KR100732727B1

KR100732727B1 - 고지혈증 예방 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR100732727B1
Application number: KR1020060011754A
Authority: KR
Inventors: 강필돈; 김진원; 김미자; 강석우; 류강선; 박용수; 권무길; 이민주; 서성곤; 문석식; 조순장; 송준식
Original assignee: 근화제약주식회사
Priority date: 2006-02-07
Filing date: 2006-02-07
Publication date: 2007-06-27

Abstract

본 발명은 고지혈증 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 누에번데기로부터 얻은 기름이 콜레스테롤, 트리글리세라이드, 동맥경화 지수를 효과적으로 저하시킴을 확인함으로써 누에번데기 기름을 유효성분으로 함유하는 고지혈증 예방 및 치료용 조성물과 건강식품으로서의 용도에 관한 것이다.

누에번데기 기름, 콜레스테롤, 트리글리세라이드, 동맥경화 지수

Description

고지혈증 예방 및 치료용 조성물{Pharmaceutical compositions for hypercholesterolemia treatment}

도 1a는 누에번데기 추출농축액 초기상태의 적외선 흡수 스펙트럼이고,

도 1b는 누에번데기 추출농축액 중 물질 A의 적외선 스펙트럼이며,

도 1c는 누에번데기 추출농축액 중 물질 B의 적외선 스펙트럼이고,

도 1d는 누에번데기 추출농축액 중 물질 C의 적외선 스펙트럼이며,

도 1e는 누에번데기 추출농축액 중 물질 D의 적외선 스펙트럼이고,

도 1f는 누에번데기 추출농축액 중 물질 E(팔미토렌산)의 적외선 스펙트럼이다.

도 2a는 누에번데기 추출농축액 초기상태의 ¹H NMR 분석 스펙트럼이고,

도 2b는 누에번데기 추출농축액 물질 A의 ¹H NMR 분석 스펙트럼이며,

도 2c는 누에번데기 추출농축액 물질 B의 ¹H NMR 분석 스펙트럼이고,

도 2d는 누에번데기 추출농축액 물질 C의 ¹H NMR 분석 스펙트럼이며,

도 2e는 누에번데기 추출농축액 물질 D의 ¹H NMR 분석 스펙트럼이고,

도 2f는 누에번데기 추출농축액 물질 E(팔미토렌산)의 ¹H NMR 분석 스펙트럼이다.

도 3a는 누에번데기 추출농축액 초기상태의 ¹³C NMR 분석 스펙트럼이고,

도 3b는 누에번데기 추출농축액 물질 A의 ¹³C NMR 분석 스펙트럼이며,

도 3c는 누에번데기 추출농축액 물질 B의 ¹³C NMR 분석 스펙트럼이고,

도 3d는 누에번데기 추출농축액 물질 C의 ¹³C NMR 분석 스펙트럼이며,

도 3e는 누에번데기 추출농축액 물질 D의 ¹³C NMR 분석 스펙트럼이고,

도 3f는 누에번데기 추출농축액 물질 E(팔미토렌산)의 ¹³C NMR 분석 스펙트럼이다.

도 4a는 누에번데기 추출농축액 중 함유된 팔미틴산의 기체크로마토그래피 질량분석기를 이용한 분석스펙트럼이고,

도 4b는 누에번데기 추출농축액 중 함유된 EPA 지방산의 기체크로마토그래피 질량분석기를 이용한 분석스펙트럼이다.

도 5는 실험예 2에 따른 그룹별 체중 변화를 나타낸 그래프이다.

도 6은 실험예 2에 따른 그룹별 총 콜레스테롤 수치를 나타낸 그래프이다.

도 7은 실험예 2에 따른 그룹별 트리글리세라이드 수치를 나타낸 그래프이 다.

도 8은 실험예 2에 따른 그룹별 LDL-콜레스테롤 수치를 나타낸 그래프이다.

도 9는 실험예 2에 따른 그룹별 HDL-콜레스테롤 수치를 나타낸 그래프이다.

도 10은 실험예 2에 따른 그룹별 동맥경화지수를 나타낸 그래프이다.

도 11은 실험예 2에 따른 그룹별 간 콜레스테롤 수치를 나타낸 그래프이다.

도 12는 실험예 2에 따른 그룹별 간 트리글리세라이드 수치를 나타낸 그래프이다.

도 13은 실험예 2에 따른 그룹별 간 무게를 나타낸 그래프이다.

예로부터 무공해 생명체로 알려져 있는 누에번데기는 최근에 분말 및 추출물을 이용하여 강정제뿐만 아니라 당뇨, 고혈압 등의 성인병 치료 및 면역기능 강화를 위한 기능성 식품으로 많이 이용되어지고 있다. 현재까지 천연물로서의 누 에의 안정성과 임상적 효능은 익히 알려져 있으나 그 활성기작은 아직까지 확실치 않다.

천연물로서의 누에번데기 그 자체는 부작용이 없고 다양한 성인병 관련 질환의 치료제로서의 효능이 계속적으로 밝혀지고 있기 때문에 이를 이용한 건강보조식품, 의약품 또는 화장품 개발에 직접 많이 활용되고 있다. 그럼에도 불구하고 이 누에번데기로부터 유용한 기름성분을 분리하고 그 성분을 화학적으로 규명한 연구는 알려져 있지 않다.

