KR101413528B1 - ６―진저롤을 포함하는 면역 증강용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 6―진저롤을 포함하는 면역 증강용 조성물에 관한 것으로, CD4 T세포, CD8 T세포, B세포 등의 면역세포의 증진 및 IFN―γ, IL―6 및 MCP―1 등 사이토카인의 분비의 증가를 통해 면역력을 증가시켜 항종양, 항균 등의 효과를 가져 면역 증강용 건강식품, 항암 보조제 등으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

６―진저롤을 포함하는 면역 증강용 조성물{COMPOSITION COMPRISING ６―GINGEROL HAVING IMMUNE ENHANCEMENT ACTIVITY}

본 발명은 6―진저롤을 포함하는 면역 증강용 조성물에 관한 것이다.

전 세계적으로 가장 많은 사망 원인의 두 가지는 아마도 암과 세균 질환으로 사료된다. 이에 따라 해마다 많은 항암제와 항생제가 개발되고 있다. 그런데 이러한 항암제와 항생제는 언제나 양면성이 있다. 항암제는 암 만을 죽이는 것이 아니라 정상세포도 죽이기 때문에 체중저하, 탈모, 구토, 면역세포 감소 등 많은 부작용을 수반한다는 것은 널리 알려져 있다. 또한 항암제 투여에 의한 면역세포 감소로 인해 세균 질환에 더욱 약할 수밖에 없고, 실제로 암환자가 암으로 죽기 보다는 세균 질환으로 죽는 경우도 많다. 또한 이러한 항암제나 항생제에 대해 암세포나 세균은 내성을 획득하고 있다는 것이 더욱 어려운 현실이다. 특히, 항생제의 무분별한 남용으로 인해 약제 내성균이 증가하고 있다.

이에 따라, 암이나 세균의 감염으로부터 보호를 위해 부작용을 최소화할 수 있도록 식품의 성분 등 부작용이 적은 성분을 이용한 면역력 증강을 통해 항암, 항균 등의 효과를 갖는 조성물의 개발이 요청되고 있다.

본 발명의 일 목적은 6―진저롤(6―gingerol)을 포함하는 면역 증강용 조성물을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 다른 목적은 6―진저롤(6―gingerol)을 포함하는 면역 증강용 건강식품을 제공하는 데에 있다.

본 발명자들은 생강 추출물의 주성분 중 하나인 6―진저롤이 면역세포에 미치는 영향을 암 모델과 세균 모델의 두 가지 모델로 실험하여, 6―진저롤이 CD4 T세포, CD8 T세포, B세포 등의 면역세포의 증진 및 IFN―γ, IL―6 및 MCP―1 등 사이토카인의 분비의 증가를 통해 면역력을 증가시킨다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 6―진저롤(gingerol)을 포함하는 면역 증강용 조성물을 제공한다.

6―진저롤(gingerol)은 화학식 1의 화합물로서, 생강 추출물의 주성분 중 하나이다.

[화학식 1]

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 화학식 1의 6―진저롤(6―gingerol)은 신장암, 흑색종양 및 대장암 등에서 면역세포 증진 촉진 또는 면역세포의 사이토카인 분비능 향상을 통해 암세포의 발생 및 성장을 저해할 수 있다. 또한, 상기 화학식 1의 6―진저롤(6―gingerol)은 면역력 증가시켜 항균력을 증가시킬 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 면역 증강은 면역세포 증진 촉진 또는 면역세포의 사이토카인 분비능 향상을 통해 이루어질 수 있다.

상기 면역세포는 CD4 T세포, CD8 T세포, B세포, 수지상세포 등을 포함하며, 사이토카인은 인터류킨(interleukin; IL), MCP―1(monocyte chemoattractant protein―1), IFN―γ(interferon regulatory factor―γ) 등을 포함한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 면역세포 증진 촉진은 CD4 T세포, CD8 T세포 및 B세포의 증가를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 사이토카인은 IFN―γ, IL―6 및 MCP―1를 포함할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 6―진저롤(gingerol)은 산제, 정제, 캡슐제, 주사제, 에어로졸 및 주사제로 이루어진 군에서 선택된 하나의 제형으로 제형화 될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 조성물은 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용가능한 담체, 부형제 또는 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등을 들 수 있다.

상기 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 흡입제, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물은 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로즈 또는 락토즈, 젤라틴 등을 섞어 조제한다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다.

경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

주사제의 구체예로서, 글루코스 주사, 자일리톨 주사, D―만니톨 주사, 프룩토스 주사, 생리식염수, 덱스트란 40 주사, 덱스트란 70 주사, 아미노산 주사, 링거액, 락트산―링거액 등이 포함될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물인 액상 또는 분말상의 조성물은 유효성분인 6―진저롤에 용제, 기제, 희석제, 충전제, 증량제 등의 액상 또는 분말상의 조성물의 형태를 부여하는 부형제; 용해 보조제, 가용화제, 완충제, 등장화제, 유화제, 계면활성제, 안정화제, 현탁화제, 분산제, 증점제, 활택제, 결합제, 부착 방지제, 분무제 등의 액상 또는 분말상의 형태가 유지되는 것을 돕는 기능을 가지는 보조제; 보존제, 살균제, 방부제, 감미제, 향미제, 방향제, 착색제, 항산화제 등의 사용상의 성질을 개선하는 목적으로 첨가되는 첨가제 등을 필요하게 따라 함유시키고, 통상의 방법에 따라 경비 투여 제제 또는 경구 흡입 투여 제제로서 제조될 수 있다.

상기 조성물의 유효성분인 6―진저롤의 면역증강효과를 위한 유효량은 개인의 연령, 성별, 질환의 정도에 따라서 다르지만, 통상 0.1㎎/㎏ ~ 10.0㎎/㎏의 양을 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있다.

사용된 6―진저롤의 활성, 성별, 투여 시간, 투여 경로, 치료 기간 및 횟수 등에 따라 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서 상기 투여량은 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 6―진저롤(gingerol)을 포함하는 면역 증강용 건강식품을 제공한다.

6―진저롤(gingerol)은 화학식 1의 화합물로서, 생강 추출물의 주성분 중 하나이다.

상기 건강식품은 건강기능식품 또는 건강음료의 형태로 제공될 수 있으며, 기능성 음료, 환제, 정제 또는 상기 성분을 건조 분말화하여 충진한 연질 또는 경질 캡슐제의 형태로 이용하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 6―진저롤를 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어 각종 식품류, 캔디, 초코릿, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 각종 건강보조 식품류 등이 있고 분말, 과립, 정제, 환제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.

상기 건강식품은 식품학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 일 실시예로서, 본 발명의 건강식품이 음료인 경우에는 지시된 비율로 필수 성분으로서 6―진저롤를 함유하는 것 이외에는 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 이때, 천연 탄수화물의 예로는 모노사카라이드, 예를 들어 포도당, 과당, 디사카라이드, 예를 들어 말토즈, 수크로즈, 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당 알코올을 들 수 있다. 또, 상기 향미제로는 천연향미제, 예를 들어, 타우마틴, 스테비아 추출물, 헤바우디오시드 A, 글리시르히진과 합성 향미제 예를들어 사카린, 아스파르탐 등을 사용할 수 있다.

상기 음료 외에 본 발명의 건강식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물, 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제, 증진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.

상기 건강식품에 함유된 6―진저롤의 유효 용량은 상기 조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 특정농도 이상의 고농도로 사용하지 않는 이상 안전성 면에서 문제되지 않을 것이다.

본 발명에 따른 6―진저롤을 포함하는 면역 증강용 조성물은 CD4 T세포, CD8 T세포, B세포 등의 면역세포의 증진 및 IFN―γ, IL―6 및 MCP―1 등 사이토카인의 분비의 증가를 통해 면역력을 증가시켜 항종양, 항균 등의 효과를 가져 면역 증강용 건강식품, 항암 보조제 등으로 활용될 수 있다.

