KR100737193B1 - 약제학적으로 허용되는(ｓｓ-ｒｓ)-ｓ-아데노실-ｌ-메티오닌 염의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 염화된(salfied) (RS)-(+)-S-아데노실-L-메티오닌 부분입체 이성체를 염화된 (SS)-(+)-S-아데노실-L-메티오닌 부분입체 이성체에 대하여 3% 이하의 양으로 수득할 수 있는 약제학적으로 허용되는 (SS,RS)-S-아데노실-L-메티오닌 염의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 제조방법으로 수득할 수 있는 당해 염은 시간이 경과하더라도 이의 구조를 안정하게 유지할 수 있다.
(SS,RS)-S-아데노실-L-메티오닌 염, 부분입체 이성체, 라세미화, 삭카로마이세스 칼스버겐시스, 쉬렌크법
Description
본 발명은 약제학적으로 허용되는 (SS,RS)-S-아데노실-L-메티오닌[이후, (SS,RS)-SAMe라고 함] 염의 제조방법에 관한 것이다.
특히 본 발명은 염화된(salified) (RS)-(+)-S-아데노실-L-메티오닌 [이후, (RS)-(+)-SAMe라고 함] 부분입체 이성체가 염화된 (SS)-(+)-S-아데노실-L-메티오닌 [이후, (SS)-(+)-SAMe라고 함] 부분입체 이성체에 대하여 3% 이하의 양으로 제조되는, 약제학적으로 허용되는 (SS,RS)-SAMe 염의 제조방법에 관한 것이다.
공지되어 있는 바와 같이, (SS,RS)-SAMe는 효소에 의한 메틸 교환반응(transmethylation)과 관련된 생리학적 메틸 공여체로서, 모든 유기체에 존재하며 만성 간장 질환, 비만증, 지혈증 및 아테롬성 동맥경화증에 치료학적 효과를 제공하므로 다량으로 생산하는 것이 바람직하다.
또한, (SS,RS)-SAMe를 함유하는 생성물은 두 가지 부분입체 이성체, 즉 아래의 화학식의 (RS)-(+)-SAMe 및 (SS)-(+)-SAMe의 혼합물로 이루어진 것으로 공지되어 있다[참조: J.W. Cornforth, J.A.C.S., 1977, 99, 7292-7300; Stolowitz et al., J.A.C.S., 1981, 103, 6015-6019].
또한, 두 가지 부분입체 이성체 중 하나, 즉 (SS)-(+)-SAMe만이 메틸 교환반응에 효소적으로 활성이며 자발적으로 라세미화되어 불활성 부분입체 이성체인 (RS)-(+)-SAMe를 약 20%의 양으로 형성한다[참조: Wu et al., Biochemistry 1983, 22, 2828-2832]고 입증되어 있다[참조: De La Haba et al., J.A.C.S., 1959, 81, 3975-3980].
사실, 본 출원인은 (SS,RS)-SAMe를 기본으로 하는 모든 시판 제품에서 불활성 부분입체 이성체인 (RS)-(+)-SAMe가 20% 이상의 비율로 존재함에 주목하였다. 또한, 당해 비율은 시간 경과에 따라 심지어 40% 이상까지 증가함에 주목하였다.
이러한 관찰에 의해 부분입체 이성체 혼합물이 시간 경과에 따라 불안정하다는 사실이 명백히 확인되었으며, 이는 다른 한편으로 용액 중의 생성물과 관련하여 이미 주목된 바 있다[참조: G.L. Creason et al., Phytochemistry, vol. 24, N., 6, 1151-1155, 1985; H. C. Uzar, Liebigs Ann. Chem. 1989, 607-610].
활성 (SS)-(+)-SAMe 부분입체 이성체의 비율이 불활성 (RS)-(+)-SAMe 이성체에 비해 명백히 더 높게 존재하고 당해 비율이 시간이 경과해도 안정한 것으로 판명되는 (SS,RS)-SAMe 유도체가 특히 당해 분야에서 요구되고 있다.
