KR100554387B1 - 골다공증 예방 및 치료용 영지버섯 추출물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 골다공증 예방 및 치료에 효과를 갖는 영지버섯(학명 Ganodema lucidum (Fr.) Karst.) 추출물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 영지버섯을 에틸 알코올로 추출하여 얻어지는 지용성 성분이 다량 함유된 골다공증 유발 억제 활성을 갖는 영지버섯 추출물에 관한 것이다. 본 발명에 의한 영지버섯 추출물은 골다공증 치료제 또는 예방제로서 사용될 수 있을 뿐만 아니라 건강 식품으로도 응용될 수 있다.

영지버섯, 골다공증 치료제

Description

골다공증 예방 및 치료용 영지버섯 추출물{Ganoderma lucidum extract for the prevention and treatment of osteoporosis}

도 1은 영지버섯 추출물의 농도에 따른 조골세포 증식에 미치는 영향을 나타낸 그래프이고,

K6EB : 영지버섯 에탄올 추출물의 노말 부탄올 분획,

K6EEa : 영지버섯 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획,

도 2는 영지버섯 추출물이 RCC 세포의 콜라젠(collagen), 염기성 인산분해효소, 오스테오폰틴(osteopontin) 및 오스테오칼신(osteocalcin) RNA 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이고,

COL: 콜라젠, ALP: 염기성 인산분해효소,

OPN: 오스테오폰틴 OC: 오스테오칼신,

K6EB-0.5: 영지버섯 에탄올 추출물의 노말 부탄올 분획 0.5 ㎍/㎖,

K6EB-5 : 영지버섯 에탄올 추출물의 노말 부탄올 분획 5 ㎍/㎖,

K6EEa-0.1: 영지버섯 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획 0.1 ㎍/㎖,

K6EEa-1: 영지버섯 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획 1 ㎍/㎖,

도 3는 영지버섯 추출물이 조골세포의 OPG 발현에 미치는 영향을 나타낸 전 기영동 사진이고(농도 단위는 ㎍/㎖),

K6EB: 영지버섯 에탄올 추출물의 노말 부탄올 분획

K6EEa: 영지버섯 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획

도 4는 영지버섯 추출물이 파골세포의 형성에 미치는 영향을 나타낸 그래프이고(농도 단위는 ㎍/㎖이고, MNCs는 다핵세포(multinucleated cells)를 의미한다),

도 5는 영지버섯 추출물이 파골세포 활성에 미치는 영향을 나타낸 그래프이고(농도 단위는 ㎍/㎖이고, MNCs는 다핵세포를 의미한다),

도 6은 영지버섯 추출물이 6xOSE2-Luc 벡터를 삽입한 C2C12세포에 처리하였을 때 분화를 위한 전사인자 (Runx2)의 발현을 대조군과 비교하여 나타낸 그래프이고(농도 단위는 ㎍/㎖),

본 발명은 골다공증 예방 및 치료에 효과를 갖는 영지버섯(학명 Ganodema lucidum (Fr.) Karst.) 추출물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 영지버섯을 에틸 알코올로 추출하여 얻어지는 지용성 성분이 다량 함유된 골다공증 유발 억제 활성을 갖는 영지버섯 추출물에 관한 것이다.

골다공증(Osteoporosis)과 관련하여 과거에는 주로 골의 무기질, 즉 칼슘과 인의 대사이상만을 중심으로 그 연구가 진행되어 왔으며, 이의 발병기전 규명에는 진전을 보지 못하였다. 그러나, 최근 골형성에 중요한 무기질 뿐만 아니라 골기질 단백질의 대사에 관한 연구의 중요성이 새로이 부각되고 있다. 골다공증의 치료 및 예방을 위하여 의사들은 대개 칼슘이 함유된 식이요법을 권하고 폐경기의 여성들에게는 에스트로젠(estrogen)을 투여하거나 비타민 D를 투여하여 골다공증을 예방하거나 골다공증의 진행을 완화시킨다. 골다공증 치료제로 널리 사용되는 칼슘 보강제재는 부갑상선 호르몬의 분비를 억제하며 골흡수에 의한 골량 감소를 방지하지만, 골량 유지의 개인 차이가 심하다고 알려져 있다(Heaney, R.P., Principles of Bone biology, Academic Press, 1007-1017, 1996). 에스트로젠이나 칼시토닌을 이용한 호르몬 요법의 경우 골밀도를 증가시키고, 직장암의 발생을 감소시킨다는 보고도 있으나, 유방암, 심근경색, 정맥 혈전증 등의 부작용이 보고된 바 있다(Nelson, H.D. et al., JAMA, 288:872-881, 2002; Lemay, A., J. Obstet. Bynaecol. Can., 24:711-715, 2002). 비스포스포네이트는 파골세포를 억제하는 골흡수 억제제로써 새로운 대체 치료제로 주목받고 있으나, 올바르지 않은 경구 투여시 상기도에 병소가 관찰되기도 한다(Fleisch, H., Principles of Bone biology, Academic Press, 1007-1017, 1996; Cryer, R. and Bauer, D.C., Mayo. Clin. Proc., 77:1031-1043, 2002)

