KR100872108B1

KR100872108B1 - 지실 추출물을 함유하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물

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Publication number: KR100872108B1
Application number: KR1020070046390A
Authority: KR
Inventors: 정윤석; 윤형영; 윤선일; 이상아; 김정진; 류종현; 송난규
Original assignee: 아주대학교산학협력단; 경기도; 에이치 엘 지노믹스(주)
Priority date: 2007-05-14
Filing date: 2007-05-14
Publication date: 2008-12-05
Also published as: KR20080100557A

Abstract

본 발명은 지실 (Poncirus trifoliata Rafin) 추출물 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 상기 지실 추출물은 조골세포의 증식뿐만 아니라 조골세포의 분화를 유도하고 파골세포의 분화를 억제함으로써 뼈 형성 및 유지를 증가시켜, 골다공증의 예방 및 치료 효능을 가진다.

지실

Description

지실 추출물을 함유하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating osteoporosis comprising poncirus extracts}

도 1a 및 도 1b는 각각 지실의 n-헥산 추출물 및 에틸 아세테이트 추출물이 마우스의 조골세포 세포주의 생존율에 미치는 영향을 측정한 결과를 나타낸다.

도 2는 마우스의 조골세포에서 덱사메타손이 알카리 포스파타아제 활성에 미치는 영향을 측정한 결과를 나타낸다.

도 3은 마우스의 조골세포에서 지실 추출물이 무기질화에 미치는 영향을 측정한 결과를 나타낸다.

도 4는 Raw 264.7 세포에서 지실 추출물이 파골세포의 분화에 미치는 영향을 측정한 결과를 나타낸다.

본 발명은 지실 (Poncirus trifoliata Rafin) 추출물 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

골다공증은 골량의 감소와 골의 미세구조의 이상으로 심한 충격 없이도 일상생활의 활동에 의해 쉽게 골절이 발생되는 질환이다. 골다공증은 폐경에 따른 급격 한 호르몬의 변화에 의한 파골세포의 활성화에 따른 골흡수 증가로 나타나는 폐경 후 골다공증과, 노화되면서 조골세포의 기능이 감소하여 골형성이 감소하는 노인성 골다공증 등으로 나누어진다. 또한 골다공증은 그 증세 자체보다는 골의 약화에 따라 용이하게 초래되는 각종 골절, 특히 대퇴골 골절 또는 척추골절 등이 장기간 활동을 제한하여 건강한 생활을 영위할 수 없고, 결과적으로 노인층 사망의 15%에 대한 원인 제공을 하기 때문에 문제가 되고 있다.

골다공증과 관련하여 과거에는 주로 골 무기질, 즉 칼슘과 인의 대사이상만을 중심으로 연구가 진행되어 왔고 기전 규명에 있어서 진전을 보지 못하였다. 하지만 최근 골 형성에 있어 무기질뿐만 아니라 골 기질 단백질의 대사에 관한 연구의 중요성이 새롭게 부각되고 있다. 골다공증의 치료 및 예방을 위하여 칼슘이 함유된 식이요법이 추천되며, 폐경기의 여성들에게는 에스트로겐(estrogen) 또는 비타민 D 투여가 추천되고 있다. 기타, 비스포스포네이트 제제가 파골세포를 억제하는 골흡수 억제제로서 새로운 대체 치료제로 주목받고 있다.

그러나, 골다공증 치료제로 널리 사용되는 칼슘보강제는 부갑상선 호르몬의 분비를 억제하며 골흡수에 의한 골량 감소를 방지하지만, 골량 유지의 개인 차이가 심한 것으로 알려져 있다 (Heandy.R.P. principles of bone biology, Academic press, 1007-1017, 1996). 또한, 에스트로겐이나 칼시토닌을 이용한 호르몬 요법의 경우 골밀도를 증가시키고, 직장암의 발생을 감소시킨다는 보고도 있으나, 유방암, 심근경색, 정맥 혈전증 등의 부작용이 보고된 바 있다 (Nelson, H.D et al., JAMA, 288:872-881, 2002; Lemay, A., J.Obstet. Bynaecol. Can., 24:711-7152-3). 또한, 비스포스포네이트 제제의 경우, 부적절한 경구 투여시 상기도에 병소가 관찰되기도 한다 (Heandy.R.P. principles of bone biology, Academic press, 1007-1017, 1996; Cryer, R. and Bauer, D.D., Mayo.Clin.Poc., 77:1031-1043, 20021,4). 따라서, 부작용 발현이 적은 안전성이 확보된 새로운 골다공증 치료제가 당업계에 요구되고 있다.

