가 3,5-디플루오로페닐보론산인 것이고, 화합물(1-2)의 제조방법중의 3,5-디메톡시페닐보론산을 등몰 대체하는 것이고, 화합물33의 NMR 테스트의 결과는:

실시예34: 화합물34의 제조

구체적인 제조방법은: 화합물1의 제조방법과 유사하며, 다른 점은 사용하는 원료중의 하나가 3,5-디트리플루오로메틸페닐보론산인 것이고, 화합물(1-2)의 제조방법중의 3,5-디메톡시페닐보론산을 등몰 대체하는 것이고, 화합물34의 NMR 테스트의 결과는:

실시예35: 화합물35의 제조

구체적인 제조방법은: 화합물1의 제조방법과 유사하며, 다른 점은 사용하는 원료중의 하나가 3-플루오로-5-트리플루오로메틸페닐보론산인 것이고, 화합물(1-2)의 제조방법중의 3,5-디메톡시페닐보론산을 등몰 대체하는 것이고, 화합물35의 NMR 테스트의 결과는:

실시예36: 화합물36의 제조

구체적인 제조방법은: 화합물10의 제조방법과 유사하며, 다른 점은 사용하는 원료중의 하나가 4,4,4-트리플루오로부텐산인 것이고, 화합물(1-3)의 제조방법중의 아크릴로일 클로라이드를 등몰 대체하는 것이고, 화합물36의 NMR 테스트의 결과는:

실시예37: 화합물37의 제조

구체적인 제조방법은: 화합물34의 제조방법과 유사하며, 다른 점은 사용하는 원료중의 하나가 4,4,4-트리플루오로부텐산인 것이고, 화합물(1-3)의 제조방법중의 아크릴로일 클로라이드를 등몰 대체하는 것이고, 화합물37의 NMR 테스트의 결과는:

실시예38: 화합물38의 제조

구체적인 제조방법은: 화합물35의 제조방법과 유사하며, 다른 점은 사용하는 원료중의 하나가 4,4,4-트리플루오로부텐산인 것이고, 화합물(1-3)의 제조방법중의 아크릴로일 클로라이드를 등몰 대체하는 것이고, 화합물38의 NMR 테스트의 결과는:

실시예39: 화합물39의 제조

구체적인 제조방법은: 화합물10의 제조방법과 유사하며, 다른 점은 사용하는 원료중의 하나가 트랜스-4-디메틸아미노크로톤산인 것이고, 화합물(1-3)의 제조방법중의 아크릴로일 클로라이드를 등몰 대체하는 것이고, 화합물39의 NMR 테스트의 결과는:

실시예40: 화합물40의 제조

구체적인 제조방법은: 화합물10의 제조방법과 유사하며, 다른 점은 사용하는 원료중의 하나가 크로톤산인 것이고, 화합물(1-3)의 제조방법중의 아크릴로일 클로라이드를 등몰 대체하는 것이고, 화합물40의 NMR 테스트의 결과는:

실시예41 효소 활성 시험

본 발명은 균질 시간 분해 형광(HIRF)기술을 채용하여 화합물이 FGFR1, 2, 3과 4 네개 아형에 대한 억제작용을 평가한다. 우선, FGFR1, 2, 3과 4의 원핵 발현 담체를 구현하고, 정확함을 검증한후, 대장균체계로 정제 FGFR 단백질을 대량으로 발현하여, 단백질 농도를 측정하고, 나누어 보관한다. 효소 활성 시험을 시작하기 전, cisbio HTRF KinEA(62TK0PEB)을 사용하여 효소 활성 체계중에 필요한 각종 구성요소를 필요한 작업농도로 사전 희석한다(효소 활성 완충액으로 희석). 384웰 플레이트(66PL384025)를 준비하고, 각 웰에 순차적으로 5 μL의 단백질 용액, 1 μL화합물, 2 μL 기질을 추가하고, 마지막으로 2 μL ATP를 추가하여 반응을 시작한다. 각 농도에 대하여 3개 병렬실험을 셋팅하고, 블랭크 대조군에서는 1 μL 화합물을 1 μL DMSO로 대체하였고, 양성 대조군은 양성 약물 AZD4547로 하고, 기타 조건은 그대로 유지한다. 384웰 플레이트를 밀봉하고, 실온에서 약 1시간 인큐베이터한다. 인큐베이터 완료후, 각 웰에 5 μL의 란탄족원소로 표기된 인산화기질의 항체(기증체)와 5 μL의 스트렙트아비딘으로 표기된 XL665(수용체)를 넣어 반응을 멈추고, 빛을 피하여, 실온에서 약 1시간 계속 인큐베이터한다. 마지막으로 TECAN infinite M1000PRO 다기능 마이크로플레이트 리더기를 사용하여 형광 신호를 감지하고, 억제율을 계산하고, IC50값을 GraphPad Prism 7.0으로 적합한다.

