KR20170004210A

KR20170004210A - 누에 번데기 농축 기름 분말, 이를 함유한 조성물 및 그의 제조 방법

Info

Publication number: KR20170004210A
Application number: KR1020150094245A
Authority: KR
Inventors: 권무길; 강신우; 임세경
Original assignee: 권무길
Priority date: 2015-07-01
Filing date: 2015-07-01
Publication date: 2017-01-11
Also published as: KR101738754B1

Abstract

본 발명의 누에 번데기를 복합균주 배양액을 이용하여 발효추출한 후에 분리 및 정제하여 천연기름을 얻고, 이를 동결 건조하여 분말을 형성하였으며, 이를 콜레스테롤 저하 등의 효능을 가지는 기능성 식품 또는 의약품의 원료 또는 콜라겐 생합성 증가, 콜라게네이즈 억제와 같이 주름 개선 효과가 있으며, 또한 피부 보습 효능도 나타냄을 확인함으로써 누에 번데기 농축 기름 분말을 함유하는 피부 개선용 화장료 조성물로서의 용도로 이용하도록 구성되어 있다.

Description

누에 번데기 농축 기름 분말, 이를 함유한 조성물 및 그의 제조 방법{Powder from the concentrat of silkworm oil, compositions containing the same and the process thereof}

본 발명은 누에 번데기 농축 기름 분말, 이를 함유한 조성물 및 그의 제조 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 고지혈증 예방 및 개선, 피부 개선 효과를 가진 누에 번데기 농축 기름 분말, 이를 함유한 조성물 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명은 누에 번데기 농축 기름 분말, 이를 포함한 조성물 및 이들의 제조방법에 관한 것으로, 특히 고지혈증 예방 및 개선용 조성물, 피부 개선용 화장료 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 누에 번데기로부터 얻은 기름 분말이 콜레스테롤, 트리글리세라이드, 동맥경화 지수 저하와 콜라겐 생합성 증가, 콜라게네이즈 억제와 같이 주름 개선 효과가 있으며, 또한 피부 보습 효능도 나타냄을 확인함으로써 누에 번데기 농축 기름 분말을 함유하는 고지혈증 예방 및 개선용 조성물, 피부 개선용 화장료 조성물로서의 용도에 관한 것이다.

예로부터 무공해 생명체로 알려져 있는 누에 번데기는 최근에 분말 및 추출물을 이용하여 강정제뿐만 아니라 당뇨, 고혈압 등의 성인병 치료 및 면역기능 강화를 위한 기능성 식품으로 많이 이용되어지고 있다. 현재까지 천연물로서의 누에의 안정성과 임상적 효능은 익히 알려져 있으나 그 활성기작은 아직까지 확실치 않다.

천연물로서의 누에 번데기 그 자체는 부작용이 없고 다양한 성인병 관련 질환의 치료제로서의 효능이 계속적으로 밝혀지고 있기 때문에 이를 이용한 건강보조식품, 의약품 또는 화장품 개발에 직접 많이 활용되고 있다.

누에 번데기는 자양강정, 혈당강화, 항암, 노화방지, 숙취해소, 피부보습, 주름제거 등에 매우 효과적인 것으로 알려져 있다. 누에 번데기 추출물에는 봄비콜, 히드록시헥사데카디엔, 봄비신 등의 단백질과 아르기닌 등의 아미노산 함량이 높아 이러한 성분들이 복합적으로 작용하여 다양한 효능을 보이는 것으로 예상되고 있다.

현재까지 누에 번데기의 다양한 효능물질 및 효능기작을 정확하게 규명하지 못하고 있었으나, 누에 번데기 기름에는 오메가-3 지방산인 리놀렌산(linolenic acid)(ω-3 지방산), 리놀산(linoleic acid), 올레산(oleic acid) 등의 다가 불포화지방산이 다량 함유되어 있는 것이 밝혀져 있다.

한국특허 제10-0573466호(출원번호 제10-2004-076364호)은 "누에 번데기로부터 기름의 추출, 분리 및 정제방법"에 관한 발명이며, 누에 번데기분말을 초산에틸 등의 유기용매로 추출하고, 초음파 추출한 다음 여과하고, 수산화나트륨으로 불순물을 제거하여 누에 번데기름 추출액을 얻고, 얻어진 누에번데 기름을 헥산에 용해후 활성탄으로 불순물을 제거하고, 여과한 다음 감압 농축하여 정제된 누에 번데기 기름을 얻고, 불포화지방산과 포화지방산이 7:3 중량비율로 이루어진 누에 번데기기름이 소개되어 있으며, 한국특허 제10-075117호(출원번호 제10-2006-0011753호)은 "누에 번데기 기름을 유효성분으로 함유하는 건강식품"에 관한 발명으로, 상기 특허 제10-0573466호에서 얻어진 누에 번데기 기름을 함유한 고지혈증예방용 건강식품이 소개되어있고, 한국특허 제10-0732727호(출원번호 제10-2006-0011754호)은 "고지혈증 예방 및 치료용 조성물"에 관한 발명으로, 상기 특허 제10-0573466호에서 얻어진 누에 번데기 기름을 함유한 고지혈증 예방 및 치료용 약제조성물이 소개되어 있으며, 한국특허 제10-0764928호(출원번호 제10-2006-0011755호)은 "누에 번데기 기름을 유효성분으로 함유한 피부개선용 화장료 조성물"에 관한 발명으로, 상기 특허 제10-0573466호에서 얻어진 누에 번데기 기름을 함유한 피부개선용 화장료 조성물이 소개되어 있다.