항염증 및 면역억제 효능을 갖는 덱사메타손 등의 당질코르티코이드(glucocorticoids)를 장기 투여할 경우 골 손실과 뼈 여림(bone fragility)이 증가하여 부작용으로서 골다공증이 발생하는 것으로 알려져 있다 (Kobayashi A et al., Scand J Rheumatol 2005; 34:480-484; Humphrey E.L et al., Bone 38 (2006) 652-661; 및 Mei-Fway Iu et al., J Bone Miner Metab (2005) 23:450-455). 당질코르티코이드는 MSC(Mesenchymal stem cell)로부터 조골세포로의 분화 과정을 억제하고, 최종적으로 골형성의 기능을 갖게 되는 조골세포로의 분화를 억제한다. 이런 결과는 결국 성숙된 조골세포수가 적어지는 결과를 초래한다. 또한, 당질코르티코이드는 성숙된 조골세포의 사멸을 촉진시켜 조골세포 분화장애 및 조골세포 사멸 촉진이라는 결과를 초래하여 골형성 세포들이 감소하게 된다 (Osteoporosis 3판 대한골대사학회).

골 조직은 조골세포에 의한 골 형성과 파골세포의 의한 골 흡수가 함께 일어나는 지속적인 리모델링(remodeling)을 통해 균형을 유지하고 있다. 이런 대사는 물리적 영향, 호르몬 체계와 국소 인자에 의해 조절이 이루어지는데, 여러 가지 요인에 의해 골 흡수가 골 형성을 초과하여 골량이 한계 이하로 감소하면 골다공증과 같은 골 질환이 발생한다.

조골세포는 골의 유기 물질인 오스테오이드(osteoid)를 침착시킴으로서 골형성을 이루게 되며, 오스테오이드는 제1형 콜라겐(type 1 collagen), 오스테오칼신(osteocalcin), 오스테오넥틴(osteonetin), 시알로프로테인(sialo protein)등으로 구성되어있다. 형성된 오스테오이드는 후에 무기질 침착 작용을 거치는데 이때 조골세포가 무기질을 유도하여 인산화 칼슘이 결정체인 수산화인회석(hydroxyapatitie)을 이루어 오스테오이드에 침착되게 된다.

조골세포의 생화학적인 지표로는 알칼리 포스파타아제(alkaline phosphatase, ALP), 제1형 콜라겐(type 1 collagen), 오스테오칼신(osteocalcin) 등이 이용된다. 알카리 포스파타아제는 증식이 끝나면 바로 배출되는 초기 활성 지표로서 기질의 무기질화가 일어나기 시작하면 감소한다. 오스테오칼신은 기질의 무기질화(mineralization)가 일어나는 동안 발현되는 칼슘 결합 단백질이며 후기 활성 지표로서 이용된다 (Bronkers AL et al., Bone iner 2(5):361-73, 1987).

한편, 지실(학명: Poncirus trifoliata Rafin)은 산초과의 낙엽관목으로서, 탱자나무의 익지 않은 열매를 말린 것을 말한다. 대부분 반구형, 외면은 녹색-갈색이며 거칠고 오목한 작은 점들이 많다. 내면은 더러운 회색이고 중심으로부터 방사형으로 8-16개의 작은 방으로 되어있고 이 작은 방들이 건조하게 되면 오목하게 쭈그러지고 간혹 덜 익은 황백색의 씨가 들어있을 때가 있다. 특이한 냄새가 있으며 맛은 매우 쓰다. 지실의 효능은 방향성 건위약으로 사용되며 항염증, 항히스타민 작용이 있는 것으로 보고되고 있고 복통을 멎게 하는 작용과 처진 위를 끌어올리는 작용이 알려져 있다.

대한민국 특허공개 제10-2000-0046630호는 지실 추출물을 함유한 피부가려움증 완화용 조성물을 개시하고 있고, 대한민국 특허 제10-0378734호는 지실 추출물을 함유한 치매 치료용 조성물을 개시한 바 있다. 또한, 대한민국 특허등록 제10-0473529호 및 제10-0478150호는 지실, 순기산 등의 복합제 추출물을 유효성분으로 함유하는 당뇨병 예방 및 치료용 조성물 등을 개시한 바 있다. 또한, 대한민국 특허등록 제10-635658호는 지실을 알콜 및 알콜 수용액으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 용매를 사용하여 추출한 수술후 장폐색 치료용 조성물을 개시한 바 있다.

본 발명자들은 우수한 안전성을 갖는 천연물 유래의 추출물을 대상으로, 골다공증의 예방 또는 치료 효과를 갖는 추출물을 개발하고자 다양한 연구를 수행하였다. 특히, 덱사메타손 등의 당질코르티코이드에 의해 유발되는 골 손실 현상을 조골세포 증식 효과와 더불어 골세포 분화지표 인자인 알칼리 포스파타아제(alkaline phosphatase)와 조골세포의 무기질화(mineralization) 효과 및 골 흡수를 조절하는 인자인 오스테오프로테게린(osteoprotegerin, OPG)과 골 흡수에 관여하는 파골세포의 분화억제 효과를 다양한 천연물을 대상으로 검색하였다. 그 결과, 놀랍게도, 골다공증과 관련한 활성이 전혀 보고된 바 없는 지실 추출물이 조골세포의 증식뿐만 아니라 조골세포의 분화를 유도하고 파골세포의 분화를 억제함으로써 뼈 형성 및 유지를 증가시킬 뿐만 아니라, 우수한 안전성을 갖는다는 것을 발 견하였다.