도 1은 실시예 1에 따른 6―진저롤(gingerol)의 면역 증강에 의한 항암 효과를 검증하기 위한 실험 과정을 보여준다.
도 2는 다양한 농도(0. 25, 50 및 200㎍/마우스)의 6―진저롤 주사에 의한 신장암 종양 부피를 나타내는 그래프이다.
도 3은 신장암에 대한 항암제(5―FU)와 6―진저롤과의 병용 효과를 보여주는 그래프들로, 각각 대조군(control), 5―FU 처리군, 6―진저롤+5―FU 병용처리군 및 6―진저롤 처리군의 암세포 주사 후 날짜별 종양부피(㎣)를 나타낸다.
도 4는 날짜별 단계로 본 신장암에 대한 항암제(5―FU)와 6―진저롤과의 병용 효과를 보여주는 그래프들을 나타낸다.
도 5는 암세포 주사 후 날짜별 생존율을 나타내는 그래프로, 각각 대조군(control), 5―FU 처리군, 6―진저롤+5―FU 병용처리군 및 6―진저롤 처리군의 암세포 주사 후 생존율의 비교 결과이다.
도 6은 흑색종양에 대한 4―1BB mAb와 6―진저롤과의 병용효과를 보여주는 그래프로 각각 대조군(control), 4―1BB mAb 처리군(4―1BB), 6―진저롤+4―1BB mAb 병용처리군 및 6―진저롤 처리군의 암세포 주사 후 날짜별 종양부피(㎣)를 나타낸다.
도 7은 날짜별 생존율을 나타내는 그래프로, 각각 대조군(control), 4―1BB mAb 처리군(4―1BB), 6―진저롤+4―1BB mAb 병용처리군 및 6―진저롤 처리군의 암세포 주사 후 생존율의 비교 결과이다.
도 8은 대장암 세포 주사 후 날짜별 종양부피(㎣)를 나타내는 그래프이다.
도 9는 대장암에 대한 6―진저롤의 항암 효과를 보여주는 그래프들로, 각각 대조군과 6―진저롤 주사군(처리군)의 대장암 세포(CT26) 주사후 날짜(일)별 종양 부피(㎣)를 보여준다.
도 10은 날자별 생존율을 나타내는 그래프로, 각각 대조군과 6―진저롤 처리군의 암세포 주사 후 생존율의 비교 결과이다.
도 11은 마우스의 종양크기를 비교하기 위한 사진으로, 각각 대조군과 6―진저롤 처리군의 암세포 주사 후 7일째, 14일째, 25일째의 모습을 보여주는 사진이다.
도 12는 각각 대조군(control)과 6―진저롤을 먹인 (6―진저롤 처리군) 생쥐에 대장암세포를 본 실험에 사용한 세포수의 1/3 세포수 (1× 10⁵/마우스)를 주사하여 암을 발생시키고, 종양부피(㎣)를 나타내는 그래프이다.
도 13은 각각 대조군(control)과 6―진저롤을 먹인 (6―진저롤 처리군) 생쥐에 대장암세포를 본 실험에 사용한 세포수의 1/3 세포수 (1× 10⁵/마우스)를 주사하여 암을 발생시키고, 암세포 접종 후 날짜별 생존율을 나타내는 그래프이다.
도 14는 대장암세포(CT26)를 1× 10⁴/웰로 하여 96웰 플레이트에서 24시간 배양한 후 6―진저롤을 1000, 500, 250, 125, 12.5, 2.5, 1.25, 0 ㎍/㎖ 농도로 각각 처리 후 37℃ CO₂ 세포 배양기에서 24시간 키운 후, EZ―CyTox Cell Viability Assay Kit를 사용하여 생존 세포를 450nm에서 흡광도를 측정한 결과를 나타낸다.
도 15는 신장암세포(RENCA)를 5× 10³/웰로 하여 96웰 플레이트에서 24시간 배양한 후 6―진저롤을 1000, 500, 250, 125, 12.5, 2.5, 1.25, 0 ㎍/㎖ 농도로 각각 처리 후 37℃ CO₂ 세포 배양기에서 48시간 키운 후 EZ―CyTox Cell Viability Assay Kit를 사용하여 생존 세포를 450nm에서 흡광도를 측정한 결과를 나타낸다.
도 16 및 도 17은 각각 플레이트에 대장암세포(CT26)와 신장암세포(RENCA)에 대해 진저롤을 1000, 500, 250, 125, 12.5, 2.5, 1.25, 0 ㎍/㎖ 농도로 각각 처리한 96 웰 플레이트의 모습을 보여주는 사진이다.
도 18은 대조군의 종양의 조직학 사진(H&E 염색)을 보여준다(× 400).
도 19는 6―진저롤 처리군의 종양의 조직학 사진(H&E 염색)을 보여준다(× 400).
도 20은 대조군(control)과 6―진저롤 처리군의 종양 속 면역세포의 분석 결과로 FACS 데이터를 나타낸다.
도 21은 대조군(control)과 6―진저롤 처리군의 종양 속 면역세포의 분석 결과로 면역세포의 백분율(%)을 나타낸다.
도 22는 대조군(control)과 6―진저롤 처리군의 종양 속 면역세포의 분석 결과로 면역세포의 세포수(× 10⁵)를 나타낸다.
도 23은 CD8 T세포의 활성측정결과로 대조군(control)과 6―진저롤 처리군의FACS 데이터를 나타낸다.
도 24는 CD8 T세포의 활성측정결과로 대조군(control)과 6―진저롤 처리군의 CD8 T세포의 백분율(%)을 나타낸다.
도 25는 CD8 T세포의 활성측정결과로 대조군(control)과 6―진저롤 처리군의 CD8 T세포의 세포수(× 10⁴)를 나타낸다.
도 26은 암세포에 대한 항체생성을 측정한 결과로 대조군(control)과 6―진저롤 처리군의 FACS 데이터를 나타낸다.
도 27은 종양 내 사이토카인 분석 결과로 대조군(control)과 6―진저롤 처리군의 IL―6 농도(pg/㎖)를 나타낸다.
도 28은 종양 내 사이토카인 분석 결과로 대조군(control)과 6―진저롤 처리군의 MCP―1 농도(pg/㎖)를 나타낸다.
도 29는 종양 내 사이토카인 분석 결과로 대조군(control)과 6―진저롤 처리군의 IFN―γ 농도(pg/㎖)를 나타낸다.
도 30은 종양 내 암세포의 MHC I의 발현을 측정한 결과로 대조군(control)과 6―진저롤 처리군의 FACS 데이터를 나타낸다.
도 31은 실시예 2에 따른 세균 모델에서의 6―진저롤의 면역 증강에 의한 세균감염 예방 및 치료 효과를 검증하기 위한 실험 과정을 보여준다.
도 32는 대조군(control)의 Listeria monocytogeneses 주사 후 체중 변화 관찰한 결과를 나타낸다.
도 33은 6―진저롤의 Listeria monocytogeneses 주사 후 체중 변화 관찰한 결과를 나타낸다.
도 34는 Listeria monocytogeneses 주사 후 날짜별 생존율을 나타내는 그래프로, 각각 대조군(control)과 6―진저롤 처리군의 Listeria monocytogeneses 주사 후 날짜별 생존율의 비교 결과이다.
도 35는 Listeria 감염 4일째 마우스 사진으로, 각각 대조군, 6―진저롤 처리군 및 치유된 마우스를 나타낸다.
도 36은 Pseudomonas aeruginosa 주사 후 날짜별 생존율을 나타내는 그래프로, 각각 대조군(control)과 6―진저롤 처리군의 Pseudomonas aeruginosa 주사 후 날짜별 생존율의 비교 결과이다.
도 37은 Staphylococcus aureus 주사 후 날짜별 생존율을 나타내는 그래프로, 각각 대조군(control)과 6―진저롤 처리군의 Staphylococcus aureus 주사 후 날짜별 생존율의 비교 결과이다.
도 38은 Listeria 주사 후 4일째 사진육안으로 본 간 조직 사진으로 각각 대조군 및 6―진저롤 처리군의 간 조직 사진이다.
도 39는 Listeria 주사 후 3일째 대조군 및 6―진저롤의 조직학 사진(H&E 염색)을 나타내며, (a)와 (b)는 각각 40배율, 200배율의 조직학 사진을 나타낸다.
도 40은 Listeria 주사 후 4일째 대조군 및 6―진저롤의 조직학 사진(H&E 염색)을 나타내며, (a)와 (b)는 각각 40배율, 200배율의 조직학 사진을 나타낸다.
도 41은 정상 비장 및 림프구, 그리고, 암세포에 반응하여 커진 비장과 림프구를 보여주는 사진이다. 도 41에서, (a), (b) 및 (c)는 정상 비장, 대조군 비장 및 6―진저롤 처리군 비장이며, (d), (e) 및 (f)는 정상 림프구, 대조군 림프구 및 6―진저롤 처리군 림프구이다.
도 42는 Listeria 주사 후 4일째 대조군(control)과 6―진저롤 처리군의 혈청 속의 다양한 사이토카인 농도를 보여준다.
도 43은 Listeria 주사 후 4일째 대조군(control)과 6―진저롤 처리군의 혈청 속의 다양한 사이토카인 농도(pg/㎖)를 보여준다.
도 44는 Listeria 주사 후 1일째 대조군(control)과 6―진저롤 처리군의 혈청 속의 다양한 사이토카인 농도를 보여준다.
도 45는 Listeria 주사 후 1일째 대조군(control)과 6―진저롤 처리군의 혈청 속의 다양한 사이토카인 농도(pg/㎖)를 보여준다.
도 46은 FACS를 사용하여 대조군(control)과 6―진저롤 처리군의 비장속의 면역세포 변화를 분석한 결과를 나타낸다.
도 47은 Listeria 주사 후 1일째 대조군(control)과 6―진저롤 처리군의 비장속의 각 면역세포 백분율(%)을 나타낸다.
도 48은 Listeria 주사 후 4일째 대조군(control)과 6―진저롤 처리군의 비장속의 각 면역세포 백분율(%)을 나타낸다.
도 49는 Listeria 주사 후 1일째 대조군(control)과 6―진저롤 처리군의 비장속의 각 면역세포 수(× 10⁶)를 나타낸다.
도 50은 Listeria 주사 후 4일째 대조군(control)과 6―진저롤 처리군의 비장속의 각 면역세포 수(× 10⁶)를 나타낸다.
도 51은 고형 배지를 만들고 6―진저롤을 농도별로 첨가시켜 액체배지에서 키운 배양액을 여러 단계로 희석한 다음 고형 배지 위에 도말하고 37℃ 배양기에 하루동안 키운 후 집락을 보여주는 사진으로, (a), (b), (c) 및 (d)는 각각 0㎍/㎖, 25㎍/㎖, 100㎍/㎖ 및 500㎍/㎖ 6―진저롤 처리를 나타낸다.
도 52는 Staphylococcus aureus에 대한 6―진저롤의 직접적인 효과를 실험한 결과로, 고형 배지를 만들고 6―진저롤을 농도별로 첨가시켜 액체배지에서 키운 배양액을 희석한 다음 고형 배지 위에 도말하고 37℃ 배양기에 하루 동안 키운 후 집락을 헤아려 6―진저롤 농도가 0일 때의 집락의 수를 100%로 하고 비교 백분율을 농도별로 표시한 그래프이다.
도 53은 Pseudomonas aeruginosa에 대한 6―진저롤의 직접적인 효과를 실험한 결과로, 고형 배지를 만들고 6―진저롤을 농도별로 첨가시켜 액체배지에서 키운 배양액을 희석한 다음 고형 배지 위에 도말하고 37℃ 배양기에 하루 동안 키운 후 집락을 헤아려 6―진저롤 농도가 0일 때의 집락의 수를 100%로 하고 비교 백분율을 농도별로 표시한 그래프이다.

