KR20090022706A

KR20090022706A - 우르솔릭산 또는 2-α-하이드록시-우르솔릭산을 포함하는,조골세포 분화 및 활성 촉진용 약학 조성물

Info

Publication number: KR20090022706A
Application number: KR1020070088294A
Authority: KR
Inventors: 민용기; 유시용; 김성환; 이수의
Original assignee: 한국화학연구원
Priority date: 2007-08-31
Filing date: 2007-08-31
Publication date: 2009-03-04

Abstract

본 발명은 하기 화학식 1의 우르솔릭산(ursolic acid) 또는 하기 화학식 2의 2-α-하이드록시-우르솔릭산(2-α-hydroxy-ursolic acid)을 유효 성분으로 함유하는 약학 조성물에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 약학 조성물은 조골세포의 분화 및 활성화를 촉진시켜 골다공증 및 골절 등과 같은 질환 및 증상의 치료 및 예방 뿐만 아니라, 골 강화를 목적으로 하는 치주 질환 및 화상으로 비롯되는 골성장 장애의 치료에도 유용하게 사용될 수 있다.

<화학식 1>

<화학식 2>

Description

우르솔릭산 또는 2-α-하이드록시-우르솔릭산을 포함하는, 조골세포 분화 및 활성 촉진용 약학 조성물 {PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PROMOTING OSTEOBLAST DIFFERENTIATION AND ACTIVITY COMPRISING URSOLIC ACID AND 2-α-HYDROXY-URSOLIC ACID}

본 발명은 우르솔릭산 또는 2-α-하이드록시-우르솔릭산을 유효 성분으로 함유하는 약학 조성물에 관한 것으로서, 본 발명의 약학 조성물은 조골세포 분화 및 활성을 촉진시킴으로써 골다공증, 골절, 치주 질환 및 골성장 장애 등과 같은 골 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다. .

뼈의 항상성은 파골세포(osteoclast)에 의한 골 흡수(bone resoprtion)와 조골세포(osteoblast)에 의한 골 형성(bone formation)의 대등한 작용에 의한 리모델링 과정(bone remodeling)이 지속적으로 조절됨으로써 유지된다. 하지만, 파골세포의 지나친 활성이나 조골세포의 활성 저하는 리모델링 과정의 불균형을 초래하여, 골다공증과 같은 성인 골격계 질환을 초래하는데, 이러한 불균형을 해소하기 위한 방법으로는 기본적으로 다음과 같은 세 가지 방법, 1) 파골세포의 지나친 활성 억제, 2) 조골세포의 활성 촉진, 및 3) 파골세포의 활성 억제 및 조골세포의 활성 촉진이 알려져 있다.

지금까지, 골다공증 치료 및 예방을 위한 많은 제약들이 파골세포 억제의 측면으로 개발되었지만, 최근에는 골 형성을 촉진시키는 방법으로도 많은 연구가 진행되고 있다(참조: Rosen et al., Clinical review 123: Anabolic therapy for osteoporosis; J Clin Endocrinol Metab. 2001 Mar;86(3):957-64; Garces C et al, Maturitas: Combination of anabolic and antiresorptive agents for the treatment of osteoporosis, Apr. 20, 2006, 54(1):47-54). 특히, 부작용을 줄이기 위해 천연물에서 골다공증 유효 물질 발굴을 위한 연구가 계속되고 있다(참조: Whelan et al., Ann Pharmacother: Natural health products in the prevention and treatment of osteoporosis: systematic review of randomized controlled trials, May 2006, 40(5):836-49; Putnam et al, Phytother Res.: Natural products as alternative treatments for metabolic bone disorders and for maintenance of bone health, Feb. 2007, 21(2):99-112).

조골세포는 간엽줄기세포에서 기원하여 형성되는데 조골세포의 분화에 의한 칼슘 형성과 같은 무기질화는 뼈의 세기를 유지시켜 줄 뿐만 아니라, 신체 전체의 칼슘 및 호르몬 대사의 항상성에도 매우 중요한 기능을 하고 있다. 조골세포의 분화에 의한 칼슘 형성은 비타민 D 및 부갑상선 호르몬(parathyroid hormone) 등에 의해 조절되며, 조골세포의 분화에 의한 골 형성은 세포내에서 뼈 형태형성 단백 질(bone morphogenetic protein; BMP), Wnt, MAP 키나아제, 칼시뉴린-칼모듈린 키나아제(calcineurin-calmodulin kinase), NF-κB, AP-1 등의 다양한 신호전달 체계의 상호작용(cross-talk)에 의해 조골세포의 분화와 관련된 알칼리성 포스파타제(alkaline phosphatase; ALP)가 초기 분화단계에서 합성된 후, 무기질화와 관련된 오스테오폰틴(osteopontin), 오스테오칼신(osteocalcin), 타입 I 콜라겐 등이 합성됨으로써 이루어진다고 알려져 있다.

