KR100872910B1 - 김치유산균으로 발효한 콩 요구르트를 유효성분으로함유하는 조류독감, 독감 및 사스의 호흡기성 급성전염질환바이러스에 대한 항바이러스 조성물 - Google Patents

김치유산균으로 발효한 콩 요구르트를 유효성분으로함유하는 조류독감, 독감 및 사스의 호흡기성 급성전염질환바이러스에 대한 항바이러스 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 김치유산균으로 발효한 콩 요구르트를 유효성분으로 함유하는 조류독감, 독감 및 사스의 호흡기성 급성전염질환 바이러스에 대한 항바이러스 조성물에 관한 것으로, (a) 배지에서 식물성 김치유산균인 류코노스톡 김치아이( Leuconostoc kimchii ), 류코노스톡 시트레움( Leuconostoc citreum ), 류코노스톡 메센테로이드스( Leuconostoc mesenteroides ), 류코노스톡 가시코미타툼( Leuconostoc gasicomitatum ), 류코노스톡 락티스( Leuconostoc lactis ) 락토바실러스 플랜타룸( Lactobacillus plantarum ) 및 락토바실러스 사케이( Lactobacillus sakei )를 혼합배양(mixed culture)하는 단계; (b) 배지에 동물성 우유유산균인 락토바실러스 엑시도필루스( Lactobacillus acidophilus ), 비피도박테리움 론굼( Bifidobacterium longum ), 스트렙토코커스 써머필러스( Streptococcus thermophilus ) 및 락토바실러스 불가리쿠스 ( Lactobacillus bulgaricus )를 혼합배양(mixed culture)하는 단계; 및 (c) 콩물을 100℃ 1시간 멸균하고 20∼40℃로 식힌 다음, 상기 식힌 콩물에 상기 (a) 단계에서 배양된 배양액을 첨가하여 10∼20시간 1차 발효한 후, 상기 (b) 단계에서 배양된 배양액을 첨가하여 5∼10시간 추가로 2차 발효하는 단계;를 거쳐서 수득하는 것을 특징으로 한다.
김치유산균, 콩 요구르트, 조류독감, 독감, 사스, 호흡기 바이러스

Description

김치유산균으로 발효한 콩 요구르트를 유효성분으로 함유하는 조류독감, 독감 및 사스의 호흡기성 급성전염질환 바이러스에 대한 항바이러스 조성물{Anti―virus composition for acute respiratory infectious disease virus of Avian Influenza, Influenza and SARS with soy yogurt fermented by kimchi lactic acid bacteria}
본 발명은 김치유산균으로 발효한 콩 요구르트를 유효성분으로 함유하는 조류독감, 독감 및 사스의 호흡기 바이러스에 대한 항바이러스 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 에 식물성 김치유산균과 동물성 우유유산균의 혼합균주를 단계적으로 접종하여 발효시켜서 수득한 콩 요구르트를 인간에게 급성 호흡기질환을 일으키는 바이러스, 구체적으로 조류독감을 유발하는 아비안 인플루엔자 바이러스 (Avian Influenza Virus)나 독감을 유발하는 인플루엔자 바이러스(Influenza Virus) 사스(Svere Acute Respiration Syndrom; SARS)를 유발하는 코로나 바이러스(coronavirus)에 대한 항바이러스 조성물로서 사용하는 것에 관한 것이다.
일반적으로 조류에 독감을 일으키는 조류독감 바이러스는 사람에게 직접적으로 전염되지 못하며 , 돼지를 중간숙주로 거쳐 사람에 전염되는 것으로 알려져 있 다. 2004년 베트남과 태국등지에서 조류독감에 의한 사망자가 발생하는 등 조류독감에 대한 인체감염의 피해가 점점 심각해지고 있다. 이러한 피해를 줄이기 위하여 조류독감 백신과 치료제를 개발하기 위하여 많은 노력이 이루어지고 있으나 완벽한 예방과 치료가 이루어지고 있지 않다. 대한민국 공개특허10-2007-0035203에서는 어성초 추출물을 이용한 한약재 조성물을 항조류인플루엔자바이러스제로서 제안하였으며 대한민국 등록특허 10-0485056에서는 효모의 수용성 글루칸 올리고머를 함유하는 조성물을 세포내의 NO 와 TNF-α의 생성을 증가시킴으로서 간접적으로 조류독감에 대한 예방 및 치료제로서 제안하고 있다.