이하, 하기 실시 예에 의해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 하기 실시 예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 설명일 뿐 실시 예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 암 세포 모델에서의 6―진저롤(gingerol)의 면역 증강에 의한 항암 효과

1. 암 세포 모델(6―진저롤(gingerol)의 면역 증강에 의한 항암 효과)의 실험 방법

암 세포 모델의 실험 과정은 도 1의 방법에 의해 수행하였다.

1) 생쥐 구입 및 시료의 준비

7주령의 암컷 Balb/c생쥐 및 C57BL/6 생쥐를 오리엔트에서 구입하여 울산대학교 생명과학부 동물실에서 유지하며 실험을 행하였다. 6―진저롤(gingerol)은 WaKo사의 것을 사용하였으며, 6―진저롤은 물에 잘 녹지 않는 성질이어서 처음에는 0.4 DMSO(dimethyl sulfoxide)에 10㎎/㎖로 녹인 다음 PBS(phosphate buffer saline)로 희석하여 사용하였다. 6―진저롤을 먹이는 실험의 경우는 50% 에탄올에 20㎎/㎖로 녹인 다음 3.5㎍/㎖이 되도록 물로 희석한 다음 사용하였다.

2) 6―진저롤(gingerol) 투여

주사의 경우는 암세포 주사 5일전부터 3일 간격으로 19일까지 복강으로 주사하였다. 먹이는 실험에서는 암세포 주사 5일전부터 3.5㎍/㎖이 되도록 물에 타서 물병을 꽂아두고 자유롭게 먹게 하였다. 생쥐(20g)가 하루에 약 3.5㎖의 물을 먹었다. 따라서 12.3㎍/일(day)을 먹었고, ㎏ 단위로 환산하면, 하루에 약 615 ㎍/㎏ 의 6―진저롤을 먹었다. 먹이는 실험에서의 보통 주사농도의 1.5배를 먹이면 유사한 효과를 보이므로 먹이는 실험에서의 농도는 주사 농도를 감안하여 결정한 것이다. 먹이는 실험에서 대조군(control)의 경우는 에탄올이 0.0087% 되도록 물에 희석한 다음 먹였다.

3) 암 세포 주사

7주령의 암컷 Balb/c생쥐의 오른쪽 옆구리에 털을 깎고 암 세포를 1㏄ 주사기(30 게이지(gage) 바늘)에 넣고 100㎕를 피부 바로 아래(피하)에 주사하여 생쥐를 죽이지 않고도 종양의 크기를 눈으로 보고, 크기를 측정할 수 있도록 하였다. 이때 신장암세포는 7× 10⁵/마우스(mouse), 대장암 세포는 3× 10⁵/마우스(mouse)로 주사하였다. 흑색종 세포는 C57BL/6 생쥐 7주령의 암컷에 2× 10⁵/마우스(mouse)로 주사하였다.

4) 항암제 주사

항암제 5―FU를 암세포 주사 후 5일째에 한 번만 생쥐의 복강에 주사하였다.

5) 4―1BB mAb 주사

T세포 공동자극분자인 4―1BB mAb는 암세포 주사 후, 7일과 12일에 100㎍/마우스(mouse)로 복강 주사하였다.

6) 암 성장 측정

암세포 주사 후 2∼3일 간격으로 종양의 가로, 세로, 높이를 마이크로캘리퍼스(microcalipus)를 이용하여 측정하고 아래의 식에 따라 계산하였다.

종양 부피(Tumor volume) (㎣) = (주축(major axis)) × (단축(minor axis)) × (높이) × 0.52

7) 생존율 측정

암세포를 생쥐에 주사하여 암에 걸린 생쥐를 만든 후 2∼3일 간격으로 암의 가로, 세로, 높이를 마이크로캘리퍼스(microcalipus)를 이용하여 측정하였다. 실험 동물법에 의해 직경이 2㎝가 되면 인위로 안락사 시키고, 암으로 인해 죽은 것으로 간주하여 생존율을 측정하였다.

8) 사용한 암세포

본 실시예에 사용한 암세포는 대장암세포 (CT26), 신장암세포 (Renca) 및 흑색종세포 (B16F1)이었다.

가) 사용한 배지

(1) 대장암세포 (CT26); RPMI 1640 (Sigma) + 10 % FBS(feta bovine serum) + 항생제 (페니실린 G(Penicillin G) + 스트렙토마이신(Streptomycin))

(2) 신장암세포 (RENCA); H―DMEM + 10 % FBS + 항생제 (페니실린 G + 스트렙토마이신)

(3) 흑색종세포 (B16F1); H―DMEM + 10 % FBS + 항생제 (페니실린 G + 스트렙토마이신)

나) 계대배양

(1) 대장암세포; 1× 10⁶ 세포를 10㎖ 배양 배지에 넣어 배양디쉬에서 키웠다. 세포의 상태를 현미경으로 관찰 하면서 3일째, 70―80% 정도의 공간으로 세포가 증식하게 되면 새로운 배지와 새로운 배양디쉬에 옮겨 키웠다.

(2) 신장암세포; 5× 10⁵ 세포를 10㎖ 배지에 넣어 배양디쉬에서 키웠다. 세포의 상태를 현미경으로 관찰하면서 3일째, 70―80% 정도의 공간으로 세포가 증식하게 되면 새로운 배지와 새로운 배양디쉬에 옮겨 키웠다.

(3) 흑색종세포 : 3× 10⁵ 세포를 10㎖ 배지에 넣어 배양디쉬에서 키웠다. 세포의 상태를 현미경으로 관찰하면서 3일째, 70―80% 정도의 공간으로 세포가 증식하게 되면 새로운 배지와 새로운 배양디쉬에 옮겨 키웠다.

9) 종양조직 관찰

종양을 유발시킨 15일 후 대조군과 6―진저롤(gingerol) 투여군의 생쥐에 형성된 종양을 잘라내어 4% 포르말린 용액에 고정시킨 후 파라핀 절편을 만들고 헤마톡실린―에오신(Hematoxylin―eosin; H&E)염색을 하여 현미경으로 관찰하였다. 파라핀 절편을 만들고 염색하여 판독하는 것은 울산대학교 병원 조직병리학실에서 수행하였다.

10) 종양내의 면역세포(Tumor―infiltrated lymphocytes)관찰

울산대학교 세포생물학 실험실의 도움을 받아 FACS(유세포분리기)를 이용하여 면역세포를 분석하였다.