따라서, 본 발명은 지실 (Poncirus trifoliata Rafin) 추출물을 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 태양에 따라, 지실 (Poncirus trifoliata Rafin) 추출물 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학 조성물이 제공된다.

상기 지실 추출물은 조골세포(osteoblast)의 증식 및 분화를 유의성 있게 증가시킴과 동시에 파골세포(osteoclast)의 활성을 억제함으로써, 골다공증의 예방 및 치료 효과를 갖는다. 즉, 조골세포에 덱사메타손을 처리하였을 때 세포 생존율이 약 20% 정도 감소되었으나, 지실 추출물은 덱사메타손에 의해 사멸된 조골세포를 거의 정상으로 회복시켰다. 또한 지실 추출물은 조골세포의 분화지표 인자인 알칼라인 포스파타아제(Alkaline phosphatase, ALP)와 조골세포 무기질화(osteoblast mineralization)를 유의성 있게 증가시킨다. 또한, 지실 추출물은 뼈 흡수를 조절하는 인자 중의 하나인 오스테오프로테게린(Osteoprotegerin, OPG)의 분비를 증가시키고 뼈 흡수에 관여하는 파골세포의 분화를 억제한다. 따라서, 지실 추출물은 조골세포의 증식뿐만 아니라 조골세포의 분화를 유도하고 파골세포의 분화를 억제함으로써 뼈 형성 및 유지를 증가시켜, 골다공증의 예방 및 치료 효능을 가진다. 또한, 지실 추출물은 우수한 안전성을 가진다.

본 발명의 약학 조성물에 활성 성분으로서 함유되는 지실 추출물은 지실을 예를 들어, 에탄올, 메탄올 등의 C₁∼C₄ 알콜 또는 C₁∼C₄ 알콜 수용액으로 추출하여 얻어진 것을 바람직하게 사용할 수 있다. 더욱 바람직하게는 상기 지실 추출물은 에탄올 또는 에탄올 수용액, 바람직하게는 약 95% 에탄올을 추출용매로 사용하여 얻어진 추출물일 수 있다.

또한, 본 발명의 약학 조성물에 함유되는 지실 추출물은 (a) 지실을 C₁∼C₄ 알콜 또는 C₁∼C₄ 알콜 수용액으로 추출하여 추출물을 얻는 단계 및 (b) 단계(a)에서 얻어진 추출물에 물 및 n-헥산을 가하여 n-헥산 분획을 얻는 단계를 포함하는 추출공정에 의해 얻어진 추출물일 수 있다.

상기 단계(a)에서 사용되는 추출용매 즉, C₁∼C₄ 알콜 또는 C₁∼C₄ 알콜 수용액으로는 에탄올 또는 에탄올 수용액을 바람직하게 사용할 수 있다. 또한, 상기 단계(a)는 지실을 에탄올 또는 에탄올 수용액 등의 C₁∼C₄ 알콜 또는 C₁∼C₄ 알콜 수용액으로 추출한 다음, 추출액을 농축 또는 건조하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 농축 또는 건조는 통상의 방법, 예를 들어 감압 농축 또는 감압 건조 등의 방법으로 수행될 수 있다. 상기 추출은 80 ∼ 120 ℃, 더욱 바람직하게는 약 100 ℃에서, 3 ∼ 6 시간 동안, 더욱 바람직하게는 약 3 시간 동안 수행될 수 있으나, 상기 추출온도 및 추출시간은 사용되는 지실 및 추출용매의 양에 따라 변경될 수 있다.

상기 단계(b)는 n-헥산 분획을 얻은 다음, 필요에 따라 농축 및/또는 건조하 는 단계를 더 포함할 수 있으며, 상기 농축 및/또는 건조는 통상의 방법, 예를 들어 감압 농축 또는 감압 건조 등의 방법으로 수행될 수 있다. 즉, 얻어지는 지실 추출물은 n-헥산 농축액의 형태일 수 있으며, 상기 n-헥산 추출분획 또는 농축액을 통상의 방법에 따라 건조시킨 건조 분말의 형태일 수도 있다.

또한, 본 발명의 약학 조성물에 함유되는 지실 추출물은 제1항에 있어서, 상기 지실 추출물이 (a') 지실을 C₁∼C₄ 알콜 또는 C₁∼C₄ 알콜 수용액으로 추출하여 추출물을 얻는 단계, (b') 단계(a')에서 얻어진 추출물에 물 및 n-헥산을 가하여 물 분획을 얻는 단계, 및 (c') 단계(b')에서 얻어진 물 분획에 에틸 아세테이트를 가하여 에틸 아세테이트 분획을 얻는 단계를 포함하는 추출공정에 의해 얻어진 추출물일 수 있다.

