KR100734040B1

KR100734040B1 - 진저롤을 유효성분으로 함유하는 자외선에 대한 피부보호용 화장료 조성물

Info

Publication number: KR100734040B1
Application number: KR1020050094252A
Authority: KR
Inventors: 신동헌
Original assignee: 신동헌
Priority date: 2005-10-07
Filing date: 2005-10-07
Publication date: 2007-07-02
Also published as: KR20070039205A

Abstract

본 발명은 진저롤을 유효성분으로 함유하는 자외선에 대한 피부 보호용 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 화장료 조성물은 자외선에 의한 활성산소종 생성 및 세포내 신호전달 분자의 생성을 저해하여 피부세포의 사멸 및 홍반 생성을 억제함으로써 자외선으로부터 피부를 보호할 수 있는 효과가 있다.

진저롤, 자외선, 피부, 화장료

Description

진저롤을 유효성분으로 함유하는 자외선에 대한 피부 보호용 화장료 조성물{Cosmetic composition comprising gingerol for protecting skin damage from ultraviolet light}

도 1은 인간 각질세포에서 진저롤의 처리농도에 따른 세포독성을 MTT 분석법으로 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 2는 인간 각질세포에서 진저롤의 자외선 B에 의한 활성산소 생성 억제 효과를 측정한 결과이다.

A: 진저롤과 자외선을 모두 처리하지 않은 세포(무처리군)

B: 자외선만 조사한 세포(자외선 단독 처리군)

C: 진저롤만 처리한 세포(진저롤 단독 처리군)

D: 진저롤을 처리한 후 자외선을 조사한 세포(실험군)

도 3은 인간 각질세포에서 진저롤의 자외선 A에 의한 활성산소 생성 억제 효과를 측정한 결과이다.

A: 자외선 A와 진저롤을 모두 처리하지 않은 세포(무처리군)

B: 진저롤만 50μM 농도로 처리한 세포(진저롤 단독 처리군)

C: 자외선 A만 10J/m²으로 조사한 세포(자외선 단독 처리군 1)

D: 자외선 A만 20J/m²으로 조사한 세포(자외선 단독 처리군 2)

E: 진저롤 30μM을 처리한 후 자외선 A를 10J/m²로 조사한 세포(실험군 1)

F: 진저롤 30μM을 처리한 후 자외선 A를 20J/m²로 조사한 세포(실험군 2)

G: 진저롤 50μM을 처리한 후 자외선 A를 10J/m²로 조사한 세포(실험군 3)

H: 진저롤 50μM을 처리한 후 자외선 A를 20J/m²로 조사한 세포(실험군 4)

도 4는 인간 각질세포에서 진저롤의 자외선 B에 의한 IκBα의 인산화 억제 효과를 웨스턴 블롯으로 분석한 결과이다.

Gin:진저롤, -: 무처리, +: 처리

도 5a는 무모 마우스에서 진저롤의 처리가 자외선 B에 의한 COX-2 mRNA의 발현에 미치는 영향을 RT-PCR로 분석한 결과이다.

Gin: 진저롤, -: 무처리, +: 처리

도 5b는 무모 마우스에서 진저롤의 처리가 자외선 B에 의한 COX-2 단백질의 발현에 미치는 영향을 웨스턴 블롯으로 분석한 결과이다.

Gin: 진저롤, -: 무처리, +: 처리

도 5c는 무모 마우스에서 진저롤의 처리가 자외선 B에 의한 COX-2의 발현에 미치는 영향을 조직학적으로 분석한 결과이다.

도 6은 무모 마우스에서 진저롤의 처리가 자외선 B에 의한 NF-κB p65의 발현에 미치는 영향을 조직학적으로 분석한 결과이다.

도 7a는 인간 각질세포에서 진저롤의 자외선 B에 의한 Fas, 카스파제-8 및 카스파제-3의 발현 억제 효과를 웨스턴 블롯으로 분석한 결과이다.

Gin: 진저롤, -:무처리, +:처리

도 7b는 인간 각질세포에서 진저롤의 자외선 B에 의한 카스파제-9, Bcl-2 및 Bax의 발현 억제 효과를 웨스턴 블롯으로 분석한 결과이다.

Gin: 진저롤, -:무처리, +:처리

도 8a는 무모 마우스에서 진저롤의 처리가 자외선에 의한 홍반 생성에 미치는 영향을 육안으로 관찰한 사진이다.

A: 마우스의 등 피부에 아세톤 도포하고 자외선 B를 200mJ/cm²의 강도로 조사한 후 홍반 반응을 관찰한 사진

B: 마우스의 등 피부에 진저롤을 도포하고 자외선 B를 200mJ/cm²의 강도로 조사한 후 홍반 반응을 관찰한 사진

C: 마우스의 등 피부에 아세톤을 도포하고 자외선 B를 300mJ/cm²의 강도로 조사한 후 홍반 반응을 관찰한 사진

D: 마우스의 등 피부에 진저롤을 도포하고 자외선 B를 300mJ/cm²의 강도로 조사한 후 홍반 반응을 관찰한 사진

도 8b는 마우스의 등 피부에 아세톤 또는 진저롤을 도포하고 자외선을 조사 후 48시간에 나타난 홍반 반응을 크로마미터로로 측정한 결과이다.

A: 마우스의 등 피부에 아세톤을 도포하고 자외선 B를 200mJ/cm²의 강도로 조사한 후 홍반 반응을 관찰한 사진

본 발명은 진저롤을 유효성분으로 함유하는 자외선에 대한 피부 보호용 화장료 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 진저롤을 유효성분으로 함유하여 자외선에 의한 활성 산소종 생성 및 세포내 신호전달 분자의 생성을 저해하여 피부세포의 사멸 및 홍반 생성을 억제함으로써 자외선으로부터 피부를 보호하는 활성을 가진 화장료 조성물에 관한 것이다.

태양광으로부터 조사되는 자외선은 피부에 홍반이나 부종, 주근깨, 피부암 등을 일으키는 주요 원인이 되고 있다. 일반적으로 자외선은 그 파장에 따라 자외선 A(320∼400nm), 자외선 B(280∼320nm) 및 자외선 C(240∼280nm)로 분류된다. 상기 자외선 A는 장파장·저에너지를 특징으로 하며 피부의 진피까지 침투하여 피부암과 주름, 멜라닌 형성을 촉진하는 등 피부 노화 및 피부 자극을 유발하는 것으로 알려져 있으나, 에너지의 강도가 높지 않다. 자외선 B는 단파장·고에너지를 특징으로 하며 자외선 중 광 생물학적으로 인체에 가장 영향을 많이 미치며 피부에 광 손상을 일으키는 주원인이다. 상기 자외선 B는 에너지의 강도가 높기 때문에 피부의 표피까지 침투하여 홍반, 주근깨 및 부종 등을 일으킨다. 또한, 상기 자외선 B에 만성적으로 노출되면 피부 노화, 면역 억제, 피부암 및 세포사멸의 결과를 초래한다. 자외선 C는 오존층을 통과하면서 지표면에 도달하지 못하고 소실된다.