따라서, 새로운 작용 및 골격구조를 가지면서 독성 및 부작용이 적어 골다공증의 예방 및 치료에 효과적인 신물질의 개발이 절실히 요구되고 있다. 또한, 이러한 신물질은 민간요법으로 예로부터 적용되어온 천연물에서 발견될 가능성이 매우 높기 때문에 천연물, 특히 생약으로부터 신약을 제조하려는 시도가 활발히 진행되고 있다.

골다공증은 그 증세 자체보다는 골의 약화에 따라 용이하게 초래되는 각종 골절, 특히 대퇴골 골절 또는 척추골절 등이 장기간 활동을 제한하여 건강한 생활을 영위할 수 없고, 결과적으로 노인층 사망의 15%에 대한 원인제공을 하기 때문에 문제가 되고 있다.

한편, 골조직은 조골세포에 의한 형성과 파골세포에 의한 파괴 흡수가 끊임없이 반복되는 동적인 조직이다. 이러한 골흡수와 형성의 기전에는 불명확한 점이 많으나, 골다공증은 골흡수와 골형성의 균형이 무너져 발생하는 것으로 골형성보다 과다하게 골흡수가 진행되는데 기인한 질환이다. 따라서, 현재 골흡수 억제제의 개발이 활발히 진행되고 있다.

영지버섯(학명 Ganodema lucidum (Fr.) Karst.)은 다공균과(Polyporaceae)에 속하는 다년생 버섯으로 2,000 여년 전 중국 최고의 목초서인 이시진의 본초강목과 신농본초경에 상약으로서 이수, 보간, 강장, 정신안정 작용, 관절염, 해소, 기관지염 등의 치료에 유효하다고 기재되어 있다. 한방에서는 자양 강장, 해독 수렴, 소적, 혈중지질 감소 등의 약리 작용을 나타내기 때문에 동맥 경화증, 고혈압증, 뇌 졸중, 협심증, 각종 암, 중증 근무력증, 급만성 기관지염 등에 다른 한방약과 배합하여 사용해 오고 있다. 최근에 알려진 영지버섯의 약효는 항암 작용, 신경계 작용, 순환계 작용, 면역조절 작용 및 항HIV 작용 등과 관련된 우수한 약리 작용이 보고되어 있으며, 영지버섯의 주성분은 β-글루칸(β-glucan)으로 밝혀진 분자량 1,050 kDa의 다당체와 영지버섯 특유의 쓴맛을 나타내는 고미성분인 트리페르노이드(triterpenoid)류에 속하는 라노스탄(lanostane) 형이 주성분으로 루시덴산(lucidenic acid) D > 가노데르산(ganoderic acid) A > 루시돈(lucidone) A > 루시덴산 A > 가노데르산 C > 루시돈 C의 순서로 고미를 나타냄이 밝혀졌다. 이 버섯에는 각종 생리활성을 나타내는 성분이 알려져 있는데 가노데르산 R과 S의 간독성 억제작용, 가노데르산 C 및 D의 히스타민 유리 억제작용, 가노데르산 B와 T-O의 콜레스테롤 저하작용, 가노데르산 B, D, F, H, K, S 및 Y의 항고혈압 작용 등이 알려져 있다.

이에, 본 발명자들은 영지버섯의 다양한 생리활성 연구를 수행하던 중, 열수 또는 에틸 알코올 추출법에 의한 영지버섯 추출물이 골다공증 유발 억제작용이 있음을 발견하고, 활성추적 분획법(bioassay-directed fractionation)으로 영지버섯 추출물의 지용성 성분이 강력한 골다공증 유발억제 작용을 확인하고, 영지버섯 추출물을 골다공증 치료제 또는 예방제 및 건강 식품으로 유용하게 사용할 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 골다공증 유발 억제 활성을 갖는 지용성 성분을 함유하는 영지버섯 추출물 및 상기 영지버섯 추출물을 유효 성분으로 함유하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학적 조성물 또는 건강 식품을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 영지버섯을 에틸 알코올로 추출하고 농축함으로써 지용성 성분이 다량 함유된 골다공증 유발 억제 활성을 갖는 영지버섯 추출물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 영지버섯 추출물을 유효 성분으로 함유하는 골다공증 치료 또는 예방용 약학적 조성물 또는 건강 식품을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 영지버섯을 에틸 알코올로 추출하고 농축함으로써 지용성 성분이 함유된 골다공증 유발 억제 활성을 갖는 영지버섯 추출물을 제공한다.