상기 단계(a')에서 사용되는 추출용매 즉, C₁∼C₄ 알콜 또는 C₁∼C₄ 알콜 수용액으로는 에탄올 또는 에탄올 수용액을 바람직하게 사용할 수 있다. 또한, 상기 단계(a')는 지실을 에탄올 또는 에탄올 수용액 등의 C₁∼C₄ 알콜 또는 C₁∼C₄ 알콜 수용액으로 추출한 다음, 추출액을 농축 또는 건조하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 농축 또는 건조는 통상의 방법, 예를 들어 감압 농축 또는 감압 건조 등의 방법으로 수행될 수 있다. 상기 추출은 80 ∼ 120 ℃, 더욱 바람직하게는 약 100 ℃에서, 3 ∼ 6 시간 동안, 더욱 바람직하게는 약 3 시간 동안 수행될 수 있으나, 상기 추출온도 및 추출시간은 사용되는 지실 및 추출용매의 양에 따라 변경될 수 있다.

상기 단계(c')는 에틸 아세테이트 분획을 얻은 다음, 필요에 따라 농축 및/또는 건조하는 단계를 더 포함할 수 있으며, 상기 농축 및/또는 건조는 통상의 방법, 예를 들어 감압 농축 또는 감압 건조 등의 방법으로 수행될 수 있다. 즉, 얻어지는 지실 추출물은 에틸 아세테이트 농축액의 형태일 수 있으며, 상기 에틸 아세테이트 추출분획 또는 농축액을 통상의 방법에 따라 건조시킨 건조 분말의 형태일 수도 있다.

본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 상기 약제학적으로 허용가능한 담체로는 락토즈, 옥수수전분 등의 부형제, 마그네슘 스테아레이트 등의 활택제, 유화제, 현탁화제, 안정화제, 및 등장화제 등을 사용할 수 있다. 필요할 경우, 감미제 및/또는 향미제를 가할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 경구 투여하거나, 정맥내, 복강내, 피하, 직장 및 국소 투여를 포함한 비경구로 투여될 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물은 정제, 캡슐제, 수성액제 또는 현탁제 등의 다양한 형태로 제제화될 수 있다. 경구용 정제의 경우 락토즈, 옥수수 전분 등의 담체 및 마그네슘 스테아레이트와 같은 활택제가 통상 가해질 수 있다. 경구투여용 캡슐제의 경우, 락토즈 및/또는 건조 옥수수 전분이 희석제로서 사용될 수 있다. 경구용 수성 현탁제가 필요할 경우, 활성성분을 유화제 및/또는 현탁화제와 결합시킬 수 있다. 필요할 경우, 특정 감미제 및/또는 향미제를 가할 수 있다. 근육내, 복강내, 피하 및 정맥내 투여의 경우, 활성성분의 멸균 용액이 통상 제조되며, 용액의 pH를 적합하게 조절하고 완충시켜야 한다. 정맥내 투여의 경우, 용질의 총 농도는 제제 에 등장성이 부여되도록 조절되어야 한다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 pH가 7.4인 염수 등을 수용액제의 형태일 수 있다. 상기 용액은 국소 주사(local bolus injection)로 환자의 근육내 혈류에 도입될 수 있다.

본 발명의 화합물은 골다공증 환자에게 약 0.5 mg/kg 내지 약 500 mg/kg per day의 유효량으로 투여될 수 있다. 물론, 상기 용량은 환자의 나이, 체중, 감수성, 또는 증상에 따라 변경될 수 있다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.

실시예

1. 시험 방법

(1) 지실의 n-헥산 추출물의 제조

지실 800 g에 95% 에탄올 3.2 L를 가하고, 약 100 ℃에서 3 시간 동안 추출한 다음, 여과하여 얻어진 추출액을 감압 농축하여 95% 에탄올 추출물 약 150 g을 얻었다. 여기에 물 150 ml를 가하여 현탁시킨 후 n-헥산을 상기 현탁액의 2배 부피로 가하여 혼합한 다음, 층이 완전히 분리될 때까지 방치하였다. 물 층 및 n-헥산 층을 분리하고 n-헥산 분획을 감압 농축하여 약 25 g의 n-헥산 분획(이하, "n-헥산 추출물"이라 칭함)을 얻었다.

(2) 지실의 에틸 아세테이트 추출물의 제조

(1)에서 얻어진 물 층에, 약 2 배 부피의 에틸 아세테이트를 가하여 혼합한 다음, 층이 완전히 분리될 때까지 방치하였다. 물 층 및 에틸 아세테이트 층을 분리하고, 에틸 아세테이트 분획을 감압 농축하여 약 70 g의 에틸 아세테이트 분획(이하, "에틸 아세테이트 추출물"이라 칭함)을 얻었다.