최근에는 이러한 자외선에 의한 피부 손상을 억제하기 위하여 자외선의 침투 자체를 차단하여 세포를 보호하는 자외선 차단제나 자외선에 의한 세포내 활성산소종의 생성을 억제하는 항산화 기능을 가진 성분들을 이용한 화장료 조성물에 대한 개발이 활발히 이루어지고 있다.

한편, 진저롤(gingerol)은 쇼가올(shogaol) 및 진저론(zingerone) 성분들과 더불어 생강의 매운맛을 나타내는 대표적인 성분이다. 생강(ginger: Zingiber officinale Roscoe)은 열대 및 아열대 지역에서 유사 이전부터 재배되어 온 생강과에 속하는 다년생 초본식물의 근경으로 특유한 향기와 매운 맛으로 인하여 전세계적으로 오랫동안 애용되고 있는 향신료 중의 하나이다. 또한, 생강은 약리효능을 가지고 있어 한방에서 건위제, 구토, 복통, 요통, 설사 등의 치료제 및 발한제로 사용되고 있다. 이와 같이 생강이 향신료로서 뿐만 아니라 약용으로 사용되는 것은 생강 중의 매운맛 성분과 방향성분 등이 함유되어 있기 때문이다. 이 중에서 진저롤은 생강의 가장 강력한 매운맛 성분이다. 상기 진저롤은 [6]-진저롤, [8]-진저롤 및 [10]-진저롤 등 3가지 동족체 화합물로 구성되어 있다(Connell, D.W et al., Austral J Chem., 22. 1033-1043, 1969).

그러나, 아직까지 진저롤이 자외선으로부터 피부를 보호하는 효과가 있다는 것은 보고 된 바 없다.

이에 본 발명자들은 자외선으로부터 피부를 보호할 수 있는 조성물을 개발하고자 다년간 연구한 결과, 생강의 진저롤 성분이 자외선에 의한 활성 산소종 생성 및 세포내 신호전달 분자의 생성을 저해하여 피부세포의 사멸 및 홍반 생성을 억제함으로써 자외선으로부터 피부를 보호하는 효과가 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 진저롤을 유효성분으로 함유하는 자외선에 대한 피부 보호용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 진저롤을 유효성분으로 함유하는 자외선에 대한 피부 보호용 화장료 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다.

본 발명은 진저롤이 자외선에 의해 유도되는 다양한 종류의 피부손상 관련 매개체들의 생성을 저해함으로써 피부세포의 사멸 및 홍반 생성 등을 억제하여 자외선으로부터 피부를 보호할 수 있음을 규명하였다는 것에 특징이 있다. 보다 구체적으로 본 발명자들은 진저롤이 자외선에 의한 활성 산소종 생성 및 세포내 신호전달 분자의 생성을 저해하여 피부세포의 사멸 및 홍반 생성을 억제하여 자외선에 의한 피부손상을 방지하는 활성을 가짐을 확인하였다.

자외선은 활성 산소종, 프리 라디칼 및 피부세포 손상을 촉진하는 다양한 세포 내 신호전달 분자의 생성을 유도함으로써 피부의 광노화, 색소 침착 및 홍반과 같은 다양한 피부손상을 유발한다.

자외선에 의해 활성 산소종이 과다하게 생성되는 경우, 세포 내의 단백질, 핵산 및 지방과 같은 생체고분자가 손상을 입게 된다. 특히, 자외선에 의해 과다 생성된 활성 산소종은 피부노화의 주 원인으로 알려져 있다.

한편, 피부에 자외선을 조사하면 피부세포 손상을 촉진하는 세포내 신호전달 분자의 생성이 유도된다. 상기 세포내 신호전달 분자로는 NF-kB, COX-2 및 인산화된 IκBα등이 있다.

상기 NF-κB(nuclear factor kappa B)는 포유류 핵 전사인자로서 세포사, 면역반응, 염증 반응 등 다양한 세포 반응 관련 유전자의 전사를 활성화하는 다중-소단위 복합체이다(Baeuerle et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 141-179, 1994; Baldwin, Ann. Rev. Immunol. 14, 649-683, 1996). NF-κB는 p50 서브유니트족(subunit family)과 p65 서브유니트족(subunit family)의 동형이량체(homodimer) 또는 이형이량체(heterodimer)로 구성되어 있으며 정상상태에서는 세포질에서 그 억제제인 IκB와 결합하고 있어 불활성화된 상태로 존재한다. 그러다가 항암제, 바이러스, 염증성 사이토카인(TNF-α, IL-1), 포르볼 에스테르, 박테리아 생성물(LPS) 및 산화적 스트레스 등의 다양한 자극에 의해 IκB 키나제로 알려진 IKK 단백질이 활성화되고 IκB가 인산화되어 분해됨으로서 NF-κB가 IκB로부터 유리되어 핵으로 들어가 전사인자로서의 기능을 하게 된다(P.A. Baeuerie and D. Baltimore, Cell 87, 13-20, 1996). NF-κB 활성화에 의하여 조절되는 유전자는 다수의 사이토카인(TNF, IL-1, IL-2, IL-6, IL iNOS), 케모카인(chemokines), 세포 부착 분자, 급성상(acute phase) 단백질, 면역조절 단백질, 아이코사노이드 대사 효소, 그리고 항-세포사멸(anti-apoptotic) 유전자가 있다. 상기 NF-κB의 활성화와 그것에 의한 유전자 발현은 노화, 암, 동맥경화증, 방사능에 의한 조직 손상, 바이러스성 복제, 급성염증상태, 조직이식 숙주반응, 독성/부패성 조직 손상 등을 포함하는 여러 가지 병리적인 상태와 관련이 있다. 특히, 자외선에 의해 NF-κB가 활성화되면 COX-2의 발현을 조절하여 프로스타글란딘과 같은 여러 면역활성을 가지는 매개물 또는 싸이토카인을 생성함으로써 피부손상을 야기한다.

상기 COX-2(cyclooxygenase-2)는 피부세포에서 자외선과 같은 외부 자극에 의해 대량으로 발현되는 효소로서, 세포막에 있는 아라키돈산을 프로스타글란딘으로 전환시켜 세포손상을 촉진한다. 특히, 이러한 COX-2와 프로스타글란딘은 피부 노화 및 피부의 암화(carcinogenesis)와 같은 피부 손상과 관련이 있다는 보고들이 있다.(Pentland A.P., Needleman P., J. Clin. Invest 77, 246-251, 1986; Dempke W. et al, J. Cancer Res. Clin. Oncol 127, 411-417, 2001).