이때, 상기 에틸 알코올 추출은 70 내지 80℃에서 3 내지 5시간 동안 이루어지는 것이 바람직하고, 상기 농축은 20 내지 40℃에서 진공감압으로 이루어지는 것이 바람직하다.

상기 추출물의 유효성분을 보다 단리하기 위하여 유기용매추출, 크로마토그 래피 등 사용할 수 있는 분리 방법에 특별히 제한되는 것은 아니나, 본 발명의 실시예에서와 같이 에틸아세테이트(ethylacetate)로 추출하는 것이 바람직하고, 추가적으로 노말 부탄올(n-butanol)로 추출하는 것이 더욱 바람직하다. 또한, 상기 에틸 알코올로 추출하는 단계는 3회 이상을 반복되는 것이 바람직하다.

상기 영지버섯 추출물은 지용성 성분을 다량 함유하고 있는 것이 특징이다. 본 발명의 골다공증 유발 억제 활성을 갖는 영지버섯 추출물은 영지버섯을 에틸 알코올로 추출한 후, 유기용매에 의해서 상기 추출액을 추가적으로 추출함으로써 지용성 성분이 다량 함유되어 있는 분획을 얻고, 이것을 감압농축하여 최종적인 영지버섯 추출물을 제조한다.

본 발명의 일실시예에서는 영지버섯 추출물 또는 이를 포함하는 화합물 등의 골다공증 치료 효과를 조사하기 위하여, 사람 골육종 세포 및 랫트(rat) 조골세포군(RCC)의 일차배양 세포 등에 대하여 테스트하였다. 그 결과 조골세포의 증식, 조골세포의 특징적 유전자들에 대한 mRNA 발현 정도, 조골세포에 의한 파골세포의 생성을 억제하는 OPG(osteoprotegerin)의 발현 정도 및 조골세포 분화를 나타내는 전사 인자의 발현 등에 있어서, 영지버섯 추출물은 조골세포의 기능을 향상시키는 것으로 보인다(도 1, 도 2, 도 3 및 도 6 참조). 아울러, 상기 영지버섯 추출물은 파골세포로 여겨지는 TRAP(+) 다핵세포의 형성 및 파골세포의 활성을 크게 감소시킴으로써 파골세포 기능을 억제하여 골조직 파괴의 감소에 보다 크게 기여한다(도 4 및 도 5 참조). 따라서, 본 발명의 영지버섯 추출물은 조골세포의 증식 및 분화 를 촉진하고, 파골세포의 형성 및 활성을 감소시켜 골다공증의 치료 및 예방에 효과적이다. 특히, 본 발명의 실시예에 기재된 바와 같이, 상기 영지 버섯 추출물은 파골세포의 형성 및 활성을 억제함으로써 골다공증의 발생 및 진행을 차단하는데 더 큰 기여를 하는 것이라 판단된다.

또한, 본 발명은 상기 영지버섯 추출물을 유효성분으로 함유하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 영지버섯 추출물을 포함하는 약학적 조성물은 임상 투여시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품제제의 형태로 사용될 수 있다.

즉, 본 발명의 조성물은 실제 임상 투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 영지버섯 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose) 또는 락토오스(Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용 제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 또한 골다공증 예방 또는 치료제로서의 효능 증진을 위해 칼슘이나 비타민 D₃를 첨가할 수 있다.

투약 단위는, 예를 들면 개별 투약량의 1, 2, 3 또는 4배로, 또는 1/2, 1/3 또는 1/4배를 함유할 수 있다. 개별 투약량은 바람직하기로는 유효 약물이 1회에 투여되는 양을 함유하며, 이는 통상 1일 투여량의 전부, 1/2, 1/3 또는 1/4배에 해당한다.

상기 조성물의 유효용량은 33.3-83.3 mg/kg 이고, 바람직하게는 33.3-50 mg/kg 이며, 하루 2-3 회 투여될 수 있다. 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태 및 신경 질환의 발병 정도에 따라 변할 수 있다.

본 발명의 영지버섯 추출물을 포함하는 약학적 조성물을 마우스에 경구 투여시 및 복강내 투여시의 독성 실험을 수행한 결과, 경구 독성 시험에 의한 50% 치사량(LD₅₀)은 적어도 5,000 mg/kg 이상인 것으로 나타나 안전한 물질로 판명되었다.

또한, 본 발명은 상기 영지버섯 추출물을 함유하는 건강 식품을 제공한다.