마우스의 종양을 잘게 자르고, 콜라게나제(collagenase)와 DNase를 넣고 90분간 배양 후, 갈아서 하나의 세포들로 만든 다음 각 면역세포에 결합할 수 있는 단일클론 항체를 결합시겼다. 이후 30분간 4℃에서 반응시킨 후 FACS 완충액(buffer)로 여분의 항체를 씻은 다음 FACS Calibur (Becton Dickinson) 기계를 통해 분석하였다. 사용한 항체는 CD4―PE, CD3―FITC, CD8―PE, CD11b―PE, Ly6G―FITC, DX5―PE, CD11c―PE, B220―PE를 사용하였고, 모두 BD PharMingen 제품이다.

11) 면역세포의 암세포 살해능 실험

CD8 T세포는 암세포를 죽일 수 있는 세포이다.

암세포 살해 실험은 CD107a 항체를 이용하여 실시하였다. CD8 T세포가 암세포를 인지하고 활성화되면, 리소좀 관련 막단백질인 CD107a를 표면에 나타나게 되는 데, 이를 유세포분석기를 이용하여 측정할 수 있다.

2mM 모넨신(monensin)(1㎕) 와 CT26 암세포 100㎕ (2× 10⁶ 세포), 림프구에서 분리한 면역세포 100㎕(1× 10⁶ 세포), 그리고 CD107a―FITC 항체를 96 웰 플레이트에 넣고 5시간 반응시킨다. 이후 세포를 FACS 튜브로 옮겨담고, CD8―PE 항체로 30분간 4℃에서 반응시킨 후 PBS로 여분의 항체를 씻고, 유세포 분석기로 분석하였다.

12) 종양내의 사이토카인(cytokine) 분석

종양을 분리 후 종양의 무게를 측정하고,(㎕/mg)의 PBS를 넣고, 균질기(homogenizer)로 종양을 분쇄 후, 원심분리하여 상층액을 회수한다. 이 상층액으로 사이토카인을 측정하였다. 사이토카인은 CBA kits로 실험하고, 분석은 FACS Calibur (Becton Dickinson) 기계를 통해 분석하였다. CBA kits : (Contents; BD Cytometric Bead Array specific for Mouse IL―6, MCP―1, IFN―γ, Cat No; 552364 이 제품은 비드(Bead)에 미리 각 사이토카인에 대한 항체가 형광을 붙인 채 코팅되어 있어 시료 중에 특정 사이토카인이 있으면 항원항체 결합반응으로 형광을 띄게 되어 유세포분석기로 형광을 분석하여 존재하는 양을 측정할 수 있다.

2. 결과

1) 신장암에 대한 6―진저롤의 항암효과

가) 효과적인 6―진저롤 주사농도 구하기

효과적인 6―진저롤의 주사농도를 구하기 위해 0, 25, 50, 200㎍/마우스로 각각 복강주사 하여 항암효과를 관찰하였다. 도 2를 참조하면, 25㎍/마우스와 50㎍/마우스의 효과는 대조군보다 좋았고, 200㎍/마우스의 농도는 6―진저롤을 주사하지 않고 6―진저롤을 녹인 용매만 주사한 대조군과 유사하거나 오히려 더 나빴다. 가장 효과적인 농도는 25㎍/마우스였다.

나) 신장암에 대한 항암제(5―FU)와 6―진저롤과의 병용효과

(1) 종양의 크기

항암제(5―FU)와 6―진저롤과의 병용효과를 확인하기 위하여, 예비 실험 및 문헌 연구에 따라, 항암제 5―FU 농도는 1㎎/마우스로 결정하였고, 6―진저롤의 농도는 도 2의 결과에 따라 25㎍/마우스로 결정하였다. 주사일정은 도 1에서 도식한 바와 같이, 6―진저롤은 ―5일부터 3일 간격으로 19일 까지 복강으로 주사하고, 암세포는 Day(일) 0에 피하로, 그리고 항암제는 암세포 주사 후 5일째에 복강으로 한 번만 주사하였다.

도 3 및 도 4를 참조하면, 6―진저롤과 항암제 5―FU를 함께 주사한 군에서 종양성장이 가장 느렸다. 그러나 완전히 치유되지는 않고, 종양의 발생을 늦게 하는 예방효과가 있었으며, 종양이 발생한 이후에도 종양의 성장이 대조군(control)보다 느렸다. 10일 후 종양성장을 비교했을 때, 6―진저롤을 투여한 경우는 종양의 발생이 현저히 느림을 알 수 있다. 항암제를 단독으로 주사한 경우는 항암제 주사 후 현저히 성장이 느려지다가 다시 급속도로 증가 하였다. 6―진저롤을 단독 또는 항암제와 공동 투여한 경우는 6―진저롤의 투여 중단(19일) 이후 빠르게 종양이 성장하였다.

따라서, 6―진저롤은 신장암의 발생을 늦게 하는 효과가 있었으며, 암의 발생이후에도 성장이 대조군보다 느려서 도 5에서와 같이 생존율도 증가시켰다. 6―진저롤 단독으로도 신장암에 대한 항암효과가 있었으며, 5―FU와의 병용치료효과도 있었다.

2) 흑색종양에 대한 6―진저롤의 항암효과

흑색종은 항암치료가 되지 않는 대표적인 난치성 암종이다. 4―1BB(4―1BBmAb로 자극할 수 있음)는 T세포 공동자극분자로 알려져 있고, 항원 자극 등으로 활성화되면, T세포에 발현되며, 이것을 자극할 수 있는 단일클론 항체 4―1BBmAb로 자극하면 항암활성효과가 나타나는 것으로 보고되고 있다. 그러나 다른 종양과 달리, 흑색종양(B16F1)에 대한 치료효과는 높지 않은 것으로 알려져 있다. 따라서 6―진저롤과 4―1BB를 공동으로 자극하면, 항암효과가 높아지는 지를 실험해 보았다. 6―진저롤은 ―5일부터 3일 간격으로 19일 까지 복강으로 주사하고, 암세포는 Day 0에 피하로, 그리고 4―1BB mAb는 암세포 주사 후 7일째와 12일째에 복강으로 주사(100㎍/마우스)하였다. 실험 결과(도 6 및 도 7 참조), 6―진저롤 단독으로도 흑색종에 대한 항암효과가 있었으며, 4―1BB와의 병용치료효과도 있었다. 따라서 6―gingerol과 4―1BB를 함께 주사한 생쥐가 가장 오래 생존하였다.

3) 대장암에 대한 6―진저롤의 항암효과

6―진저롤의 투여가 대장암의 발생 및 성장에 미치는 영향을 알아보기 위해 생쥐의 대장암 모델을 설정하였다. 먼저 6―진저롤은 대장암세포 주사 5일 전부터 3일 간격으로 19일 까지 25㎍/마우스의 농도로 복강 주사하였다. 대장암 세포는 Day 0에 3× 10⁵/마우스 되도록 피하에 주사 후 2―3일 간격으로 종양의 크기를 측정하였다.

도 8, 9 및 11에서 보는 바와 같이, 6―진저롤을 주사한 군에서는 종양의 발생을 늦게 하는 예방효과가 있었다. 암세포 주사 후 7일째 보면, 대조군은 주사한 생쥐 모두에서 종양이 발생한 반면, 6―진저롤을 주사한 생쥐는 7마리 중 3마리는 아직 눈으로 관찰 될 정도의 종양이 형성되지 않았다. 종양이 발생 한 이후에도 종양의 성장이 대조군보다 느렸다.

다음은 6―진저롤을 물에 희석시켜 먹이면, 동일한 항암효과를 볼 수 있는지를 실험하였다. 먼저 6―진저롤은 대장암세포 주사 5일 전부터 3.5㎍/㎖이 되도록 물에 타서 물병을 꽂아두고 자유롭게 먹게 하였다. 생쥐(20g)가 하루에 약 3.5㎖의 물을 먹었다. 따라서 12.3㎍/일(day)를 먹었고, ㎏ 단위로 환산하면, 하루에 615 ㎍/㎏ 의 6―진저롤을 먹었다. 대장암 세포는 Day 0에 1× 10⁵/마우스 되도록 피하에 주사 후 2―3일 간격으로 종양의 크기를 측정하였다. 도 12에서 보는 바와 같이 6―진저롤을 먹인 마우스는 대조군에 비해 종양형성이 느리고, 종양성장도 느렸다. 또한, 6―진저롤을 먹인 경우는 종양이 형성되지 않은 생쥐가 50%인 반면, 대조군은 17%였다(도 13 참조).

결론적으로 보면, 6―진저롤은 대장암의 발생을 늦게 하는 효과가 있었으며, 암의 발생 이후에도 성장이 대조군보다 느려서 도 10, 13에서와 같이 생존율을 증가시켰다.

4) 6―진저롤의 항암기작 연구

6―진저롤이 암세포를 직접 살해하는 것인지 면역세포를 자극하여 면역세포가 암세포를 공격하는지 여부를 실험하였다.