누에번데기는 자양강정, 혈당강화, 항암, 노화방지, 숙취해소, 피부보습, 주름제거 등에 매우 효과적인 것으로 알려져 있다. 누에번데기 추출물에는 봄비콜, 히드록시헥사데카디엔, 봄비신 등의 단백질과 아르기닌 등의 아미노산 함량이 높아 이러한 성분들이 복합적으로 작용하여 다양한 효능을 보이는 것으로 예상되고 있다.

현재까지 누에번데기의 다양한 효능물질 및 효능기작을 정확하게 규명하지 못하고 있었으나, 본 발명을 통하여 누에번데기 기름에는 오메가-3 지방산인 리놀렌산(linolenic acid)(ω-3 지방산), 리놀산(linoleic acid), 올레산(oleic acid) 등의 다가 불포화지방산이 다량 함유되어 있는 것을 밝히고자 한다.

현재까지 누에번데기의 다양한 효능물질 및 효능기작을 정확하게 규명하지 못하고 있었으나, 본 발명자들은 누에번데기 기름에 오메가-3 지방산인 리놀렌산 (linolenic acid)(ω-3 지방산), 리놀산(linoleic acid), 올레산(oleic acid) 등의 다가불포화지방산이 다량 함유되어 있는 것을 명확히 밝히고, 이 기름의 의약, 식품, 화장품으로의 용도를 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 다양한 효능이 입증된 다가불포화지방산과 예로부터 알려진 임상적 효능을 기초로 하여 누에번데기로부터 천연 기름을 추출, 분리 및 정제하는 방법을 제공하고, 이를 주원료로 하는 기능성 식품, 의약품 또는 화장품의 원료로 사용함에 있다.

본 발명은 누에번데기 기름을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 고지혈증 예방 및 치료용 조성물 또는 건강식품을 그 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 리놀렌산 25 ~ 35 중량%, 리놀산 3 ~ 7 중량%, 올레산 35 ~ 45 중량%, 스테아린산 20 ~ 30 중량%, 팔미토렌산 0.01 ~ 2 중량%, 팔미틴산 0.01 ~ 2 중량% 및 에이코산펜타에노인산(EPA) 0.01 ~ 2 중량%를 포함하는 기름을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 고지혈증 예방 및 치료용 조성물 또는 건강식품을 또 다른 특징으로 한다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 누에번데기로부터 얻은 기름이 콜레스테롤, 트리글리세라이드, 동맥경화 지수를 효과적으로 저하시킴을 확인함으로써 누에번데기 기름을 유효성분으로 함유하는 고지혈증 예방 및 치료용 조성물과 건강식품으로서의 용도에 관한 것 이다.

본 발명은 누에번데기를 메틸에틸케톤, 아세톤, 메탄올, 에탄올, 헥산, 석유에테르, 이염화메탄, 프로판올, 이소프로판올 또는 초산에틸 중에서 선택한 1종 이상의 유기용매 및 초음파로 추출한 후에 분리 및 정제하여 천연기름을 얻고 이를 콜레스테롤 저하 등의 효능을 가지는 식품 또는 의약품의 원료로 이용하도록 구성되어 있다. 그리하여 본 발명은 1) 누에번데기를 유기용매로 추출하는 단계 ; 2) 초음파로 추출하는 단계 ; 3) 누에번데기 기름을 분리ㆍ정제하는 단계 ; 4) 누에번데기 기름의 성분을 분석하는 단계를 포함하는 누에번데기 기름의 추출, 분리 및 정제방법을 특징으로 한다.

건조된 누에번데기를 파쇄하여 가루로 만들고 누에번데기 1 킬로그람당 메틸에틸케톤, 아세톤, 메탄올, 에탄올, 헥산, 석유에테르, 이염화메탄, 프로판올, 이소프로판올 또는 초산에틸 중에서 선택한 500 밀리리터 ~ 5 리터의 혼합 또는 단일유기용매를 첨가한 후에 혼합하면서 20 ~ 80 ℃에서 1 ~ 3 시간 동안 추출하고, 초음파로 10 ~ 60 분 동안 재추출한 후에 원심분리 또는 여과를 통하여 추출액만을 분취하였다. 남아있는 누에번데기 고형물을 분리하여 같은 방법으로 3 회 반복 추출하여 추출액을 얻고, 추출액들을 모두 합하였다.

합한 추출액에 적당량의 10% 수산화나트륨 수용액을 첨가하여 혼합하고 상온에서 수 십분 동안 방치하여 층 분리시킴으로써 수용성 불순물을 제거하였고 남아있는 유기용매층에 적당량의 염화암모늄을 혼합하여 다시 한번 층 분리시켰다. 이때 유기용매층만을 분리하여 적당량의 포화소금물과 혼합하여 다시 층 분리시켜 잔존하는 수용성 불순물을 완전히 제거하고 황산마그네슘을 첨가함으로써 유기용매로부터 물을 완전히 제거하였다. 유기용매층을 5 ~ 50 ㎛의 공극을 가진 여과지로 여과한 후에 20 ~ 80 ℃에서 감압 농축하여 유기용매를 제거하였다.