조골세포의 활성화를 촉진시키는 화합물은 골다공증 및 골절 등과 같은 질환 및 증상의 예방 또는 치료에 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 골 강화를 목적으로 하는 치주 질환 치료에도 사용될 수 있으며(참조: Zhang et al., Shanghai Kou Qiang Yi Xue: The effects of fluoride and dexamethasone on the phenotypic development of osteoblast grown on the demineralized dental root surface, June 1998, 7(2):99-103; Cahill et al, Biol Blood Marrow Transplant: Replacement of recipient stromal/mesenchymal cells after bone marrow transplantation using bone fragments and cultured osteoblast-like cells, Oct. 2004, 10(10):709-717), 또한 화상으로 비롯되는 골성장 장애 치료에 유용하게 사용될 수 있다는 연구도 있다 (참조: Klein et al., Osteoporos Int.: The efficacy of acute administration of pamidronate on the conservation of bone mass following severe burn injury in children: a double-blind, randomized, controlled study, June 2005, 16(6):631-635).

이와같은 조골세포를 활성시키기 위한 촉진제는 일반적으로 환자에게 장기 투여하여야 하기 때문에 독성이 적고 경구투여가 가능한 것이 바람직하며, 독성이 없는 조골세포 활성 약제 및 기능성 식품의 개발이 요구되고 있다.

한편, 우르솔릭산은 다양한 형태로 식물계에 존재하는데, 특히, 사과, 배, 자두와 같은 과일이나 바실, 로즈마리 등과 같은 약용 허브에서 많이 발견되는 천연물 중 하나이다(참조: Aggarwal et al., Biochem Pharmacol: Molecular targets of dietary agents for prevention and therapy of cancer, May 14, 2006, 71(10):1397-1421). 우르솔릭산이 포함된 추출물은 해독작용에 효과적이며, 항암, 항알레르기 및 항염 작용이 있다고 보고된 바 있다(참조: Liu et al., J Ethnopharmacol: Pharmacology of oleanolic acid and ursolic acid. Dec. 1, 1995, 49(2):57-68). 또한, 우르솔릭산은 세포 독성이 있어 잠재적인 항암치료제로 보고된 바도 있다(참조: Hsu et al., Cancer Lett.: Effects of oleanolic acid and ursolic acid on inhibiting tumor growth and enhancing the recovery of hematopoietic system postirradiation in mice, Jan. 1, 1997, 111(1-2):7-13). 우르솔릭산은 글르코코티코이드 수용체 (glucocorticoid receptor)의 전위(translocation)에 관여하여, 세포외 기질(extracellular matrix)을 녹일 수 있는 매트릭스 메탈로프로테나제(matrix metalloproteinase)-9를 억제함으로써 암세포의 침윤을 억제할 수도 있다(참조: Cha et al., Oncogene: Ursolic acid-induced down-regulation of MMP-9 gene is mediated through the nuclear translocation of glucocorticoid receptor in HT1080 human fibrosarcoma cells, Feb. 12, 1998, 16(6):771-778; Cha et al., Cancer Res.: Anti-invasive activity of ursolic acid correlates with the reduced expression of matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) in HT1080 human fibrosarcoma cells, May 15, 1996, 56(10):2281-2284). 아울러, 우르솔릭산은 분화와 관련된 유전자들의 발현을 조절함으로써 세포분화를 유도할 수 있음이 보고되었다(참조: Lee et al., J Cancer Res Clin Oncol.: Induction of differentiation in te cultured F9 teratocarcinoma stem cells by triterpene acids, 1994, 120(9):513-518).

그러나, 아직까지 우르솔릭산이 조골세포의 분화 및 활성을 촉진시킨다는 생물학적 유용성에 대해서는 보고된 바가 없다.