그러나, 상기와 같은 선행기술의 누에 번데기 기름 중에는 지방산 함량이 극히 적을 뿐만 아니라, 비록 정제공정이 포함되어 있으나 여전히 다량의 불순물이 함유되어 있고, 불포화지방산과 포화지방산의 비율이 7:3으로 혼합되어 있어 고지혈증 개선효과를 극대화시킬 수 없었는바, 지방산이 다량 함유되고 불포화지방산과 지방산이 이상적으로 배합된 누에 번데기 기름 분말 및 이를 함유한 약제, 식품 및 화장품 성분 제제의 꾸준한 개발이 요구되어 왔다.

본 발명의 목적은 고지혈증 예방 및 개선, 피부 개선 효과를 가진 누에 번데기 농축 기름 분말, 이를 함유한 조성물 및 그의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 누에 번데기를 복합균주 배양액을 이용하여 발효추출한 후에 분리 및 정제하여 천연기름을 얻고, 이를 동결 건조하여 분말을 형성하였으며, 이를 콜레스테롤 저하 등의 효능을 가지는 식품 또는 의약품의 원료 또는 콜라겐 생합성 증가, 콜라게네이즈 억제와 같이 주름 개선 효과가 있으며, 또한 피부 보습 효능도 나타냄을 확인함으로써, 누에 번데기 농축 기름 분말을 유효성분으로 함유하는 건강기능성 보조식품 및 피부 개선용 화장료 조성물로서의 용도로 이용하도록 구성되어 있다.

건조된 누에 번데기를 파쇄하여 가루로 만들고 누에 번데기 1 킬로그람 당 바실러스(Bacillus sp), 아스퍼질러스(Aspergillus sp) 등의 미생물의 복합균주 배양액 10 L를 혼합하여 pH 4.5~6.5, 온도 35~40 ℃, 반응시간 70~75 시간 동안 발효 추출하였으며, 원심분리 또는 여과를 통하여 추출액만을 분취하였다. 남아있는 누에 번데기 고형물을 분리하여 같은 방법으로 3 회 반복추출하여 추출액을 얻고, 추출액들을 모두 합하였다.

위 방법으로 얻어진 누에 번데기 기름에 10~30 배량의 헥산과 적당량의 활성탄을 첨가하여 30~80 ℃에서 혼합하여 30 분~2 시간 동안 불순물을 흡착 제거시킨 후, 5~50 ㎛의 공극을 가진 여과지로 여과한 여과액을 감압농축하여 유기용매를 완전히 제거함으로써 최종 분리된 누에 번데기의 기름성분을 획득하였다. 누에 번데기의 초기 수분 함유량은 약 65~75 %이며, 획득한 기름성분은 중량기준으로 약 10 %를 차지하였다. 이와 같은 방법으로 얻은 누에 번데기 기름은 색깔이 거의 없으며, 누에 번데기의 고유한 냄새가 전혀 나지 않는 투명한 점도가 있는 액체이다.

계속하여, 얻어진 누에 번데기 기름에 덱스트로즈(Dextrose), 레시틴(Lecithin), 실크펩타이드(Silkpeptide) 등을 포함하는 부형제를 혼합하였으며, 이 혼합물을 교반, 유화시키고 동결 건조시켜, 누에 번데기 농축 기름 분말을 얻었다.

[표 1] 일반정제기름(특허 제10-0573466호)과 누에 번데기 농축 기름 분말을 이루고 있는 주요 지방산과 이들의 함량 비율 비교표.

상기 표 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 본원발명의 발효추출 방법에 따르면, 지방산 중 비록 올레산 및 스테아린산의 함유량은 낮았지만, 건강유효성분인 순수한 α-리놀렌산(ω-3 지방산)과 EPA의 함유량을 현저히 높일 수 있었다.

[표 2] 누에 번데기 농축 기름 분말에 함유된 주요 지방산의 구조식

본 발명에 따른 고도로 정제된 리놀산과 리놀렌산 등으로 구성된 누에로부터 얻은 누에 번데기 기름 분말은 콜레스테롤, 트리글리세라이드, 동맥경화 지수 저하작용이 있으며, 콜라겐 생합성 증가, 콜라게네이즈 억제와 같이 주름 개선 효과, 피부 보습 효능등의 효과가 있어 식품, 의약품, 화장품으로의 사용이 기대된다.

본 발명에서는 누에 번데기 농축 기름분말의 콜레스테롤 섭취에 의한 고지혈증 유발 동물의 콜레스테롤 저하효과 검증과, 기니픽을 이용하여 제모한 피부에 피부건조증을 유발한 후 시험물질(누에 번데기 불포화지방산)에 의한 피부 보습상태의 개선 효능을 검증하기 위하여, 실험을 실시하였다.

고지혈증 유발과 함께 랫트에 시험물질을 4 주간 경구투여하면서 혈액생화학 검사와 간에서의 콜레스테롤 및 트리글리세라이드를 측정하여 평가하였다. 시험군은 정상식이군(G1), 콜레스테롤 식이 음성대조군(G2), 시험물질 40 mg/kg(G3), 200 mg/kg(G4) 및 1,000 mg/kg(G5) 및 양성대조군(G6)으로 설정하였다. 시험물질 투여군의 결과는 음성대조군과 양성대조군을 비교 검토하였으며, 시험 결과를 요약하면 다음과 같다.

1. 시험물질의 투여와 관련된 이상증상은 관찰되지 않았다.

2. 체중의 변화에서 유의한 변화는 관찰되지 않았다.

3. 사료섭취량에서 유의한 변화는 관찰되지 않았다.

4. 혈액생화학적인 검사에서는 총 콜레스테롤과 LDL-콜레스테롤 수치에서 음성대조군에 비하여 재현성 있는 감소 경향을 보였다.