정상상태에서 IκBα는 상기 NF-κB와 결합하여 NF-κB가 불활성화 상태로 존재하도록 한다. 자외선에 의해 상기 IκBα는 인산화되어 분해된다. IκBα가 분해되면 NF-κB가 활성화되어 핵 내로 이동하게 되고 DNA에 결합하여 여러 가지 유전자 발현을 조절하게 된다.

본 발명의 일 실시예에서는 진저롤이 인간 각질세포에서 자외선에 의한 활성산소종의 생성을 억제하는 활성이 있는지를 조사하였다(실시예 2 참조). 그 결과, 인간 각질세포에 자외선을 조사하기 전에 진저롤을 전처리하면 자외선에 의해 발생하는 세포내 활성산소종의 생성을 저해됨을 확인하였다(도 2 및 도 3 참조). 특히, 상기 진저롤은 유해한 자외선인 자외선 A 및 자외선 B에 의한 활성산소종 생성을 모두 억제하는 것으로 나타났다.

본 발명의 다른 실시예에서는 진저롤이 자외선에 의한 IκBα의 인산화, COX-2 및 NF-κB의 발현을 억제하는 효과가 있는지를 조사하였다(실시예 3 내지 5 참조). 실험 결과, 자외선을 조사하기 전 진저롤을 처리하면 자외선에 의한 IκBα의 인산화(도 4 참조), COX-2의 발현(도 5 참조) 및 NF-κB의 발현이 억제(도 6 참조)됨을 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명자들은 상기 실험 결과로부터 진저롤이 자외선에 의해 발생하는 활성 산소종 및 세포내 신호전달 분자의 생성을 저해함을 확인하였다.

나아가, 본 발명의 일 실시예에서는 진저롤이 자외선에 의해 발생하는 활성 산소종 및 세포내 신호전달 분자의 생성을 저해함으로써 자외선에 의한 피부세포의 사멸 및 홍반 생성을 억제할 수 있는지를 조사하였다(실시예 6 및 실시예 7 참조). 그 결과, 진저롤이 자외선에 의한 피부세포의 사멸을 억제하며(도 7a 및 도 7b 참조), 홍반 생성을 억제함을 확인할 수 있었다(도 8a 및 도 8b).

따라서, 본 발명자들은 진저롤이 자외선에 의해 발생하는 활성 산소종 및 세포내 신호전달 분자의 생성을 저해함으로써 자외선에 의한 피부세포의 사멸 및 홍반 생성을 억제하여 자외선으로부터 피부를 보호할 수 있는 활성이 있음을 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명은 진저롤을 유효성분으로 함유하는 자외선에 대한 피부 보호용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 화장료 조성물에 유효성분으로 함유되는 진저롤은 하기 화학식 I으로 표시되는 [6]-진저롤[5-hydroxy-1-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-3-decanone], [8]-진저롤[5-hydroxy-1-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-3-dodecanone] 및 [10]-진저롤[5-hydroxy-1-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-3-tetradecanone]로 이루어진 그룹 중에서 선택된 어느 하나일 수 있다.

화학식 I

상기에서 n은 4, 6 및 8로 이루어진 그룹 중에서 선택된 어느 하나의 정수이 다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 화장료 조성물의 유효성분인 진저롤은 상기 n이 4인 하기 화학식 Ⅱ로 표시되는 [6]-진저롤일 수 있다.

화학식 Ⅱ

상기 본 발명에 따른 화장료 조성물의 유효성분인 진저롤은 생강으로부터 분리 및 정제하거나 상업적으로 구입하여 사용할 수 있다.

진저롤을 생강으로부터 분리 및 정제하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면, 진저롤은 건조된 생강의 메탄올 추출물을 실리카겔에서 헥산/에틸아세테이트(2:1, v/v) 용매를 이용하여 TLC(thin-layer chromatography)함으로써 분리할 수 있다(Lee E.Y., Surh Y.J., Cancer letters, 134, 163-168, 1998; Kiuchi F. et al., Chem. Pharm. Bull., 40, 387-391, 1992; Denniff P.et al., J Chem Soc, Perkin Trans, 1, 82-87, 1981; Denniff P.et al., J Chem Soc Chem Commun, 18, 712-713, 1976; Tanaka M. et al., Jpn Kokai Tokyo Koho Vol. JP61137834 A2 19860625. Japan, 1986:10; Roufogalis BD. et al., PCT Int Appl CODEN: PIXXD2 WO9920589 A1 19990429 CAN 130: 325046 AN1999:282187,1999).

또한, 분리 및 정제된 형태의 진저롤을 와코 퓨어 케미칼(Wako pure chemicals), 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 글락소(Glaxo), 나카라이 테스퀴(Nacalai Tesque) 및 바이오몰 리서치 래버토리(BioMol Research Laboratories Inc) 사로부터 상업적으로 구입하여 사용할 수 있다. 상기 진저롤은 바람직하게는 순도가 95% 이상, 더욱 바람직하게는 98% 이상의 것을 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물 중에 진저롤의 함량은 0.00001∼10중량%, 바람직하게는 0.005∼5중량%, 더욱 바람직하게는 0.01∼1중량% 일 수 있다.

상기 화장료 조성물 중 진저롤이 0.00001중량% 미만으로 함유된 경우에는 기대하는 효과를 나타내기에 부족한 양이며 진저롤이 10중량%를 초과하여 함유된 경우에는 피부세포에 세포독성을 나타낼 수 있다.

한편, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 유효성분으로서 진저롤 이외에 화장품학 및/또는 피부학적으로 허용 가능한 부형제를 추가로 함유함으로써 당업계에 공지된 방법에 따라 국소 적용에 적합한 모든 형태의 제형으로 제조될 수 있다. 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 본 발명에 따른 화장료 조성물은 용액, 겔, 고체, 에멀전, 현탁액, 마이크로에멀전, 마이크로캡슐, 미세과립구, 이온형 및/또는 비이온형 소낭 분산제, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 스틱의 형 태로 제조될 수 있다.

상기 화장품학 및/또는 피부학적으로 허용가능한 부형제로는 피부 연화제, 유화제, 농후제 및 용매를 포함할 수 있다.