이에, 본 발명자들은 조골세포의 분화 및 활성 촉진 효과를 갖는 천연물의 스크리닝 연구과정에서 우르솔릭산과 2-α-하이드록시-우르솔릭산이 조골세포의 분화 및 활성을 촉진시킬 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 골다공증 및 골절 등과 같은 질환 및 증상의 치료 및 예방 뿐만 아니라, 골 강화를 목적으로 하는 치주 질환 및 화상으로 비롯되는 골성장 장애의 치료에도 효과적인, 우르솔릭산 또는 2-α-하이드록시-우르솔릭산을 포함하는 조골세포의 분화 및 활성 촉진용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 하기 화학식 1의 우르솔릭산 또는 하기 화학식 2의 2-α-하이드록시-우르솔릭산을 활성성분으로 포함하는, 조골세포 분화 및 활성 촉진용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 조골세포 분화 및 활성 촉진용 약학 조성물은 골다공증, 골절, 치주 질환 및 골성장 장애 등과 같은 골 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 조골세포 분화 및 활성 촉진용 약학 조성물은 화학식 1의 우르솔릭산 또는 화학식 2의 2-α-하이드록시-우르솔릭산을 유효성분으로 하며, 우르솔릭산 및 2-α-하이드록시-우르솔릭산은 Ryu 등의 하기문헌에 기재된 방법에 따라 한약재 하고초(Prunella vulgaris)의 추출물로부터 컬럼 크로마토그래피 공정을 통하 여 분리 정제될 수 있다 (참조: Ryu et alk., Arch . Pharm . Res.: Antiviral Triterpenes from Prunella vulgaris., 1992, 15:242-245; Ryu et al., Plant. Med.: Anti-allergic and anti-imflammatory triterpenes from the herb of Prunella vulgaris., 2000, 66:358-360)

이와 같이 얻어진 우르솔릭산 및 2-α-하이드록시-우르솔릭산은 유효 농도로 포유류에 투여시 조골세포의 분화 및 활성을 촉진시킨다. 예컨대, 우르솔릭산 및 2-α-하이드록시-우르솔릭산은 5μM 이하의 농도에서는 마우스 조골세포인 MC3T3-E1 서브클론 4의 증식에 아무런 영향을 미치지 않으면서, 조골세포의 분화와 관련된 ALP 활성 및 발현, 칼슘 형성을 포함한 무기질화 및 이와 관련된 유전자의 발현, 미토겐 활성 단백질 키나아제 및 전사인자의 활성을 증가시키며, 이에 따라 골 형성이 이루어지게 된다.

따라서, 상기 우르솔릭산 및 2-α-하이드록시-우르솔릭산을 함유하는 본 발명의 조골세포의 분화 및 활성 촉진용 조성물은 골다공증 및 골절 등과 같은 질환 및 증상의 치료 및 예방 뿐만 아니라, 골 강화를 목적으로 하는 치주 질환 및 화상으로 비롯되는 골성장 장애의 치료에도 유용하게 사용될 수 있다. .

본 발명의 약학 조성물은 유효성분으로서 우르솔릭산 및 2-α-하이드록시-우르솔릭산을 조성물의 총중량을 기준으로 0.0001 내지 50 중량%, 바람직하게는 0.01 내지 1 중량%의 양으로 함유할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 다양한 경로를 통해 경구적 또는 비경구적으로 투여될 수 있으며, 담체, 희석제 또는 부형제 등 약학적으로 허용가능한 첨가제를 함 께 사용하여 제형화될 수 있다. 이때, 사용가능한 적합한 담체, 희석제 또는 부형제의 실례로는 전분, 당, 및 마니톨과 같은 부형제; 칼슘 포스페이트 및 규산 유도체와 같은 충전제 및 증량제; 카르복시메틸셀룰로오스 또는 히드록시프로필셀룰로오스 등의 셀룰로오스 유도체, 젤라틴, 알긴산염, 및 폴리비닐 피롤리돈과 같은 결합제; 활석, 스테아린산 칼슘 또는 마그네슘, 수소화 피마자유, 및 고상 폴리에틸렌 글리콜과 같은 윤활제; 포비돈, 나트륨 크로스카멜로스, 및 크로스포비돈과 같은 붕해제; 폴리소르베이트, 세틸 (cetyl) 알코올, 및 글리세롤 모노스테아레이트 등과 같은 계면활성제 등을 들 수 있다.

유효성분으로서의 우르솔릭산 및 2-α-하이드록시-우르솔릭산은 사람을 포함하는 포유동물에 대해, 하루에 1 내지 150 ㎎/㎏ 체중, 바람직하게는 1 내지 15 ㎎/㎏ 체중의 양으로 1회 또는 분할하여 투여될 수 있으며, 투여량은 또한 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서 상기 투여량이 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