5. 동맥경화지수는 용량상관성이 있으며 재현성있는 감소를 나타내었다.

이상의 결과로, 본 발명에 따른 누에 번데기 농축 기름 분말에 의하여 총 콜레스테롤 수치의 감소 경향이 나타났고, 동맥경화지수에서는 재현성 있는 감소를 나타내었다.

피부보습상태의 개선은 제모한 왼쪽 옆구리를 대조군으로 하고, 제모 및 피부건조증을 유발한 후 시험물질을 도포한 오른쪽의 보습도를 대조군의 보습도와 비교하여 평가한 결과, 대조군의 보습도는 시간의 경과에 따라 서서히 증가한 반면, 시험물질 도포군은 2 회차 측정부터 보습도가 급격히 증가하여 그 상태가 계속 유지되는 결과를 보였다. 또한, 콜라겐 생합성 시험과 콜라게네이즈 억제능 시험을 통한 유효성 검증에서, 시료 누에 번데기 유래의 불포화지방산은 대조군과 비교시 유의한 수준으로(p<0.01) 콜라겐 생합성을 증가시켰고, 이러한 결과를 종합해 볼때, 누에 번데기 유래의 불포화지방산은 주름 개선 효과가 있음을 알 수 있었다.

따라서, 본 발명에 따른 누에 번데기 농축 기름 분말은 고지혈증 예방 및 개선용 조성물 또는 건강식품으로 사용하기에 적합하며, 피부 개선용 화장료로 사용하기에 적합하여, 본 발명은 누에 번데기 기름 분말을 포함하는 고지혈증 예방 및 개선용 조성물 또는 건강식품과 피부 개선용 화장료 조성물을 그 특징으로 한다.

도 1은 누에 번데기 기름 분말을 제조과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 누에 번데기 기름 분말의 입자 구조의 나타낸 모식도이다.

이하, 본 발명에 따른 실시예와 실험예를 기재한다.

실시예 1 : 누에 번데기를 발효 추출하는 단계

건조된 누에 번데기를 파쇄하여 가루로 만들고 누에 번데기 1 킬로그람 당 바실러스 섬틸리스(Bacillus subtlis), 아스퍼질러스 카제이(Aspergillus casei) 복합균주 배양액 10 L를 혼합하여 pH 4.5~6.5, 온도 35~40 ℃, 반응시간 70~75 시간 동안 발효 추출하였으며, 원심분리 또는 여과를 통하여 추출액만을 분취하였다. 남아있는 누에 번데기 고형물을 분리하여 같은 방법으로 3 회 반복추출하여 추출액을 얻고, 추출액들을 모두 합하였다.

실시예 2 : 누에 번데기 기름을 분리 및 정제하는 단계

상기 실시예 1 방법으로 얻어진 누에 번데기 추출액을 1 ㎛ 필터로 여과후 동결 건조시켜 실크펩타이드 분말을 얻었다. 또한 누에 번데기 추출액을 10~30 배량의 헥산과 적당량의 활성탄을 첨가하여 30~80 ℃에서 혼합하여 30 분~2 시간 동안 불순물을 흡착 제거시킨 후, 5~50 ㎛의 공극을 가진 여과지로 여과한 여과액을 감압농축하여 유기용매를 완전히 제거함으로써 최종 분리된 누에 번데기의 기름성분을 획득하였다. 누에 번데기의 초기 수분 함유량은 약 65~75 %이며, 획득한 기름성분은 중량기준으로 약 10 %를 차지하였다. 이와 같은 방법으로 얻은 누에 번데기 기름은 색깔이 거의 없으며, 누에 번데기의 고유한 냄새가 전혀 나지 않는 투명한 점도가 있는 액체이다.

실시예 3 : 누에 번데기 기름을 농축하는 단계

1) 결정화를 이용한 농축

메탄올 4 L에 요소 1.5 kg을 넣고 70 ℃에서 완전 용해시킨 후 실시예 2의 방법에 의해 정제된 누에 기름을 5∼8 회 분할하여 주입하며 40 ℃까지 냉각시킨 후 여과한다. 여과된 액을 진공 회전 증발기로 메탄올을 증발시킨 후 남아있는 고형분에 물 1 L와 소량의 염산을 넣고 교반한다. 이후 상층부의 지방산 층을 회수한다. 다시 메탄올 4 L에 요소 1.5 kg을 재차 넣고 70 ℃에서 완전 용해시킨 후 회수된 지방산을 5∼8 회 분할하여 주입하며 10 ℃까지 냉각한다. 이 후 이 액을 다시 여과하여 고체입자를 회수하며 이 고체입자에 물(2 L)과 헥산(2 L)을 넣고 소량의 염산을 넣고 분해하여 상층부액을 회수한다. 여기에 물로 2∼3 회 세정한 후 헥산을 제거시킨다. 여기에 다시 헥산을 700∼1400 ml 넣고 완전 용해시킨 후 -10∼-5 ℃까지 교반하지 않고 냉각한다. 이후 얻어지는 결정체를 여과하여 헥산을 제거시킨다.

2) 에스테르화를 이용한 농축

(1) 지방산 알킬 에스테르 제조단계

실시예 2의 방법에 의해 정제된 누에 기름을 물과 1:1 부피비로 첨가 후 온도 38~40 ℃, 효소촉매로는 유지의 트리아실글리세롤에 아실 사슬 특이성(acyl chain specificity)과 유지의 트리글리세롤 탄소에 1,3-위치 특이성을 갖는 리파제를 첨가하여 교반속도 200 rpm으로 24 시간동안 가수분해 반응을 실시하였다. 반응개시 4 시간 후부터 40 ℃로 가온된 주정용 에탄올을 유지와 에탄올의 몰비가 3:1 수준에 도달할 때까지 첨가하여 에스테르 교환반응을 실시하고 지방산 에틸 에스테르화물을 생산하였다.