(3) 세포배양

마우스의 조골세포(RIKEN cell bank, 일본)을 10% FBS (fetal bovine serum, GibcoBRL, Grand Island, USA), 1% 페니실린/스트렙토마이신 (GibcoBRL, Grand Island, USA)이 첨가된 α-MEM (α- modified Eagle's medium, GibcoBRL, Grand Island, USA) 배지에서 37 ℃ (5% CO₂ / 60% 상대습도)의 항온, 항습 배양기로 배양하였다. 파골세포인 뮤라인 마크로파지 세포주 Raw 264.7(murine macrophage cell line Raw 264.7)(TIB-71, ATCC, USA)은 10% FBS (fetal bovine serum, GibcoBRL, Grand Island, USA), 1% 페니실린/스트렙토마이신 (GibcoBRL, Grand Island, USA)이 첨가된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium, GibcoBRL, Grand Island, USA) 배지에서 37 ℃(5% CO₂ / 60% 상대습도)의 항온, 항습 배양기로 배양하였다.

(4) MTT 분석

조골 세포의 사멸정도는 덱사메타손(Sigma, St. Louis, MO, USA) 10uM 처리후 MTT(3-[4,5-디메틸티아졸-2-일]-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드, 5mg/mL, Sigma, St. Louis, MO, USA) 분석법에 의하여 측정하였다. 또한 시료의 세포손상 억제정도 및 세포증식효과는 지실 추출물을 첨가한 세포를 48시간 배양 후, MTT 분석에 의하여 세포의 생존율을 측정하여 확인하였다. 즉, 마우스의 조골세포를 3 × 10³ cells/well로 96 웰 플레이트에 100 μl씩 분주하여 24시간 배양하고, 덱사메타손 및 시료 처리 후 48시간 배양한 다음, 배지의 10%를 제거한 후, 제거한 양만큼의 MTT 용액을 첨가하고, 4 시간 동안 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 배양액을 제거한 후, 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide(DMSO), Duksan) 용액 150 μl씩을 첨가하고 교반기(shaker)로 10분간 흔들어준 후, 540 nm에서 ELISA (enzyme-linked immunosorbant assay) 리더(reader) (Molecular Devices Co.)로 흡광도를 측정하였다.

(5) ALP 분석

조골세포의 분화에 미치는 지실 추출물의 영향을 확인하기 위해, ALP 활성의 변화를 측정하였다. 12 웰 플레이트에 1 x 10⁵ cells/well이 되도록 분주하여 단층으로 증식시킨 후 10 mM β-글리세로포스페이트(β-glycerophosphate)(Sigma, St. Louis, MO, USA) 와 50 ㎍/㎖ 아스코르빈산(Sigma, St. Louis, MO, USA)를 첨가한 배지에 지실추출물(0.1 또는 0.05 mg/ml) 및/또는 덱사메타손(1 uM)을 처리하였다. 6 일 동안 배양한 다음, 배양액을 제거하고 PBS로 세척 후 용혈 완충액(lysis buffer)을 처리하여 원심분리한 다음, 상층액의 일정량(약 50 ul)을 기질인 100 mM P-NPP(p-nitrophenyl phosphate, Fluka, UK)와 함께 상온에서 반응시켜 기질인 P-NPP로부터 유리되어 나온 P-NP(p-nitrophenol)의 양을 측정하였다. ALP활성 측정은 ELISA 리더(reader) 흡광도 405 nm로 측정하였다.

(6) 오스테오프로테게린(Osteoprotegerin, OPG) ELISA

오스테오프로테게린(Osteoprotegerin, OPG)은 파골세포의 생성 억제 및 파골세포의 분화를 억제하는 물질로서 지실 추출물이 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위해 OPG 단백질을 ELISA를 이용하여 측정하였다. 12 웰 플레이트에 1 x 10⁵ cells/well이 되도록 조골세포를 분주하여 단층으로 증식시킨 후 10 mM β-글리세로포스페이트(Sigma, St. Louis, MO, USA) 와 50 ㎍/㎖ 아스코르빈산(Sigma, St. Louis, MO, USA)을 첨가한 배지에 지실 추출물을 0.1, 0.05, 0.01 mg/ml의 농도로 처리하여 48 시간 동안 배양하였다. 배양액을 항-마우스 OPG 캡쳐(capture) 항체 플레이트(890966, R&D systems, Oxon, UK)에 50 ㎕씩 넣고 상온에서 2 시간 동안 반응시켰다. 세척용 완충액(washing buffer)으로 5회 세척한 후 마우스 OPG 컨쥬게이트(mouse OPG conjugate)(890967, R&D systems, Oxon, UK)를 100㎕씩 넣고 상온에서 2 시간 동안 반응시켰다. 세척용 완충액으로 5회 세척한 후 기질 용 액(895000-1, R&D systems, Oxon, UK)을 100㎕씩 넣고 빛을 차단하여 상온에서 30분 동안 반응시켰다. 발색 정도를 확인 후 정지 용액(stop solution)을 100㎕씩 첨가하여 ELISA 리더(reader) 흡광도 450 nm로 측정하였다.