참조예 1: 우르솔릭산 및 2-α-하이드록시-우르솔릭산의 제조

건조된 하고초 6kg을 상온에서 메탄올 7ℓ에 일주일 동안 냉침시킨 후 여과하고 여액을 감압 농축하여 메탄올 추출물 85g을 얻었다. 상기 메탄올 추출물을 증류수 3ℓ에 현탁시킨 후, 동량의 에틸아세테이트로 추출하여 에틸아세테이트 추출물 42g을 얻었으며, 남은 수층은 동결 건조시켰다. 상기 에틸아세테이트 추출물 10g을 취하여 n-헥산/에틸아세테이트 혼합용액을 이동상으로서 3 ml/분의 유속으로 흘려주면서 헥산/에틸아세테이트의 혼합비를 10:1에서부터 1:1까지 순차적으로 올려주는 농도구배 용출방식의 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 총 6개의 분획(제1분획 내지 제6분획)으로 나누었다. 이 중 제4분획 및 제5분획을 합하여 다시 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(이동상으로서 메틸렌디클로라이드/메탄올=50:1, 30:1, 10:1, 5:1, 1:1, 유속 3 ml/분)로 정제하여, 1.4 g의 우르솔릭산 및 32 mg의 2-α-하이드록시-우르솔릭산을 분리하였다.

실시예 1: 조골세포의 분화 및 알칼리성 포스파타아제(ALP)의 활성 분석

단계 1: 조골세포의 배양 및 세포 증식 분석

조골세포로는 MC3T3-E1 서브클론 4(ATCC CRL-2593)를 사용하고, 세포 배양에 사용된 배지 및 재료는 하이클론(Hyclone)사의 제품을 사용하였다. 입수된 조골세포를 분화유도 배지(αMEM, 10% FBS, 50 ㎍/㎖ 아스코르브산 및 10 mM β-글리세로포스페이트(glycerophosphate))에서 배양하면서 3일 간격으로 배지를 교체하였다. MC3T3-E1 서브클론 4를 96-웰 플레이트에 1 × 10³세포/웰로 분주하고, 24시간 후에 2-α-하이드록시-우르솔릭산 및 우르솔릭산을 농도별(0, 1, 2.5, 5, 10 및 20 μM)로 처리하였다. 처리 후 1일 및 3일째에 각각의 웰에 대해서 CCK-8 키 트(Dojindo, 일본)를 이용하여 흡광도를 측정하고, 측정된 흡광도를 세포수로 전환하여 조골세포의 증식정도를 분석하였으며, 그 결과를 도 1a 및 1b에 나타내었다. 이때, 측정 12시간 전에 세포를 1, 2, 4, 8 × 10³ 세포/웰로 분주하여 플레이트에 처리하고 흡광도를 측정하여, 이를 세포수에 대한 표준 그래프(standard graph)로 사용하였다.

도 1a 및 1b로부터, 2-α-하이드록시-우르솔릭산(도 1a) 및 우르솔릭산(도 1b)은 농도 의존적으로 세포증식 속도를 감소시키지만 5μM 이하에서는 세포증식에 영향을 미치지 않음을 볼 수 있다. 따라서, 후속 단계에서는 2-α-하이드록시-우르솔릭산 및 우르솔릭산을 5μM 이하의 농도 범위로 사용하였다.

단계 2: 조골세포의 분화 유도

MC3T3-E1 서브클론 4 세포가 70% 정도 성장했을 때, 트립신을 이용하여 세포를 배양 플레이트에서 분리하고, 이를 48-웰 플레이트에 1 × 10⁴세포/웰의 농도로 분주하였다. 세포가 95% 이상 자라면, 세포를 분화유도 배지(αMEM, 10% FBS, 50 ㎍/㎖ 아스코르브산 및 10 mM β-글리세로포스페이트(β-glycerophosphate))로 옮기고, 3일에 한번씩 배지를 교체하며 배양하여 세포 분화를 유도하였으며, 이때 각각의 배지에 2-α-하이드록시-우르솔릭산과 우르솔릭산을 1, 2.5 및 5μM의 농도로 첨가하였다.

단계 3: ALP의 활성 분석

2-α-하이드록시-우르솔릭산과 우르솔릭산이, 조골세포 분화의 초기단계에서 활성 및 발현이 증가된다고 알려진 ALP의 활성에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 하기와 같은 방법으로 실험을 수행하였다.

상기 단계 2와 같은 공정으로 조골세포를 분화 유도 배지에 2-α-하이드록시-우르솔릭산 및 우르솔릭산을 처리한 후, 배지를 3일에 한 번씩 교체하였으며, 화합물 처리 6일 및 9일째에 세포를 용균 용액 (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.5 mM MgCl₂, 0.1% Triton X-100)을 이용하여 30분 동안 상온에서 용균하고, 이를 12,000 rpm, 4℃에서 20분 동안 원심분리한 후, 얻어진 상층액으로부터 BCA 키트(Bio-Rad)를 이용하여 ALP를 정량하였으며, 랩어세이 ALP 키트(LabAssay ALP kit)(Wako, 일본)를 이용하여 ALP 활성을 측정하였다. 이때, 측정된 활성은 "units/mg 단백질"로 표기하였다. 또한, 유의성 검증을 t-테스트로 수행하였다 (분화 유도 배지에서의 세포 ALP 활성 대 2-α-하이드록시-우르솔릭산나 우르솔릭산이 포함된 분화 유도 배지에서의 세포 ALP 활성, *, p<0.05 , **, p<0.01). 이로부터 얻은 결과를 도 2a에 나타내었다.