코로나 바이러스에 의해 유발되는 질병은 다양하다. 포유류와 조류에서 호흡기질환, 소화기질환, 간질환, 뇌질환등을 일으키는 RNA바이러스이다. 코로나바이러스는 감기를 일으키는 바이러스 중의 하나이지만 사스바이러스도 코로나바이러스의 일종이다. 사스바이러스는 2002년 중국에서 처음 발생하여 2003년 봄까지 전 세계적으로 9,000여명의 중증 급성호흡기질환 환자를 발생시켰으며 15%의 높은 치사율을 나타내었다.
매년 독감을 유행시키는 인프루엔자 바이러스는 RNA바이러스인데 변형을 번번이 일으켜 매년 새로운 항원변이주가 출현한다. 이로 인해 백신에 의존하여 독감을 예방하는 데에는 한계가 있다.
바이러스의 치료에는 많은 항바이러스제들이 쓰이고 있다. Ribavirin, acyclovir, azido thymidin, glycyrrhizin 등의 약제가 그 예이다.
상기 항바이러스제들은 이들 약물에 대한 바이러스의 내성 및 부작용으로 지 속적인 사용에 문제가 있다. 그러므로 항 바이러스 활성은 높고 부작용이 없는 재료가 있다면 일상적으로 바이러스에 노출되어 있는 현대인의 건강에 중요한 역할을 하게 될 것이다. 바이러스의 감염에 대한 억제 효과가 높고 또한 안전성에 문제가 없으며 일상적으로 이용이 가능한 항 바이러스 조성물의 개발이 요망되고 있다.
이에, 본 발명자는 김치유산균과 우유유산균의 복합균주로 콩을 발효하여 콩의 발효취가 없어 식감이 좋고 유리아미노산, 천연비타민, 활성 이소플라본, 가바 등의 영양이 풍부한 콩요구르트를 개발한 바 있으며, 상기 콩 요구르트가 바이러스 감염에 대한 억제 효과가 우수함을 입증함으로써, 본 발명을 완성하였다.
또한, 본 발명에 따른 항 바이러스 조성물은 사람이 예전부터 섭취해 왔던 콩과 김치 유산균을 이용한 발효물을 주성분으로 하고 있기 때문에, 복용에 따른 부작용이 거의 없다.
따라서, 본 발명은 김치 유산규균과 우유 유산균의 복합 균주를 이용하여 콩을 발효한 콩 요구르트를 이용하여 바이러스의 감염에 대한 억제 효과가 높고 또한 안전성에 문제가 없으며 일상적으로 섭취가 가능할 수 있는 호흡기 바이러스에 대한 항바이러스 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 해결하기 위하여, 본 발명은 (a) 배지에서 식물성 김치유산균인 류코노스톡 김치아이( Leuconostoc kimchii ), 류코노스톡 시트레움( Leuconostoc citreum ), 류코노스톡 메센테로이드스( Leuconostoc mesenteroides ), 류코노스톡 가시코미타툼( Leuconostoc gasicomitatum ), 류코노스톡 락티스( Leuconostoc lactis ) 락토바실러스 플랜타룸( Lactobacillus plantarum ) 및 락토바실러스 사케이( Lactobacillus sakei )를 혼합배양(mixed culture)하는 단계; (b) 배지에 동물성 우유유산균인 락토바실러스 엑시도필루스( Lactobacillus acidophilus ), 비피도박테리움 론굼( Bifidobacterium longum ), 스트렙토코커스 써머필러스( Streptococcus thermophilus ) 및 락토바실러스 불가리쿠스 ( Lactobacillus bulgaricus )를 혼합배양(mixed culture)하는 단계; 및
(c) 콩물을 100℃에서 1시간 가열하여 멸균하고 20∼40℃로 식힌 다음, 상기 식힌 콩물에 상기 (a) 단계에서 배양된 배양액을 첨가하여 10∼20시간 1차 발효한 후, 상기 (b) 단계에서 배양된 배양물을 첨가하여 5∼10시간 추가로 2차 발효하는 단계;를 거쳐서 수득한 콩 요구르트를 유효성분으로 함유한 조류독감, 독감 및 사스의 호흡기 바이러스에 대한 항바이러스 조성물을 제공한다.