(2) 예비증류단계

상기 (1)단계에서 제조된 지방산 에틸에스테르를 분자증류장치를 이용하여 연속적으로 증류하였다. 이때 온도는 150 ℃, 진공도는 0.05 mmHg를 유지하였다.

(3) 감압 분별증류단계

상기 (2)단계에서 제조된 증류물을 농축하기 위하여 감압증류탑에서 탑저온도 180 ℃, 탑정온도 150 ℃ 탑정의 진공도 5 mmHg, 환류비 5(환류비(Reflux ratio)=L/D, L=유입(feed)량, D=유출(output)량)의 조건으로 연속적으로 증류하였다. 이때 증류수율은 80 % 였다.

실시예 4 : 누에 번데기 농축 기름을 분말화하는 단계

덱스트로즈(Dextrose)(10-20 %), 레시틴(Lecithin)(10-20 %), 실크펩타이드(Silkpeptide)(5-10 %) 등을 포함하는 부형제를 물에 넣고 혼합하였으며, 상온에서 상기 혼합물을 5000 r/min 및 10000 r/min에서 각각 15 분간 교반하였다. 생성된 혼합물에 상기 실시에 3에서 얻어진 누에 번데기 농축물을 첨가하고, 1 시간 간 10000 r/min에서 교반을 통해 유화하여 유화액을 제조하였으며, 제조한 유화액은 액상 질소로 동결한 다음 동결건조기로 처리하여 누에 번데기 농축 기름 분말을 제조하였다(0.55 ㎏). 화장품 조성물 제제 필요에 따라 누에 번데기 농축물에 글라브리딘(Glabridin)과 같은 미백개선제를 포함시켜 유화액을 제조하고, 여기에 피부 흡수촉진제로 폴리글리세릴올레이트(Plurol Oleque), PEG-8 글리세릴 카프리에이트/카프레이트(Labrasol), PEG-8 글리세릴 리놀레이트(Labrafil 2609), 소르비탄 지방산 에스테르(Span), 폴리옥시에틸렌-소르비탄-지방산 에스테르(Tween)로 구성된 그룹 중에서 1개 이상을 선택하여 첨가, 분산 시켜 제제화 할수 있다.(0-10 %)

제제예

1. 연질캅셀 (건강기능성 식품)

연질캅셀중 처방(㎎) :

누에농축오일 동결건조분말 100

팜유 40

밀납 15

레시틴 15

콩기름 220

총 390 ㎎

제조방법 : 상기 처방의 조성량을 갖고 균질하게 혼합하여 현탁액을 제조한후, 젤라틴 연질캅셀에 충진하여 제조한다.

2. 화장수 제조 [표 3]

<제조방법>

1) 번호 2, 3, 4의 원료를 칭량한 후 번호 1의 정제수를 첨가하여 실온에서 교반하여 용해하였다.

2) 번호 5, 6, 7, 8, 9의 원료를 칭량한 후 교반용해하고 상기 1)에 첨가하였다.

3) 번호 10과 누에 번데기 기름을 첨가하여 용해한 후 상기 1)에 넣고 적절하게 교반하고 여과하여 화장수를 제조하였다.

3. 로션의 제조 [표 4]

<제조방법>

1) 번호 1∼12의 원료를 칭량하여 유상가온탱크에 넣고 75 ℃에서 교반 용해하였다.

2) 번호 13∼18의 원료를 칭량하여 수상탱크에 넣고 75 ℃에서 교반 용해하였다.

3) 상기 2)를 진공감압 하에 유화탱크로 이송하고 이어서 상기 1)을 이송하여 3500 RPM으로 5 분간 유화하였다.

4) 번호 19∼20의 원료를 칭량하여 1 % 솔루션 용액으로 만든 후 진공감압 하에 유화탱크에 주입하여 2500 RPM으로 균질 혼합하고, 진공, 탈포하면서 페달믹서를 25 RPM으로 교반, 55 ℃로 냉각하였다.

5) 실시예의 원료를 칭량하여 실온에서 에탄올에 용해하고 이어서 향을 칭량하여 각각 유화탱크에 넣고 균질분산, 냉각한 후 30 ℃에서 작업 종료하여 로션을 제조하였다.

4. 크림의 제조 [표 5]

<제조방법>

3) 상기 2)를 진공감압 하에 유화탱크로 이송하고, 이어서 상기 1)을 이송하여 3500 RPM으로 5 분간 유화하였다.

4) 번호 19∼20의 원료를 칭량하여 1 % 솔루션 용액으로 만든 후, 진공, 감압하에 유화탱크에 주입하여 2500 RPM으로 균질 혼합하고, 진공, 탈포하면서 페달믹서를 25 RPM으로 교반, 55 ℃로 냉각하였다.

5) 실시예의 원료를 칭량하여 실온에서 에탄올로 용해하고 이어서 향을 칭량하여 각각 유화탱크에 넣고 균질분산, 냉각한 후 30 ℃에서 작업 종료하여 크림을 제조하였다.

5. 마스크 팩의 제조 [표 6]

<제조방법>

1) 번호 1~3 원료를 칭량하여 75 ℃에서 30 분간 교반 용해하였다.

2) 번호 4∼11의 원료를 칭량하여 75 ℃에서 교반 용해하였다.

3) 번호 12∼19의 원료를 칭량하여 정제수 1과 함께 교반 용해하였다.

4) 번호 20∼25의 원료를 칭량하여 정제수 1과 함께 교반 용해하였다.