본 발명의 영지버섯 추출물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 영지버섯 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에는 본 발명의 영지버섯 추출물이 원료에 대하여 0.1 내지 15 중량%, 바람직하게는 0.2 내지 10 중량%의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 영지버섯 추출물의 제조

영지버섯은 국내에서 재배한 것으로 시중의 건재상에서 구입하여 사용하였다. 절편시킨 영지버섯을 분말로 분쇄하여 분말 200 g을 3 L 플라스크에 넣고 에탄올 2,000 ㎖을 이용하여 78.5℃에서 환류 교반시키면서 4시간 동안 가열 추출을 3회 반복 실시하였다. 상기 가열 추출액을 여과한 후, 40℃ 이하에서 회전식 진공농축증발기(vacuum rotary evaporator)를 사용하여 진공 감압농축시킴으로써 영지버섯 분말 11.4 g이 포함된 최초 조추출물을 수득하였다(영지버섯 분말에 대한 수율: 5.7%). 상기의 추출방법으로 지용성 성분이 함유된 영지버섯 추출물이 분리되었다. 상기 추출물을 20 ㎖의 에탄올에 녹여 증류수 500 ㎖에 현탁시킨 후, 상온에서 에틸아세테이트(ethylacetate) 500 ㎖로 분획용 깔대기(separatory funnel)를 사용하여 3회 반복 용매 분획한 것을 'K6EEa'로 명명하였다. 상기 K6EEa를 추가적으로 상온에서 노말 부탄올(n-butanol) 500 ㎖로 분획용 깔대기를 사용하여 3회 반복 용매 분획한 것을 'K6EB'로 명명하였다. 이하의 실시예에서는 상기의 K6EEa 및 K6EB로 분획된 추출물을 농축하여 동결건조한 후, 에탄올에 5 g/L로 희석시켜 시험관 조건(in vitro)에서 하기의 조골세포 및 파골세포에 대한 실험을 수행하였다.

<실시예 2> 영지버섯 추출물 분획에 의한 조골세포 증식 실험

상기 실시예 1에서 분리한 영지버섯 추출물 분획이 조골세포의 증식과 세포 활성도 증가에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 하기와 같은 실험들을 실시하였다.

<2-1> 조골세포의 선별 및 세포 배양

하기의 3가지의 세포를 사용하여 영지버섯 추출물이 조골세포의 증식에 미치는 영향을 평가하였다. 사람 세포로는 사람 골육종에서 유래된 세포주인 MG-63 세포(ATCC No. CRL-1427)를, 마우스의 세포로는 마우스 근육 세포인 C2C12 세포(ATCC No. CRL-1772)를 ATCC(Rockville, USA)에서 구입하여 DMEM(Gibco, BRL, USA)에 10% FBS(fetal bovine serum)를 첨가한 배지에서 배양한 후에 실험에 사용하였다.

또한, 일차배양 세포로는 스프래그-다우리(Sprague-Dawley) 랫트(rat)의 두개관에서 얻어진 조골세포군(RCC)을 사용하였다. 즉, 태생 19일째 스프래그-다우리 랫트의 두개관에서 전두골과 두정골을 적출한 다음, 0.1% 콜라제나제(collagenase), 0.05% 트립신 및 0.5 mM EDTA를 포함하는 효소용액으로 37℃에서 각각 10분, 10분, 10분, 20분, 20분간씩 연속적으로 처리하여 Ⅰ 내지 Ⅴ 군의 세포를 분리하고, 이중 조골세포의 특성을 가진 세포가 주로 존재하는 Ⅳ 및 Ⅴ 군의 세포를 혼합하여 10% FBS가 함유된 DMEM에서 일차 배양한 후 트립신-EDTA 용액으로 세포를 수집하고 세포수를 측정하여 각 실험에 이용하였다.

<2-2> 조골세포 증식의 측정

영지버섯 추출물이 조골세포의 증식에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 상기의 실시예 <2-1>에서 기술한 방법으로 준비된 3가지 조골세포를 이용하여 세포 증식시 세포의 DNA 안으로 유입된 ³H-티미딘(thymidine)의 양을 측정하였다. 구체적으로, 24-웰 플레이트(well plate)의 웰당 2 x 10⁴개가 되도록 조골세포를 분주하 고, 다음날 1% FBS가 함유된 DMEM으로 교체하였다. 교체된 배양액 내에 10^-4, 10^-3, 10^-2, 10^-1, 1 또는 10 ㎕/㎖ 농도로 연속적으로 희석하여 준비한 영지버섯 추출물을 농도별로 첨가하고 48시간 동안 배양하였다. 마지막 4시간 동안 3 μCi/웰의 ³H-티미딘을 첨가하여 배양한 후, 세포를 PBS(phosphate buffered saline)로 세척하고 얼음 냉각된 5% TCA(trichloroacetic acid)로 처리하여 TCA-불용성인 분획을 분리한 후 0.1 M NaOH로 용해하였다. 이중 일정 분획을 취하여 액체 신틸레이션 계측기(liquid scintillation counter)에서 방사능(radioactivity)을 측정함으로써 ³H-티미딘 유입도를 측정하였다.