가) 6―진저롤이 암세포를 직접 살해하는지 여부의 확인 실험

암세포는 동물 실험에 사용한 생쥐 대장암(CT26)과 신장암(RENCA) 세포주를 대상으로 하였다. 대장암 및 신장암 세포를 배양배지를 넣고 키우면서 6―진저롤을 넣고 키울 때와 넣지 않고 키울 때의 세포 성장을 비교하였다. 먼저 대장암 세포를 1× 10⁴/웰, 신장암 세포를 5× 10³/웰로 하여 96웰 플레이트에서 24시간 배양한 후 6―진저롤을 1000, 500, 250, 125, 12.5, 2.5, 1.25, 0 ㎍/㎖ 농도로 각각 처리 후 37℃ CO₂ 세포 배양기에서 CT26은 24시간, RENCA는 48시간 키운 후 EZ―CyTox Cell Viability Assay Kit를 사용하여 생존 세포를 450nm에서 흡광도를 측정하였다(도 14 및 도 15 참조).

실험 결과 대장암의 경우 6―진저롤을 1㎎/㎖로 처리하였을 때 저해작용이 현저히 나타났으며(도 14 참조), 신장암의 경우는 저해 작용이 미미하였다(도 15 참조). 비록 1㎎/㎖의 농도에서 암세포의 성장 저해 효과를 보이기는 했지만, 이것을 생체 내 주사 농도로 환산하면 20mg/마우스 (20g 생쥐기준)이다. 본 실험에서 사용한 6―진저롤의 농도인 25㎍/마우스와 비교해 볼 때 이 농도는 800배 높은 고농도이다. 따라서 생쥐에 6―진저롤을 주사하여 얻은 생체내의 항암작용은 6―진저롤이 직접 암세포를 살해하여 나타난 결과로 보기는 어려울 것으로 판단되었다.

나) 6―진저롤이 면역세포를 자극하여 면역세포가 암세포를 공격하는지 여부의 확인 실험

(1) 종양조직을 염색하여 관찰

6―진저롤을 주사한 생쥐에서 생긴 종양과 대조군의 종양을 잘라내어 관찰하였다. 종양은 14일째 생쥐에서 잘라내어 4% 포르말린용액에 넣어 고정하였다. 조직의 염색은 울산대학교 병원 병리검사실에서 수행하였다.

결과

대조군 : 종양의 내부에는 암세포로 가득 채워져 있고, 면역세포는 잘 관찰되지 않았다. (화살표부분 ; 암세포 ) (도 18 참조)

6―진저롤 처리군 ; 종양의 내부에는 암세포외 면역세포가 많이 관찰되었다. (화살표 부분; 면역세포) (도 19 참조)

(2) 종양조직내의 면역세포 분석

생쥐의 면역세포를 분석하였다. 6―진저롤을 투여한 마우스와 대조군의 마우스에 생성된 종양을 11일째 잘라내어 종양속의 면역세포변화를 분석하였다.

도 20 내지 22를 참조하면, 6―진저롤을 주사한 생쥐는 대조군 보다 CD4 T세포, CD8 T세포, B세포의 백분율(%) 및 세포수가 현저히 증가하였다. 즉, 암세포에 CD4 T 및 CD8 T세포, B세포가 많이 침투해 들어가 있는 것을 확인할 수 있었다. 호중구세포 및 면역세포를 조절하는 조절 T세포는 적었다. 암세포 면역활성에 필수적인 CD4 T 및 CD8 T세포, B세포의 증가는 중요한 항암기작으로 생각되었다.

(3) 면역세포의 암세포 살해능 실험

상기 실험에서 확인한 증가된 CD8 T세포가 암세포 살해능이 있는지를 확인하였다. 암세포 살해 실험은 CD107a 항체를 이용하여 실시하였다. CD8 T세포가 암세포를 인지하고 활성화되면, 리소좀관련 막단백질인 CD107a를 표면에 나타나게 되는데, 이를 유세포분석기를 이용하여 측정할 수 있다. 다음은 종양 속에 침투하여 들어온 면역세포(Tumor infiltrated lymphocytes)를 분리하여 CD8 T세포의 종양살해능을 분석한 결과이다.

도 23 내지 25를 참조하면, 6―진저롤을 주사 받은 마우스의 림프구에는 암세포에 활성을 나타내는 CD8 T세포의 백분율(%) 및 수가 대조군에 비해 현저히 많았다.

(4) 암세포에 대한 항체 생성능 실험

상기 실험에서는 6―진저롤을 투여하면 암세포에 대한 항체생성이 증가하는가를 확인하였다. -5일 째부터 6―진저롤(6―진저롤 처리군) 및 vehicle control(대조군)을 먹이면서 day 0에 대장암 세포를 주사하여 대장암을 발생시킨 후 15일째 생쥐에서 혈액을 채취, 혈청을 분리하여 대장암 세포와 반응시켰다. 그 후 형광이 결합된 항체를 이용하여 암세포에 대한 항체 생성을 유세포분석기로 분석하였다. 실험방법에 대해 보다 상세하게는 설명하면 다음과 같다. 대장암세포 CT26 + 암발생 시킨 생쥐로부터 분리한 혈청, 37℃, 2시간 배양하여 혈청중의 대장암세포의 항체와 대장암세포를 결합시켰다. 이후 2번 인산완충액으로 세척하고, anti-mouseIgG-FITC를 4℃에서 30분 결합시켰다. 이후 2번 인산완충액으로 세척하고, 유세포분석기(FACS)로서 분석하였다. 그 결과, 6―진저롤을 투여하면 암세포에 대한 항체생성이 대조군에 비해 약 2배 증가하였다(도 26 참조).

(5) 종양 내 사이토카인(cytokine) 분석

다음은 6―진저롤을 주사받은 생쥐의 종양과 대조군의 종양을 15일째 분리 후 종양 내 사이토카인을 측정하였다. 그 결과, 6―진저롤을 주사 받은 마우스의 종양 내에는 IL―6, MCP―1, IFN―γ가 대조군보다 높은 수치로 측정되었다(도 27 내지 29 참조, 단위: pg/㎖). MCP―1은 종양 내로 면역세포의 침투를 촉진시키는 주요한 사이토카인인데, 6―진저롤 투여군의 종양 내에 MCP―1이 높은 농도로 측정된 것은 앞서 조직염색으로 확인한 도 19의 결과(종양 내에 면역세포의 침투가 증가)와 일치한다. IL―6은 다양한 기능을 가지고 있는데, 그 중 종양세포가 분비하는 TGF―β의 역할을 중화시키는 능력을 가지고 있다. TGF―β는 T세포의 활성을 방해하는 사이토카인이다. 또한 최근 보고에 의하면, IL―6과 IFN―γ의 공동작용으로 종양의 MHC 발현을 증가시킨다고 한다. 암세포는 TGF―β를 분비하여 숙주세포의 항암활성을 저해시키거나, MHC 발현감소로 숙주세포의 면역감시로부터 회피하려는 성질을 가지고 있다. 그런데, 6―진저롤의 투여로 종양 내에 면역세포의 침투를 증가시키고, 또한 침투된 면역세포들로 하여금 IL―6과 IFN―γ의 분비를 증가시키는 것은 항암활성의 중요한 기작으로 평가될 수 있다.

(6) 종양속에서 분리한 암세포의 MHC I의 분석

도 30은 6―진저롤을 주사 받은 생쥐의 종양과 대조군의 종양을 15일째 분리 후 종양 속에서 암세포를 분리하여 암세포의 MHC I의 발현을 비교한 것이다. 그 결과, 6―진저롤을 주사 받은 마우스에서는 종양 세포의 MHC I 발현이 대조군에 비해 2배 높았다. 이것은 암세포가 면역세포에 의해 잘 감시될 수 있도록 하는 항암활성의 중요한 기작으로 평가될 수 있다.

5) 실험결과의 결론

6―진저롤은 대장암 및 신장암, 흑색종양의 발생을 느리게 하고 종양성장 억제효과가 있음을 알 수 있었으며, 신장암의 경우는 항암제 5―FU와의 병용효과가, 흑색종의 경우는 T세포 공동자극분자인 4―1BB mAb와의 병용효과도 관찰되었다. 동물 실험을 통한 6―진저롤의 항암작용은 6―진저롤이 암세포에 직접 작용하여 암세포의 성장을 저해한 것으로 보기는 어려우며, 면역세포의 활성과 증식을 통한 효과라고 볼 수 있다. 그 증거로는 종양 내에서 많이 관찰된 면역세포(도 19 내지 22 참조)와 항암활성을 나타낼 수 있는 CD4 및 CD8 T세포의 증가로 볼 수 있다. 또한 종양내의 사이토카인을 분석한 결과, 대표적인 항암활성 사이토카인인 IFN―γ의 증가, 종양내로 면역세포의 침투를 유도하는 MCP―1이 증가해 있었으며, 항암활성을 방해하는 TGF―β의 역할을 방해하는 IL―6의 증가도 관찰되었다. 또한 종양 내에서 대조군에 비해 많이 관찰된 CD8 T세포가 정말 암세포를 죽일 수 있는 활성화된 형태인지를 알아보기 위해 세포독성실험을 하였는데, 활성화된 형태의 CD8 T세포가 대조군보다 유의적으로 많이 측정되었다. 종양 내 면역세포에는 T 세포뿐만 아니라 B세포도 많이 관찰되어 암세포에 대한 항체생산을 측정한 결과 6―진저롤을 투여하면 암세포에 대한 항체생성이 대조군에 비해 약 2배 증가하였다(도 26 참조). 따라서 6―진저롤은 T세포와 B세포의 면역세포의 활성과 증식을 증가시키는 항암 면역력을 높이는 주요한 물질로 평가될 수 있다.