또한, 레밍톤 약제학 핸드북 (Remington's Pharmaceutical Sciences Handbook, Mack Pub, Co.,N.Y., USA)에 개시된 것과 같이, 본 발명에 따라 제조한 콩 요구르트를 유효성분으로 하여, 투여방법, 투여형태 및 치료목적에 따라 적절한 약제학적 조성물의 형태(분말 또는 액제)로 약제학적으로 허용가능한 담체와 함께 혼합하여 희석하거나, 용기 형태의 담체 내에 봉입하여 사용할 수 있다.
그리고, 상기 담체가 희석제로 사용되는 경우에는 염수, 완충제, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 락토즈, 수크로즈, 칼슘 실리케이트, 메틸 셀룰로오즈 또는 에탄올을 담체를 사용하여 경구투여용으로 분말, 과립, 시럽, 용액제, 정제 등과 같은 제형으로 제조할 수 있다. 다만, 본 발명의 담체가 상기의 담체로 한정되는 것은 아니다.
그리고, 상기 제형에 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방 부제 등을 추가로 포함하여 포유동물에 투여된 후 활성성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 제형화할 수 있다.
한편, 본 발명에 따른 콩 요구르트 조성물의 유효량은 대상자의 우울증 정도의 경중(輕重)에 따라 당업자에 의해 결정할 수 있을 것이다. 다만, 실험을 통해 본 발명에 따른 콩 요구르트 조성물의 우효량은 0.1～ 1 mg/g으로 하는 것이 바람직하다.
이하, 본 발명을 상세히 설명하기로 한다.
이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가진다.
또한, 종래와 동일한 기술적 구성 및 작용에 대한 반복되는 설명은 생략하기로 한다.
본 발명은 단일 유산균이 아니라 복합유산균을 사용하였고 또한 일시에 접종을 하는 것이 아니고 처음에는 식물성 김치유산균을 접종하여 초기발효의 효율성을 높인 다음, 2차로 동물성 우유유산균을 콩물에 접종하여 안정된 발효 환경에서 충분하게 최종 발효시켜서 수득한 콩 요구르트를 호흡기 바이러스에 대한 항바이러스 조성물로 개발한 것이다.
본 발명에서는 11가지의 복합유산균을 사용하는데, 사용한 유산균은 식물성 김치유산균 7가지 균주와 동물성 우유유산균 4가지 균주이다. 구체적으로는 김치유산균으로 류코노스톡 김치아이( Leuconostoc kimchii KCTC 0651 ), 류코노스톡 시 트레움( Leuconostoc citreum KCTC 3526 ), 류코노스톡 메센테로이드스( Leuconostoc mesenteroides IMSNU 10146 ), 류코노스톡 가시코미타툼( Leuconostoc gasicomitatum KCTC 3753 ), 류코노스톡 락티스( Leuconostoc lactis KCTC 3528) 락토바실러스 플랜타룸( Lactobacillus plantarum KCTC 10123 ) 및 락토바실러스 사케이( Lactobacillus sakei IMSNU 10130 )를 사용하고, 우유유산균으로 락토바실러스 엑시도필루스( Lactobacillus acidophilus KCTC3145 ), 비피도박테리움 론굼( Bifidobacterium longum KCTC 3421 ), 스트렙토코커스 써머필러스( Streptococcus thermophilus KCTC 3658 ) 및 락토바실러스 불가리쿠스 ( Lactobacillus bulgaricus IMSNU 13005 )를 사용하는 것이 구입 및 항바이러스 효과적 측면에서 바람직하다. 이러한 복합유산균을 사용한 이유는 유산균의 종류마다 그 발효 메카니즘이 상이하여 상호 보완을 통해 발효취를 없애고 풍부한 발효산물을 만들 수 있기 때문이다. 구체적으로 발효메카니즘의 상이함의 예를 들면 같은 부류의 유산균이라 하더라도 포도당을 이용하여 생육할 때에 젖산(Lactic acid)을 주로 생성하는 스트렙토코커스와 같은 유산균이 있는가 하면 젖산과 더불어 에탄올과 이산화탄소를 생성하는 류코노스톡과 같은 유산균이 있고 젖산과 초산을 생성하는 비피도박테리움과 같은 유산균이 있다.