결과, 화합물1-40이 모두 FGFR1/2/3/4의 단백활성을 어느 정도 억제할 수 있는 것으로 나타났다.

실시예42 세포 증식 실험

본 발명에서는 화합물10과 36을 선택하였고, MTT 비색법으로 해당 화합물10과 36의 다양한 종양세포에 대한 증식 억제 작용을 평가하였다. 대수 성장기의 종양세포를 판크레아틴 소화 수집하고, 1 mL의 신선한 배지에 재현탁하고, 다음 소량을 취하여 희석하고, 혈구기수판으로 세포수량을 계산한다. 세포성장 속도에 따라, 종양세포를 3000-5000개/웰의 밀도로 96웰 플레이트에 접종한 다음, 24시간 동안 세포 배양기에 넣어 배양한다. 이어서, 화합물10과 36으로 종양세포를 처리하고, 8개 농도를 설치하고, 각 농도에 3개의 복수웰을 셋팅한 후, 96시간 인큐베이터한다. 인큐베이터후, 각 웰에 10 μL MTT 용액(5 mg/mL)을 추가하고, 두드려 혼합한 후, 세포배양기에 넣어 3-4시간 배양한다. 인큐베이터후, 조심스럽게 웰판내의 액체를 모두 흡인하고, 각 웰에 100 μL DMSO 용액을 추가한다. 마이크로플레이트 리더 프로그램을 셋팅하고, 각각 490nm와 570 nm에서 흡광도 값을 측정하고, 공식에 따라 각 농도에서의 증식억제율을 계산하고, 마지막으로 Graphpad Prism 7 소프트웨어로 데이터 처리하여, IC50을 계산한다.

결과(표1)는 화합물10과 36은 인간폐 편평암세포 NCI-H1581(FGFR1증폭)와 인간 위암세포 SNU-16 (FGFR2증폭)의 증식을 현저히 억제하였고, 인간 간암세포 SK-hep-1 (FGGR4증폭)의 증식을 어느 정도 억제하지만, FGFR이 정상적으로 발현된 종양세포에는 현저한 억제작용이 없었음을 보여주었으며, 이는 화함물 10과 36이 강한 선택성을 가진다는 것을 나타낸다.

실시예43 화합물10과 36의 FGF/FGFR 및 이의 하류신호전달경로에 대한 억제

화합물10과 36의 FGF/FGFR 신호에 대한 영향을 진일보 설명하기 위하여, 웨스턴 블롯 실험으로 FGFR과 하류신호단백질 인산화에 대한 영향을 검증한다. 대수 성장기의 인간 폐 편평 암세포 NCI-H1581와 인간 위암세포 SNU-16를 판크레아틴 소화 수집하고, 1 mL의 신선한 배지에서 재현탁하고, 소량을 취해 희석 후, 혈구계수판으로 세포수량을 계산한다. 3 x 105/개 각웰의 밀도로, 상응한 부피의 종양세포 현탁액을 취해 6웰 플레이트에 접종하고, 세포배양기에서 24시간 인큐베이터한다. 세포가 완전히 벽에 부착된 후, 기존 배지를 흡인하고, 상이한 농도의 화합물10과 36을 함유하는 신선한 배지를 추가하고, 세포배양기에서 12시간 동안 인큐베이터한다. 인큐베이터 완료후, 상층액을 흡인하고, 사전 냉각된 1× PBS 용액으로 3회 세척하고, 잔액을 완전히 제거 후, 각 웰에 60 μL RIPA 용해액을 추가하고, 세포 스크레이퍼로 세포를 부드럽게 긁어내고, 용해 액을 1.5 mL EP 튜브에 옮기고, 10분간 빙욕하고, 14000rpm에서 10분간 원심분리하고, 상층액을 새로운 1.5 mL EP 튜브에 흡인해 넣고, 소량을 흡인하여 단백질 함량을 측정하고, 나머지에 상응한 부피의 5X 로딩버퍼를 추가하고, 와선혼합하고, 10분간 100℃ 금속욕을 진행한다. 측정된 단백질함량에 따라, 웰당 30 μg 단백질의 로딩량에 따라, 상응한 로딩량을 계산한다. 8%의 SDS-PAGE 겔 전기영동으로 단백질을 분리하고, 분리된 단백질을 PDVF막으로 옮기고, 폰소염색하고, 목표 단백질의 분자량에 따라 단백질이 포함된 PDVF막을 트리밍하고, 1× TBST 용액으로 폰소를 세척하고, 5% 무지방 분유에서 30분간 밀봉한다. 1× TBST 용액으로 3회 세척하고, 목표 단백질밴드가 포함된 PDVF막을 인큐베이션 상자에 넣고, 상응한 1차 항체 인큐베이션 버퍼를 추가하고, 4℃에서 밤새 인큐베이터한다. 1차 항체 인큐베이터 후, 1× TBST 용액으로 3회 세척하고, 상응한 2차 항체 인큐베이션 버퍼를 추가하고, 상온에서 1.5시간 인큐베이터한다. 인큐베이터 완료 후, 1× TBST 용액으로 3회 세척하고, 과민성 HRP 화학발광키트로 발색한다.