상기 과정에 의한 다양한 영지버섯 추출물 농도에 따른 조골세포 증식의 정도를 도 1에 나타내었다. 이로부터 낮은 농도의 영지버섯 추출물 처리한 경우에는 영지버섯 추출물을 처리하지 않은 대조군과 커다란 차이가 없었으나, K6EB에서 10 ㎍/㎖부터 50 ㎍/㎖까지는 처리 농도에 비례하여 K6EEa나 대조군에 조골세포 증식이 비하여 뚜렷이 높아지는 것을 확인하였다(도 1).

<2-3> 조골세포의 특징적 유전자(제 1형 콜라젠, 염기성 인산분해효소, 오스테오폰틴 및 오스테오칼신)에 대한 mRNA 발현

영지버섯 추출물이 조골세포의 분화에 미치는 영향을 평가하기 위하여, 상기의 실시예<2-1>에서 기술한 방법으로 스프래그-다우리 랫트의 두개관 조골세포를 준비하여 배양한 후, 1차 계대배양한 세포를 수집하고 63 x 10⁴/dish의 밀도로 60 mm 조직배양 접시에 분주하였다. 조골세포를 10% FBS가 함유된 α-최소필수배지(α-minimum essential medium)에서 배양하며, 배양 3일째부터 아스코르브산(ascorbic acid) 50 ㎍/㎖과 β-글리세로포스페이트(β-glycerophosphate) 10 mM를 첨가하여 조골세포의 분화를 유도하였다. 배양 시작 다음날부터 K6EB는 0.5 및 5 ㎍/㎖의 농도로, K6EEa는 0.1 및 1 ㎍/㎖의 농도로 상기 조골세포의 배양 접시에 첨가하였으며, 2일에 한번씩 배양액을 교체할 때마다 동일 농도의 영지버섯 추출물 분획을 첨가하여 조골세포에서 석회화 결절이 생성되는 12-15일까지 배양하였다. 영지버섯 추출물의 효과를 알아보기 위하여, 배양 3일, 7일 및 배양이 완료(14일)된 후, 이지블루 토탈 RNA 분리키트(Easy Blue^TM total RNA isolation kit)를 이용하여 토탈 RNA를 분리하였다. 이중 25 ??g의 토탈 RNA를 1.2% 아가로스/포름알데히드(agarose/formaldehyde) 디네튜어링 겔(denaturing gel)에서 전기영동을 수행하고, 나일론 필터(nylon filter)(Hybond-N)로 이전한 후, 익스프레스하이브(ExpressHyb^TM) 혼성화 용액(hybridization solution)에서 선결 혼성화(prehybridization) 반응을 수행하였다. 그 후 메가프라임 DNA 라벨링 키트(megaprime DNA labelling kit)를 이용하여 ³²P-dCTP 로 표지된 pro-α1(I)-콜라젠, 염기성 인산분해효소, 오스테오폰틴(osteopontin) 또는 오스테오칼신(osteocalcin) 프로브가 함유된 혼성화 용액에서 1시간 동안 혼성화시키 고, 세척용액(wash solution) 1(2 X SSC, 0.05% SDS)로 2회, 세척용액 2(0.1 X SSC, 0.1% SDS)에서 1회 세척한 후 자기방사성(autoradiography)을 수행하였으며 상기 단백질의 발현정도의 비교는 후지 바스 1500 상분석기(Fuji Bas 1500 image analyzer)를 이용하여 분석하였다.

상기 과정으로 조사한 조골세포의 제1형 콜라젠, 염기성 인산분해효소, 오스테오폰틴, 오스테오칼신 mRNA 발현을 측정한 결과, 영지버섯 추출물은 제1형 콜라젠, 염기성 인산분해효소, 오스테오폰틴의 발현을 촉진함을 확인하였다(도 2). 이때, 염기성 인산분해효소는 조골세포의 세포막에 결합되어 있는 효소로써 조골세포의 표지효소로 이용되고 골조직 형성의 여러 단계에 관여할 것으로 추측되며(Farley, J.R. and Baylink, D., Metabolism, 35:563-571, 1986). 제1형 콜라젠, 염기성 인산분해효소, 오스테오폰틴 및 오스테오칼신 등은 조골세포의 특징적 유전자로 알려져 있다(Gerstenfeld, L.C. et al., Develop. Biol., 122:49-60, 1987; Yoon, K. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 148:1129-1136, 1987).