위 방법으로 얻어진 누에번데기 기름에 10 ~ 30 배량의 헥산과 적당량의 활성탄을 첨가하여 30 ~ 80 ℃에서 혼합하여 30 분 ~ 2 시간 동안 불순물을 흡착 제거시킨 후, 5 ~ 50 ㎛의 공극을 가진 여과지로 여과한 여과액을 감압농축하여 유기용매를 완전히 제거함으로써 최종 분리된 누에번데기의 기름성분을 획득하였다. 누에번데기의 초기 수분 함유량은 약 65 ~ 75%이며, 획득한 기름성분은 중량기준으로 약 10 %를 차지하였다. 이와 같은 방법으로 얻은 누에번데기 기름은 색깔이 거의 없으며, 누에번데기의 고유한 냄새가 전혀 나지 않는 투명한 점도가 있는 액체이다. 이렇게 얻은 누에기름에는 적외선 스펙트럼(도 1), 핵자기공명 스펙트럼(도 2와 도 3) 등의 분광학적 방법으로 분석한 결과, 오메가-3 지방산이 25 ~ 35 % 함유되어 있음이 확인되었다.

누에번데기 기름성분에 존재하는 지방산의 구조와 조성비율을 정확히 알아내기 위하여, 누에번데기 기름을 수산화나트륨으로 가수분해한 후에 메틸화 반응하여 구성하고 있는 각각의 물질을 순수 분리하였다. 이때 사용한 관 크로마토그래피에는 관충진제로 실리카겔 또는 역상 옥타데실실리카겔, 이동상으로는 헥산, 초산에틸, 메탄올, 아세토니트릴 등의 혼합액을 사용하였다. 분리된 메틸화 지방산의 구조는 적외선, 핵자기공명 등의 분광학적 방법으로 규명하였다. 메틸화 지방산의 고속액체크로마토그래피 분리결과로 얻은 지방산의 무게를 측정함으로써, 누에번데기로부터 분리한 기름의 지방산 함유 조성비율을 규명하였다. 누에 기름은 25 ~ 35 : 3 ~ 7 : 35 ~ 45 : 20 ~ 30 중량%의 비율로 존재하는 α-리놀렌산(α-linolenic acid)(ω-3 지방산), 리놀산(linoleic acid), 올레산(oleic acid), 스테아린산(stearic acid) 등의 주요 지방산과 글리세롤이 결합된 지방산 글리세롤 에스터이며, 그밖에 팔미토렌산(palmitoleic acid), 팔미틴산(palmitic acid) 및 에이코사펜타에노인산(eicosapentaenoic acid; 일명 EPA)등이 함유되어 있음이 확인되었다. 기름에 함유된 불포화지방산과 포화지방산의 함량 비율은 약 7 : 3 이다(표 1 참조). 이들 지방산의 구조는 다음 표 2에 도시하였다.

[표 1]

누에 기름을 이루고 있는 주요 지방산과 이들의 함량 비율

지방산	지방산의 함량 비율(%)범위 (5회 반복)	지방산 함량 비율(%) 평균값
α-리놀렌산(α-linolenic acid: ω-3 지방산)	25 ~ 35	25.6
리놀산(linoleic acid)	3 ~ 7	4.8
올레산(oleic acid)	35 ~ 45	40.3
스테아린산(stearic acid)	20 ~ 30	25.3
팔미토렌산(palmitoleic aicd)	0.01 ~ 2	1.6
팔미틴산(palmitic acid)	0.01 ~ 2	1.4
에이코사펜타에노인산(EPA)	0.01 ~ 2	1

[표 2]

누에 기름의 주요 지방산의 구조식

본 발명에 따른 고도로 정제된 리놀산과 리놀렌산 등으로 구성된 누에로부터 얻은 기름은 콜레스테롤, 트리글리세라이드, 동맥경화 지수 저하 등의 효과가 있어 식품, 의약품으로의 사용이 기대된다.

본 발명에서는 누에번데기 기름이 콜레스테롤 섭취에 의한 고지혈증 유발 동물의 콜레스테롤 저하효과를 검증하기 위하여 실시하였다.

고지혈증 유발과 함께 랫트에 시험물질을 4 주간 경구투여하면서 혈액생화학 검사와 간에서의 콜레스테롤 및 트리글리세라이드를 측정하여 평가하였다. 시험군은 정상식이군(G1), 콜레스테롤 식이 음성대조군(G2), 시험물질 40 mg/kg(G3), 200 mg/kg(G4) 및 1,000 mg/kg(G5)으로 설정하였다. 시험물질 투여군의 결과는 음성대조군(2)과 비교 검토하였으며, 시험 결과는 다음과 같다.

1. 시험물질의 투여와 관련된 이상증상은 관찰되지 않았다.

2. 체중의 변화에서 유의한 변화는 관찰되지 않았다.

3. 사료섭취량에서 유의한 변화는 관찰되지 않았다.

4. 혈액생화학적인 검사에서는 총 콜레스테롤과 LDL-콜레스테롤 수치에서 음성대조군에 비하여 재현성 있는 감소 경향을 보였다.

5. 동맥경화지수는 용량상관성이 있으며 재현성있는 감소를 나타내었다.

이상의 결과로, 본 발명에 따른 누에번데기 기름에 의하여 총 콜레스테롤 수치의 감소 경향이 나타났고, 동맥경화지수에서는 재현성 있는 감소를 나타내었다.