5) 상기 1)~4)를 혼합하여 혼합액을 제조, 진공, 탈포하여 마스크팩 조성물을 제조하였다.

실험예 1 : 콜레스테롤 저하 효과 시험

1. 투여량 및 시험군의 구성

투여량, 시험군의 구성, 투여액량 및 투여량은 다음 표 7과 같다.

[표 7]

2. 군 분리 및 동물식별

가) 투여 전날 체중을 측정하고 순위화하여 특정병원부재(SPF) SD계 랫트를 군당 6 마리씩 6 군으로 분리하였다.

나) 개체식별은 사육 상자 앞에 부착되는 개체식별라벨과 피크린산을 이용하여 등에 표시하였다.

3. 고지혈증 유발 및 시험물질의 투여

가) 고지혈증 유발

AIN-76에 콜레스테롤 1 %를 첨가한 콜레스테롤 식이를 자유 섭취시킴과 아울러 0.5 % 에탄올을 함유한 음수를 공급하여 고지혈증을 유발하였다.

나) 시험물질의 조제 방법

시험물질 최고용량을 1,000 mg/kg으로 설정하고 공비를 5로 하여 아래로 2 개의 용량군을 추가하였다. 시험물질을 칭량하여 부형제인 콘 오일(Corn oil)에 용해하여 1,000 mg/kg의 최고용량군의 투여할 시험물질을 조제하였다. 아래의 용량군의 투여할 시험물질은 최고용량군의 투여할 시험물질을 동일한 부형제를 이용하여 단계별로 희석하여 조제하였다. 시험물질의 조제는 매일 투여 전에 실시하였다.

배부 피부 고정법으로 동물을 고정하고 고지혈증 유발을 위한 식이의 공급한 날(Day 0)부터 시험물질을 매일 1 회 4 주간 경구 투여하였다.

4. 시험항목

가) 일반증상 관찰

실험기간 중 전 동물에 대하여 1 일 1 회 이상 매일 관찰하였고, 특이한 이상증상은 관찰되지 않았다.

나) 체중 측정

모든 동물에 대하여 입수시, 군 분리시, 시험물질 투여 개시시, 시험기간 중 주 1 회 그리고 부검일에 절식 후 체중을 측정하였다.

[표 8] 체중 변화(단위: g)

상기 표 8에 나타낸 바와 같이, 체중의 변화에서 유의한 변화는 관찰되지 않았다.

다) 사료 섭취량

주 1 회 측정하였다.

[표 9] 사료 섭취량(단위: g)

상기 표 9에 나타낸 바와 같이, 사료 섭취량에서 유의한 변화는 관찰되지 않았다.

라) 혈액생화학적인 검사

혈액생화학검사는 2 회 실시하였다. 1 차 검사는 시험물질 투여 후 2 주째에, 2 차 검사는 부검시에 실시하였다. 1 차 검사시는 동물을 하룻밤 절식시킨 후 동물의 미정맥으로부터 채혈하였고, 2 차 검사시는 동물을 하룻밤 절식시켜 마취 하에 개복하여 후대정맥에서 채혈하였다. 채혈한 혈액을 3,000 rpm, 10 분간 원심분리하여 얻은 혈청으로 아래 항목에 관해 측정하였다. (표 10 참조)

[표 10]

동맥경화지수(atherogenic index, AI)는 (Total cholesterol HDL - cholesterol) 수치를 HDL-콜레스테롤 수치로 나누어 산출하였다.

① 1 차 검사(시험물질 투여 2 주째)

[표 11] 혈청 내 지질 함유량 및 동맥경화지수(AI)

시험물질 투여군의 총 콜레스테롤과 LDL-콜레스테롤이 음성대조군(G2)에 비하여 용량 상관성 있게 감소하는 경향을 보였다. 동맥경화지수는 음성대조군(G2)과 비교하여 각각 25 %(G3), 44 %(G4) 및 64 %(G5)로 감소하는 경향을 보였다. 양성대조군(G6)와 비교하였을 시 40 %이상의 더 좋은 효율을 가진 것을 확인할 수 있었다.

② 2 차 검사(시험물질 투여 4 주째)

[표 12] 혈청 내 지질 함유량 및 동맥경화지수(AI)

시험물질 1,000 mg/kg 투여군에서 총 콜레스테롤, 트리글리세라이드 및 LDL-콜레스테롤이 음성대조군(G2)에 비하여 감소하는 경향을 보였다. 동맥경화지수는 음성대조군(G2)과 비교하여 각각 22 %(G3), 42 %(G4) 및 60 %(G5)로 감소하는 경향을 보였다. 양성대조군(G6)와 비교하였을 시 24 %이상의 더 좋은 효율을 가진 것을 확인할 수 있었다.

실험예 2 : 급성 독성실험

본 발명의 누에 번데기 농축 기름 분말의 급성 독성을 알아보기 위하여, 다음과 같은 방법으로 급성 독성실험을 하였다.

실험동물로 6 주령의 특정병원부재(SPF) SD계 랫트를 사용하였으며, 군당 5 마리씩 나누었다. 상기 실시예에서 얻은 누에 번데기 농축 기름 분말을 0.5 % 메틸셀룰로오스 용액에 현탁하여 0.1 g/㎏의 용량으로 단회 경구 투여하였다.

시험물질 투여 후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적 검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하였다.

시험결과, 시험물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상은 없었고 폐사된 동물도 없었으며, 또한 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다.

이상의 결과 상기 누에 번데기 농축 기름은 랫트에서 0.1 g/㎏까지 독성변화를 나타내지 않았으며, 경구 투여 최소치사량(LD₅₀)은 적어도 0.1 g/㎏ 이상인 안전한 물질로 판단되었다.