또한, 본 발명에서는 시간차를 두고 다른 복합유산균을 접종하는데, 구체적으로 멸균한 콩물에 먼저 식물성 김치유산균을 접종하고 10∼20시간 발효 후에 우유 유산균을 접종하여 5∼10시간 추가로 발효한다. 김치유산균과 우유유산균을 동시에 접종하여 발효하는 것보다는 시간차를 두고 접종하는 단계적인 발효를 하는 것이 다양한 대사산물 생성을 촉진하여 항바이러스 성분을 생성하는 것으로 판단된다. 이 경우 김치유산균을 먼저 접종하는 것이 같은 식물성 콩의 초기 발효에 효과적이다. 그리고 김치유산균에 의한 1차 발효시간을 10∼20시간으로 한정하고 우유유산균에 의한 발효시간을 5∼10시간으로 한정한 것은 본 발명의 조건으로 발효할 경우에 그 시간 동안 충분한 발효 대사산물이 생성되기 때문이다.
이하, 호흡기 바이러스에 대한 항바이러스 조성물의 제조 단계를 설명하면 다음과 같다.
- 1차 혼합배양 단계(김치유산균 종균 배양)
배지를 121℃에서 15분간 멸균하고 식물성 김치유산균인 류코노스톡 김치아이( Leuconostoc kimchii KCTC 0651 ), 류코노스톡 시트레움( Leuconostoc citreum KCTC 3526 ), 류코노스톡 메센테로이드스( Leuconostoc mesenteroides IMSNU 10146 ), 류코노스톡 가시코미타툼( Leuconostoc gasicomitatum KCTC 3753 ), 류코노스톡 락티스( Leuconostoc lactis KCTC 3528) 락토바실러스 플랜타룸( Lactobacillus plantarum KCTC 10123 ), 락토바실러스 사케이( Lactobacillus sakei IMSNU 10130 )를 각각 1×104cfu/ml 되게 접종하여 20∼40℃에서 10∼20시간 정치 배양한다. 이때, 배지는 MRS 배지를 사용하는 것이 바람직하다.
- 2차 혼합배양 단계(우유 유산균 종균 배양)
배지를 121℃에서 15분간 멸균하고 동물성 우유유산균인 락토바실러스 엑시도필루스( Lactobacillus acidophilus KCTC 3145 ), 비피도박테리움 론굼( Bifidobacterium longum KCTC 3421 )과 스트렙토코커스 써머필러스( Streptococcus thermophilus KCTC 3658 ), 락토바실러스 불가리쿠스 ( Lactobacillus bulgaricus IMSNU 13005 )를 각각 1×104cfu/ml 되게 접종하여 20∼40℃에서 10∼20시간 정치 배양한다. 이때, 배지는 1차 종균MRS 배지를 사용하는 것이 바람직하다.
- 1차 발효단계
콩물을 100℃에서 1시간 가열하여 멸균하고 20∼40℃로 식힌 다음 여기에 1차 종균을 3%(v/v)되게 접종한 다음 20∼40℃에서 10∼20시간 발효한다.
이때, 10 시간 미만을 발효하면 발효대사산물이 충분히 만들어지지 않으며 20시간을 초과하여 발효하면 우유유산균에 의한 2차 발효를 억제하기 때문에, 상술한 발효 시간 범위 내에서 발효하는 것이 바람직하다. 하지만, 본 발명의 목적에 부합되는 것이라면 발효 기간은 변경될 수 있다.
- 2차 발효단계
다음으로 2차 종균을 3%(v/v)되게 접종한 다음 20∼40℃에서 5∼10시간 발효한다.
이때, 5시간 미만을 발효하면 우유유산균에 의한 발효대사산물이 충분히 만들어지지 않으며 10시간을 초과하여 발효하면 콩요구르트의 신맛이 강하여 식감이 떨어지기 때문에 상술한 발효 시간 범위 내에서 발효하는 것이 바람직하다. 하지만, 본 발명의 목적에 부합되는 것이라면 발효 기간은 변경될 수 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명은 김치 유산균과 우유유산균의 복합균주를 이용하여 콩의 발효취가 없고 유리 아미노산 , 천연비타민, 활성 이소플라본, 발효 GABA등의 발효대사산물이 풍부한 콩 요구르트를 만들어 급성 호흡기질환을 일으키는 바이러스에 대한 항바이러스 활성을 보이는 조성물을 제공할 수 있게 되었다.