상기 피부 연화제는 피부의 연화, 진정, 코팅, 매끄럽게 하거나 또는 촉촉하게 하기 위해 사용한다. 본 발명에서 피부 연화제는 당업계에 공지된 모든 종류를 사용할 수 있으며 예를 들어, 석유 기제, 지방산 에스테르, 알킬 에톡실레이트, 지방산 에스테르 에톡실레이트, 지방 알코올, 폴리실록산 또는 이의 혼합물일 수 있다. 이외에 프로필렌 글리콜, 부틸렌 글리콜, 글리세린, 트리에틸렌 글리콜, 경랍, 왁스, 지방산, 지방 알코올 에테르, 글리세라이드, 아세토글리세라이드, 에톡실화 글리세라이드, 폴리하이드록시 알코올의 다른 지방산 에스테르, 라놀린 및 이의 유도체와 같은 통상적인 피부 연화제를 포함한다.

유화제는 화장료 조성물의 수상과 유상이 혼합되도록 하는 역할을 한다. 본 발명에서 유화제는 1종 이상을 임의로 함유할 수 있으며 비이온성, 음이온성 또는 양이온성을 모두 포함할 수 있다. 상기 유화제의 종류는 에멀전의 형태가 유중수 분산형인지 수중유 분산형인지에 따라 결정할 수 있다. 적합한 유화제의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 솔비탄 트리올레이트, 솔비탄 트리스테아레이트, 글리세롤 모노올레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 글리세롤 모노라우레이트, 솔비탄 세스퀴올레이트, 솔비탄 모노올레이트, 솔비탄 모노스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 스테알릴에테르, 폴리옥시에틸렌솔비톨 밀랍 유도체, PEG 200 디라우레이트, PEG 200 모노스테아레이트, PEG 400 디올레이트, 솔비칸 모노팔미테이트, 폴리옥시에틸 렌 모노스테아레이트 및 폴리옥시에틸렌 솔비탄 모노스테아레이트 등이 있다.

농후제는 가교된 카르복시폴리메틸렌 중합체, 에틸 셀룰로오스, 폴리에틸렌 글리콜, 트라칸트검, 카라야검, 산탄검, 벤토나이트, 히드록시에틸 셀룰로오스 및 히드록시프로필 셀룰로오스를 포함한다.

용매로는 정제수, 알코올 또는 정제수와 알코올의 혼합물을 사용할 수 있다.

기타 임의로 사용할 수 있는 일반적인 화장품 첨가제의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 파라-히드록시벤조에이트 에스테르와 같은 보존제, 부틸 히드록시 톨루엔, 아스코르브산 및 그 유도체 및 토코페롤 및 그 유도체와 같은 항산화제, 글리세롤, 솔비톨, 2-피롤리돈-5-카르복실레이트, 디부틸프탈레이트, 젤라틴, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 습윤제, 아세테이트, 인산염, 시트르산염, 트리에탄올아민 및 카르보네이트와 같은 pH 완충제, 밀랍, 파라핀과 같은 왁스류, 증점제, 활성 증강제, 착색제 및 향료가 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 진저롤을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물은 공지된 자외선 차단제 또는 자외선에 의한 피부손상 방지제 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 자외선에 노출되기 전 또는 후에 사용할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 자외선에 노출되기 전에 사용함으로써 자외선에 의한 피부세포손상을 예방할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

진저롤이 세포에 미치는 세포독성 조사

진저롤이 인간 각질세포에 대한 세포독성이 있는지를 MTT 세포 생존능력 분석방법으로 조사하였다. 이를 위해 먼저, 인간 각질 세포주 HaCaT(German Cancer Research, Germany의 prof. N. Fuseni로부터 제공받음)를 10% FBS(Hyclone)와 100nuit/ml 페니실린, 100㎍/ml 스트렙토마이신을 첨가한 DMEM 배지에 접종하고 37℃, 5% CO₂ 배양기(Forma)에서 배양하였다. 세포 배양 중의 생존율과 세포수는 혈구계(hematocytometer)를 이용하여 트립판 블루 익스클루전(trypan blue exclusion) 방법으로 주기적으로 측정하였다. 모든 실험에서 세포의 생존율은 95% 이상으로 유지시켰다.

상기에서 배양된 HaCaT 세포를 5×10⁴ cells/well의 농도로 96-웰 플레이트에 분주하고, 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 상기 세포에 0, 10, 30, 50, 100, 200, 300 μM의 다양한 농도의 [6]-진저롤(순도 > 98%, Wako Pure Chemicals)을 각 웰에 처리한 후, 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 배양이 완료된 후, 배지가 있는 상태에서 각 웰에 5mg/ml의 MTT 시약을 20㎕/100ml의 농도로 첨가하고 배양기에서 2시간 배양하였다. 2시간 후, 배양액을 제거하고 각 웰에 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 150㎕씩 첨가하고, 스펙트로포토미터(spectrophotometer)를 사용하여 540nm에서 흡광도를 측정함으로써 세포생존능력을 분석하였다. 이때, 세포생존능력은 [6]-진저롤을 처리하지 않은 대조군의 세포생존능력을 100%로 하고 이에 대한 상대적인 값으로 나타내었다.

실험 결과, [6]-진저롤의 처리 농도가 증가할수록 세포생존능력이 감소하는 것으로 나타났다. 한편, [6]-진저롤을 30μM 농도까지 처리한 경우에는 세포 독성이 전혀 나타나지 않았다(도 1).

상기 결과로부터 인간 각질세포에 처리할 수 있는 [6]-진저롤의 바람직한 농도범위가 30μM이하 임을 알 수 있었다.

<실시예 2>

진저롤의 자외선에 의한 활성산소 생성 억제 효과

<2-1> 진저롤의 자외선 B에 의한 활성산소 생성 억제 효과

진저롤이 인간 각질세포에서 자외선 B에 의한 활성산소 생성을 억제하는 효과가 있는지를 조사하였다. 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 배양된 HaCaT 세포를 3×10⁵cells/well의 농도로 6웰 플레이트에 분주하였다. 12시간 정도의 혈청 기아(serum starvation)를 준 후, 30분 동안 [6]-진저롤(순도 > 98%, Wako Pure Chemicals) 30μM을 전처리하고 자외선 B를 100 J/m²로 조사하였다. 자외선을 조사한 지 3시간 후에, 각각의 플레이트에 10μM의 형광 색소 H₂DCFDA(2',7' -dichlorodihydrofluorescein diacetate)를 첨가하고 37℃에서 30분간 배양기에서 반응하였다. 반응이 완료된 직후, DCF 형광을 레이져 스캐닝 공초점 현미경(laser scanning confocal microscope)으로 관찰하였다. 이때 상기 실험군의 비교를 위해 자외선과 진저롤을 모두 처리하지 않은 세포(무처리군), 자외선만 조사한 세포(자외선 단독 처리군), [6]-진저롤만 처리하고 자외선을 처리하지 않은 세포(진저롤 단독 처리군)를 동일한 방법으로 반응시킨 후 관찰하였다. 상기 H₂DCFDA는 세포내로 들어가서 프리 라디칼들에 의해 산화되면 DA(diacetate)가 떨어지고 DCF(2',7' -dichlorodihydrofluorescein)가 되어 높은 형광을 나타낸다. 레이져 스캐닝 공초점 현미경 상에서 상기 형광은 녹색으로 관찰된다.