따라서, 누에번데기 기름은 고지혈증 예방 및 치료용 조성물 또는 건강식품으로 사용하기에 적합하여, 본 발명은 누에번데기 기름을 유효성분으로 포함하는 고지혈증 예방 및 치료용 조성물 또는 건강식품을 그 특징으로 한다.

상기 누에번데기 기름은 누에번데기분말을 메틸에틸케톤, 아세톤, 메탄올, 에탄올, 헥산, 석유에테르, 이염화메탄, 프로판올, 이소프로판올 또는 초산에틸 중에서 선택한 1종 이상의 유기용매로 20 ~ 80 ℃에서 1 ~ 3 시간 동안 추출하고, 초음파로 재추출한 다음, 얻어진 추출액을 5 ~ 50 ㎛ 공극을 가진 여과지로 여과하고, 추출액에 수산화나트륨 등의 염을 첨가하여 수용성 불순물을 제거하고 남은 유 기용매를 제거하여 추출된 것이 바람직하며, 추가적으로 10 ~ 30 배량의 헥산에 녹인 후, 활성탄에 30 ~ 80 ℃에서 30 분 ~ 2 시간 동안 불순물을 흡착시킨 후, 5 ~ 50 ㎛의 공극을 가진 여과지로 여과하여 얻은 여과액을 감압 농축하여 용매를 제거하여 정제된 것도 포함된다.

또한, 상기 누에번데기 기름은 리놀렌산 25 ~ 35 중량%, 리놀산 3 ~ 7 중량%, 올레산 35 ~ 45 중량%, 스테아린산 20 ~ 30 중량%, 팔미토렌산 0.01 ~ 2 중량%, 팔미틴산 0.01 ~ 2 중량% 및 에이코산펜타에노인산(EPA) 0.01 ~ 2 중량%를 포함하며, 더욱 바람직하기로는 불포화지방산과 포화지방산이 5 ~ 8 : 5 ~ 2의 중량비율, 특히 바람직하기로는 약 7 : 3의 비율로 이루어진 것도 포함된다.

한편, 본 발명은 리놀렌산 25 ~ 35 중량%, 리놀산 3 ~ 7 중량%, 올레산 35 ~ 45 중량%, 스테아린산 20 ~ 30 중량%, 팔미토렌산 0.01 ~ 2 중량%, 팔미틴산 0.01 ~ 2 중량% 및 에이코산펜타에노인산(EPA) 0.01 ~ 2 중량%를 포함하는 기름을 유효성분으로 함유하는 고지혈증 예방 및 치료용 조성물 또는 건강식품을 모두 포함한다. 더욱 바람직하기로는 상기 기름은 불포화지방산과 포화지방산이 5 ~ 8 : 5 ~ 2의 중량비율로 이루어진 기름을 유효성분으로 함유하는 고지혈증 예방 및 치료용 조성물 또는 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 조성물은 실제 임상투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캅셀제 등이 포함되 며, 이러한 고형 제제는 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.

투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량은 화학식 1의 화합물이 약 1 ∼ 100 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 5 ∼ 50 ㎎/㎏이며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 조성물은 고지혈증의 예방 및 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 고지혈증의 개선을 목적으로 건강식품에 첨가될 수 있다. 본 발명의 누에번데기 기름을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 누 에번데기 기름을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에는 누에번데기 기름은 원료에 대하여 1 ∼ 20 중량%, 바람직하게는 5 ∼ 10 중량%의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 0.01 ∼ 0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 ∼ 0.03 g이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01 ∼ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 실시 예를 들어 본 발명을 상세히 기술할 것이나 본 발명의 범위를 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 누에번데기를 유기용매와 초음파로 추출하는 단계

건조된 누에번데기 1 킬로그람을 교반기로 파쇄하고 1 리터의 초산에틸을 첨가하여 40 ℃에서 1 시간 동안 누에성분을 추출한 후에, 10 분 동안 초음파(135 W, 42 KHz)로 다시 추출하였다. 20 ㎛ 여과지를 이용하여 여과액을 분취하였다. 이 과정을 3회 반복하여 내용물을 추출하였다.

실시예 2 : 누에번데기 기름을 분리 및 정제하는 단계

추출액과 추출액의 1/2 량의 10 % 수산화나트륨을 혼합한 후에 상온에서 30 분 동안 방치하여 층분리시킴으로써 수용성 불순물을 제거하는 공정을 2 회 반복하였고 남아있는 유기용매추출액에 1/2 량의 염화암모늄을 혼합하여 층 분리하는 공정을 다시 2회 반복하였다. 유기용매 층분리로 얻어진 추출액과 추출액 1/2 량의 포화된 염화나트륨을 혼합하여 상온에서 방치시킴으로써 잔존하는 수용성 불순물을 완전히 제거하였고, 10%(w/v) 황산마그네슘을 첨가하여 물 성분을 완전히 제거하였다. 위에서 얻은 유기용매 추출액을 10 ㎛의 공극을 가진 여과지로 다시 여과한 후에 40 ℃에서 감압 농축하여 유기용매를 제거하였다. 남은 기름에 5 배량의 50 % 이염화메탄를 첨가하여 혼합한 후에 10 ℃에서 2 시간 동안 방치시켜 이염화메탄층을 분리하여 감압 농축하여 유기용매를 제거하였다. 분취되어진 누에번데기 기름에 20 배량의 헥산을 첨가하여 녹인 후 5 %(w/v) 활성탄을 첨가하여 60 ℃에서 1 시간동안 혼합하면서 불순물을 흡착시켜 활성탄을 여과하여 없애고 감압 농축하여 유기용매를 완전히 제거함으로써 분리ㆍ정제된 누에번데기의 기름성분을 획득하였다.