실시예 2. 세균 모델에서의 6― 진저롤(gingerol)의 면역 증강에 의한 세균감염 예방 및 치료 효과

1. 세균 모델의 실험 방법

세균 모델의 실험 과정은 도 31의 방법에 의해 수행하였다.

1) 6―진저롤 주사

세균(Listeria monocytogenes)주사 5일전부터 3일 간격으로 +4일까지 총 4번 복강으로 50㎍/마우스를 주사하였다.

2) 세균 주사

세균은 Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aerusinosa 세 종류를 각각 사용하였다.

Day 0에 세균을 꼬리 정맥에 Listeria monocytogenes를 1× 10⁵ CFU/마우스 주사하였다. 생존율 측정 경우에는 Staphylococcus 및 Pseudomonas도 실험하였는데, Staphylococcus aureus를 주사한 경우는 3.5× 10⁹ CFU/마우스, Pseudomonas aeruginosa는 2× 10⁷ CFU/마우스로 주사하였다.

3) 생존율 측정

세균 주사 후 다음 날부터 체중과 생존여부를 확인하였다.

4) 조직의 병변 관찰

생쥐를 희생시켜 비장과 간의 상태를 육안으로 관찰하고, 간은 4% 포르말린 용액에 넣어 고정하여 파라핀 절편을 만들고 H&E (Hematoxylin―eosin)염색을 하여 현미경으로 관찰하였다. 파라핀 절편을 만들고 염색하여 판독하는 것은 울산대학교 병원 조직병리학실에서 수행하였다.

5) 면역세포 분석

Listeria를 주사하고 1일 후, 그리고 4일 후의 면역세포를 분석해 보았다. 각 면역세포는 세포표면에 특징적인 세포표면 단백질을 가진다. 따라서 그 세포표면 단백질을 항원으로 하여 만들어진 단일클론 항체(Monoclonal antibodies)를 사용하여 그 세포가 어떤 표면 단백질을 가진 세포인지 알 수 있다. 이 항원―항체 결합을 눈으로 볼 수 있게 하기위해 형광염색소(Fluorescent dye)가 결합된 단일클론 항체(Monoclonal antibodies)를 상업용으로 판매하고 있다. 마우스의 비장을 갈아서 하나의 세포들로 만든 다음 각 면역세포에 결합할 수 있는 단일클론 항체(CD4―PE, CD3―FITC, CD8―PE, CD11b―PE, Ly6G―FITC, CD11c―PE)를 각각 결합시켰다. 이후 30분간 4℃에서 반응시킨 후 FACS 완충액으로 여분의 항체를 씻은 다음 FACS Calibur (Becton Dickinson) 기계를 통해 어떤 표면 단백질을 가진 면역세포가 6―진저롤 처리군과 대조군에서 차이가 나는지 분석하였다.

6) 사이토카인 분석

채취된 혈액은 실온에서 30분간 굳혀서 혈청을 분리한 후 혈청 속의 사이토카인을 CBA kits로 실험하였다. BDTM Cytometric Bead Array (CBA) Mouse Inflammation Kit (Contents; BD Cytometric Bead Array specific for Mouse IL―6, IL―10, MCP―1, IFN―γ, TNF and IL―12p70, Detection Reagent, Positive Standards, Flow Cytometer Setup System, Assay Diluent and wash Buffer) Cat No; 552364 이후 유세포분석기(FACS)로 형광을 분석하여 존재하는 양을 측정하였다.

2. 결과

1) 체중의 변화 및 생존율

먼저 Balb/c 생쥐를 7주령의 암컷으로 구입하여, 체중을 확인 후 대조군과 실험군(6―진저롤 처리군)으로 나누어 케이지에 담는다. 이때 매일 체중의 변동사항을 측정해야하기 때문에 생쥐의 귀에 펀치로 구멍을 뚫어 번호를 매긴다. 6―진저롤을 세균 주사 5일전부터 +4일까지 3일 간격으로 총 4회 복강에 50㎍/마우스의 용량으로 투여하였다. day 0에 Listeria(1× 10⁵ CFU/마우스)를 꼬리 정맥에 주사 후 매일 체중과 생존 여부를 관찰하였다.

도 32 및 33을 참조하면, 4일째 대조군의 평균 마우스의 몸무게는 대조군이 15.88g인 반면, 6―진저롤을 투여 받은 마우스는 16.55g 이었다. 또한 마우스의 상태는 대조군은 털이 서있고, 마우스가 눈이 게슴츠레하며 움직임이 둔한 반면, 6―진저롤 처리군은 털은 조금 서 있지만 심각하지는 않았고, 움직임도 양호하였다. 대조군의 경우 Listeria를 주사한지 4―5일 사이에 모두 사망하였으나, 6―진저롤 처리군은 5일째부터는 양호한 상태를 보이기 시작하여 2주일 이내에 정상 몸무게를 회복하였다(도 34 내지 35 참조).

도 36은 동일한 방법으로 6―진저롤을 투여하고, Pseudomanas aeruginosa를 꼬리 정맥으로 2× 10⁷ CFU/마우스로 주사 후 생존율을 대조군과 비교한 것이다. 대조군은 세균 주사 후 3일째 모두 사망한 반면, 6-진저롤 주사군은 57% 마우스가 생존하였고, 2주 이내 모두 회복하였다.

도 37은 동일한 방법으로 6―진저롤을 투여하고, Staphylococcus aureus를 꼬리 정맥으로 3.5× 10⁹ CFU/마우스로 주사 후 생존율을 대조군과 비교한 것이다. 대조군은 세균 주사 후 2일째 86%가 사망한 반면, 6-진저롤 주사군은 71% 마우스가 생존하였고, 2주 이내 모두 회복하였다.

3) 간 병변 관찰

먼저 육안적인 간의 상태를 보았다.

도 38은 Listeria 주사 후 4일째 사진육안으로 본 간 조직 사진으로 각각 대조군 및 6―진저롤 처리군의 간 조직 사진이다.

(1) 외형상의 병변 : 대조군은 간의 전부분에 걸쳐 하얀 점들을 많이 보여주고 있었다. 반면, 6―진저롤 처리군은 그러한 현상이 대조군보다는 적었다.

(2) 용혈 : 대조군은 6―진저롤 처리군보다 용혈이 많이 일어나서 간 색깔도 붉은 빛이 적었다. 이것은 상대적으로 6―진저롤 처리군보다 많은 수의 제거되지 않은 Listeria 때문으로 판단된다.

이러한 현상들로 보아 외형상의 간 조직 손상은 대조군이 6―진저롤 처리군보다 심하였다. 좀 더 자세한 결과를 얻기 위해, 울산대학교 병원 조직검사실에 의뢰하여 간을 염색하고, 생쥐의 간 병변 상태를 현미경으로 관찰하였다.

도 39를 참조하면, Listeria 주사 후 3일째, 대조군은 간세포가 부푼 현상(swelling)이 관찰된다. 따라서 전체적으로 6―진저롤 처리군보다 연한 핑크색을 나타내어 간 손상이 일어났음을 알 수 있다.

도 40을 참조하면, Listeria 주사 후 4일째, 대조군은 많은 소농양(microabscesses) (화살표 부분)가 관찰된다. 이것은 세균은 처리하러온 호중구 세포와 죽은 세균, 그리고 간 손상 등이 합쳐진 산물로 사진 상에서 좀 진하게 염색되어 있는 부분들이다. 반면, 6―진저롤 처리군은 소농양이 상대적으로 적게 관찰되며, 간 상태가 양호하였다.