도1과 2에서 나타난 바와 같이, 화합물10과 36은 NCI-H1581 세포중의 FGFR1과 SNU-16 세포중의 FGFR2의 인산화를 현저히 억제할 뿐만 아니라, 용량 의존방식으로 하류 PLCγ, AKT와 ERK의 활성을 억제한다. 종합하면, 화합물10과 36은 체외에서 FGF/ FGFR과 하류 신호전달경로를 강력하게 억제할 수 있다.

실시예44 화합물10과 36은 마우스 체내의 종양성장을 현저히 억제

화합물10과 36의 체내에서의 항종양 효능을 평가하기 위하여, 높은 FGFR1 발현을 갖는 인간폐 편평 암세포 NCI-H1581로 마우스 피하이식 암모델을 건립한다. 대수 성장기의 세포를 판크레아틴 소화 수집하고, 1× PBS로 3회 세척하고, 세포침전용 재현탁액(1640배지:Matrigel=1:1)으로 1×10⁸/ mL까지 희석하고, 5×10⁶개/마리 수량에 따라 세포를 5-6주령 암컷 BALB/c Nude 마우스의 앞겨드랑이 하단에 접종한다. 종양 부피가 50-100 mm³로 성장했을 때, 마우스를 랜덤으로 3개그룹(대조군, 50 mg/kg, 100 mg/kg)으로 나누고, 각 그룹에 마우스 6마리이고, 화합물10을 매일 경구투여하고, 화합물36을 매일 복강내 주사 투여하며, 마우스의 종양부피와 체중을 측정하고, 투여 26일후 마우스를 처리하고, 종양조직을 해부하고, 포르말린 용액에 고정하여 비축한다.

도3과 4에서 나타난 바와 같이, 화합물10과 36은 용량 의존적으로 NCI-H1581세포가 마우스 체내에서의 증식을 억제하고, 고용량 그룹의 억제율은 72%로, 종양조직내의 FGFR1의 인산화활성을 억제하고, 현저한 체중감소현상이 없었고, 화합물10과 36이 체내에서 모든 제량에서 양호한 내성을 갖고 있음을 나타낸다.

결론적으로, 본 발명은 2H-피라졸로[3,4-d]피리미딘의 신형 유도체화합물10과 36을 최적화 및 발견하였고, FGFR1, FGFR2와 FGFR3에 대한 유효하고 선택적인 억제제로서, 표적 단백질에 대한 비가역적 결합을 표징하였다. 해당 선도화합물은 낮은 농도에서 FGF / FGFR 및 이의 하류신호통로를 억제할 뿐만 아니라, 체내외에서 NCI-H1581 암세포라인에 대하여 현저한 항증식효과를 보였다. 또한, 화합물10과 36은 독성이 낮고, 양호한 PK 특성을 보여주었고, 현재 우수한 약물후보로 확인되고 있다.

이상의 설명은 본 발명의 바람직한 실시예일 뿐, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니며, 본 발명의 사상 및 원리 내에서 이루어진 모든 수정, 균등 교체, 개량 등은 본 발명의 보호범위에 포함되어야 한다.