<2-4> 조골세포에 의한 파골세포 생성을 억제하는 OPG(osteoprotegerin)의 발현

상기 MG63 세포주를 60 ㎜ 조직배양 접시에 포화되게(confluent) 배양한 다음, 1, 4, 20 및 100 ㎍/㎖의 농도의 영지버섯 추출물을 포함한 혈청이 첨가되지 않은 DMEM 2 ㎖을 첨가하여 16시간 배양한 후 상청액을 수확하였다. 20-25% TCA(trichloroacetic acid)로 배양 상청액을 농축시킨 후, SDS-PAGE 시료 버퍼로 용해하여 10% 아크릴아미드 SDS-PAGE 젤에서 전기영동하였다. 전기영동 후 250 ㎃로 1시간 동안 방치하여 시료들을 젤에서 PVDF 멤브레인(milipore)으로 옮겼다. 시료가 옮겨진 멤브레인을 블럭킹 버퍼(5% skim milk)에 1시간 동안 방치 한 후, 1차 항체인 항-OPG 항체(R&D system 사)를 블럭킹 버퍼에 1:25로 희석하여 만든 용액에 넣어 상온에서 2시간 정도 방치하였다. TBST 용액(100 mM Tris-Cl, 0.9% NaCl, 0.1% tween 20, pH 7.5)으로 15분씩 2번 멤브레인을 씻어준 후 알카린 포스페이트(alkaline phosphate)가 붙어있는 2차 항체(Promega 사)를 1:7000으로 블럭킹 버퍼에 희석한 용액에서 멤브레인을 1시간 동안 방치하였다. 상기 TBST 용액으로 20분씩 3회 멤브레인을 씻은 후 기질을 넣어 15분간 반응시킨 후 RAS(Fujifilm 사)를 이용하여 분석하였다.

상기 과정으로 조골세포에서 파골세포의 생성을 억제하는 물질인 OPG의 발현을 측정한 결과, 영지버섯의 추출물인 K6EB 및 K6EEa에서 모두 농도가 증가함에 따라 20 ㎍/㎖까지는 농도에 비례하여 조골세포의 OPG의 발현을 촉진하는 경향을 나타냈고, 그 이상의 농도에서는 OPG의 발현 효율은 상대적으로 감소하는 것으로 나타났다(도 3).

<2-5> 조골세포 분화의 주요 전사인자(Runx2)의 발현

골형성에 필수적인 전사인자인 Runx2가 결합하는 DNA 서열인 OSE2를 6개 직렬 연결한 것을 pGL3 프로모터 벡터에 삽입한 6xOSE2-Luc 벡터로 C2C12 세포(ATCC No. CRL-1772)를 임시 형질전환(transient transfection)하여 검사대상 분획을 투여함으로써 Runx2의 발현 정도를 루시페라제(luciferase) 활성으로 판정하는 방법을 선택하였다.

골형성의 촉진을 위해서는 조골세포의 분화가 선행되어야 하며, 특히 조골세포의 분화를 촉진하기 위해서는 분화를 위한 전사인자인 Runx2의 발현이 필수적이다. 이것은 조골세포가 필요로 하는 여러 유전자(오스테오칼신, 오스테오폰틴, 제 1형 콜라젠, 뼈 시알로단백질)의 발현을 증가시킨다. 이들 유전자의 프로모터에는 Runx2의 결합 부위(response element)('OSE'라고도 명칭: osteoblast specific factor binding element)가 존재하며, 그 중심의 콘센서스 서열(consensus sequence)은 PuACCPuCA(이때, P는 퓨린 염기를 나타내고, u는 피리미딘 염기를 나타낸다)로 기재된다. 이는 조골세포의 골형성유전자의 발현을 증가시킨 것으로 골형성의 촉진에 관여함을 보여준다(Lee, K-S., et al., Mol. Cell. Biol., 2000 Dec;20(23):8783-92; Park, M-H, et al., J. Bone Miner Res., 2001 May;16(5):885-92).

그 자세한 실험 방법은 하기와 같다.

Day 0

각각의 C2C12 세포를 6 웰 플레이트의 웰 당 1x10⁵ 밀도로 접종한 후 24시간 동안 5% CO₂ 배양기에서 배양한다.

Day 1

(1) 리포펙타민(LipofectAmine)를 이용하여 p6xOSE2-Luc:리포펙타민 복합체를 제조하였다. 구체적으로 6 웰 플레이트의 웰 당 0.5 ㎍의 p6xOSE2-Luc, 3 ㎕의 PLUS 시약 및 100 ㎕의 혈청이 첨가되지 않은 DMEM 배지를 혼합한 후 15분간 실온에서 반응시켜 용액 Ⅰ을 제조하였다.

다음으로, 3 ㎕의 리포펙타민과 100 ㎕의 혈청이 첨가되지 않은 DMEM을 포함하여 용액 Ⅱ를 제조한 후, 상기 용액 Ⅰ과 용액 Ⅱ를 혼합한 후 15분간 실온에서 반응시켜 p6xOSE2-Luc:리포펙타민 복합체를 제조하였다.