(7) 무기질화 분석(Mineralization assay)

마우스의 조골세포를 100 Φ 디쉬(dish)에 5 x 10⁴ cells/dish 가 되도록 분주하여 단층으로 증식시킨 후 10 mM β-글리세로포스페이트(Sigma, St. Louis, MO, USA) 와 50 ㎍/㎖ 아스코르빈산(Sigma, St. Louis, MO, USA)을 첨가한 배지에 지실 추출물을 0.1, 0.05, 0.01 mg/ml의 농도로 처리하여 3일 간격으로 배양액의 일부를 교환해주면서 30 일 동안 배양하였다. 배양 후 PBS로 세척한 후 차게한 메탄올-아세테이트 고정액을 넣고 -20℃에서 1 시간 동안 고정하였다. 고정 후 증류수로 세척한 다음, 40 mM 알리자린 레드 S(alizarin red S)(pH4.2, Sigma, St. Louis, MO, USA)로 상온에서 10분 동안 염색하였다. 증류수로 5회 세척 후 PBS로 15분 동안 흔들면서 세척한 다음, 건조시킨 후 사진촬영을 하였다.

(8) TRAP(tartrate resistant acid phosphatase) - 양성 염색(positive staining)

파골세포의 분화에 있어 다핵세포가 생성되며, 파골세포 분화에 미치는 지실추출물의 영향을 측정하였다. 12 웰 플레이트에 1 x 10⁴ cells/well 이 되도록 Raw 264.7 세포를 분주하여 단층으로 증식시킨 후, 30 ng/ml의 RANKL(receptor activator of NF-kB ligand)과 M-CSF(macrophage colcony stimulating factor)를 첨가하고, 지실의 에틸 아세테이트 추출물을 0.1 mg/ml의 농도로 처리하여 4-5일 동안 배양하였다. 세포를 PBS로 세척한 다음 시트레이트-아세테이트-포름알데히드(citrate-acetate-formaldehyde)로 5분간 고정시키고 나프톨(naphtohol) AS-BI 포스페이트(phosphate), 패스트가넷(fast Garnet) GBC 용액과 7 mM 타르트레이트(tartrate) 완충액(pH 5.0)를 함유하는 37 ℃ 아세테이트(acetate) 완충액(pH 5.0)에서 1시간 동안 배양하여 TRAP염색을 하였다. 이때, 3개 이상의 핵을 가지는 TRAP(+)다핵세포들을 파골세포로 간주하였다.

(9) 단회 투여 급성 독성 시험

지실 추출물은 독성이 없는 것으로 알려져 있으나(Lee HT 등, J Ethnopharmacol. 2005 Nov 14;102(2):131-6), 단회 투여 급성 독성 시험을 시행하여 지실 추출물의 안전성을 확인하였다. 본 독성 시험은 한국 화학 시험 연구원 독성 연구팀에 의뢰하여 결과를 얻었으며, 독성 시험은 GLP 조건하에서 수행하였다. 생후 6 주령의 마우스를 암,수 각각 5마리/군으로 하여 4 군으로 시험하였다. 단회 투여량은 2000 mg/kg로 하여 경구 투여하였으며, 투여 후 2주 이상 관찰하여(2회/1일) 개략의 치사량, 체중의 측정(기간 중 3회 이상), 관찰 종료 후 부검실시, 육안적 변화 관찰과 폐사 동물에 대한 병리조직 검사를 시행하였다.

2. 시험 결과

(1) 지실 추출물이 마우스 조골세포 세포주의 생존율에 미치는 영향

덱사메타손은 줄기세포로부터 조골세포로의 분화를 억제시키고 또한 조골세포의 사멸을 유도한다. 조골세포의 사멸은 골형성 세포들이 감소함에 따라 골다공증을 유발하게 되는데 이러한 조골세포 사멸의 억제는 골다공증 방지에 중요한 인자가 된다.

덱사메타손에 의한 세포사멸이 지실추출물에 의해서 회복되는지 확인하기 위하여 마우스 조골세포 세포주에 덱사메타손과 지실 추출물을 동시처리하여 그 효과를 확인하였다. 즉, 지실의 에틸 아세테이트 추출물, n-헥산 추출물과 덱사메타손 10^-5M을 첨가한 세포를 48 시간 동안 배양 후 MTT 분석법에 의하여 세포의 생존율을 확인하였다. 그 결과, 지실의 에틸 아세테이트 추출물은 0.1 mg/ml에서 덱사메타손에 의해 감소된 세포 생존율이 대조군(control) 수준 이상 증가하였고, 지실의 n-헥산 추출물은 0.05 mg/ml에서 세포 생존율이 90 %이상 증가하였다 (도 1a 및 도 1b 참조).