3) 6―진저롤의 항균 기작 연구

가) 비장 및 림프구 관찰

6―진저롤 처리군의 생존율이 대조군보다 현저히 증가함이 관찰됨에 따라 그 기작을 알아보기 위해 먼저 비장 및 림프구의 형태를 관찰하였다. 종양을 유발할 때 오른 쪽 옆구리에 종양세포를 주사하였는데, 그런 경우 종양이 유발된 위치와 가장 가까운 곳의 림프구가 자극되어서 보다 더 커지게 된다. 도 41은 정상 비장 및 림프구, 그리고, 암세포에 반응하여 커진 비장과 림프구를 보여주고 있다. 도 41에서, (a), (b) 및 (c)는 정상 비장, 대조군 비장 및 6―진저롤 처리군 비장이며, (d), (e) 및 (f)는 정상 림프구, 대조군 림프구 및 6―진저롤 처리군 림프구이다. Listeria는 적혈구를 파괴하는 용혈소를 생성하기 때문에 비장의 적혈구가 파괴되어 비장의 색깔이 허옇게 된 것을 알 수 있다. 반면 6―진저롤을 투여 받은 마우스의 비장은 Listeria로부터 보호되어 검붉은 색깔을 나타낸다. 이는 정상 마우스의 비장의 색깔과 유사하다. 또한 세균으로부터 감염되면, 면역세포는 이를 방어하기위해 노력하는데, 이의 결과 면역세포의 수가 증가한다. 6―진저롤 처리군의 비장 및 림프구의 크기가 커져 있는 것을 도 41을 통해 알 수 있었다.

나) 혈청 분석

6―진저롤을 주사 받은 마우스와 대조군의 혈액을 뽑아 혈청을 분리하고 혈청중의 사이토카인을 분석하였다. 채취된 혈액은 실온에서 30분간 굳혀서 혈청을 분리한 후 혈청 속의 사이토카인을 CBA kits로 실험하였다.

도 42 및 도 43을 참조하면, Listeria 주사 후 4일째, 6―진저롤 처리군의 혈청에서는 조사한 대부분의 사이토카인 농도가 높게 나왔다. 그래서 대조군의 마우스 상태가 너무 나빠 기작을 알기보다는 결과에 의해 나타난 현상으로 판단되었다. 따라서 이번에는 좀 더 빠른 날짜의 마우스를 희생시켜 혈청을 분석해 보기로 하였다.

도 44 및 도 45를 참조하면, Listeria 주사 후 1일째, 6―진저롤 처리군에서는 IFN―γ가 현저히 높게 측정되었다. IFN―γ는 바이러스 감염이나, 세포내 기생성 세균 감염, 그리고 종양에 대한 반응에 매우 중요한 사이토카인이다. IFN―γ는 NK세포, 수지상세포(Dendritic cell) CD4, CD8 T세포가 주로 분비한다. 6―진저롤 처리군에서 IFN―γ가 현저히 높게 생성됨은 세포내 기생세균인 Listeria를 제거하는데 중요한 기작이 된다.

다) 면역세포 분석

Listeria를 주사하고 1일 후, 그리고 4일 후의 면역세포를 분석해 보았다. 본 실험은 마우스의 비장을 갈아서 하나의 세포들로 만든 다음 각 면역세포에 결합할 수 있는 단일클론 항체(CD4―PE, CD3―FITC, CD8―PE, CD11b―PE, Ly6G―FITC, CD11c―PE)를 각각 결합시키고 FACS Calibur (Becton Dickinson) 기계를 통해 어떤 표면 단백질을 가진 면역세포가 6―진저롤 처리군과 대조군에서 차이가 나는지 분석하였다.

(1) 비장 속의 면역세포 변화(%)

도 46은 FACS를 사용하여 대조군(control)과 6―진저롤 처리군의 비장속의 면역세포 변화를 분석한 결과를 나타낸다.

하기 표 1은 비장 속의 각 면역세포(%)를 보여준다.

Listeria 주사 후 1일째	%gated	대조군	6―진저롤 처리군	Listeria 주사 후 4일째	%gated	대조군	6―진저롤 처리군
	CD3+CD4+	19.1	24.4		CD3+CD4+	6.23	15.71
	CD3+CD8+	11.4	14.4		CD3+CD8+	2.45	9.07
	CD11b+Ly6G+	9.5	7		CD11b+Ly6G+	11.19	8.22
	CD11c+	6.6	9.1		CD11c+	1.51	8.94

(2) 비장속의 면역세포 수 변화

하기 표 2는 비장 속의 면역 세포 수(× 10⁶ 개)를 보여준다.

Listeria 주사 후 1일째	×106 세포	대조군	6―진저롤 처리군	Listeria 주사 후 4일째	×106 세포	대조군	6―진저롤 처리군
	CD3+CD4+	19.1	26.84		CD3+CD4+	1.246	21.994
	CD3+CD8+	11.4	15.84		CD3+CD8+	0.49	12.698
	CD11b+Ly6G+	9.5	7.7		CD11b+Ly6G+	2.238	11.508
	CD11c+	6.6	10.01		CD11c+	0.302	12.516

도 47 내지 50을 참조하면, 6―진저롤 처리군은 CD4 T세포, CD8 T세포, 수지상 세포 수 및 백분율(%)이 대조군에 비해 높았다. 이러한 현상은 Listeria 주사 후 1일과 4일 모두에서 공통으로 나타나는 현상이었다. 특히 4일째는 대조군과 6―진저롤 처리군에서 현저한 차이를 보였다. 따라서 6―진저롤은 세포내 기생세균의 감염에 대항하여 CD4 T세포, CD8 T세포, 수지상 세포를 활성화시키는 역할을 하는 것으로 생각된다.

라) 6―진저롤이 세균의 생장에 직접 미치는 영향

6―진저롤 처리군의 생존율이 대조군보다 현저히 증가하는 것은 6―진저롤이 직접적으로 Listeria를 죽이기 때문일 수도 있고, 6―진저롤이 면역세포를 활성화 시켜서 이들이 Listeria를 제거 할 수도 있다. 따라서 이번에는 6―진저롤이 세균에 직접 작용하여 세균의 성장을 저해할 수 있는지를 실험해 보았다.

Listeria를 키우는 배지에 6―진저롤을 농도별로 첨가하여 배양액의 혼탁도를 분광광도계(spectrophotometer)로 600㎚에서 측정하였다. 세균이 자라게 되면 혼탁도가 증가되고, 6―진저롤이 세균의 성장을 방해하게 되면 대조군에 비해 혼탁도가 떨어질 것이다.

실험결과 6―진저롤 농도 25㎍/㎖부터 조금씩 살균효과가 나타났고, 25㎍/㎖이하에서는 효과가 없었다. 500㎍/㎖ 농도에서는 현저히 살균력이 증가하였다. 따라서 이번에는 같은 농도에서 생균수를 측정하는 실험으로 다시 확인하였다. 세균은 눈으로 보이지 않는 마이크로 단위의 크기인데, 이것이 이분열하여 고형 영양배지 상에서는 눈으로 보일 수 있는 집락을 형성하게 된다. 이것을 관찰하기 위해 고형배지를 만들고 여기에 6―진저롤을 농도별로 첨가시켜 액체배지에서 키운 배양액을 여러 단계로 희석한 다음 고형배지위에 도말하고 37℃ 배양기에 하루 동안 키운 후 집락을 헤아렸다(도 51 참조).

하기 표 3은 액체배지의 흡광도 및 고형배지 상의 집락(colony) 수를 나타낸다. *는 배양액을 1 × 10⁸배 희석한 후 100㎕를 BHI 아가(agar) 플레이트에 도말하여 24시간 키운 후 colony(세균의 집락)의 수를 헤아린 것이며, **는 6―진저롤을 처리하지 않고 키운 플레이트에서 헤아린 집락 수를 100%로 보고, 상대적 수를 백분율(%)로 나타낸 것이다.

6―진저롤(㎍/㎖)	0	25	100	500
집락(colony) 수 *	287	253	221	109
비교 % **	100	88	77	38
흡광도(600㎚)	0.765	0.749	0.748	0.692

실험결과 6―진저롤 500㎍/㎖처리 농도에서 현저히 살균효과가 높아짐을 보였고, 25㎍/㎖ 아래의 농도에서는 대조군과 유사하여 살균효과가 없는 것으로 판단되었다. 본 실험의 결과 6―진저롤이 Listreia균의 생육을 현저히 저해할 것으로 판단되는 농도는 500㎍/㎖이었다. 이것을 마우스(20g)에 주사농도로 환산하면, 10㎎/마우스이다. 이는 본 실험에서 주사한 농도(50㎍/마우스)의 200배이다. 약 12% 효과가 있다고 생각되어지는 25㎍/㎖의 경우도 본 실험에서 주사한 농도(50㎍/mouse)의 10배이다. 따라서 마우스에 주사하여 Listeria 균에 대해 보호 작용을 나타낸 것은 6―진저롤이 직접 박테리아를 죽여서 나타낸 효과로 보기 어려울 것으로 판단되었다.