실시예
< 실시예 1 >
콩요구르트 조성물의 제조
< 1-1 > 1차 종균 배양
MRS 배지를 121℃에서 15분간 멸균하고 식물성 김치유산균인 류코노스톡 김치아이( Leuconostoc kimchii KCTC0651 ), 류코노스톡 시트레움( Leuconostoc citreum KCTC 3526 ), 류코노스톡 메센테로이드스( Leuconostoc mesenteroides IMSNU 10146 ), 류코노스톡 가시코미타툼( Leuconostoc gasicomitatum KCTC 3753 ), 류코노스톡 락티스( Leuconostoc lactis KCTC 3528) 락토바실러스 플랜타룸( Lactobacillus plantarum KCTC 10123 ), 락토바실러스 사케이( Lactobacillus sakei IMSNU 10130 )를 각각 1×104cfu/ml 되게 접종하여 35℃에서 12시간 정치 배양하였다.
< 1-2 > 2차 종균 배양
MRS 배지를 121℃에서 15분간 멸균하고 동물성 우유유산균인 락토바실러스 엑시도필루스( Lactobacillus acidophilus KCTC3145 ), 비피도박테리움 론굼( Bifidobacterium longum KCTC 3421 )과 스트렙토코커스 써머필러스( Streptococcus thermophilus KCTC 3658 ), 락토바실러스 불가리쿠스 ( Lactobacillus bulgaricus IMSNU 13005 )를 각각 1×104cfu/ml 되게 접종하여 35℃에서 12시간 정치 배양하였다.
< 1-3 > 콩요구르트 발효
콩물을 100℃에서 1시간 가열하여 멸균하고 35℃로 식힌 다음 여기에 상기 실시예 1-1의 1차 종균을 3%(v/v)되게 접종한 다음 35℃에서 12시간 발효하였다. 다음으로 실시예 1-2의 2차 종균을 3%(v/v)되게 접종한 다음 35℃에서 6시간 발효하여, 본 발명의 콩 요구르트를 제조하였다.
이를 본 발명에서는 쏘이프로(Soypro)라 명명하였다.
< 비교예 1 >
< 1-1 > 김치유산균만을 포함하는 1회 접종방식
MRS 배지를 121℃에서 15분간 멸균하고 식물성 김치유산균인 류코노스톡 김치아이( Leuconostoc kimchii KCTC 0651 ), 류코노스톡 시트레움( Leuconostoc citreum KCTC 3526 ), 류코노스톡 메센테로이드스( Leuconostoc mesenteroides IMSNU10146 ), 류코노스톡 가시코미타툼( Leuconostoc gasicomitatum KCTC 3753 ), 류코노스톡 락티스( Leuconostoc lactis KCTC 3528) 락토바실러스 플랜타룸( Lactobacillus plantarum KCTC 10123 ), 락토바실러스 사케이( Lactobacillus sakei IMSNU 10130 )를 각각 1×104cfu/ml 되게 접종하여 35℃에서 12시간 정치 배양하여 접종액을 만든 후 콩물을 100℃에서 1시간 가열하여 멸균하고 35℃로 식힌 다음 여기에 접종액을 3%(v/v)되게 접종한 다음 35℃에서 18시간 발효하였다.
< 1-2 > 우유유산균만을 포함하는 1회 접종방식
MRS 배지를 121℃에서 15분간 멸균하고 동물성 우유유산균인 락토바실러스 엑시도필루스( Lactobacillus acidophilus KCTC 3145 ), 비피도박테리움 론굼( Bifidobacterium longum KCTC 3421 )과 스트렙토코커스 써머필러스( Streptococcus thermophilus KCTC 3658 ), 락토바실러스 불가리쿠스 ( Lactobacillus bulgaricus IMSNU 13005 )를 각각 1×104cfu/ml 되게 접종하여 35℃에서 12시간 정치 배양하여 접종액을 만든 후 콩물을 100℃에서 1시간 가열하여 멸균하고 35℃로 식힌 다음 여기에 접종액을 3%(v/v) 되게 접종한 다음 35℃에서 18시간 발효하였다.