또한, (SS,RS)-SAMe 및 약제학적으로 허용되는 이의 염은 심지어 실온에서도 열에 불안정하고 이의 제조 및 정제 방법이 복잡하기 때문에 공업적 수준에서 사용하는 데 지장이 있는 것으로 밝혀졌다.
(SS,RS)-SAMe의 정제방법 및 약제학적으로 허용되는 이의 염의 제조방법이 몇가지 공지되어 있다.
그러나, 공지된 정제방법은, 강산 수지[참조: 일본 특허 제13680/1971호], 킬레이트형 수지[참조: 일본 특허 제20998/1978호] 또는 고가의 특정 반응물, 예를 들면, 피크르산 또는 피콜린산[참조: 미국 특허 제3,707,536호 및 미국 특허 제3,954,726호]을 사용할 뿐만 아니라, (SS,RS)-SAMe의 황 키랄 중심을 부분적으로 라세미화하여 불활성 부분입체 이성체를 20% 초과하는 양으로 함유하는 최종 생성물을 제공한다.
약산 수지를 사용하는 정제방법[참조: 일본 특허 제14299/1981호, 프랑스 공개특허공보 제2531714호 및 유럽 공개특허공보 제0 141 914호]도 공지되어 있지만, (SS,RS)-SAMe를 단지 부분적으로 분리하여 약제학적 용도로 사용하기에는 순도가 불충분하다.
비록 위에 확인된 몇가지 방법을 수행하여 더 높은 순도를 얻을 수 있다할지라도, 여하튼 부분적 라세미화는 20% 이상의 불활성 부분입체 이성체가 존재함을 의미한다. 또한, 특정 경우[참조: 프랑스 공개특허공보 제2531714호]에는, 중탄산칼륨을 사용한 후, 과염소산칼륨을 침강시켜 세포로부터 생성물을 추출하는 방법이 제공되어 있는데, 당해 방법은 먼저 분리시에 문제를 일으키고, 이어서 생성물 폐기시에도 문제를 일으킨다. 유럽 공개특허공보 제0 141 914호에서는, 100 내지 200메쉬 수지를 기본으로 하는 크로마토그래피 컬럼을 사용하여 유기 용매(예를 들면, 에틸 아세테이트, 아세톤 등)의 존재하에 (SS,RS)-SAMe를 함유하는 효모 세포를 분해시키는데, 이 경우 투자 및 유지 비용이 높다. (SS,RS)-SAMe의 추출용 용매의 사용은 필수적으로 안티데플라그런트 플랜트(antideflagrant plant) 및 회수, 증류 및 용매 회수 시스템을 사용해야 할 뿐만 아니라, 사용한 균사체를 필수적으로 건조시켜 잔류 용매의 배출을 방지해야 함을 의미하며, 이들 모든 요소들은 명백히 추가의 투자 및 공정 비용을 발생시킨다.
제1 양태에 따르면, 본 발명은
0 내지 12℃의 온도 또는 그 이상의 온도에서
- pH 값을 1.2 내지 3.5로 조정하는 단계(a), 강화된 효모(enriched yeast)로부터 (SS,RS)-SAMe의 수성 분해질(lysate)을 제조하는 단계(b), 수득된 분해질을 정밀여과(microfiltration)하는 단계(c), 수득된 정밀여과액을 0.1 내지 2N의 무기산 용액으로 용출시켜 약산 수지에 흡착시키는 단계(d) 및 수득된 용출물을 탈색시키는 단계(e)를 포함하여, 6g/ℓ 이상의 (SS,RS)-S-아데노실-L-메티오닌을 함유하는 강화된 효모로부터 (SS,RS)-S-아데노실-L-메티오닌을 정제하는 단계,
- 탈색된 용출물을 역삼투압에 의해 30 내지 70용적%로 농축시키는 단계 및
- 농축된 용출물에 화학양론적 양의 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 산 을 가하여 상응하는 약제학적으로 허용되는 (SS,RS)-SAMe 염을 수득하는 단계를 포함하는, 염화된 (RS)-(+)-SAMe 부분입체 이성체가 염화된 (SS)-(+)-SAMe 부분입체 이성체에 대하여 3% 이하의 양으로 존재하는, 약제학적으로 허용되는 (SS,RS)-SAMe 염의 제조방법에 관한 것이다.