Staphylococcus aureus에 대해서도 상기 Listeria의 실험과 6―진저롤의 처리 농도를 제외하고 실질적으로 동일한 방법으로 6―진저롤이 직접 작용하여 세균의 성장을 저해할 수 있는지를 실험을 수행하였다. 하기 표 4는 Staphylococcus aureus에 대한 6―진저롤의 직접적인 효과를 실험한 결과로, 6―진저롤을 농도별로 첨가시켜 액체배지에서 키운 배양액의 흡광도를 600nm에서 측정한 데이터 및 이들 배양액을 희석한 다음 고형 배지 위에 도말하고 37℃ 배양기에 하루 동안 키운 후 집락을 헤아린 결과를 나타낸 표이다.

6―진저롤(㎍/㎖)	0	1.25	2.5	5	20
집락(colony) 수 *	218	220	223	217	219
비교 % **	100	100.9	102.3	99.5	100.5
흡광도(600㎚)	0.999	0.974	1.021	1.023	1.023

도 52는 Staphylococcus aureus에 대한 6―진저롤의 직접적인 효과를 실험한 결과로, 고형 배지를 만들고 6―진저롤을 농도별로 첨가시켜 액체배지에서 키운 배양액을 희석한 다음 고형 배지 위에 도말하고 37℃ 배양기에 하루 동안 키운 후 집락을 헤아려 6―진저롤 농도가 0일 때의 집락의 수를 100%로 하고 비교 백분율을 농도별로 표시한 그래프이다.

Pseudomonas aeruginosa에 대해서도 상기 Listeria의 실험과 6―진저롤의 처리 농도를 제외하고 실질적으로 동일한 방법으로 6―진저롤이 직접 작용하여 세균의 성장을 저해할 수 있는지를 실험을 수행하였다. 하기 표 5는 Pseudomonas aeruginosa에 대한 6―진저롤의 직접적인 효과를 실험한 결과로, 6―진저롤을 농도별로 첨가시켜 액체배지에서 키운 배양액의 흡광도를 600nm에서 측정한 데이터 및 이들 배양액을 희석한 다음 고형 배지 위에 도말하고 37℃ 배양기에 하루 동안 키운 후 집락을 헤아린 결과를 나타낸 표이다.

6―진저롤(㎍/㎖)	0	1.25	2.5	5	20
집락(colony) 수 *	200	208	198	205	204
비교 % **	100	104	99	102.5	102
흡광도(600㎚)	0.864	0.864	0.869	0.869	0.88

도 53은 Pseudomonas aeruginosa에 대한 6―진저롤의 직접적인 효과를 실험한 결과로, 고형 배지를 만들고 6―진저롤을 농도별로 첨가시켜 액체배지에서 키운 배양액을 희석한 다음 고형 배지 위에 도말하고 37℃ 배양기에 하루 동안 키운 후 집락을 헤아려 6―진저롤 농도가 0일 때의 집락의 수를 100%로 하고 비교 백분율을 농도별로 표시한 그래프이다.

상기 실험을 통해, Staphylococcus aureus 및 Pseudomonas aeruginosa에 대한 항균 활성은 6―진저롤 처리 농도가 0 내지 20(㎍/㎖)일 경우, 대조군과 유의한 차이가 없어, 6―진저롤 처리 농도가 0 내지 20(㎍/㎖)일 경우 세균 증식에 직접적인 영향을 주지 않으며, 본 실험들을 통해 얻은 항균 활성이 면역세포 항진에 의한 것이며, 세균을 직접 살균하여 얻은 것이 아님을 확인할 수 있었다.

4) 실험결과의 결론

6―진저롤은 Listeria 세균의 감염에 대해 숙주의 저항성을 높여 생존율을 증가시켰다. Listeria에 감염된 대조군 마우스는 처음에는 털이 서고, 체중이 감소하고, 4일 이후로 모두 죽었다. 6―진저롤을 투여받은 마우스는 83%가 생존하였다.

Pseudomanas aeruginosa 및 Staphylococcus aureus감염의 경우도 6―진저롤을 투여받은 마우스의 생존율이 대조군보다 현저히 높았다. Pseudomonas는 대조군 0%, 6―진저롤을 투여받은 마우스는 57% 생존, Staphylococcus는 대조군 14%, 6―진저롤을 투여받은 마우스는 71% 생존하였다(도 36 및 도 37 참조).

1일, 4일째 면역세포를 분석한 결과 6―진저롤을 투여받은 마우스는 CD4 T세포, CD8 T세포, 수지상 세포의 백분율 및 세포수가 증가하였고, 호중구(neutrophil)수는 감소하였다. 반면 대조군의 마우스는 호중구(neutrophil)의 백분율 및 세포수는 증가하였으나, CD4 T세포, CD8 T세포, 수지상세포(Dendritic 세포)의 백분율 및 세포수는 감소하였다. Listeria균이 세포내 기생세균임을 감안하면, CD8 T 세포 및 수지상 세포가 증가하는 것은 면역세포에 의한 Listeria의 제거가 활발히 일어남의 증거가 된다. 4일째 해부하여 마우스의 조직을 분석해 보니 대조군의 비장에서 용혈이 심하게 관찰된 반면 6―진저롤 처리군은 심하지 않아 혹여 6―진저롤이 Listeria 독소에 의한 적혈구의 용혈을 저해하는 효과가 있는지 시험하여 보았으나 보호 효과는 없었다. 따라서 적혈구의 용혈이 대조군보다 적게 일어난 것은 생체 내 생존한 Listeria의 수가 적었기 때문으로, 결과적으로 나타난 현상이라 판단된다. 6―진저롤이 직접 Listeria에 작용하였는지를 실험해 본 결과 직접적인 생육 저해는 일으키지만 그 농도는 현저히 높아야 가능하며, 적어도 본 실험에서 사용된 농도로서는 직접적인 살균 효과는 없는 것으로 판단되었다.

따라서 6―진저롤 처리군이 대조군보다 Listeria 감염에 대한 생존율이 높아진 원인은 6―진저롤이 CD4 T 세포, CD8 T세포, 그리고, 수지상세포의 수 및 활성을 높여서 즉, 숙주의 면역반응의 결과로 판단된다.

이하, 본 발명의 6―진저롤을 함유하는 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함은 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

< 제제예 1> 산제의 제조

6―진저롤 20㎎, 유당 100㎎ 및 탈크 10㎎을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

< 제제예 2> 정제의 제조

6―진저롤 20㎎, 옥수수전분 100㎎, 유당 100㎎ 및 스테아린산 마그네슘 2 ㎎을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

< 제제예 3> 캅슐제의 제조

6―진저롤 20㎎, 옥수수전분 100㎎, 유당 100㎎ 및 스테아린산 마그네슘 2㎎을 혼합한 후 통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

< 제제예 4> 에어로졸의 제조

6―진저롤 10㎎, 에탄올 100㎎, 클로로디플루오로메탄 300㎎의 성분을 갖는 에어로졸 용액을 제조하였다.

< 제제예 5> 주사제의 제조

6―진저롤 10㎎과 염화나트륨 90㎎을 주사용 증류수 적량에 용해시켜 주사제(처방 100㎖)를 제조하였다.

< 제제예 6> 건강식품의 제조

6―진저롤 10㎎, 비타민 혼합물 적량(비타민 A 아세테이트70㎍, 비타민 E 1.0㎎, 비타민 B 1 0.13㎎, 비타민 B 2 0.15㎎, 비타민 B 6 0.5㎎, 비타민 B 12 0.2㎍, 비타민 C 10㎎, 비오틴 10㎍, 니코틴산아미드 1.7㎎, 엽산 50㎍, 판토텐산 칼슘 0.5㎎), 무기질 혼합물 적량(황산제 1철 1.75㎎, 산화아연 0.82㎎, 탄산마그네슘 25.3㎎, 제1 인산칼륨 15㎎, 제2 인산칼슘 55㎎, 구연산칼륨 90㎎, 탄산칼슘 100㎎, 염화마그네슘 24.8㎎)을 혼합한 다음 과립을 제조하고 통상의 방법에 따라 건강식품을 제조하였다.

< 제제예 7> 건강음료의 제조

6―진저롤 30㎎, 구연산 1000㎎, 올리고당 100g, 매실농축액 2g, 타우린 1g 및 정제수를 가하여 전체 900㎖가 되도록 하며, 통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관하였다.

Claims (5)

1. 하기 화학식 1의 6―진저롤(6―gingerol)을 포함하며, 상기 6-진저롤이 면역세포 증진 촉진 또는 면역세포의 사이토카인 분비능 향상을 통해 면역세포의 종양 내 침투를 유도하며, 상기 면역세포 증진 촉진이 CD4 T세포, CD8 T세포 및 B세포의 증가를 포함하며, 상기 면역세포의 사이토카인 분비능 향상이 IFN―γ, IL―6 및 MCP―1의 분비 증가를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역세포의 종양 내 침투 촉진용 항암보조제 조성물:
   [화학식 1]
   

   

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