실험 결과, 자외선 B만 조사한 세포(자외선 단독 처리군)(도 2의 B)에서는 자외선 B를 조사하지 않은 세포(무처리군)(도 2의 A)에 비해 활성산소의 양이 상당히 많이 증가한 것을 확인할 수 있었다. 한편, 자외선 B을 조사하기 전에 [6]-진저롤을 전처리한 세포(실험군)(도 2의 D)의 경우에는 활성산소의 양이 현저히 감소한 것으로 나타났다. 따라서 [6]-진저롤이 자외선 B에 의해 발생하는 세포내 활성산소의 생성을 저해하는 활성을 가지고 있음을 확인할 수 있었다.

<2-2> 진저롤의 자외선 A에 의한 활성산소 생성 억제 효과

상기 실시예 1과 동일한 방법으로 배양된 HaCaT 세포를 100 mm 플레이트에 분주하였다. 12시간 정도의 혈청기아(serum starvation)를 준 후, 세포의 밀도가 80% 정도 되었을 때 30분 동안 [6]-진저롤을 각각 30 μM 및 50 μM씩 전처리하고 자외선 A를 각각 10 J/m² 또는 20 J/m²씩 조사하였다(실험군 1 내지 실험군 4). 자외선을 조사한 지 3시간 후에, 각각의 플레이트에 형광색소 H₂DCFDA를 10 μM의 농도로 첨가하고 37℃에서 30분간 반응시켰다. 반응이 완료된 후 트립신-EDTA를 이용하여 세포를 플레이트로부터 분리한 후 PBS 버퍼로 2회 세척하고 FACS 스캔(Becton Dickinson) 분석기로 분석하였다. 이때, 상기 실험군과의 비교를 위해 자외선 A와 진저롤을 모두 처리하지 않은 세포(무처리군), 자외선 A만 10 J/m²으로 조사한 세포(자외선 단독 처리군 1), 자외선 A만 20 J/m²으로 조사한 세포(자외선 단독 처리군 2) 및 진저롤만 50 μM 농도로 처리한 세포(진저롤 단독 처리군)를 상기와 동일한 방법으로 반응시킨 후 FACS 스캔 분석기로 분석하였다. 자외선 A에 의해 세포 내 활성산소(ROS)가 증가하게 되면 그래프는 오른쪽으로 이동(Shift)하게 되며, 그 값을 M1으로 표시하였다. 상기 형광색소인 H2DCFDA는 세포내로 들어가서 활성산소에 의해 산화되면 DA(diacetate)가 떨어지고 DCF(2',7' -dichlorodihydrofluorescein)가 되어 높은 형광을 나타낸다. 상기 형광의 정도는 평균값(Mean)으로 표시하였다.

실험 결과, 자외선 A를 조사한 세포(자외선 단독 처리군 1 및 2)는 자외선을 조사하지 않은 세포(무처리군)에 비해 활성산소의 양이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 한편, 자외선을 조사하기 전에 [6]-진저롤을 처리한 세포의 경우에는 활성산소의 양이 감소하는 것을 확인할 수 있었으며 특히, 진저롤의 처리 농도가 증가할 수록 활성산소의 생성이 더욱 저해됨을 확인할 수 있었다(도 3).

<실시예 3>

진저롤의 자외선에 의한 IκBα 인산화 억제 효과

인간 각질세포에 진저롤을 전처리한 후 자외선을 조사하고 상기 진저롤의 전 처리가 자외선에 의해 유도된 IκBα인산화를 억제하는 효과가 있는지 조사하였다.

상기 실시예 1과 동일한 방법으로 배양한 인간 각질 세포주인 HaCaT 세포를 3×10⁵cells/well의 농도로 6웰 플레이트에 분주하였다. 12시간 정도의 혈청 기아(serum starvation)를 준 후, 30분 동안 아세톤으로 희석한 [6]-진저롤 30 μM을 전 처리하고 자외선 B를 100 J/m²로 조사하였다. 자외선 조사 후 4시간과 5시간에 각질세포로부터 단백질을 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 분리하고 IκBα(Ser-32)의 항체(Santa Cruz, CA, USA)를 사용하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 이 때, 상기 실험군과의 비교를 위해 자외선이나 진저롤을 모두 처리하지 않은 경우(무처리군), 아세톤을 처리하고 자외선을 조사한 경우(자외선 단독 처리군) 및 진저롤만 처리한 경우(진저롤 단독 처리군)의 각질세포로부터 단백질을 분리하고 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 로딩 대조군으로는 액틴을 사용하였다. IκBα인산화의 상대적 강도는 자외선이나 진저롤을 모두 처리하지 않은 경우(무처리군)와 비교하여 나타내었으며 3회 동일한 실험을 반복하여 평균치로 나타내었다(^* P<0.05).

실험 결과, 각질세포에 아세톤을 처리한 후 자외선을 조사하면(자외선 단독 처리군) IκBα의 인산화가 증가됨을 확인할 수 있었다. 한편, [6]-진저롤을 처리한 후 자외선을 조사하는 경우(실험군)에는 자외선에 의한 IκBα의 인산화가 억제됨을 확인할 수 있었다. 상기 진저롤에 의한 IκBα의 인산화 억제는 시간이 경과될수록 더 높게 나타났다. 즉, [6]-진저롤을 처리한 다음 자외선을 조사한 지 4시간째 보다는 5시간째에 자외선에 의한 IκBα의 인산화가 더 많이 감소 되는 것으로 나타났다(도 4).

<실시예 4>

마우스 모델에서 진저롤의 자외선에 의한 COX-2 발현 억제 효과

<4-1> 자외선에 의한 COX-2 mRNA의 발현 억제

무모 마우스 동물 모델로부터 자외선에 의해 유도되는 COX-2 mRNA 발현에 미치는 진저롤의 효과를 조사하였다. 10주령의 수컷 마우스를 각 그룹 당 3마리로 분류하고 한 그룹에는 자외선과 진저롤을 모두 처리하지 않았으며(무처리군) 다른 그룹에는 아세톤을 처리한 후 자외선을 조사하였다(자외선 단독 처리군). 나머지 한 그룹에는 진저롤을 처리한 후 자외선을 처리하였다(실험군). 보다 구체적으로 진저롤 처리 그룹에는 아세톤으로 희석한 [6]-진저롤(30μM)을 자외선 조사 30분 전에 100㎕씩 두 번(총 200㎕) 마우스 등 피부에 도포하였다. 30분 후에 자외선 B 조사장치(FS24T12/UVB/HO, Voltare Co., Fairfield, CT, USA, 290-320nm)를 이용하여 자외선을 300mJ/m²의 강도로 마우스의 등 피부에 조사하였다. 조사부위는 1×1 cm²이였다. 이때, 자외선 단독 처리군에는 진저롤을 대신하여 아세톤을 동일한 양으로 처리하였다. 자외선 조사 후 12 시간과 16 시간 후에 각각의 동물의 등으로부터 피부를 적출하였다. 적출한 조직을 막자사발로 분쇄하고 트라이졸(Trizol)을 이용하여 총 RNA를 분리한 다음 RT-PCR을 수행함으로써 COX-2 mRNA의 발현 양상을 분석하였다.