참고문헌

Claims

식I에 표시된 화합물 혹은 이의 약학적으로 허용가능한 염에 있어서,

;
상기 식I에서, Ar은 치환된 방향족 고리그룹과 치환된 방향족 헤테로고리 그룹중의 어느 하나이고;
R은 H, 알킬기, 아릴기, -CF3와 알킬3차아민구조중의 어느 하나이고;
Linker는 알킬기, 알콕시기, 헤테로원자 치환기, 치환된 N 헤테로고리 중의 어느 하나인 것을 특징으로 하는 화합물 혹은 이의 약학적으로 허용가능한 염.
제1항에 있어서, 상기 Ar은

인 것을 특징으로 하는 화합물 혹은 이의 약학적으로 허용가능한 염.
제1항에 있어서, 상기 R은 H, CF₃, (CH₃)₂NCH₂ 혹은 CH₃인 것을 특징으로 하는 화합물 혹은 이의 약학적으로 허용가능한 염.
제1항에 있어서, 상기 Linker는

인 것을 특징으로 하는 화합물 혹은 이의 약학적으로 허용가능한 염.
제1~4항중의 임의의 한 항에 있어서, 상기 화합물은 화합물1~40중의 어느 하나인 것을 특징으로 하는 화합물 혹은 이의 약학적으로 허용가능한 염:
합성경로가:

인 것을 특징으로 하는 제1~5항중 임의의 한 항에 따른 화합물 혹은 이의 약학적으로 허용가능한 염의 제조방법.
제6항에 있어서,
식a에서 표시된 구조화합물과 식b에서 표시된 구조화합물을 미츠노부반응시켜, 식c에서 표시된 구조화합물을 얻고; 상기 미츠노부반응의 온도는 실온이고, 시간은 4시간이고;
상기 식c에서 표시된 구조화합물과 식d에서 표시된 구조화합물을 스즈키 커플링 반응시켜, 식e에서 표시된 구조화합물을 얻고; 상기 스즈키 커플링 반응의 온도는 80℃고;
상기 식e에서 표시된 구조화합물과 트리플루오로아세트산을 탈보호반응시켜, 식f에서 표시된 구조화합물을 얻고; 상기 탈보호반응의 반응의 온도는 0℃고;
상기 식f에서 표시된 구조화합물을 아실화반응시켜, 식I에서 표시된 구조화합물을 얻고; 상기 아실화반응의 온도는 실온이며;

인 것을 특징으로 하는 제조방법.
상기 종양세포는 FGFR 비정상 관련 종양세표인 것을 특징으로 하는 제1~5항의 임의의 한 항의 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염의 종양세포 증식 억제제의 제조에서의 응용.
제8항에 있어서, 상기 종양세포는 NCI-H1581, SNU-16을 포함하는 것을 특징으로 하는 응용.
상기 종양세포는 FGFR 비정상 관련 종양세표인 것을 특징으로 하는 제1~5항의 임의의 한 항의 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염의 종양세포중의 FGF/ FGFR 신호경로 차단에서의 응용.
제10항에 있어서, 상기 종양세포는 NCI-H1581 혹은 SNU-16을 포함하는 것을 특징으로 하는 응용.
한가지 또는 여러가지 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하고;
약학조성물의 제형은 약학적으로 허용가능한 임의의 제형인 것을 특징으로 하는 제1~5항의 임의의 한 항의 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염의 약학조성물.
제1~5항 중의 임의의 한 항의 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염 혹은 제12항의 약학조성물의 암치료 및/혹은 암예방약물의 제조에서의 응용.
제9항에 있어서, 상기 암은 FGFR 비정상 관련 암인 것을 특징으로 하는 응용.
제12항의 약학조성물의 비가역적 범섬유아세포 성장인자 수용체 억제제의 제조에서의 응용.
경구 혹은 복강내 주사의 방식으로, 암치료 약물을 환자에게 투여하고;
상기 암치료 약물은 제1~5항 중의 임의의 한 항의 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 것을 특징으로 하는 암의 치료방법.
제16항에 있어서, 상기 암치료 약물은 화합물10 혹은 화합물36을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제17항에 있어서, 상기 약투여량은 50mg/kg 혹은 100mg/kg이고;
상기 약투여량은 상기 화합물10 혹은 화합물36의 사용량을 기준으로 하는 것을 특징으로 하는 방법.
제17 혹은 18항에 있어서, 상기 암치료 약물이 상기 화합물10을 포함하는 경우, 상기 약투여 방식이 경구인 것을 특징으로 하는 방법.
제17 혹은 18항에 있어서, 상기 암치료 약물이 상기 화합물36을 포함하는 경우, 상기 약투여 방식이 복강내 주사인 것을 특징으로 하는 방법.