바람직한 양태에 따라서, 이와 같이 수득된 약제학적으로 허용되는 (SS,RS)-SAMe 염을 동결 건조시킬 수 있다.
또 다른 바람직한 양태에 따라서, 본 발명의 방법은 2 내지 5℃의 온도에서 수행한다.
추가의 바람직한 양태에 따라서, 단계(a)의 pH 값은 1 내지 2인 반면, 단계(b)의 분해질의 제조는 효모를 세포 파괴장치로 통과시킨 후, 이렇게 하여 수득된 효모를, 예를 들면, 세라믹 막 상에서 정밀여과하여 진행시킬 수 있다.
(SS,RS)-SAMe가 정제되는 강화된 효모는, 바람직하게는 (SS,RS)-SAMe를 8 내지 10g/ℓ이상 함유한다. 약제학적으로 허용되는 산은 바람직하게는 황산 및 p-톨루엔설폰산으로부터 선택된다.
본 발명의 방법에서는, 예를 들면, 흡착된 생성물 kg당 10 내지 20ℓ의 수지에 상응하는 수지/생성물 비율을 사용할 수 있음이 주목되며, 이는 일본 특허 제20998/1978호에 기재된 것보다 유리하다.
본 발명의 방법에서는, 심지어 실온에서도 (SS)-(+)-SAMe 부분입체 이성체가 97% 이상이고, 따라서 (RS)-(+)-SAMe 부분입체 이성체가 3% 이하의 양으로 검출되는 (SS,RS)-SAMe 염을 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 방법에서는 분해질의 제조시 유기 용매를 배제할 수 있어, 약제학적으로 허용되는 (SS,RS)-SAMe 염의 정제 단계와 관련하여 현저히 유리할 뿐만 아니라 생태학적 및 환경학적으로도 유리하다.
또한, 공지된 방법으로 수득할 수 있는 것보다 수율 및 순도가 더 높은 약제학적으로 허용되는 (SS,RS)-SAMe 염을 수득할 수 있다. 실제로 발효된 생성물의 경우, (SS,RS)-SAMe의 순도는 98% 이상이고 수율은 90% 이상이다.
특정 조건으로 인해 본 발명의 방법에서는 분해질의 제조 동안 (SS,RS)-SAMe의 분해를 방지할 수 있고, 수율이 98%를 초과하며 부산물(이의 주 생성물은 5-데아실-5-메틸티오아데노신이다) 함량이 1% 미만이 되도록 분해시킬 수 있다.
위에서 기재한 바와 같이 적절하게 염화된 (SS,RS)-SAMe는, 예를 들면, 삭카로마이세스 파스토리아누스(Saccharomyces pastorianus[예를 들면, 삭카로마이세스 칼스버겐시스(Saccharomyces carlsbergensis) CBS 1513], 삭카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) (IFO 2044), 토룰롭시스 유틸리스(Torulopsis utilis) 및 캔디다 유틸리스(Candida utilis)와 같은 적합한 미생물을 발효시켜 제조할 수 있다.
(SS,RS)-SAMe를 함유하는 효모는 당해 분야에 공지된 방법, 예를 들면, DL 메티오닌의 사용을 최적화하는 것만을 변경하여 약 20시간 동안 최대 온도 27.5℃에서 수행되는 쉬렌크법(Schlenk method)[참조: "Journal of Biological Chemistry", vol. 29, page 1037(1987)]으로 강화시킬 수 있다.