실험예 3 : 피부 보습 효과 시험

1. 투여량 및 시험군의 구성

투여량, 시험군의 구성 및 투여량은 다음 표 13 과 같다.

[표 13]

2. 누에 번데기 농축 기름분말의 투여

누에 번데기 농축 기름 분말을 시험물질을 칭량하여 부형제인 콘 오일(Corn oil)에 용해하여 사용하였다. 도포량을 피펫을 이용하여 칭량한 후 제모 부위에 고루 6 시간 간격으로 1 일 2 회 도포하였다.

3. 시험항목

(1) 시험물질의 적용 전 제모 및 피부건조 유발법

가) 제모

기니픽의 양쪽 옆구리(flank)를 클립퍼(clipper)로 1 차 제모하고, 전기면도기를 이용하여 2 차 제모하였다.(제모면적은 3.0 cm x 3.0 cm으로 함)

나) 제모 후 2 % SLS(소디움 라우릴 설페이트, Sodium Lauryl Sulfate)를 적신 면패드를 오른쪽 옆구리부분에 5 분간 접촉하였다. 1 일과 2 일 후에 동일한 방법으로 SLS를 적용하여 피부 건조증을 유발하였다.

다) 위의 방법과 같이 3 회차 2 % SLS를 적용한 후 2 일을 방치하였다.

(2) 시험물질의 적용 및 보습도 측정

가) 1 일째(2 % SLS 3 회차 적용 2 일 후, 1 차 보습도 측정)

전기면도기로 양쪽 플랭크(flank) 부분을 면도한 후 흐르는 물로 세척을 하였다. 세척 후 제모한 동물이 들어 있던 사육상자 내에서 2 시간 방치하였다. 피부보습 측정기(Corneometer, CM 825, Germany)로 양쪽 플랭크 부분의 보습도(정전용량 capacitance)를 측정하였다. 보습의 측정은 한 부위를 3 회 이상 측정하여 평균치를 기록하였다. 보습도 측정 후 2 % SLS를 처치한 부위에 시험물질을 도포하였다(6 시간 후 반복처치).

나) 2 일째

위의 1 일째와 같은 방법으로 시험물질을 도포하였다.

다) 3 일째(2 차 보습도 측정)

전기면도기로 제모하고 1 시간 30 분 후에 피부보습 측정기(corneometer)로 보습도를 측정하였다. 측정 후 시험물질을 적용하였다. 측정시 왼쪽을 대조로 하고 오른쪽은 시험물질을 처리하여 양쪽의 보습차이를 측정하였다. 보습도 측정 후 시험물질을 6 시간 간격으로 2 회 도포하였다.

라) 4 일째

위의 1 일째와 같은 방법으로 시험물질을 도포하였다.

마) 5 일째(3 차 보습도 측정)

3 일째와 같은 방법으로 제모 후 보습도를 측정하고, 시험물질을 도포하였다.

바) 6 일째

위의 1 일째와 같은 방법으로 시험물질을 도포하였다.

사) 7 일째

시험물질을 적용하지 않고 방치하였다.

아) 8 일째(4 차 보습도 측정)

제모를 한 후 보습도를 측정하였다.

(3) 관찰 및 검사항목

(1) 측정된 보습도 수치는 누에 번데기 기름이 처리되지 않은 왼쪽과 피부 건조증이 유발된 오른쪽과의 차이를 시험자료로 처리하였다.

(2) 측정된 보습도 수치의 통계처리는 상용통계 프로그램인 SPSS 10.1을 이용하여 일원배치분산분석을 실시하고 군간 유의성이 있을 경우에 사후검정을 실시하여 각 시험물질 도포군과 대조군과의 P값을 비교하였다. 또는 독립표본 T 검정을 실시하여 대조군과 누에 번데기 기름 처리군의 P값을 비교하였다.

4. 결과

2 % SLS를 이용하여 오른쪽 피부에 피부 건조증을 유발하고, 대조부위인 왼쪽과 누에 번데기 농축 기름 분말을 도포한 오른쪽 피부의 보습도 차이는 다음 표 9에 표시하였다. 보습도의 차이가 적을수록 피부 건조증 유발부위의 보습도가 증가한 것이다.

1 차 측정시 누에 번데기 농축 기름 분말 도포군의 보습도가 대조군보다 약간 증가한 경향이 있었다. 2 차 측정은 누에 번데기 농축 기름 분말 도포군의 보습도가 대조군의 179 %(G2), 167 %(G3), 219 %(G4)로 유의하게 증가하였다(p<0.05). 일반 정제기름보다 115 %이상의 효율을 가졌다. 3 차 측정은 누에 번데기 농축 기름 분말 도포군의 보습도가 대조군과 비교하여 대조군의 129 %(G2), 137 %(G3), 188 %(G4)로 증가하였다. 일반정제기름보다 117 %이상의 효율을 가졌다. 4 차 측정은 누에 번데기 농축 기름 분말 도포군의 보습도가 대조군의 112 %(G2), 134 %(G3), 158 %(G4)로 증가하였다. 일반정제기름보다 129 %이상의 효율을 가졌다.

[표 14] 피부 보습도 측정

대조군의 보습도는 시간의 경과에 따라 서서히 증가한 반면, 누에 번데기 농축 기름 분말 도포군은 2 회차 측정부터 보습도가 급격히 증가하여 그 상태가 계속 유지되는 결과를 보였다. 이상의 결과로 보면, 누에 번데기 농축 기름 분말의 도포는 피부건조증을 유발한 본 시험조건에서 피부의 보습도를 증가시키는 결과를 보여 피부 보습상태의 개선 효과를 보이는 것으로 판단된다.