실시예 3 : 누에번데기의 유기용매 추출 및 구조 분석

누에번데기(107 g, 냉동)를 분쇄기로 잘게 간 후에 에탄올(200 mL)를 넣고 교반기로 충분히 저어주었다. 거름 장치를 이용하여 고체부분을 걸러서 여과액과 찌꺼기로 나누었다. 이 찌꺼기를 초산에틸 100 mL로 3 회 추출하여 합하였다. 이 용액을 진공 농축하여 다시 헥산(150 mL)에 녹인 후, 활성탄(20 g)을 넣고 1 시 간 동안 가열하였다. 이 혼합물을 식힌 후 셀라이트(celite)를 이용하여 여과하였다. 여과액을 진공 농축하여 무색무취의 점성 액체 기름 3.4 g을 얻었다. 이 기름은 IR(도 1) 분광기, ¹H NMR(도 2) 및 ¹³C NMR(도 3) 분광기로 분석한 결과, 여러 가지 불포화 및 포화지방산들의 글리세롤 에스터인 것으로 판명하였다.

실시예 4 : 기름의 가수분해로 지방산 정제

위에서 얻은 지방(1 g)을 에탄올(50 mL)에 녹인 후 수산화나트륨(300 mg)을 넣었다. 이 혼합물을 1 시간 동안 가열 환류하였다. 반응물을 식힌 후에 차가운 1 M 염산수용액을 넣어서 pH 2가 되게 만들었다. 여기에 물(50 mL)과 초산에틸(50 mL)을 넣고 잘 흔들어준 후에 방치하여 생긴 초산에틸 층을 포화 소금물로 씻어주고 무수 황산마그네슘을 넣고 잔여 수분을 제거하였다. 이 혼합물을 여과하여 나온 여과액을 농축하여 생성물 900 mg을 얻었다. 이 생성물을 실리카겔 크로마토그래피(7 : 3 헥산/초산에틸)하여 지방산 혼합물 800 mg을 얻었다.

실시예 5 : 가수분해된 지방산의 메틸화 반응

위에서 얻은 지방산 혼합물 일부(190 mg)를 에테르(20 mL)에 녹인 후 다이아조메탄 발생 장치로부터 발생된 다이아조메탄 에테르 용액을 떨어뜨렸다. 이 혼합물을 7 시간 동안 교반하였다. 초산을 방울방울 넣어서 여분의 다이아조메탄을 제거하였다. 반응 혼합물을 포화 중탄산나트륨로 씻고 다시 포화 소금물 로 씻었다. 무수 황산마그네슘을 넣어서 흔들어준 후 여과하여 얻은 용액을 농축하여 약간의 백색 고체가 섞여있는 무색의 액체생성물(181 mg)을 얻었다. (다이아조메탄 발생 방법 : 5 g의 다이아잘드(diazald)를 40 mL의 에테르에 녹인 용액을 5 g의 수산화칼륨이 녹은 10 mL의 에탄올 용액에 온도를 60 도로 유지하면서 방울방울 떨어뜨렸다. 이때 발생되는 다이아조메탄 에테르 용액을 증류장치를 이용하여 얻었다)

실험예 1: 지방산 메틸 에스테르 혼합물의 고속액체크로마토그래피 순수 분리 및 구조 규명

지방산 혼합물의 정제는 다이나맥스(dynamax) C-18 컬럼(column)(22.5 i.d. ×250 mm)을 이용하여 고속 액체 크로마토그래피하였다. 용출은 95 % 아세토니트릴을 40 분 동안 100 % 아세토니트릴이 되게 점진적으로 변화시켰으며, 유속은 7 mL/min으로 하였다. UV 208 nm에서 흡수를 보이는 4 개의 피크를 분취 후 농축하였다. 얻은 물질의 무게는 28.0 mg(무색 액체, 물질 A), 5.2 mg(무색 액체, 물질 B), 44.0 mg(무색 액체, 물질 C), 32.0 mg(백색 고체, 물질 D)였다. 이들 물질을 적외선(IR), 자외선(UV), ¹H 핵자기공명(NMR), ¹³C 핵자기공명(NMR) 분광기로 분석하여 각각 α-리놀렌산(α-linolenic acid; ω-3 지방산), 리놀산(linoleic acid), 올레산 (oleic acid), 스테아린산(stearic acid)의 메틸 에스터로 규명되었다. 이들 물질의 물리화학적 자료는 다음과 같다.

또한, 소량 함유되어 있는 팔미토렌산(palmitoleic acid), 팔미틴산(palmitic acid) 및 에이코사펜타에노인산(eicosapentaenoic acid; 일명 EPA)은 각각 2 g, 1.9 g, 1.2 g을 얻어졌고, 이에 관한 도면은 도 1f, 2f, 3f, 4a 및 4b에 나타낸 바와 같다.

실험예 2: 콜레스테롤 저하 효과 시험

1. 투여량 및 시험군의 구성

투여량, 시험군의 구성, 투여액량 및 투여량은 다음 표 3과 같다.