(SS,RS)-SAMe-강화된 효모(본 발명을 실시하는데 유리하게 사용되도록 하기 위해 (SS,RS)-SAMe를 6g/ℓ 이상 함유한다)는 pH 값을 1.2 내지 3.5로 조절시 효모를 바람직하게는 세포 파괴장치를 통해 통과시킴으로써 세포가 분해된다.
수득된 분해질에 대해, 예를 들면, 세라믹 막[예를 들면, 케라셉(KerasepR) K09A] 상에서 정밀여과 공정을 수행한 후, 이를 바람직하게는 양이온 유형의 약산인 카복실산 수지[예를 들면, 룀 앤드 하아스(Rohm and HaasR) IRC86]에 바람직하게는 포화될 때까지 흡착시키고(약 150g/ℓ) 무기산, 예를 들면, 0.1 내지 2N의 황산, 염산 등의 용액으로 용출시킨다.
이어서, 예를 들면, 스티렌-디비닐벤젠 단위를 포함하는 공중합체 수지[예를 들면, 레신디온(ResindionR) 825L]를 사용하여, 수득된 용출물을 탈색시킨다.
(SS,RS)-SAMe를 함유하는 수득된 용출물은 역삼투압에 의해 30 내지 70용적%, 바람직하게는 40 내지 50용적%로 농축시킨다. 이렇게 하여 수득된 농축물에 화학양론적으로 동량인 산 또는 약제학적으로 허용되는 산들의 혼합물, 예를 들면, 위에 기재한 바와 같은 것들을 첨가한다. 이렇게 하여 수득된 생성물은 용액 형태의 제제로 사용하거나, 고체 형태로 사용하고자 하는 경우에는 동결 건조시킬 수 있다.
아래의 실시예로 본 발명을 설명하지만, 이로 인해 본 발명이 제한되는 것은 아니다.
실시예 1
삭카로마이세스 칼스버겐시스를 발효시켜 수득한 효모 1000kg을, 다음과 같이 개질된 쉬렌크법에 따라 (SS,RS)-SAMe로 강화시킨다. 효모에 효모 크림(탈이온수 100ℓ로 희석시킬 경우 2.2g/ℓ의 역가를 갖는다) 100kg, DL 메티오닌 2kg, 수화된 글루코스 12kg 및 시트르산 1.5kg을 가하고, 27 ±0.5℃에서 22시간 동안 교반하면서 유지하고, 멸균 여과 공기를 0.6ℓ/ℓ/m의 유량으로 방출시켜 에어레이션시킴으로써 (SS,RS)-SAMe 9g/ℓ를 수득한다. H2SO4를 사용하여 pH를 1.2로 조정한 후, 12℃의 온도에서 냉각 시스템을 포함하는 가압형 세포 파괴 시스템인 "콘스턴트 셀 디스럽션 시스템(Constant Cell Disruption System)" [제조사: 콘스턴트 시스템 리미티드(Constant System Ltd.)]을 사용하여 분해시킨다. 이어서, 먼저 냉각수를 사용하고, 이어서 염수를 사용하여 용액을 약 2℃로 냉각시킨다.
이어서, 배출된 고체를 강화된 액체로부터 분리시키기 위해, 수득된 혼합물을 타입 베린드(Verind) A-10 HFM 180 SM 카트리지가 제공된 정밀여과장치로 운반한다. 패널을 2℃에서 2000ℓ의 탈염수로 세척한다. 여과 수율은 98%이다.
강화된 용액을 카복실산 수지인 IRC86 수지[제조사:룀 앤드 하아스]를 통해 통과시키고, 계속 약 2℃의 온도에서 유지하면서 1N 황산으로 용출시킨다.
수집한 용출물을 레신디온 825L 수지를 사용하여 탈색시킨다. 강화된 용액을 역삼투압에 의해 농축시켜 40% 농도의 (SS,RS)-SAMe를 수득한다. 이어서, 상응하는 화학양론적 양의 황산 및 p-톨루엔설폰산을 가하여 (SS,RS)-SAMe 디설페이트 p-톨루엔설포네이트를 수득한다. (SS,RS)-SAMe 디설페이트 p-톨루엔설페이트의 최종 수율은 90%이다.