(2) 형질전환

1) 15분간 반응시키는 동안 세포의 배양배지를 제거한 후 혈청이 첨가되지 않은 DMEM으로 세포를 세척하였다. 6 웰 플레이트의 웰 당 800 ㎕의 혈청이 첨가되지 않은 DMEM을 넣어주었다.

2) 상기 웰에 반응이 끝난 207 ㎕의 p6xOSE2-Luc:리포펙타민 복합체를 넣어준 후 3시간 동안 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다.

3) 3시간 배양 후 웰 당 1 ㎖ 의 30% FBS가 들어있는 DMEM를 넣어준 후 24시간 동안 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다.

Day 2

세포의 배양배지를 제거한 후 혈청이 첨가되지 않은 DMEM으로 세포를 세척하였다. 6 웰 플레이트의 웰 당 2 ㎖의 bFGF가 10.0 ng/㎖로 첨가되어 있는 혈청이 첨가되지 않은 DMEM을 처리하고 대조군은 bFGF가 첨가되어 있지 않는 혈청이 첨가되지 않은 DMEM을 처리한 후 24시간 동안 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다.

Day 3

24시간 배양 후에 PBS 용액으로 세척한 후 브라이트 글로리시스 버퍼(bright glo lysis buffer)(Promega, WI, USA) 500 ㎕로 세포를 처리한 후 브라이트 글로 기질(bright glo substrate)(Promega, WI, USA)을 동량 첨가하여 5분간 반응시킨 후 Runx2의 활성도를 발광측정기(luminometer)(Junior, EG&G BERTHOLD, Australia)를 사용하여 루시페라제 활성을 측정하였다.

상기와 같은 방법으로 p6xOSE2-Luc-임시 형질전화된 C2C12 세포에 대한 영지버섯 추출물의 영향을 측정한 결과, 대조군에 비해 Runx2 유전자의 발현이 크게 증가함을 확인하였다(도 6).

<실시예 3> 영지버섯 추출물에 의한 파골세포 증식 억제 실험

영지버섯 추출물에 의한 파골세포의 생성 억제와 세포 활성도 감소 확인을 위하여, 본 발명자들은 다음과 같은 실험들을 수행하였다.

<3-1> 파골세포 전구세포의 순수 분리 및 성숙한 파골세포로의 분화 유도 및 영지버섯 추출물의 처리

마우스 골수세포를 분리하기 위해 7-9주 된 웅성 마우스를 경부염전으로 희생시킨 후 대퇴골과 경골을 무균적으로 적출하고 연조직을 제거하며 장골의 양끝을 절단한 후, 26G 주사침을 이용하여 한쪽 끝의 골수강에 0.1% 콜라젠 분해효소(collagenase)(Gibco), 0.05% 트립신 및 0.5 mM EDTA(Gibco)가 포함된 효소용액 1 ㎖를 주사하여 골수를 꺼낸 후 30분간 교반하여 골수세포를 모아 10% FBS가 포함된 α-최소필수배지(α-MEM)에 24시간 전 배양한 후 미부착 세포들을 얻었다. 파골세포의 전구세포가 되는 미부착세포를 웰 당 2×10⁵개의 세포가 되도록 분주하여 배양하였다. 8일간 배양하는 동안 20 ng/㎖ M-CSF(macrophage-colony stimulating factor; Peprotech, USA)와 30 ng/㎖ RANKL(Peprotech, USA)이 포함된 α-MEM에 실시예 1에서 제조된 영지버섯 추출물을 처리하여 배양하였다. 배양을 완료한 후 파골세포의 생성을 검사하기 위하여, 세포를 고정하여 TRAP 염색을 시행하였다. 또한, 파골세포의 활성을 검사하기 위하여 세포를 떼어낸 후 흡수된 부위를 관찰하였다.

<3-2> TRAP(+)인 다핵세포 생성 억제

세포배양 후, 부착세포를 PBS로 세척한 다음 시트레이트-아세테이트-포름알데히드(citrate-acetate-formaldehyde)로 5분간 고정시키고 나프톨(naphthol) AS-BI 포스페이트(phosphate), 패스트가넷(fast Garnet) GBC 용액과 7 mM 타르트레이트(tartrate) 버퍼(pH 5)를 함유하는 37℃ 아세테이트(acetate) 버퍼(pH 5.0)에 1시간 동안 배양하여 TRAP 염색을 하였다. 이때, 3 이상의 핵을 가지는 TRAP(+) 다핵세포들을 파골세포로 간주하였다.

파골세포는 골수내의 단핵구/대식세포 계통의 세포로부터 유래하고, 이 단핵전구세포는 혈액내로 순환되며 골내막층에서 전구세포들이 증식되어 다핵세포를 형성하기 위해 융합된다고 알려져 있으며(Scheven, B.A.A. et al., Nature, 321: 79-81, 1986), 파골세포에는 특징적으로 타르트레이트(tartrate)에 대해 저항성을 나타내는 산성 포스파타제(acid phosphatase)인 TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase)을 가지며 이는 다른 골조직 세포와 구별할 수 있는 파골세포의 세포화학적 표지효소로 이용된다고 알려져 있다(Minkin, C., Calcif. Tissue Int., 34: 285-290, 1982).