[표 3]

군	성별	동물 수 (마리)	동물번호	투여액량 (ml/Kg)	투여량 (mg/Kg)
G1	Male	6	1~6	2	0
G2	Male	6	11~16	2	0
G3	Male	6	21~26	2	40
G4	Male	6	31~36	2	200
G5	Male	6	41~46	2	1,000
G1: 정상식이(콜레스테롤을 첨가하지 않은 AIN-76 식이) 및 부형제 투여군 G2: 콜레스테롤 1% 함유 AIN-76 식이 및 부형제 투여군(음성대조군) G3 ~ G5: 콜레스테롤 1% 함유 AIN-76 식이 및 시험물질 투여군

2. 군 분리 및 동물식별

가) 투여 전날 체중을 측정하고 순위화하여 특정병원부재(SPF) SD계 랫트를 군당 6 마리씩 5군으로 분리하였다.

나) 개체식별은 사육 상자 앞에 부착되는 개체식별라벨과 피크린산을 이용하여 등에 표시하였다.

3. 고지혈증 유발 및 시험물질의 투여

가) 고지혈증 유발

AIN-76에 콜레스테롤 1%를 첨가한 콜레스테롤 식이를 자유 섭취시킴과 아울러 0.5% 에탄올을 함유한 음수를 공급하여 고지혈증을 유발하였다.

나) 시험물질의 조제 방법

시험물질 최고용량을 1,000 mg/kg으로 설정하고 공비를 5로 하여 아래로 2 개의 용량군을 추가하였다. 시험물질을 칭량하여 부형제인 Corn oil에 용해하여 1,000 mg/kg의 최고용량군의 투여할 시험물질을 조제하였다. 아래의 용량군의 투여할 시험물질은 최고용량군의 투여할 시험물질을 동일한 부형제를 이용하여 단계별로 희석하여 조제하였다. 시험물질의 조제는 매일 투여 전에 실시하였다.

배부 피부 고정법으로 동물을 고정하고 고지혈증 유발을 위한 식이의 공급한 날(Day 0)부터 시험물질을 매일 1 회 4 주간 경구 투여하였다.

4. 시험항목

가) 일반증상 관찰

실험기간 중 전 동물에 대하여 1 일 1 회 이상 매일 관찰하였고, 특이한 이상증상은 관찰되지 않았다.

나) 체중 측정

모든 동물에 대하여 입수시, 군 분리시, 시험물질 투여 개시시, 시험기간 중 주 1 회 그리고 부검일에 절식 후 체중을 측정하였다.

[표 4]

체중 변화(단위: g)

그룹	Dose (mg/kg)	Day 0	1 주	2 주	3 주	4 주
G1	0	126.97± 5.230	156.15± 8.516	199.82± 5.650	227.39± 12.283	260.06± 12.815
G2	0	127.92± 4.780	156.94± 11.023	198.92± 15.598	218.85± 23.847	245.47± 24.753
G3	40	127.29± 4.259	157.20± 6.559	198.29± 7.932	218.92± 8.536	242.37± 11.426
G4	200	128.54± 3.501	160.32± 7.784	204.82± 10.911	229.31± 12.862	250.75± 14.160
G5	1,000	128.40± 4.271	158.01± 7.426	197.57±10.132	221.09± 11.683	245.39± 11.242

상기 표 4와 도 5에 나타낸 바와 같이, 체중의 변화에서 유의한 변화는 관찰되지 않았다.

다) 사료 섭취량

주 1회 측정하였다.

[표 5]

사료 섭취량(단위: g)

그룹	Dose (mg/kg)	1 주	2 주	3 주	4 주
G1	0	20.64±6.310	24.73±17.106	15.17±1.813	19.34±2.651
G2	0	22.35±1.557	18.81±4.253	13.94±1.616	20.44±5.331
G3	40	18.04±5.408	15.06±1.841	14.71±1.841	16.17±1.426
G4	200	14.40±1.941	19.09±4.481	17.01±0.880	15.93±3.114
G5	1,000	13.30±3.632	15.65±2.151	15.91±1.712	18.63±2.315

상기 표 5에 나타낸 바와 같이, 사료 섭취량에서 유의한 변화는 관찰되지 않았다.

라) 혈액생화학적인 검사 [도 6 ~ 10 참조]

혈액생화학검사는 2회 실시하였다. 1차 검사는 시험물질 투여 후 2 주째에, 2차 검사는 부검시에 실시하였다. 1차 검사시는 동물을 하룻밤 절식시킨 후 동물의 미정맥으로부터 채혈하였고, 2차 검사시는 동물을 하룻밤 절식시켜 마취 하에 개복하여 후대정맥에서 채혈하였다. 채혈한 혈액을 3,000 rpm, 10 분간 원심분리하여 얻은 혈청으로 아래 항목에 관해 측정하였다.

검사항목	단위	방법
TG (Triglyceride)	mg/dl	enzyme 법
CHO (Total cholesterol)	mg/dl	enzyme 법
LDL (LDL-cholesterol)	mg/dl	enzyme 법
HDL (HDL-cholesterol)	mg/dl	enzyme 법
* 자동분석장치(AU400, Olympus, Japan)를 이용하여 측정.

동맥경화지수(atherogenic index, AI)는 (Total cholesterol - HDL-cholesterol) 수치를 HDL-콜레스테롤 수치로 나누어 산출하였다.