(SS,RS)-SAMe 디설페이트 p-톨루엔설포네이트의 부분입체 이성체 혼합물 중의 (RS)-(+)-SAMe 디설페이트 p-톨루엔설포네이트의 함량은 HPLC로 분석한 결과 1%로 나타났다. 관련 데이타는 샘플 제4번과 관련하여 아래의 표에 기재되어 있다.
실시예 2
실시예 1에 기재된 방법에 따라 (SS,RS)-SAMe로 강화된 삭카로마이세스 칼스버겐시스를 발효시켜 수득한 효모 1000kg(활성이 8.2g/kg임)을 온도 12℃ 및 pH 2에서 세포 파괴 시스템을 사용하여 분해시킨다. 수득된 용액에 물 500ℓ를 가한 후, 실시예 1에 기재된 바와 동일하게 정밀여과 및 이후의 단계들을 수행하고, 냉각된 탈염수 2000ℓ(약 5℃)로 세척한다. (SS,RS)-SAMe 7.5kg을 수득하고 이를 역삼투압에 의해 농축시킨 후, 염화(salify)시켜 (SS,RS)-SAMe 디설페이트 p-톨루엔설포네이트를 91.4%의 수율로 수득한다(분해 수율 99%; 정제 수율 98%). 발효 종료로부터 역삼투압에 의한 농축까지 걸린 시간은 32시간이다. 관련 데이타는 샘플 제5번과 관련하여 아래의 표에 기재되어 있다.
실시예 3
실시예 1의 방법으로 수득된 용액을 IRC 86 수지[제조사: 룀 앤드 하스] 상에 흡착시킨 후, 1N 황산으로 용출시킨다.
수득된 용액을 20%까지 농축시킨 후, 화학양론적 양의 황산 및 p-톨루엔설폰산을 가한 다음, 추가로 농축시켜 40%의 용액을 수득한다. (SS,RS)-SAMe 디설페이트 p-톨루엔설포네이트 14.09kg이 수득되며, 이는 전환율이 97.8%이다. 관련 데이타는 샘플 제6번과 관련하여 아래의 표에 기재되어 있다.
실시예 4 (비교 실시예)
3개의 사미르(SAMIRR)[(SS,RS)-SAMe][제조사: 크놀 파르마케우티시 에스.피.에이(Knoll Farmaceutici S.p.A.)] 샘플을 HPLC로 분석한다. 각각의 샘플에 대해 측정한 값은 아래와 같다.
샘플 제1번 - 사미르(바이얼) 100mg; 배치 045-021; 종료일 2000년 6월
(SS)-(+)-SAMe에 상응하는 피크 제5번은 58%의 비율을 나타내는데 반해, (RS)-(+)-SAMe에 상응하는 피크 제6번은 42%의 비율을 나타낸다.
샘플 제2번 - 사미르(정제) 200mg; 배치 121; 종료일 2002년 5월
(SS)-(+)-SAMe에 상응하는 피크 제5번은 60%의 비율을 나타내는데 반해, (RS)-(+)-SAMe에 상응하는 피크 제6번은 40%의 비율을 나타낸다.
샘플 제3번 - 사미르(정제) 400mg; 배치 040; 종료일 2002년 10월
(SS)-(+)-SAMe에 상응하는 피크 제3번은 59%의 비율을 나타내는데 반해, (RS)-(+)-SAMe에 상응하는 피크 제4번은 41%의 비율을 나타낸다.
실시예 5
실시예 1 내지 3에서 본 발명의 방법에 따라 수득된 생성물인 샘플 제4번 내 지 제6번을 각각 제조일로부터 4개월 후에 실시예 4에 기재된 바와 유사하게 분석한다.
각각의 샘플에 대해 측정한 값은 아래와 같다.
샘플 제4번(실시예 1); 배치 003/R
(SS)-(+)-SAMe에 상응하는 피크 제7번은 99%의 비율을 나타내는데 반해, (RS)-(+)-SAMe에 상응하는 피크 제8번은 1%의 비율을 나타낸다.