도 2a로부터, 분화 6일째에서부터 ALP의 활성이 측정되기 시작하였고, 분화 9일째에서는 ALP 활성이 2-α-하이드록시-우르솔릭산의 경우는 농도 의존적으로 증가하고, 우르솔릭산의 경우는 2.5μM의 농도에서 높은 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있다.

단계 4: ALP 발현량 분석

한편, 2-α-하이드록시-우르솔릭산과 우르솔릭산에 의한 조골세포에서의 ALP의 발현량 변화를 확인하기 위하여 다음과 같은 방법으로 ALP 염색을 수행하였다.

상기 단계 3에서 사용한 각각의 세포를 PBS 용액으로 3회 세척한 후, 10% 포르말린 용액으로 30초간 고정하고 다시 물로 세척하였다. 그 다음, 알칼리성 용액을 넣고 1시간 동안 빛이 차단된 상태로 염색을 하고 물로 다시 세척하였다. 이 때, 알칼리성 용액은 패스트 블루 RR 1 캡슐(Sigma, cat. no. 85L1-1 키트에 포함된 제품)을 48 ㎖의 물에 녹인 후, 2 ㎖의 나프톨 AS-MX 포스페이트(Sigma, cat. no. 85L1-1 키트에 포함된 제품)를 첨가함으로써 제조된 것을 사용하였다. 염색된 ALP는 자주색을 나타내며, 그 결과는 도 2b에 나타내었다.

도 2b에서, 알칼리성 포스파타아제가 염색되는 양상이 활성 증가 양상과 매우 유사하게 관찰되었다.

이러한 결과로부터, 저농도의 2-α-하이드록시-우르솔릭산과 우르솔릭산이 조골세포의 분화를 촉진하는 활성을 보유함을 확인할 수 있다.

실시예 2: 조골세포의 칼슘 형성 분석

단계 1: 조골세포에서 형성된 칼슘 정량 및 염색

실시예 1의 단계 2와 같은 공정으로 조골세포를 분화유도 배지에 2-α-하이드록시-우르솔릭산 및 우르솔릭산을 처리하고, 분화 12일 및 15일째에 축적된 칼슘 을 1N HCl로 적출하여 칼슘 C 키트(Wako, 일본)를 이용해 정량하였다. 또한, 유의성 검증을 t-테스트로 수행하여(분화 유도 배지에서의 세포 칼슘 형성 농도 대 2-α-하이드록시-우르솔릭산 또는 우르솔릭산이 포함된 분화 유도 배지에서의 세포 칼슘 형성 농도, ***, p<0.001), 얻어진 결과를 도 3a에 나타내었다.

도 3a로부터, 2-α-하이드록시-우르솔릭산과 우르솔릭산을 5μM 이하의 농도로 처리한 세포는 처리 12일째 부터 대조군(0μM)에 비해 세포내의 칼슘 형성이 현저하게 증가된 것을 확인할 수 있다.

단계 2: 조골세포에서 형성된 칼슘의 염색

상기 단계 1에서 사용한 세포를 PBS 용액으로 세척한 후, 알리자린 레드 에스(alizarin red S) 염색액(물 10 ㎖ 중 0.1368 g, pH 4.2)을 넣어 반응시키고 다시 물로 세척하여 붉은 색으로 염색된 칼슘을 확인하여, 그 결과를 도 3b에 나타내었다.

도 3b로부터, 염색된 칼슘의 양이 대조군(0μM)에 비해 현저히 증가하였음을 확인할 수 있다. 칼슘을 알리자린 레드 에스로 염색한 양상은 도 3a의 칼슘 증가 양상과 매우 흡사하였다.

이와 같이, 2-α-하이드록시-우르솔릭산 및 우르솔릭산은 조골세포의 분화를 촉진시켜 칼슘 형성을 증가시킴으로써 조골세포에 의한 무기질화를 촉진시킨다.