(2) 마우스 조골세포 세포주에서 지실 추출물이 알칼리 포스파타아제(alkaline phosphatase, ALP) 활성에 미치는 영향

알칼리 포스파타아제(alkaline phosphatase, ALP)는 조골세포의 분화과정에 서 발현되는 비콜라겐 단백질로서 골대사에서 무기질화 과정에 필수적인 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 조골세포의 분화에 영향을 주는 ALP가 p-NPP(p-nitrophenyl phosphate)와 반응한 정도를 측정하여 지실 추출물에 의한 ALP 활성 변화를 측정하였다. 마우스 조골세포 세포주에 지실 추출물을 농도별로 단독 처리하여 6일 동안 배양 후 ALP 활성을 측정하였다. 그 결과, 지실의 에틸 아세테이트 추출물, n-헥산 추출물을 처리한 세포에서 ALP 활성이 유의성 있게 증가하였다 (표 1 참조)

	콘트롤^a	0.05 mg/ml 처리군(%)	0.1 mg/ml 처리군 (%)
에틸 아세테이트 추출물	100	285.7±50.3	454.0±137.3
n-헥산 추출물	100	372.8±52.03	465.8±141.15

^a콘트롤: 지실 추출물을 처리하지 않은 세포

또한, 덱사메타손을 농도별로 처리하여 ALP활성을 확인하고(도 2 참조), 지실의 에틸 아세테이트 추출물, n-헥산 추출물에 덱사메타손을 동시 처리하여 ALP 활성을 측정한 결과는 다음 표 2와 같다.

	대조군^a	Dex^b	0.05 mg/ml 처리군 (%)	0.1 mg/ml 처리군 (%)
에틸 아세테이트 추출물	100	68.4±12.18	431.2±112.02	342.3±186.85
n-헥산 추출물	100	68.2±12.99	432.4±196.75	643.1±64.45

^a대조군: 지실 추출물 및 덱사메타손을 처리하지 않은 세포

^bDex: 덱사메타손을 처리(10^-6 M)한 세포

상기 표 2에서 알 수 있는 바와 같이, 덱사메타손 10^-6 M을 처리하였을 때 감소한 ALP 활성이 지실의 에틸 아세테이트 추출물 및 n-헥산 추출물을 처리하였을 때 크게 증가하였였다.

(3) 마우스 조골세포 세포주에서 지실 추출물이 오스테오프로테게린(osteoprotegerin, OPG) 생성에 미치는 영향

오스테오프로테게린(osteoprotegerin, OPG)은 파골세포의 생성 억제 및 파골세포의 분화를 억제하는 물질로서, OPG의 증가는 조골세포의 분화과정에서 분비되는 단백질로서 파골세포의 분화를 유도하는 RANKL(receptor activator of nuclear kappa-B ligand)과 경쟁적으로 작용하여 파골세포의 분화를 억제하는 역할을 한다.

지실 추출물이 OPG 단백질 생성에 미치는 영향을 확인하기, OPG 단백질을 ELISA를 이용하여 측정하였다. 마우스 조골세포 세포주에 지실 추출물을 농도별로 단독 처리하여 48 시간 동안 배양한 후 OPG 활성을 측정하였다. 그 결과, 지실 추출물은 OPG 생성을 유의성 있게 증가시킴을 확인하였다 (표 3 참조).

	콘트롤^a	0.01 mg/ml 처리군(%)	0.05 mg/ml 처리군(%)	0.1 mg/ml 처리군(%)
에틸 아세테이트 추출물	100	229.1±0.0	196.4±5.66	287.3±12.40
n-헥산 추출물	100	128.7±0.90	265.2±30.75	177.4±22.74

^a대조군: 지실 추출물을 처리하지 않은 세포

(4) 마우스 조골세포 세포주에서 지실 추출물이 무기질화(mineralization)에 미치는 영향

무기질화(Mineralization)는 조골세포의 분화과정에 있어 기질의 무기질화 과정으로서 초기에 알카리 포스파타아제에 의해 분화가 시작되면서 기질의 무기질화가 시작되고 최종적으로 무기질 소절(mineral nodule)이 형성되면서 기질의 무기질화가 완료되게 된다. 상기한 바와 같이, 지실 추출물이 분화 초기에 알카리 포스파타아제를 증가시켜 분화를 유도시킴을 확인하였으므로, 그 최종 단계인 기질의 무기질화를 측정함으로써 지실 추출물이 조골세포의 분화에 미치는 영향을 측정하였다.