< 1-3 > 김치유산균과 우유 유산균을 포함하는 1회의 접종방식
MRS 배지를 121℃에서 15분간 멸균하고 식물성 김치유산균인 류코노스톡 김치아이( Leuconostoc kimchii KCTC 0651 ), 류코노스톡 시트레움( Leuconostoc citreum KCTC 3526 ), 류코노스톡 메센테로이드스( Leuconostoc mesenteroides IMSNU 10146 ), 류코노스톡 가시코미타툼( Leuconostoc gasicomitatum KCTC 3753 ), 류코노스톡 락티스( Leuconostoc lactis KCTC 3528) 락토바실러스 플랜타룸( Lactobacillus plantarum KCTC 10123 ), 락토바실러스 사케이( Lactobacillus sakei IMSNU 10130 )와 동물성 우유유산균인 락토바실러스 엑시도필루스( Lactobacillus acidophilus KCTC3145 ), 비피도박테리움( Bifidobacterium longum KCTC 3421 )과 스트렙토코커스 써머필러스( Streptococcus thermophilus KCTC 3658 ), 락토바실러스 불가리쿠스 ( Lactobacillus bulgaricus IMSNU 13005 )를 각각 1×104cfu/ml 되게 접종하여 35℃에서 12시간 정치 배양하여 접종액을 만든 후 콩물을 100℃에서 1시간 가열하여 멸균하고 35℃로 식힌 다음 여기에 접종액을 3%(v/v)되게 접종한 다음 35℃에서 18시간 발효하였다.
< 실시예 2 >
관능검사
전기 실시예 1과 비교예 1-1, 비교예 1-2, 비교예 1-3에서 제조한 콩요구르트를 관능검사원 20명을 선발하여 맛과 향에 대한 점수를 종합하여 10점으로 평가하였다<표1>. [ 1(나쁨) ↔10 (좋음)]
Figure 112007076415329-pat00001
< 실험예 1 >
콩요구르트의 영양성분 분석결과
전기 실시예 1에서 제조한 콩요구르트의 영양성분을 발효 전의 두유와 비교하여 분석하였다<표2>. 분석 결과 비타민 C와 비타민 D, 비타민 E, 엽산이 생성되었다 ( 비타민C : 40mg/100ml, 일일영양소 기준치의 40%, 비타민 D : 0.04mg/100ml, 일일영양소 기준치의 800% , 비타민E: 3.0mg/100ml, 일일영양소기준치의 30%, 엽산(folic acid): 0.6mg/100ml, 일일영양소 기준치의 200% ). 화학합성이 아닌 식물성 콩을 유산균이 발효하는 과정에서 천연비타민이 만들어진 것이다. 유산균에 의한 요구르트 제조시 천연비타민이 만들어진다는 보고는 아직 없다. 이는 새로운 결과이며 매우 흥미로운 연구과제이다. 그리고 그 농도도 일일영양소 기준치와 비교했을 때 적지 않은 양이다. 그리고 가바( GABA, γ-aminobutyric acid )는 발효전의 두유에 비해 그 농도가 30배 증가하였다 ( 13.0mg/100ml ). 식이섬유는 발효 중에 만들어지는 덱스트란이 4.8g/100ml 농도로 만들어졌다. 또한 유리아미노산을 분석한 결과 발효전보다 5배 증가하였다( 단백질의 유리아미노산화율 85% ). 가바는 취장의 효소액 분비를 촉진한다는 보고가 있고 단백질은 아미노산으로 분해되어야 흡수가 잘 됨으로 본 제조방법으로 발효한 콩 요구르트는 그 영양의 흡수가 월등히 높을 것으로 기대된다.
Figure 112007076415329-pat00002
<실험예2>
항 조류독감 바이러스 효능 측정
조류독감 바이러스(H9N2)의 배양에 필요한 숙주세포로서 MDCK(Mardin-Darby Canine Kidney)동물세포를 사용하였다. MDCK의 배양에 이용되는 배지로는 Minimum essential medium (MEM)에 10%농도로 페탈보빈세럼과 0.27%농도로 소듐비카보네이트 첨가하고, 곰팡이 오염을 방지하기 위하여 0.005% 농도로 젠타마이신을 첨가한 후 여과하는 방법으로 멸균한 배지이다. 동물세포 배양병 (크기:75㎠)에 15ml의 MEM 배지를 15ml 넣은 후 33℃ 온도의 CO2 인큐베이터에서 3∼4일간 배양하였다. MDCK가 90% 이상 성장하였을 때 배양 상등액은 제거하고 조류독감 바이러스를 접종하였다. 또한, 페탈보빈세럼과 젠타마이신이 포함되지 않은 MEM 배지를 15ml 넣은 후 33℃온도의 CO2 인큐베이터에서 3∼4일간 배양하면서 90% 정도 MDCK가 사멸됐을 때 그 배양액을 원심분리하여 MDCK가 제거된 조류독감 바이러스의 용액을 얻을 수 있다.
전기 실시예1과 비교예1에서 제조한 콩요구르트는 5000 ×gfh 3분간 원시분리하여 상등액을 취하고, 이 상등액을 pore size 0.22㎛인 여과막을 이용하여 여과하여 bacteria-free 상태의 soypro 상등액을 수득하였다.