실시예 3: 유전자 발현 분석

조골세포의 분화시 나타나는 바이오 마커는 분화 시점에 따라 달라진다. 분화 초기에는 알칼리성 포스파타아제(ALP)가 나타나고, 조골세포에 의한 무기질화가 진행되는 단계에서는 오스테오폰틴(osteopontin; OP), 오스테오칼신(osteocalcin; OC) 및 콜라젠 (type I collagen; Col)과 같은 유전자의 발현이 높아지는 것으로 알려져 있다. 이에 따라, 조골세포 분화에 관련된 것으로 알려진 상기 4개의 유전자의 발현량이 조골세포에 2-α-하이드록시-우르솔릭산과 우르솔릭산의 처리 후 15일째에 어떻게 변화하는지를 알아보기 위하여, 하기와 같이 실시간 RT-PCR (real time reverse transcriptase polymerase chain reaction)을 수행하였다.

구체적으로, 실시예 1의 단계 2와 같은 공정으로 조골세포를 분화유도 배지에 2-α-하이드록시-우르솔릭산 및 우르솔릭산을 처리하고, 분화 12일 및 15일째에 TRIzol 시약(Life Technologies)을 이용하여 세포로부터 총 RNA를 추출하고, 옴니스크립트(Omniscript) RT 키트 (Qiagen)을 이용하여 추출된 RNA 1㎍ 및 1μM 올리고(oligo)-dT15 프라이머로부터 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA를 50분의 1로 희석한 후, 브릴리언트(Brilliant) SYBR 그린 마스터 믹스(Stratagene) 및 프라이머 20 pmole을 사용하여 스트라타진(Stratagene) Mx3000P 기기로 PCR을 수행하였다. 이때, ALP 유전자에 대해서는 서열번호: 1 및 서열번호: 2의 염기서열을 갖는 프라이머, OP 유전자에 대해서는 서열번호: 3 및 서열번호: 4의 염기서열을 갖는 프라이머, OC 유전자에 대해서는 서열번호: 5 및 서열번호: 6의 염기서열을 갖는 프라이머, 그리고 Col 유전자에 대해서는 서열번호: 7 및 서열번호: 8의 염기서열을 갖는 프라이머를 사용하였다. 또한, 상기 PCR 반응은 95℃에서 10분간 변성한 후, 94℃에서 40초간 변성, 60℃에서 40초간 어닐링 및 72℃에서 1분간 확장하는 사이클을 40회 반복하고, 마지막 사이클은 PCR 산물 온도 분리 곡선을 확인하기 위하여 95℃에서 1분, 55℃에서 30초, 95℃에서 30초간 수행하였다. 이어서, 증폭된 산물을 2^-△△CT 방법을 이용하여 GAPDH(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)(서열번호: 9 및 서열번호: 10의 염기서열을 갖는 프라이머를 사용)를 기준으로 보정 및 수치화하여 도 4a 및 4b에 나타내었으며, 또한 t-테스트로 유의성 검증을 하였다 (*, p < 0.05; **, p < 0.01; ***, p < 0.001).

도 4a로부터, 2-α-하이드록시-우르솔릭산으로 처리한 세포에서는 ALP와 Col 유전자의 발현량은 9일째에, OP의 발현량은 15일째에 현저히 증가하였다. 우르솔릭산으로 처리한 세포에서는 OP, OC 및 Col의 발현량이 현저히 증가하였다. 상기 결과로부터, 2-α-하이드록시-우르솔릭산과 우르솔릭산은 조골세포의 분화를 촉진시키는 유전자 발현을 유의적으로 증가시킴을 알 수 있다.

실시예 4: 미토겐 활성 단백질 키나아제 ( MAPK ) 및 전사인자의 활성 분석

MAPK 및 전사인자의 활성화는 조골세포의 분화를 촉진시킬 수 있는 것으로 알려져 있다 (참조: Hipskind and Bilbe, 1998). 이에 따라, 2-α-하이드록시-우르솔릭산과 우르솔릭산이 세포내의 MAPK 활성 및 전사인자의 발현/활성에 어떤 영향을 미치는지를 확인하기 위하여 웨스턴 블럿 및 RT-PCR을 다음과 같이 수행하였다.

단계 1: 웨스턴 블럿 분석

실시예 1의 단계 2와 같은 공정으로 조골세포를 분화유도 배지에 2-α-하이드록시-우르솔릭산 및 우르솔릭산을 처리하고, 분화 9일 및 15일째에, 세포를 RIPA 용액으로 용균시켜 세포내 단백질을 얻었다. 얻어진 단백질의 양을 BCA 키트(Bio-Rad)를 이용하여 정량하고, 단백질 10 ㎍/레인을 12% SDS-젤에서 분리한 뒤, 이를 니트로셀룰로오즈(NC) 막에 전달하였다. 10% 탈지유로 차단한 후, MAPK인 p-JNK, JNK, p-ERK, ERK, p-p38 및 p38에 대한 항체 및 전사인자인 NF-κB p65, c-Fos, JunD, 및 Fra-1 (SantaCruz, 미국)에 대한 항체와 반응시켜, 그 결과를 도 5 및 6에 나타내었다.