실험예 4 : 콜라겐 생합성 확인

콜라겐(type I, II, III, IV and V)들은 프로콜라겐이라는 전구물질의 형태로 합성된다. 프로콜라겐은 아미노 말단과 카르복시 말단에 프로펩티드라는 펩티드염기서열을 포함한다. 프로펩티드의 기능은 소포체내에서 프로콜라겐 분자의 폴딩(folding)을 도와줌과 동시에 콜라겐 중합반응이 일어날 때 콜라겐 분자로부터 절단, 분리된다고 알려져 있다. 그래서 분리된 프로펩타이드의 양을 측정함으로써, 세포내에서의 콜라겐 생합성정도를 파악할 수 있다.

* 시험방법

① 인간 정상 섬유아세포(Human normal fibroblast cells)를 6 웰 디쉬에 일정수의 세포를 씨딩(seeding)한 후 하루 동안 배양하였다.

② FBS가 0.05 % 들어있는 각각의 웰에 시료를 농도별로 처리한 후, 48 시간 동안 다시 배양한다.

③ 48 시간 후, 세포배지를 수집하였다.

④ 수집한 각 샘플의 100 ㎕를 마이크로플레이트의 각 웰에 넣고, 37 ℃에서 2 시간동안 인큐베이션하였다.

⑤ 각 웰을 PBS 400 ㎕로 3 회 세척하였다.

⑥ 용액 I(Antibody-POD conjugate solution)을 각 웰에 100 ㎕씩 넣고, 37 ℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다.

⑦ 각 웰을 PBS 400 ㎕로 3 회 세척하였다.

⑧ 기질용액(TMBZ) 100 ㎕를 각 웰에 첨가한 후, 상온(20 ~ 30 ℃)에 15 분간 인큐베이션하였다.

⑨ 1N H2SO4 100 ㎕를 각 웰에 첨가 후, 잘 섞었다.

⑩ 450 nm에서 ELISA 리더로 분석하였다.

*통계처리

측정된 결과치는 평균± 표준편차의 형태로 표시하였고 SPSS/PC+ 프로그램을 이용하여 t-test로 유의성을 검정하였다.

[표 15] 콜라겐 생성에 미치는 누에 번데기 농축 기름 분말의 효과

[표 16] 대조군에 대한 실험구의 콜라겐 생성율

위에 제시된 결과처럼, 누에 번데기 농축 기름 분말에 대한 콜라겐합성효과를 관찰한 결과, 콜라겐 생합성을 0.01 %와 0.05 %에서 농도 의존적으로 증가시키는 것을 볼 수 있었으며(p<0.01), 일반정제기름보다 효율이 좋은 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 실험의 시료로 사용된 누에 번데기 농축 기름이 세포내 콜라겐 생성이 뛰어나다는 것을 확인하였다.

실험예 5 : 콜라게네이즈 저해 시험

콜라젠을 분해하는 효소인 콜라게네이즈의 활성정도를 측정하는 방법으로 콜라게네이즈에 대한 항체를 이용하였다.

본 시험에서는 타입 I 콜라게네이즈 분석 킷트(Amersham)를 이용하였으며, ELISA로 흡광도를 측정하였다.

* 시험방법

① 인간 정상 섬유아세포를 적합한 배지로 37 ℃ 5 % CO₂ 인큐베이터 조건하에 배양 유지하였다.

② 시험을 위하여 일정한 수의 세포를 적절한 배양용기에 분주하고 일정시간 배양하여 세포의 부착을 확인한 후, 세포 배양액에 샘플을(0.01 %, 0.05 %, 0.1 %)과 TNF-알파를 가하여 24 시간 동안 배양하였다. 이때 MMP-1 을 활성화시키는 물질로 TNF-알파를 사용하였다.

③ 24 시간 배양 후, 세포배지를 수집하여 그 중 100 ㎕를 분석 웰(assay well)에 넣고 2 ~ 8 ℃에서 밤새도록 인큐베이션하였다.

④ 각각의 분석 웰을 세척 완충용액을 이용하여 4 번 세척하였다.

⑤ 각 웰에 APMA 50 ㎕, 분석 완충용액, 검출 시약(detection enzyme + substrate)를 각각 50 ㎕씩 첨가하여 잘 섞어주었다.

⑥ 37 ℃에서 90 분간 인큐베이션한 후, ELISA 리더를 이용하여 450 nm에서 측정하였다.

* 통계처리

측정된 표준치는 평균± 표준편차의 형태로 표시하였고 SPSS/PC+ 프로그램을 이용하여 t-test로 유의성을 검정하였다.

[표 17] 콜라게네이즈 활성에 대한 누에 번데기 유래의 누에 번데기 농축 기름분말의 효과

인간 정상 섬유아세포를 적절한 배양용기에 분주하고 일정시간 배양하여 세포의 부착을 확인한 후, 세포 배양액에 농도별로 가하여 일정시간 동안 배양한 결과, 모든 실험치는 대조군에 대해 유의성이 있음을 확인하였다(p<0.01).

[표 18] 누에 번데기 농축 기름 분말에 의한 콜라게네이즈 활성 억제비율

누에 번데기 농축 기름 분말에 의한 콜라게네이즈 활성 억제비율 대조구의 실험치를 100 %로 놓고, 이에 대한 시료의 측정치를 상대적인 비율로 나타내었다.

인간 정상 섬유아세포를 배양하고 농도별로(0.01 %, 0.05 %, 0.1 %) 샘플 처리한 세포에서 킷트를 이용하여 콜라게네이즈 활성 시험을 하였다. 그 결과, 유의성 있게 농도의존적인 콜라게네이즈 활성 억제 현상을 나타내었다(p<0.01). 하지만 일반정제기름 0.1 % 농도로 처리시 콜라게네이즈 활성 억제가 거의 나타나지 않는 결과를 보였다.