마우스 조골세포 세포주에 지실 추출물을 농도별로 단독 처리하여 30일 동안 배양 후 무기질화를 측정한 결과는 도 3과 같다. 도 3에서 알 수 있는 바와 같이, 지실의 에틸 아세테이트 추출물은 대조군과 비교하여 0.1, 0.05 mg/ml에서 무기질 소절(mineral nodule)이 증가된 경향을 보이고 있고, 지실의 n-헥산 추출물도 대조군에 비해 0.05 mg/ml에서 무기질 소절(mineral nodule)의 생성이 증가하였다.

(5) 뮤라인 파골세포 세포주에서 지실 추출물이 파골세포 분화에 미치는 영향

파골세포는 골수내의 단핵구/대식세포 계통의 세포로부터 유래하고, 이 단핵 전구세포는 혈액 내로 순환되며 골내막층에서 전구세포들이 증식되어 다핵세포를 형성하기 위해 융합된다고 알려져 있으며(Scheven, B.A.A et al,. Natrure. 321:79-81, 1986), 파골세포에는 특징적으로 타르트레이트(tartreate)에 대해 저항성을 나타내는 산성 포스파타제(acid phosphatase)인 TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase)를 가지며 이는 다른 골조직 세포와 구별할 수 있는 파골세포의 세포 화학적 표지효소로 이용된다고 알려져 있다(Minkin,C,. Calcif. Tissue Int,. 34:285-290, 1982).

파골세포의 분화를 유도하기 위하여 뮤라인 마크로파지 세포주 Raw 264.7(murine macrophage cell line Raw 264.7)을 이용하였으며 TRAP(+)인 다핵세포를 파골세포로 간주하고 지실의 에틸 아세테이트 추출물(0.1 mg/ml)을 처리하여 4일 동안 배양 후 TRAP(+)다핵세포의 변화를 확인하였다. TRAP 활성을 측정한 결과, 지실의 에틸 아세테이트 추출물 처리군이 대조군에 비해 TRAP(+)가 감소함을 확인하였다 (도 4 참조)

(6) 지실 추출물에 의한 단회 투여 급성 독성 시험

급성 독성 시험은 한국 화학시험연구원 독성연구팀에 의뢰하여 GLP 수준으로 진행하였으며, 6주령의 ICR 마우스를 사용하여 급성 독성 시험을 실시하였다. 군당 암/수 5마리씩의 동물에 지실 추출물(95% 에탄올 추출물)을 50% 에탄올에 현탁하여 2000 mg/kg 용량으로 단회 경구 투여하였다. 50 % 에탄올에 대한 대조군을 추가하여 50 % 에탄올의 효과에 대해서도 진행하였다. 시험물질 투여 후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 부검으로 장기의 이상 여부를 관찰하였다.

시험결과, 시험물질인 지실 추출물을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 부검 소견 등에서도 독성 변화는 관찰되지 않았다. 이상의 결과 지실 추출물은 독성변화가 나타나지 않았으며 경구용 물질로 안전한 물질임을 확인하였다.

본 발명의 약학조성물에 활성성분으로서 함유되는 지실 추출물은 조골세포의 증식뿐만 아니라 조골세포의 분화를 유도하고 파골세포의 분화를 억제함으로써 뼈 형성 및 유지를 증가시켜, 골다공증의 예방 및 치료 효능을 가진다. 또한, 상기 지실 추출물은 우수한 안전성을 가진다.

Claims

(a) 지실을 C₁∼C₄ 알콜 또는 C₁∼C₄ 알콜 수용액으로 추출하여 추출물을 얻는 단계 및 (b) 단계(a)에서 얻어진 추출물에 물 및 n-헥산을 가하여 n-헥산 분획을 얻는 단계를 포함하는 추출공정에 의해 얻어진 지실 (Poncirus trifoliata Rafin) 추출물 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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제1항에 있어서, 상기 단계(a)가 지실을 C₁∼C₄ 알콜 또는 C₁∼C₄ 알콜 수용액으로 추출한 다음, 추출액을 농축 또는 건조하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
(a') 지실을 C₁∼C₄ 알콜 또는 C₁∼C₄ 알콜 수용액으로 추출하여 추출물을 얻는 단계, (b') 단계(a')에서 얻어진 추출물에 물 및 n-헥산을 가하여 물 분획을 얻는 단계, 및 (c') 단계(b')에서 얻어진 물 분획에 에틸 아세테이트를 가하여 에틸 아세테이트 분획을 얻는 단계를 포함하는 추출공정에 의해 얻어진 지실 (Poncirus trifoliata Rafin) 추출물 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제6항에 있어서, 상기 단계(a')가 지실을 C₁∼C₄ 알콜 또는 C₁∼C₄ 알콜 수용액으로 추출한 다음, 추출액을 농축 또는 건조하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제1항 및 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 C₁∼C₄ 알콜 또는 C₁∼C₄ 알콜 수용액이 에탄올 또는 에탄올 수용액임을 특징으로 하는 약학 조성물.