RT-PCR은 다음과 같은 방법으로 수행하였다. 상기에서 수득한 총 RNA(5 ㎍)와 50U 스트라타스크립트(StrataScript) 역전사효소 및 올리고(dT) 프라이머를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 상기에서 합성한 cDNA를 주형으로 하고 하기의 마우스 COX-2 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다.

마우스 COX-2 정방향 프라이머(서열번호 1)

5'-AAAACCGTGGGGAATGTATGAGC-3'

마우스 COX-2 역방향 프라이머(서열번호 2)

5'-GATGGGTGAAGTGCTGGGCAAAG-3'

PCR 증폭은 94℃에서 30초 동안 DNA 변성, 60℃에서 40초 동안 프라이머 어닐링 및 72℃에서 1분 동안 DNA 신장을 한 25 사이클(cycle)로 하여 총 30회 반복 수행하였다. 내부 대조군으로는 GAPDH를 사용하였다.

실험 결과, 자외선을 조사 하면(자외선 단독 처리군) COX-2 mRNA 발현이 증가하는 것으로 나타났으며 시간의 경과에 따라 COX-2 mRNA의 발현 정도가 증가하는 것으로 나타났다. 즉, 자외선 조사 후 12시간째에 비해 16시간째의 COX-2 mRNA가 보다 많이 발현되는 것으로 나타났다. 한편, 이러한 COX-2 mRNA의 발현은 [6]-진저롤의 처리에 의해 억제되는 것으로 나타났다(도 5a).

<4-2> 자외선에 의한 COX-2 단백질 발현 억제

상기 실시예 <4-1>과 동일한 방법으로 누드 마우스에 [6]-진저롤을 처리하고 자외선 B 조사 12시간 및 16시간 후에 등 피부로부터 조직을 적출하였다. 상기 적출한 조직을 막자사발로 분쇄하고 RIPA 버퍼[12mM EDTA, 137mM NaCl, 20mM Tris- HCl(pH 8.0), 1mM Na₃VO₄(Sigma-Aldrich, USA) 10mM NaF(Sigma), 1mM PMSF(Sigma), 1% Triton X-100, 10% 글리세롤, 프로테아제 억제 칵테일(Roche,Germany)]를 이용하여 용해(lysis)하였다. 용해액을 1.5ml 튜브에 넣고 피펫팅한 다음, 얼음위에서 20분간 방치하였다. 이를 14000rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 회수하여 단백질을 분리하였다. 분리한 단백질은 BCA 단백질 분석 키트(Pierce, Rockford, Illinois)를 사용하여 각각의 샘플 농도를 결정하고 전기영동(SDS-PAGE)하였다. 상기 분리된 단백질을 이용하여 웨스턴 블롯 분석을 수행함으로써 COX-2 단백질의 발현 양상을 조사하였다. 로딩 대조군으로는 액틴을 사용하였다.

즉, 전기영동이 완료된 단백질을 PVDF 멤브레인으로 옮긴 후, 상기 멤브레인을 상온에서 2시간 동안 3% BSA 용액(Amresco,USA)으로 블럭킹(blocking) 하고, 1차 항체로서 항-COX-2 항체(Santa Cruz, CA, USA)를 처리하여 2시간 동안 상온에서 반응시켰다. 1차 항체와의 반응이 완료되면 약 15분 동안 세척하고 다시 45분간 2차 항체(bovine anti-goat lgG-HRP, Santa Cruz, CA, USA)를 처리하여 반응시켰다. 반응 후에 30분 이상 충분히 세척한 후 ECL 검출 키트(Santa Cruz Biotechnology)을 사용하여 밴드를 확인하였다.

실험 결과, 상기 실시예 <4-1>의 COX-2 mRNA 발현과 동일한 패턴으로 자외선 조사 후 12시간째에 비해 16시간에서 COX-2 단백질 발현이 증가하는 것으로 나타났다. 또한 이러한 COX-2 단백질의 발현은 [6]-진저롤의 처리에 의해 감소되는 것으 로 나타났다(도 5b).

<4-3> 자외선에 의한 COX-2 발현의 조직학적 분석

상기 실시예 <4-1>과 동일한 방법으로 무모 마우스의 등 피부에 [6]-진저롤을 도포하고 자외선 B를 조사한 후 각각의 동물의 등으로부터 피부를 적출하였다. 적출한 조직을 4% 포르말린(formalin) 용액에 16시간 이상 침지시킨 후 파라핀에 포매(embeding)하여, 5 ㎛의 두께로 조직 절편을 제조하였다. 상기 조직을 디파라핀(deparaffin)하고 조직의 침투화를 용이하게 하기 위해 3% 과산화수소로 상온에서 20분간 반응시킨 다음 블록킹 버퍼(3% BSA, 0.2% Triton X-100)로 2시간동안 상온에서 반응시켰다. 다음은 1차 항체로서 COX-2 항체(Santa Cruz, CA, USA)를 첨가하여 4℃에서 16시간 반응하였다. 이후 바이오틴이 부착된(biotinylated) 2차 항체를 반응시키고 퍼옥시다제로 표지된 스트렙타비딘(streptavidin, DAKO)으로 차례로 반응시켰다. 상기 반응은 자외선을 조사한 지 16시간이 되었을 때 DAB 기질 색원체 시스템(substrate chromogen system, DAKO)을 이용하여 관찰하였다. 상기 시스템에서 COX-2 양성 세포는 갈색으로 나타난다.

실험 결과, 자외선을 조사한 조직(자외선 단독 처리군)의 경우 자외선을 조사하지 않은 조직(무처리군)에 비해 COX-2 양성 세포가 상당히 많이 증가된 것으로 나타났다. 한편, [6]-진저롤을 처리한 후 자외선을 조사한 경우(실험군)에는 COX-2 양성 세포가 현저히 감소함을 확인하였다(도 5c).

상기 실험 결과로부터, 진저롤은 자외선에 의한 COX-2 발현을 저해함을 확인하였다.