실험예 6 : 피부 안전성 시험

뉴질랜드산 백색종 토끼를 이용하여 피부 1 차 자극성 시험을 실시하였다. 토끼의 등부분 정중선 좌우를 각각 약 10 cm의 정방향으로 제모하고 각각을 전후로 구분하여 4 개소의 시험부위를 설정하였다. 좌우 대각의 2 부위에 18 게이지(Gauge) 주사바늘로 출혈이 생기지 않을 정도로 #자 모양의 틀을 만들고 나머지 2 부위는 건상부위로 두었다. 상기 누에 번데기 농축 기름 분말을 부틸렌글리콜에 녹여 20 % 용액을 조제하고, 이 용액 0.5 ㎖를 2.5×2.5 cm Lint 2 매에 스며들게 한 다음, 우측 2 부위에 폐색 부착하고, 좌측 2 부위에는 부틸렌글리콜만을 2.5×2.5 cm의 Lint 2 매에 스며들게 한 다음 좌측 2 부위에 폐색 부착하고 24, 48 및 72 시간 피부의 이상 유무를 관찰하였다.

시험 결과, 누에 번데기 농축 기름 분말을 도포한 건상부위 및 손상부위 모두 발적 및 부종 등의 피부 이상반응은 일어나지 않았다.

실험예 7 : 티로시나아제 활성 저해 효과 확인

티로시나제 작용 결과 생성되는 도파크롬(DOPA chrome)을 비색법에 의해 측정하는 방법을 변형하여, 글라브리딘과 같은 미백 개선제를 추가한 누에 번데기 농축 기름 분말과 또 다른 종류의 미백기능성 약물인 symwhite377을 포함시키고 티로시나제(Tyrosinase)활성 억제력을 측정하였다.

96-well plate내의 0.1 M Phosphate buffer(pH 6.5) 110 μl에 1.5 mM L-Tyrosine 용액 40 μl 및 미백 개선제를 추가한 누에 번데기 농축 기름 분말 또는 Symwhite377을 각각 10 μl씩 넣은 후, mushroom tyrosinase(2000unit/ml) 10 μl을 첨가하여 37 ℃에서 10 분간 반응시켜 반응액 중에 생성된 도파크롬을 마이크로플레이트 계수기를 이용하여 490 nm에서 측정하였다.

실험결과의 비교를 위해 양성대조구로 알부틴(Arbutin)을 사용하였다.

[표 19] 누에 번데기 농축 기름 분말에 의한 티로시나제 활성 억제 측정

실험예 8 : 세포 독성 및 멜라닌 생성 억제 작용 확인

색소 세포에 대한 세포 독성과 멜라닌 생성 억제 작용을 측정하였다.

MB-16 멜라노마 세포를 5×10⁴세포로 10 % 혈청을 함유하는 DMEM배지에 접종하고 T-플라스크(75 ㎠)에서 24 시간 배양한 후, 새로운 배지와 농축 기름 분말을 배양세포에 첨가한 후 2 일간 배양한다. 배양 후 배지를 제거하고 인산 완충용액으로 세정하고 트립신을 처리하여 세포를 분리시킨다. 원심 분리기로 세포를 수집하여 일부는 MTT 분석하여 세포 독성을 측정한다. 일부 세포는 5 % 트리클로로아세트산으로 처리한 후, 1N NaOH로 용해시켜 475 nm에서 멜라닌 함량을 측정하고, 그 결과를 [표 20]에 기재하였다.

[표 20]

Claims

하기 단계로 구성된 누에 번데기 농축 기름 분말의 제조 방법.
1) 누에 번데기 분쇄 분말에 바실러스속 및 아스퍼질러스속 미생물의 복합균주배양액 혼합하고 pH 4.5~0.5, 35~40 ℃, 70~75 시간동안 발효 추출하는 단계,
2) 누에 번데기 발효 추출물에 헥산과 활성탄을 가하여 불순물을 흡착 제거하고, 여과하고 감압농축하여 유기용매를 제거하여 누에 번데기 발효 추출물을 분리 및 정제하는 단계,
3) 누에 번데기 정제기름을 결정화 또는 에스테르화시켜 농축하는 단계,
4) 누에 번데기 농축 기름을 덱스트로즈, 레시틴, 실크펩타이드 혼합물과 혼합하여, 유화액을 제조하고, 이를 동결 건조시켜 분말화하는 단계,
를 포함하는 누에 번데기 분말을 발효추출, 기름 분리 및 정제한 후, 농축, 분말화 시킴을 특징으로 하는 누에 번데기 농축 기름 분말의 제조방법.
청구항 1의 누에 번데기 농축 기름 분말을 포함한 고지혈증 개선용 건강기능성 식품.
청구항 1의 누에 번데기 농축 기름 분말을 포함한 콜레스테롤 저하 효능을 가지는 건강기능성 식품.
청구항 1의 누에 번데기 농축 기름 분말을 포함한 콜라겐 생합성 증가, 콜라게네이즈 억제와 같은 주름 개선 효과가 있으며, 또한 피부 보습 효능을 가지는 피부 개선용 화장료 조성물.
청구항 1의 누에 번데기 농축 기름 분말과 글라브리딘과 같은 미백개선제를 포함한 주름 개선 및 미백 효과를 가지는 피부 개선용 화장료 조성물.
청구항 1에 따라 제조하여 얻어진, 하기 구성성분을 갖는 누에 번데기 농축 기름 분말.
(하 기)