도 5는 2-α-하이드록시-우르솔릭산과 우르솔릭산이 MAPK 활성에 미치는 영향을 나타낸 것으로, 2-α-하이드록시-우르솔릭산은 분화 9일째 및 15일째에 p38과 ERK의 인산화를 부분적으로 증가시키고, 우르솔릭산은 분화 9일째에서는 p38의 인산화를, 분화 15일차에서는 JNK 및 p38의 인산화를 농도 의존적으로 증가시키고 ERK의 인산화는 1μM에서만 증가하는 양상이 관찰되었다.

또한, 도 6은 전사인자 NF-κB p65, c-Fos, JunD 및 Fra-1 모두가 2-α-하이드록시-우르솔릭산과 우르솔릭산에 의해 대부분이 농도 의존적으로 분화 9일째 및 15일째에 핵내로 이동되어 활성화되었음을 나타내고 있다.

단계 2: 실시간 RT-PCR

하기의 프라이머를 사용하는 것을 제외하고는 실시예 3과 같은 공정을 수행한 후, 그 결과를 도 7a 및 7b에 나타내었다.

c-Jun - 서열번호: 11 및 서열번호: 12의 염기서열을 갖는 프라이머,

c-Fos - 서열번호: 13 및 서열번호: 14의 염기서열을 갖는 프라이머,

NFATc1 - 서열번호: 15 및 서열번호: 16의 염기서열을 갖는 프라이머,

Fra-1 - 서열번호: 17 및 서열번호: 18의 염기서열을 갖는 프라이머,

Fra-2 - 서열번호: 19 및 서열번호: 20의 염기서열을 갖는 프라이머,

JunD - 서열번호: 21 및 서열번호: 22의 염기서열을 갖는 프라이머, 및

MGP - 서열번호: 23 및 서열번호: 24의 염기서열을 갖는 프라이머.

도 7a 및 7b는 각각 2-α-하이드록시-우르솔릭산 및 우르솔릭산에 의해 세포 분화 15일째에 c-Jun, c-Fos, Fra-1 및 JunD 유전자의 발현이 현저히 증가하였음을 보여주고 있다.

상기 결과로부터, 2-α-하이드록시-우르솔릭산과 우르솔릭산은 조골세포의 분화를 촉진시켜 MAPK 활성 및 전사인자의 발현/활성을 증가시켜 조골세포 분화 관련 유전자 발현을 촉진시키는 것으로 판단된다.

실시예 5: 전사인자 NF-κB 및 AP-1의 활성 분석

MC3T3-El 서브클론 4 세포를 96-웰 플레이트에 5 × 10⁴세포/웰이 되도록 분 주한 후, AP-1 (Clontech, 631903)과 NF-κB(Clontech, 631904)가 결합될 수 있는 유전자 서열을 갖는 루시퍼레이즈 리포터 유전자 각각을 리포펙타민(lipofectamin, Gibco)을 이용하여 형질 도입(transfection)하였다. 형질 도입한 24시간 후, 세포에 2-α-하이드록시-우르솔릭산과 우르솔릭산을 각각 1, 2.5 및 5μM의 농도로 첨가하고 14 시간 동안 배양하였다. 배지를 회수하여 SEAP (secreted form of human placental alkaline phosphatase) 활성을 측정함으로써(Great EscAPe^TMSEAPChemiluminescence Detection Kit 사용; Clontech, 631701), NF-κB와 AP-1의 전사 활성 증가 효과를 분석하였으며, 그 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8로부터, 2-α-하이드록시-우르솔릭산 및 우르솔릭산이 NF-κB와 AP-1의 전사활성을 증가시키는 것을 확인할 수 있다.

제조예 1: 우르솔릭산 또는 2-α- 하이드록시 - 우르솔릭산을 함유하는 약학적 제제의 제조

우르솔릭산 120mg 및 2-α-하이드록시-우르솔릭산 120mg의 각각에 미정질 셀룰로오스 33mg, 인산일수소칼슘 33mg, 나트륨 전분글리콜레이트 12mg, 스테아린산 마그네슘 2mg을 혼합한 후, 각 혼합물을 통상적인 정제 제조기를 사용하여 타정함으로써 우르솔릭산 또는 2-α-하이드록시-우르솔릭산 함유 정제를 제조하였다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 2-α-하이드록시-우르솔릭산과 우르솔릭산은 조골세포 분화 및 활성을 촉진시키므로, 골다공증 및 골절 등과 같은 질환 및 증상의 치료 및 예방 뿐만 아니라, 골 강화를 목적으로 하는 치주 질환 및 화상으로 비롯되는 골성장 장애의 치료에도 유용하게 사용될 수 있다.