본 발명에서는 파골세포의 분화를 유도하기 위하여 파골세포의 전구세포가 있다고 알려진 골수를 이용하였으며, TRAP에 양성(+)이며 다핵인 세포를 파골세포로 간주하고, 파골세포 전구세포를 배양하면서 실시예 1에서 제조된 영지버섯 추출물을 처리하여 8일 동안 배양한 후 TRAP 양성 다핵세포의 수의 변화를 측정하였다. 상기 과정으로 파골세포의 표지효소인 TRAP 활성을 측정한 결과, 영지버섯 추출물을 첨가하였을 때 대조군에 비해 TRAP(+) 다핵 세포의 수가 100%에서 10% 이하로 현저히 감소하는 것을 확인하였다. 상기 결과로부터, 본 발명의 영지버섯 추출물이 파골세포의 생성 억제 작용을 한다는 것을 확인하였다(도 4).

<3-3> 파골세포의 활성 억제

파골세포의 성장 및 활성을 확인하기 위하여, 수산화 인회석으로 피막된 플레이트(OAAS, OCT Inc.)에 파골세포 전구세포를 배양하여 파골세포의 표지효소인 TRAP 활성 및 흡수와(resorption pit)를 관찰하였다. 구체적으로, 세포배양 후 배양액을 제거하였다. 세포배양 후 붙어있는 세포를 제거하기 위하여 OAAS 플레이트를 증류수로 세척한 후 5% 소듐 하이포클로라이트(sodium hypochlorite) 용액을 넣어 5분간 방치한 후 다시 증류수로 깨끗이 세척한 후 말린 다음 흡수된 부위를 이미지 프로플러스(Image pro plus)를 이용하여 관찰하였다. 즉, 골조직 내에서 골흡수를 주로 담당하는 파골세포의 활성을 검사하기 위하여 골조직의 무기질 부분과 유사하게 제작한 칼슘과 포스페이트가 피막된 플레이트를 사용하여 파골세포의 전구세포를 배양하면서 영지버섯 추출물을 처리하였을 때, 흡수 면적에 변화가 있는지를 관찰하였다.

그 결과, 영지버섯 추출물을 첨가한 경우에 파골세포 전구세포를 칼슘-포스페이트가 코팅된 플레이트 상에서 배양하여 TRAP(+)를 보이는 다핵세포의 활성 및 흡수와가 현저히 감소됨을 확인하였다(도 5).

<실시예 4> 영지버섯 추출물에 의한 급성독성 시험

본 발명에 이용된 영지버섯은 널리 식용으로 이용되고 있어서 안정성에 문제가 없을 것으로 판단하였으나, 경구 투여시 및 복강내 투여시의 독성 실험을 수행하여 이를 확인하고자 하였다.

6주령의 특정병원부재(SPF) SD계 랫트를 사용하여 급성독성실험을 실시하였다. 군당 2 마리씩의 동물에 본 발명의 K6EFa 및 K6EB를 각각 0.5% 메틸셀룰로즈 용액에 현탁하여 5 g/㎏의 용량으로 단회 경구투여하였다. 시험물질 투여후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하였다.

시험결과, 시험물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다. 이상의 결과 영지버섯 추출물은 모두 랫트에서 5 g/㎏까지 독성변화를 나타내지 않으며 경구 투여 최소치사량 (LD₅₀)은 5 g/㎏이상인 안전한 물질로 판단되었다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 의한 영지버섯 추출물은 조골세포 생성 및 파골세포 억제능이 우수하므로, 영지버섯 추출물은 골다공증 치료제 또는 예방제로 사용될 수 있을 뿐만 아니라 건강 식품으로도 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (8)

1. 영지버섯을 알코올로 추출하고 이어서 이를 에틸아세테이트 및 노말 부탄올로 추출하여 제조되는 골다공증 유발 억제 활성을 갖는 영지버섯 추출물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 알코올 추출은 70 내지 80℃에서 3 내지 5시간 동안 이루어지는 것을 특징으로 하는 추출물.
3. 제 1항에 있어서, 상기 농축은 20 내지 40℃에서 진공감압으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 추출물.
4. 삭제
5. 삭제
6. 제 1항에 있어서, 상기 알코올로 추출하는 단계를 3회 이상을 반복하는 것을 특징으로 하는 추출물.
7. 제 1항 내지 제 3항 또는 제 6항 중 어느 한 항의 추출물을 유효성분으로 함유하는 골다공증 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
8. 삭제

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