① 1 차 검사(시험물질 투여 2 주째)

[표 6]

혈청 내 지질 함유량 및 동맥경화지수(AI)

군	Dose (mg/kg)	총 콜레스테롤 (mg/dl)	트리글리세라이드 (mg/dl)	LDL- 콜레스테롤 (mg/dl)	HDL- 콜레스테롤 (mg/dl)	AI
G1	0	86.36± 6.712	142.04± 41.771	21.08± 2.264	50.58± 5.347	0.71± 0.108
G2	0	149.58± 31.669	98.56± 19.900	103.98± 26.680	26.70± 5.657	4.70± 1.291
G3	40	149.95± 12.807	115.85± 35.357	99.30± 12.830	28.09± 2.824	4.37± 0.516
G4	200	145.44± 30.411	101.77± 25.215	91.54± 27.004	33.42± 5.109	3.39± 0.927
G5	1,000	123.93± 25.634	83.87± 29.668	85.77± 6.031	27.91± 3.305	3.52± 1.226
평균값± S.D. (n=6) AI = (총 콜레스테롤 - HDL-콜레스테롤) / HDL-콜레스테롤

시험물질 투여군의 총 콜레스테롤과 LDL-콜레스테롤이 음성대조군(G2)에 비하여 용량 상관성 있게 감소하는 경향을 보였다. 동맥경화지수는 음성대조군(G2)과 비교하여 각각 93%(G3), 72%(G4) 및 75%(G5)로 일관성 있는 감소 경향을 보였다.

② 2 차 검사(시험물질 투여 4 주째)

[표 7]

혈청 내 지질 함유량 및 동맥경화지수(AI)

그룹	Dose (mg/kg)	총 콜레스테롤 (mg/dl)	트리글리세라이드 (mg/dl)	LDL- 콜레스테롤 (mg/dl)	HDL- 콜레스테롤 (mg/dl)	AI
G1	0	59.14± 8.595	74.24± 21.866	8.76± 1.882	40.12± 5.370	0.47± 0.062
G2	0	115.19± 22.378	104.75± 35.860	71.71± 18.591	26.50± 5.024	3.48± 1.239
G3	40	119.62± 8.173	136.95± 14.746	67.76± 7.413	29.53± 2.098	3.06± 0.274
G4	200	126.55± 30.130	121.47± 43.265	72.63± 20.481	31.22± 4.164	3.04± 0.638
G5	1,000	96.12± 17.059	84.77± 19.861	58.72± 14.357	25.03± 1.836	2.87± 0.848
평균값±S.D. (n=6) AI = (총 콜레스테롤 - HDL-콜레스테롤) / HDL-콜레스테롤

시험물질 1,000 mg/kg 투여군에서 총 콜레스테롤, 트리글리세라이드 및 LDL-콜레스테롤이 음성대조군(G2)에 비하여 감소하는 경향을 보였다. 동맥경화지수는 음성대조군(G2)과 비교하여 각각 88%(G3), 87%(G4) 및 83%(G5)로 감소하는 경향을 보였다.

마) 간 무게 및 조직검사

혈액검사를 위한 채혈이 끝난 동물은 복대동맥을 절단하여 방혈치사 시킨 후 모든 투여군의 간을 적출하였다. 적출한 간의 무게를 전자저울을 이용하여 측정한 후 이등분으로 나누어 Deep freezer에 보관하였다. 보관된 간 조직을 이용하여 콜레스테롤 및 트리글리세라이드를 측정하였다.

[표 8]

간 무게 및 간 내 지질함유량

그룹	Dose (mg/kg)	간 무게 (g)	총 콜레스테롤 (mg/200 g liver)	트리글리세라이드 (mg/200 g liver)
G1	0	7.27±0.640	355.86±151.356	68.46±11.15
G2	0	8.30±0.999	635.51±83.171	202.19±68.43
G3	40	8.09±0.530	578.96±227.440	149.35±46.04
G4	200	8.57±0.537	811.77±55.343	144.89±45.97
G5	1,000	7.91±0.440	715.11±246.341	158.97±62.04

상기 표 8 및 도 11 ~ 13에 나타낸 바와 같이, 투여군의 간 무게를 음성대조군(G2)과 비교하여 보면 1,000 mg/kg 투여군(G5)에서 감소하는 경향을 보였으며, 간의 조직에서 콜레스테롤 및 트리글리세라이드를 측정한 결과 트리글리세라이드가 감소하는 경향을 보였다.

이상의 결과로 보면, 본 발명에 따른 누에번데기 기름에 의하여 총 콜레스테롤치 및 트리글리세라이드 수치의 감소 경향이 나타났고, 동맥경화지수에서도 재현성 있는 감소를 나타내었다.

실험예 3 : 급성 독성실험

본 발명의 누에번데기 기름의 급성 독성을 알아보기 위하여, 다음과 같은 방법으로 급성 독성실험을 하였다.

실험동물로 6주령의 특정병원부재(SPF) SD계 랫트를 사용하였으며, 군당 5마리씩 나누었다. 상기 실시예에서 얻은 누에번데기 기름을 0.5% 메틸셀룰로오스 용액에 현탁하여 0.1 g/㎏의 용량으로 단회 경구 투여하였다.