도 1a 및 1b는 각각 2-α-하이드록시-우르솔릭산 및 우르솔릭산의 조골세포 처리 후 증가된 세포수를 나타낸 그래프이고,

도 2a는 2-α-하이드록시-우르솔릭산 및 우르솔릭산의 조골세포 처리 후 알칼리성 포스파타아제(ALP)의 활성도를 나타낸 그래프이고,

도 2b는 2-α-하이드록시-우르솔릭산 및 우르솔릭산의 조골세포 처리 후 ALP 염색도를 관찰하기 위한 사진이고,

도 3a는 2-α-하이드록시-우르솔릭산 및 우르솔릭산의 조골세포 처리 후 형성된 칼슘 농도를 나타낸 그래프이고,

도 3b는 2-α-하이드록시-우르솔릭산 및 우르솔릭산의 조골세포 처리 후 형성된 칼슘의 염색도를 관찰하기 위한 사진이고,

도 4a 및 4b는 각각 2-α-하이드록시-우르솔릭산 및 우르솔릭산이 조골세포의 분화와 관련된 유전자 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이고,

도 5는 2-α-하이드록시-우르솔릭산 및 우르솔릭산이 미토겐 활성 단백질 키나아제(MAPK) 활성에 미치는 영향을 나타낸 것이고,

도 6은 2-α-하이드록시-우르솔릭산 및 우르솔릭산이 전사인자 NF-κB와 AP-1의 사이토졸 및 핵 내 단백질 양에 미치는 영향을 나타낸 것이며,

도 7a 및 7b는 각각 2-α-하이드록시-우르솔릭산 및 우르솔릭산이 전사인자 AP-1 및 NFATc1 유전자 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이고,

도 8은 2-α-하이드록시-우르솔릭산과 우르솔릭산이 전사인자 NF-κB와 AP-1 의 활성에 미치는 영향을 나타낸 것이다.

<110> Korea Research Institute of Chemical Technology <120> PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PROMOTING OSTEOBLAST DIFFERENTIATION AND ACTIVATION COMPRISING URSORIC ACID AND 2-ALPHA-HYDROXY URSORIC ACID <130> FPD/200707-0181 <160> 24 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for alkaline phosphatase (ALP) <400> 1 atgggcgtct ccacagtaac 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for alkaline phophatase (ALP) <400> 2 tcacccgagt ggtagtcaca 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for osteopontin (OP) <400> 3 cccggtgaaa gtgactgatt 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for osteopontin (OP) <400> 4 tctcctggct ctctttggaa 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for osteocalcin (OC) <400> 5 tatgtgtcct ccgggttcat 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for osteocalcin (OC) <400> 6 gccctctgca ggtcatagag 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for type I collagen (Col) <400> 7 aggcataaag ggtcatcgtg 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for type I collagen (Col) <400> 8 gttcgggctg atgtaccagt 20 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) <400> 9 ggcctctctt gctcagtgtc c 21 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) <400> 10 ctgcaccacc aactgcttag 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for c-Jun <400> 11 tcccctatcg acatggagtc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for c-Jun <400> 12 tgagttggca cccactgtta 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for c-Fos <400> 13 ccagtcaaga gcatcagcaa 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for c-Fos <400> 14 aagtagtgca gcccggagta 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for NFATc1 <400> 15 gggtcagtgt gaccgaagat 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for NFATc1 <400> 16 ggaagtcaga agtgggtgga 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for Fra-1 <400> 17 agagctgcag aagcagaagg 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for Fra-1 <400> 18 caagtacggg tcctggagaa 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for Fra-2 <400> 19 atccacgctc acatccctac 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for Fra-2 <400> 20 gtttctctcc ctccggattc 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for JunD <400> 21 cgaccagtac gcagttcctc 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for JunD <400> 22 aactgctcag gttggcgtag 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for MGP <400> 23 acaggagaaa tgccaacacc 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for MGP <400> 24 gcgttgtagc cgtagaccat 20

Claims

하기 화학식 1의 우르솔릭산 또는 하기 화학식 2의 2-α-하이드록시-우르솔릭산을 활성성분으로 포함하는, 골다공증, 골절, 치주 질환 및 골성장 장애로 이루어진 군으로부터 선택되는 골 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.

화학식 1

화학식 2