조류독감 바이러스에 대한 항바이러스 효과를 측정하기 위하여 조류독감 바이러스와 serial dilution항 Soypro 상등액을 혼합 한 후 1시간 동안 반응시킨 후에 각각의 반응액을 수정란에 감염시켜 수정란에서 조류독감 바이러스가 성장하지 않는 농도를 측정하여 조류독감바이러스를 inactivation 시키는 농도를 결정한다. 대조군으로는 인플루엔자 바이러스의 항바이러스제로 알려진 아만타딘으로 하여 비교하였다.
하기 표들에 표시한 - 는 조류독감 바이러스가 사멸된 것을 나타내고, +는 조류독감 바이러스가 생육하고 있는 것을 나타낸다.
Figure 112007076415329-pat00003
상기 표1의 조류독감 바이러스에 대한 항바이러스 시험결과와 같이 본 발명의 콩요구르트(Soypro)는 항바이러스 효과를 나타냈으며, 김치유산균이나 우유유산균만을 발효에 사용한 경우보다 김치유산균과 우유유산균을 함께 사용한 경우가 항바이러스 효능이 높았고 1회의 접종에 의한 발효보다 2회에 걸쳐 접종하는 단계적인 발효를 하였을 때 그 효능이 더욱 높았다.
<실험예3>
항 독감 바이러스 효능 측정
독감바이러스 A1H3N2를 단일층(mobo-layer)으로 자란 동물세포주(MDCK cell line Madin-Darby canine의 Kidney, CEF cell line: Chicken embryo fibroblast)에 바이러스를 감염시켰으며, 이를 3일간 배양한 후 생성된 플라크(plaque)의 형성을 통해서 바이러스에 감염되었음을 확인할 수 있었다.
플레이트에 단층으로 80% 이상 자란 MDCK 혹은 CEF 동물세포주에 PBS(pH 7.4)로 10-3 비율로 희석된 조류독감 바이러스와 동일한 완충용액으로 10-3 비율로 희석된 전기 실시예 1 과 비교예 1에서 제조한 콩요구르트 상등액을 혼합하여 감염시킨 후 3일간 배양하고 고정화 과정과 뉴트랄 레드(Neutral red)를 통한 염색으로 플라크의 형성 정도를 관찰하여 그 결과를 표4에 나타냈다.
Figure 112007076415329-pat00004
표 4에서 보는 바와 같이 콩요구르트를 넣지 않은 대조군의 경우 1.1∼1.3 × 102개의 플라크가 형성된 반면에 콩요구르트를 첨가하여 감염시킨 경우 플라크의 개수가 현저히 감소하는 경향을 보여 본 발명에 따른 콩요구르트기 독감 바이러스에 대한 매우 강한 항바이러스 활성을 가지고 있음을 알 수 있었다. 그리고 조류독감 바이러스에서와 같이 김치유산균과 우유유산균을 이용하여 단계적 발효를 한 콩요구르트(실시예1)가 가장 항바이러스 활성이 높았다.
<실험예4>
항 코로나 바이러스 효능 측정
항바이러스능을 측정하기 위해 사용된 바이러스는 코로나바이러스의 하나인 PEDV를 대상으로 하였으며, 코로나바이러스는 Vero 세포에 감염시켜서 증식 배양하였다. Vero 세포는 소아태아혈청이 10% 포함된 MEM 배지를 사용하여 37℃ 배양기에서 배양하였으며 바이러스 증식배양 및 항바이러스능 측정에 사용된 배지는 트립신(0.005%)이 포함된 배양배지를 사용하였다.