<실시예 5>

마우스 모델에서 진저롤의 자외선에 의한 NF -κB p65 발현 억제 효과

상기 실시예 <4-1>과 동일한 방법으로 무모 마우스의 등 피부에 진저롤을 도포한 후 자외선 B를 조사하고 6시간 후에 마우스의 등 피부를 적출하였다. NF-κB p65의 발현을 측정하기 위하여 상기 실시예 <4-3>과 동일한 방법으로 면역염색을 수행하되 1차 항체로서 NF-κB p65 항체(Santa Cruz, CA, USA)를 사용하였다. NF-κB p65 양성 세포는 갈색을 나타내며, NF-κB p65가 핵 내로 이동된 세포는 붉은색을 나타낸다.

실험 결과, 자외선을 조사하지 않은 군(무처리군)에 비해 자외선 조사한 조직(자외선 단독 처리군)에서는 NF-κB p65 양성 세포와 NF-κB p65의 핵 내로의 이동이 상당히 많이 증가됨을 확인하였다. 한편, [6]-진저롤을 처리한 후 자외선을 조사한 경우에는 NF-κB p65 양성 세포와 NF-κB p65의 핵 내로의 이동이 현저히 감소함을 확인하였다(도 6).

따라서, 진저롤은 자외선에 의한 NF-κB p65 발현을 저해함을 확인하였다. 한편, NF-κB의 활성 형태(active form)는 p50과 p65로 구성된 이형이량체 (heterodimer)인데 그 중에서도 기능적으로 주요한 역할을 하는 서브유닛은 p65로 알려져 있다. 따라서, 진저롤의 자외선에 의한 NF-κB p65의 발현 저해는 궁극적으로 NF-κB를 억제하는 활성을 가지는 것으로 볼 수 있다.

<실시예 6>

진저롤의 자외선에 의한 피부세포의 사멸 억제 효과

진저롤이 자외선에 의한 활성 산소종 생성 및 세포내 신호전달 분자의 생성을 저해하므로 자외선에 의한 피부세포의 사멸을 억제하는 효과가 있는지 확인하였다. 이를 위해, 인간 각질세포에 진저롤을 처리한 후 자외선 B를 100 J/m²로 조사하고 상기 진저롤의 처리가 자외선에 의해 유도되는 세포사 관련 신호 기전들인 Fas(CD95), 카스파제-8, 카스파제-3(A), 카스파제-9, Bcl-2 및 Bax(B)의 발현에 미치는 효과를 조사하였다.

상기 실시예 1과 동일한 방법으로 배양한 인간 각질 세포주인 HaCaT 세포를 3×10⁵cells/well의 농도로 6웰 플레이트에 분주하였다. 12시간 정도의 혈청 기아(serum starvation)를 준 후, 30분 동안 [6]-진저롤 30μM을 전 처리하고 자외선 B를 100 J/m²로 조사하였다. 자외선 조사 후 24시간 뒤에 상기 세포로부터 RIPA 버퍼[12mM EDTA, 137mM NaCl, 20mM Tris-HCl(pH 8.0), 1mM Na₃VO₄(Sigma-Aldrich, USA) 10mM NaF(Sigma), 1mM PMSF(Sigma), 1% Triton X-100, 10% 글리세롤, 프로테아제 억제 칵테일(Roche,Germany)]를 이용하여 세포를 용해(lysis)하였다. 용해된 세포를 1.5ml 튜브에 넣고 피펫팅한 다음, 얼음위에서 20분간 방치하였다. 이를 14000rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 회수하여 단백질을 분리하였다. 분리한 단백질은 BCA 단백질 분석 키트(Pierce, Rockford, Illinois)를 사용하여 각각의 샘플 농도를 결정하고 전기영동(SDS-PAGE)하였다. 상기 분리된 단백질을 이용하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 즉, 샘플의 전기영동이 끝나면 젤에서 폴리비닐리덴 플루오라이드 멤브레인(Polyvinylidene Fluoride membrane, Pall Corporation)으로 단백질을 트랜스퍼 한 후, 상기 멤브레인을 상온에서 2시간 동안 3% BSA 용액(Amresco,USA)으로 블럭킹(blocking) 하고, 1차 항체를 처리하여 2시간 동안 상온에서 반응시켰다. 상기 1차 항체로는 세포사 관련 신호 기전들에 대한 항체인 항-카스파제-3 항체, 항-카스파제-8 항체, 항-Bcl-2 항체, 항-Bax 항체를 셀 시그날링 테크놀러지사(Cell Signaling Technology, Beverly, MA)로부터 구입하여 사용하였고, 항-카스파제-9 항체 및 항-Fas 항체를 업스테이트(Upstate, NY)사로부터 구입하여 사용하였다. 일차 항체와의 반응이 완료되면 약 15분 동안 세척하고 다시 45분간 2차 항체를 처리하여 반응시켰다. 반응 후에 30분 이상 충분히 세척한 후 ECL 검출 키트(Santa Cruz Biotechnology)을 사용하여 밴드를 확인하였다. 이때 상기 실험군과의 비교를 위해 자외선과 진저롤을 처리하지 않은 세포(무처리군), 자외선만 조사한 세포(자외선 단독 처리군), [6]-진저롤만 처리하고 자외선을 조사하지 않은 세포(진저롤 단독 처리군)로부터 상기와 동일한 방법으로 단백 질을 분리하고 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다.

실험 결과, 자외선만 조사한 경우(자외선 단독 처리군) 자외선에 의해 Fas 발현이 증가된 것으로 나타났다. 반면, [6]-진저롤은 전처리한 후 자외선을 조사한 경우(실험군)에는 자외선 단독 처리군에 비해 Fas의 발현이 감소된 것으로 나타났다.

Fas의 하위 신호 기전인 카스파제-8(caspase-8)의 경우 자외선 조사에 의해 카스파제-8이 절단(cleavage)되어 활성화됨을 확인할 수 있었다. 한편, [6]-진저롤을 전처리한 후 자외선을 조사한 경우에는 상기 [6]-진저롤이 카스파제-8의 절단을 억제함으로써 카스파제-8의 활성화를 저해하는 것으로 나타났다.

나아가, [6]-진저롤은 카스파제-3의 절단도 억제함으로써 카스파제-3의 활성화를 저해하는 것으로 나타났다(도 7a).

카스파제-9의 경우에도 [6]-진저롤이 자외선에 의한 카스파제-9의 절단을 억제하여 활성화를 저해하는 것으로 나타났다. 한편, [6]-진저롤은 Bcl-2 및 Bax를 포함하는 Bcl 계열의 발현에는 영향을 주지 않았다(도 7b).