샘플 제5번(실시예 2); KF=2.3%; 역가=102.6%; 배치 001/R
(SS)-(+)-SAMe에 상응하는 피크 제7번은 98%의 비율을 나타내는데 반해, (RS)-(+)-SAMe에 상응하는 피크 제8번은 2%의 비율을 나타낸다.
샘플 제6번(실시예 3); KF=1.39%; 역가=102.7; 배치 004/R
(SS)-(+)-SAMe에 상응하는 피크 제7번은 98%의 비율을 나타내는데 반해, (RS)-(+)-SAMe에 상응하는 피크 제6번은 2%의 비율을 나타낸다.
Claims (17)
- 0 내지 12℃의 온도에서- pH 값을 1.2 내지 3.5로 조정하는 단계(a), 강화된 효모로부터 (SS,RS)-S-아데노실-L-메티오닌의 수성 분해질(lysate)을 제조하는 단계(b), 수득된 분해질을 정밀여과하는 단계(c), 수득된 정밀여과액을 0.1 내지 2N의 무기산 용액으로 용출시켜 약산 수지에 흡착시키는 단계(d) 및 수득된 용출물을 탈색시키는 단계(e)를 포함하여, 6g/ℓ 이상의 (SS,RS)-S-아데노실-L-메티오닌을 함유하는 강화된 효모로부터 (SS,RS)-S-아데노실-L-메티오닌을 정제하는 단계,- 탈색된 용출물을 역삼투압에 의해 30 내지 70용적%로 농축시키는 단계 및- 농축된 용출물에 화학양론적 양의 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 산 을 가하여 상응하는 약제학적으로 허용되는 (SS,RS)-S-아데노실-L-메티오닌 염을 수득하는 단계를 포함하는, 염화(salified)된 (RS)-(+)-S-아데노실-L-메티오닌 부분입체 이성체가 염화된 (SS)-(+)-S-아데노실-L-메티오닌 부분입체 이성체에 대하여 3% 이하의 양으로 존재하는, 약제학적으로 허용되는 (SS,RS)-S-아데노실-L-메티오닌 염의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 (SS,RS)-S-아데노실-L-메티오닌 염이 동결 건조되는 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 단계(a)에서 pH 값이 1 내지 2인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 단계(b)에서 분해질의 제조가 효모를 세포 파괴장치를 통해 통과시킴으로써 수행되는 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 온도가 2 내지 5℃인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 강화된 효모가 (SS,RS)-S-아데노실-L-메티오닌을 8 내지 10g/ℓ 함유하는 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 산이 황산 및 p-톨루엔설폰산으로부터 선택되는 방법.
- 제3항에 있어서, 단계(b)에서 분해질의 제조가 효모를 세포 파괴장치를 통해 통과시킴으로써 수행되는 방법.
- 제3항에 있어서, 온도가 2 내지 5℃인 방법.
- 제4항에 있어서, 온도가 2 내지 5℃인 방법.
- 제3항에 있어서, 강화된 효모가 (SS,RS)-S-아데노실-L-메티오닌을 8 내지 10g/ℓ 함유하는 방법.
- 제4항에 있어서, 강화된 효모가 (SS,RS)-S-아데노실-L-메티오닌을 8 내지 10g/ℓ 함유하는 방법.
- 제5항에 있어서, 강화된 효모가 (SS,RS)-S-아데노실-L-메티오닌을 8 내지 10g/ℓ 함유하는 방법.
- 제3항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 산이 황산 및 p-톨루엔설폰산으로부터 선택되는 방법.
- 제4항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 산이 황산 및 p-톨루엔설폰산으로부터 선택되는 방법.
- 제5항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 산이 황산 및 p-톨루엔설폰산으로부터 선택되는 방법.
- 제6항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 산이 황산 및 p-톨루엔설폰산으로부터 선택되는 방법.
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