코로나바이러스에 대한 바이러스 증식억제능은 대한민국 특허 출원(10-2004-0111298)에 서술된 항바이러스 검출방법에 의거하여 측정하였다. 전기 실시예 1에서 제조한 콩요구르트의 항바이러스능을 측정하기 위해서, Vero 세포 2×104개의 세포를 96 웰 플레이트(well plate)의 각 웰에 넣고 24시간 배양하였다. 24시간 후에 각 웰의 배양 상등액을 제거하고 코로나바이러스 감염용액을 각 웰에 넣은 다음, 콩요구르트 상등액을 각 웰에 1.0㎕/ml ∼ 100㎕/ml의 농도로 투여하였다. 콩요구르트의 바이러스 증식 억제능 측정은 72시간 후에 실시하였다. 시험한 96 웰 플레이트의 각 웰에서 배양액을 제거하고 인산완충액으로 1회 세척하고 50% 아세톤 액을 100㎕씩 첨가한 후 20분 동안 -20℃에 방치하였다가 50℃ 건조기에서 건조한 후 1%(v/v) 아세트산에 녹인 0.4%(w/v) SRB(sulforhodamine B) 용액 100㎕를 첨가해 30분 동안 염색시켰다. 세포와 결합하지 않은 SRB 염색액은 1%(v/v) 아세트산으로 수회 세척한 다음 다시 건조시켰다. 각 웰에 10mM 트리스 용액(pH 10.5) 100㎕를 각 웰에 가하여 세포와 결합되어 있는 염색체를 충분히 녹인 후 560mm에서 흡광도를 측정하였다. 각 처리군은 바이러스를 처리하지 않은 군(A), 콩요구르트만을 처리한 군(B), 바이러스만을 처리한 군(C), 바이러스와 콩요구르트를 같이 처리한 군(D)으로 표기하였고 각 화합물의 비교 세포생존율(%)은 다음 수생한 3번의 시험결과 수치에 대한 평균값과 표준편차로 계산한 값을 제시하였다.
Figure 112007076415329-pat00005
그 결과, 콩요구르트의 세포생존율(%)은 콩요구르트를 가하지 않은 웰의 세포와 비교하였다. 콩요구르트를 가하지 않은 웰의 흡광도를 100%로 기준하여 콩요구르트를 가한 웰의 흡광도를 비율로 표시하였다. 콩요구르트는 투여한 각각의 농도에서 100% 이상을 나타내어 세포에 대한 성장 억제나 세포독성이 없음을 알 수 있다.
콩요구르트의 바이러스 증식 억제능(%)에 대한 결과는 <표5>에 나타내었으며, 콩요구르트가 코로나바이러스를 농도 의존적인 저해 효과를 가짐을 알 수 있었다. 이와 같은 결과로부터, 본 발명의 콩요구르트는 생체 외에서 항바이러스 활성을 가지는 화합물임을 확인할 수 있었다.
Figure 112007076415329-pat00006
전술한 개시에 대해서 일정 범위의 수정, 변화 및 치환이 가능하며, 어떤 경우에는 본 발명의 특징 중 일부만이 사용될 수도 있다. 따라서, 첨부된 청구항 들이 넓게 또한 본 발명의 사상과 범위에 부합되게 해석되어야 한다.

Claims (2)

  1. (a) 배지에서 식물성 김치유산균인 류코노스톡 김치아이( Leuconostoc kimchii ), 류코노스톡 시트레움( Leuconostoc citreum ), 류코노스톡 메센테로이드스( Leuconostoc mesenteroides ), 류코노스톡 가시코미타툼( Leuconostoc gasicomitatum ), 류코노스톡 락티스( Leuconostoc lactis ) 락토바실러스 플랜타룸( Lactobacillus plantarum ) 및 락토바실러스 사케이( Lactobacillus sakei )를 혼합배양(mixed culture)하는 단계; (b) 배지에 동물성 우유유산균인 락토바실러스 엑시도필루스( Lactobacillus acidophilus ), 비피도박테리움 론굼( Bifidobacterium longum ), 스트렙토코커스 써머필러스( Streptococcus thermophilus ) 및 락토바실러스 불가리쿠스 ( Lactobacillus bulgaricus )를 혼합배양(mixed culture)하는 단계; 및
    (c) 콩물을 가열 멸균하고 20∼40℃로 식힌 다음, 상기 식힌 콩물에 상기 (a) 단계에서 배양된 배양액을 첨가하여 10∼20시간 동안 1차 발효한 후, 상기 (b) 단계에서 배양된 배양물을 첨가하여 5∼10시간동안 추가로 2차 발효하는 단계; 를 거쳐서 수득한 콩 요구르트를 유효성분으로 함유한 조류독감, 독감 및 사스의 호흡기 바이러스에 대한 항바이러스 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 유효량이 0.1～1.0 mg/g 인 것을 특징으 로 하는 항바이러스 조성물.
KR1020070107643A 2007-10-25 2007-10-25 김치유산균으로 발효한 콩 요구르트를 유효성분으로함유하는 조류독감, 독감 및 사스의 호흡기성 급성전염질환바이러스에 대한 항바이러스 조성물 KR100872910B1 (ko)

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