상기 실험 결과로부터 진저롤이 인간 각질세포에서 자외선에 의한 Fas, 카스파제-8, 카스파제-9 및 카스파제-3 등과 같은 세포사 관련 신호들의 활성화를 감소시키므로 피부세포의 사멸을 저해함으로써 자외선으로부터 피부를 보호하는 활성이 있음을 확인하였다.

<실시예 7>

마우스 모델에서 진저롤의 자외선에 의한 홍반 생성 억제 효과

진저롤이 자외선에 의한 활성 산소종 생성 및 세포내 신호전달 분자의 생성을 저해하므로 자외선에 의한 홍반 생성을 억제하는 효과가 있는지 확인하였다.

이를 위해, 10주령의 수컷 무모 마우스를 각 그룹 당 3마리로 분류하고 한 그룹에는 아세톤을 마우스의 등 피부에 도포한 30분 후에 자외선을 조사하였고(자외선 및 아세톤 처리군) 다른 그룹에는 아세톤에 희석한 진저롤을 마우스의 등 피부에 도포한 후 자외선을 처리하였다(실험군). 보다 구체적으로 실험군에는 아세톤에 희석한 [6]-진저롤(30μM)을 자외선 조사 30분 전에 100㎕씩을 마우스 등 피부에 도포하였다. 30분 후에 자외선 B 조사장치(FS24T12/UVB/HO, Voltare Co., Fairfield, CT, USA, 290-320nm)를 이용하여 자외선 B를 200mJ/cm²의 강도로 100초간 조사하였다. 또는 자외선의 강도를 300mJ/cm²로 하여 140초간 마우스의 등 피부에 조사하였다. 조사부위는 1×1cm²가 되도록 하였다. 자외선을 조사한 지 48시간 후에 홍반생성 정도를 육안으로 관찰한 후 홍반생성의 정도는 크로마미터(Chromameter)를 이용하여 a^*컬러 파라미터를 측정하였다. 상기 a^* 컬러 파라미터는 녹색에서 붉은색으로의 값을 나타내는 것으로 음의 값은 녹색을 양의 값은 붉 은색을 나타낸다.

실험 결과, 진저롤의 전처리가 마우스에서 자외선에 의해 유도되는 홍반 생성을 억제함을 육안관찰에 의해 확인할 수 있었다(도 8a). 또한, 홍반 생성 정도를 크로마미터로 측정한 결과, 진저롤을 처리한 경우가 아세톤을 처리한 경우에 비해 a* 컬러 파라미터가 낮은 것으로 나타났다(도 8b). 이로부터 진저롤의 처리가 자외선에 의한 마우스 피부에서의 홍반 생성을 감소시킴을 확인할 수 있었다.

<제조예 1>

본 발명에 따른 진저롤을 유효성분으로 함유한 크림의 제조

[6]-진저롤을 함유하는 영양 크림을 하기 표 1에 나타낸 바와 같은 성분과 함량을 사용하여 제조하였다. 먼저, 수상인 정제수, 트리 에탄올 아민, 프로필렌 글리콜을 70℃로 가열 용해하였다. 여기에 유상인 지방산, 유성성분, 유화제 및 방부제를 70℃로 가열 용해한 액을 첨가하여 유화시켰다. 유화가 완료되면 상기 용액을 45℃로 냉각시킨 후 [6]-진저롤(순도 > 98%, Wako Pure Chemicals)과 향을 첨가하고 분산시킨 다음 30℃로 냉각하였다.

진저롤을 함유한 영양크림의 성분 및 함량

성분	함량(중량%)
[6]-진저롤(순도 > 98%, Wako Pure Chemicals)	0.5
호호바오일	5.0
유동 파라핀	7.0
세틸아릴 알코올	2.0
폴리글리세릴-3 메틸 글루코스 디스테아레이트	2.0
글리세릴 스테아레이트	0.5
스쿠알렌	3.0
프로필렌 글리콜	4.0
글리세린	5.0
트리에탄올 아민	0.3
카르복시 비닐 폴리머	0.3
토코페릴 아세테이트	0.2
방부제	미량
향	미량
정제수	잔량
합계	100

<제조예 2>

진저롤을 함유한 로션의 제조예는 하기 표 2에 나타낸 바와 같다. 수상인 정제수, 트리에탄올 아민, 부틸렌 글리콜을 70℃로 가열 용해하였다. 여기에 유상인 지방산, 유성성분, 유화제 및 방부제를 첨가하여 유화하였다. 유화가 완료되면 친수성 증점제인 잔탄검 2% 용액을 전체에 대해 0.05중량%가 되도록 첨가하였다. 상기 용액을 45℃로 냉각시킨 후 [6]-진저롤, 향 및 색소를 첨가하여 혼합하고 30℃로 냉각하였다.

진저롤을 함유한 로션의 성분 및 함량

성분	함량(중량%)
[6]-진저롤(순도 > 98%, Wako Pure Chemicals)	0.1
글리세린	3.0
카보머	0.1
잔탄검	0.05
1,3-부틸렌 글리콜	3.0
폴리글리세린-3 메틸글루코스 디스테아레이트	1.5
글리세린 스테아레이트	0.5
세테아릴 알코올	0.3
호호바 오일	3.0
유동 파라핀	2.0
스쿠알렌	3.0
디메치코	0.5
토코페릴아세테이트	0.2
트리에탄올아민	0.1
방부제	미량
향	미량
색소	미량
정제수	잔량
합계	100

이상 상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 진저롤을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물은 자외선에 의한 활성산소종 생성 및 세포내 신호전달 분자의 생성을 억제함으로써 자외선에 의한 피부세포의 사멸 및 홍반 생성을 억제하여 자외선으로부터 피부를 보호할 수 있는 효과가 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

하기 화학식 I으로 표시되는 진저롤을 유효성분으로 함유하는 자외선에 대한 피부 보호용 화장료 조성물.

화학식 I

상기 식에서 n은 4, 6 및 8로 이루어진 그룹 중에서 선택된 어느 하나의 정수이다.
제1항에 있어서, 상기 n이 4인 하기 화학식 Ⅱ로 표시되는 [6]-진저롤임을 특징으로 하는 화장료 조성물.

화학식 Ⅱ
제1항에 있어서, 상기 진저롤이 0.00001∼10중량%의 함량으로 함유되어 있음을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 자외선에 대한 피부 보호가 자외선에 의한 활성산소종 생성; 및 핵 인자 카파 B(nuclear factor kappa B; NF-kB), 싸이클로 옥시제나제-2(cyclo oxygenase-2; COX-2) 및 인산화된 억제제-카파 B 알파(inhibitor-kappa B alpha; IκBα)로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 것의 생성을 저해하여 피부의 세포사멸 및 홍반 생성을 억제하는 것에 의해 이루어지는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
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