시험물질 투여 후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적 검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강 장기의 이상여부를 관찰하였다.

시험결과, 시험물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상은 없었고 폐사된 동물도 없었으며, 또한 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다.

이상의 결과 상기 누에번데기 기름은 랫트에서 0.1 g/㎏까지 독성변화를 나타내지 않았으며, 경구 투여 최소치사량(LD₅₀)은 적어도 0.1 g/㎏ 이상인 안전한 물질로 판단되었다.

제제예 1 : 약제 제조

1) 정제 제조

본 발명의 누에번데기 기름의 10 ㎎을 유효성분으로 함유하는 정제는 다음과 같은 방법으로 제조하였다.

누에번데기 기름 1.0 g을 락토오스 7.0 g, 결정성 셀룰로오스 1.5 g, 마그네슘 스테아레이트 0.5 g과 혼합한 후 직타법(direct tableting method)에 의하여 정제를 제조하였다.

각 정제의 총량은 100 ㎎이고, 그 중 유효성분의 함량은 10 ㎎이다.

2) 캅셀제 제조

본 발명의 누에번데기 기름의 10 ㎎을 유효성분으로 함유하는 캅셀제는 다음 과 같은 방법으로 제조하였다.

누에번데기 기름 1.0 g을 옥수수 전분 5.0 g, 카르복스 셀룰로오스 4.0 g과 잘 혼합하여 분말을 제조하였다. 경질 캅셀에 상기 분말 100 ㎎을 넣어 캅셀제를 제조하였다.

3) 주사액제의 제조

누에번데기 기름 1 g, 염화나트륨 0.6 g 및 아스코르브산 0.1 g을 증류수에 용해시켜서 100 ㎖을 만들었다. 이 용액을 병에 넣고 20 ℃에서 30분간 가열하여 멸균시켰다.

제제예 2 : 식품 제조

본 발명의 누에번데기 기름을 포함하는 식품들을 다음과 같이 제조하였다.

1) 조리용 양념의 제조

누에번데기 기름 20 ∼ 95 중량%을 된장 및 간장과 같은 일반 양념에 첨가하여 건강 증진용 조리용 양념을 제조하였다.

2) 토마토케찹 및 소스의 제조

누에번데기 기름 0.2 ∼ 1.0 중량%를 토마토케찹 또는 소스에 첨가하여 건강 증진용 토마토케찹 또는 소스를 제조하였다.

3) 밀가루 식품의 제조

누에번데기 기름 0.5 ∼ 5.0 중량%를 밀가루에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.

4)　스프 및 육즙(gravies)의 제조

누에번데기 기름 0.1 ∼ 5.0 중량%를 스프 및 육즙에 첨가하여 건강 증진용 육가공 제품, 면류의 수프 및 육즙을 제조하였다.

5) 다류의 제조

누에번데기 기름 0.1 ∼ 10 중량%와 액상과당(0.5%), 올리고당 (2%), 설탕(2%), 식염(0.5%), 물(75%)과 같은 부재료를 섞어 건강 증진용 다류를 제조하였다.

제제예 3 : 음료의 제조

1) 탄산음료의 제조

설탕 5 ∼ 10%, 구연산 0.05 ∼ 0.3%, 카라멜 0.005 ∼ 0.02%, 비타민 C 0.1 ∼ 1%의 첨가물을 혼합하고, 여기에 79 ∼ 94%의 정제수를 섞어서 시럽을 만들고, 상기 시럽을 85 ∼ 98 ℃에서 20 ∼ 180초간 살균하여 냉각수와 1:4의 비율로 혼합한 다음 탄산가스를 0.5 ∼ 0.82 % 주입하여 누에번데기 기름을 함유하는 탄산음료를 제조하였다.

2) 건강음료의 제조

액상과당(0.5%), 올리고당(2%), 설탕(2%), 식염(0.5%), 물(75%)과 같은 부재료와 누에번데기 기름을 균질하게 배합하여 순간 살균을 한 후 이를 유리병, 패트병 등 소포장 용기에 포장하여 건강음료를 제조하였다.

3) 야채쥬스의 제조

누에번데기 기름 5 g을 토마토 또는 당근 쥬스 1,000 ㎖에 가하여 건강 증진용 야채쥬스를 제조하였다.

4) 과일쥬스의 제조

누에번데기 기름 1 g을 사과 또는 포도 쥬스 1,000 ㎖에 가하여 건강 증진용 과일쥬스를 제조하였다.

이상에서 상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 누에번데기 기름이 콜레스테롤 저하에 기인하는 고지혈증, 동맥경화 등의 각종 심혈관계 질환 예방 및 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

Claims

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리놀렌산 25 ~ 35 중량%, 리놀산 3 ~ 7 중량%, 올레산 35 ~ 45 중량%, 스테아린산 20 ~ 30 중량%, 팔미토렌산 0.01 ~ 2 중량%, 팔미틴산 0.01 ~ 2 중량% 및 에이코산펜타에노인산(EPA) 0.01 ~ 2 중량%의 지방산을 포함하는 것을 특징으로 하는 고지혈증 예방 및 치료용 조성물.
제 6 항에 있어서, 상기 지방산은 불포화지방산과 포화지방산이 5 ~ 8 : 2 ~ 5의 중량 비율로 이루어진 것을 특징으로 하는 고지혈증 예방 및 치료용 조성물.