KR100709795B1 - 바이오칩 및 이의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

프리폴리머의 중합에 앞서 또는 이와 동시에, 복수개의 생체분자 탐침을 하이드로겔 프리폴리머에 결합시키는 하이드로겔 바이오칩의 제조방법. 하이드로겔이 중합되는 동안, 이는 하이드로겔이 하이드로겔 마이크로소적의 형태로 공유결합되는 고체 기질 상에 마이크로스폿팅된다. 프리폴리머의 반응성 및 중합 조건의 조정은 생체분자 탐침 고정의 밀도의 효과적인 조절을 제공한다. 상이한 생체분자가 결합된 복수개의 이러한 마이크로소적을 함유하는 생성되는 바이오칩은 유전자 발견, 유전자 특징규명, 기능성 유전자 분석 및 관련 연구에 유용하다.
바이오칩, 하이드로겔, 생체분자, 프리폴리머

Description

바이오칩 및 이의 제조방법{BIOCHIP AND METHOD FOR MAKING IT}
삭제
본 발명은 바이오칩의 신규 제조방법과 이러한 방법으로 생성된 바이오칩에 관한 것이다. 특히, 본원에 기재된 신규 방법은 이소시아네이트-작용성 하이드로겔을 이용하여 기질상에 생체분자 탐침을 고정시킴으로써 빠르고 간편한 비용 효과적인 바이오칩 제작을 제공한다. 특히, 펩타이드 핵산(PNA)과 같은 유기-용매-용해성 생체분자, 및 DNA, RNA 및 기타 올리고뉴클레오타이드와 같은 수용성 생체분자 모두 이들의 중합 이전 또는 도중에 친수성 중합체에 쉽고도 효과적으로 결합한다. 본원에 기재된 바이오칩의 개선된 제조방법 이외에, 바이오칩 자체는 개선된 저장-수명을 제공하는 우수한 안정성과 사용시 상당한 유연성을 포함하는 개선된 특성을 가진다. 이러한 바이오칩은 유전자 발견, 유전자 특징분석, 기능성 유전자 연구, 생물학적 활성을 위한 선별 및 관련 연구에 유용하다.
DNA, RNA 또는 동족체, 예를 들어 펩타이드 핵산(PNA)과 선택적으로 결합하는 제제는 진단 및 치료 목적의 유전자-표적화 약제로 개발되어 DNA의 서열-특이성 변형을 위한 수단으로 이용되면서 분자 생물학 및 약품 화학에 주된 관심사이다. 부가적으로, 이러한 제제는 유전자 서열을 결정하고 기능성 유전자 분석을 위한 수단으로 이용될 수 있다.
최근까지, 유전자 발견, 특징분석 및 기능성 유전자 분석을 위한 과정이 난해하고도 비용이 많이 들 뿐만 아니라 엄청난 시간을 필요로 해왔다. 그러나, 과거 10년 이내에, 바이오칩이라 일컬어지는 각종 지지체상에서 생체분자의 어레이를 분리하는 방법이 개발되어 DNA 합성, 서열분석, 돌연변이 연구, 유전자 발현 연구 및 유전자 발견에 이용되어 왔다. 일반적으로 바이오칩은 기질에 직접 또는 결합 그룹을 통해, 좀더 최근에는 겔층에 의해 결합된 생체분자의 마이크로매트릭스(즉, 마이크로어레이)이다. 대부분의 바이오칩은 기질상의 기지 위치에서 생체분자의 합성을 촉진하도록 고안되었다. 예를 들어, 이러한 일 바이오칩은 빛과 일련의 사진석판 마스크를 이용하여 유리와 같은 기질상의 특정 위치를 활성화시켜 핵산을 선택적으로 결합시키고 차후에 부가적인 핵산을 부착시켜 원하는 위치에 공지된 올리고뉴클레오타이드를 형성한다. 기질상의 특정 위치를 활성화시키기 위해 빛과 사진석판 마스크를 이용하는 이러한 공정은 마이크로전자 반도체 칩의 생산에 이용된 공정과 유사하다.
유감스럽게도, 이들 1세대 바이오칩은 생산에 있어 비용이 많이 들어, 엄청난 자본 설비, 공정 처리 능력 및 장비를 필요로 한다. 또한, 기질상의 단일층에 올리고뉴클레오타이드를 형성하는 이러한 합성 방법은 낮은 감도의 바이오칩을 만들어, 칩에 특이적으로 하이브리드화된 DNA의 적절한 검출을 위해 값비싼 레이저 공초점 형광 현미경을 필요로 한다. Fodor 등에게 발행된 미국 특허 5,744,305(이 하, '305 특허)는 기질에 부착된 물질의 어레이를 만들기 위해 광반응성 보호 그룹 및 사진석판의 사용 예를 제공하고 있으며, 유리와 같은 기질을 직접 또는 링커 분자를 첨가하여 유도체화시켜 광반응성 보호 그룹으로 블로킹된 아미노 그룹을 포함하는 대규모 화학적 다양성을 만들어내는 합성 방법에 관해 기재하고 있다. 마스킹 기술을 이용하여 기질상 특정의 기지 위치내에서 광반응성 그룹을 선택적으로 탈보호시킬 수 있다. 탈보호된 영역은 광반응성 보호 그룹을 함유한 "빌딩 블록" 분자, 예를 들어 올리고뉴클레오타이드와 반응하여, 빌딩 블록 분자는 기질 (또는 링커) 표면에서 활성 그룹에 공유결합된다. 이러한 과정은 기질상의 정해진 위치에 중합체, 예를 들어 특정 서열의 올리고뉴클레오타이드 또는 펩타이드와 같은 생체분자의 직접 합성을 위해 마스크를 이용하여 반복된다.
'305 특허에 기재된 합성 방법은 단일 기질상에 약 10 내지 약 108개의 상이한 서열을 제공하고 있다. 부가적으로, 개개 중합체가 합성되는 기질상의 정해진 영역이 약 10-10 ㎠ 내지 약 1 ㎠임을 기술하고 있다. '305 특허에 제시된 실시예가 주로 펩타이드 또는 뉴클레오타이드의 합성을 수반하고 있지만, 기타 중합체의 합성에 동일 기술이 이용될 수 있음을 서술하고 있다. 마찬가지로, 합성된 중합체를 기질에 연결하는 다양한 링커 그룹, 바람직하게는 비활성 또는 불활성 링커 그룹이 단량체상의 활성 부위를 보호하는 각종 보호 그룹으로서 '305 특허에 기재되어 있으며, 보호 그룹은 중합체의 직접 합성을 위해 선택적으로 제거될 수 있다. '305 특허에는 또한 어레이의 직접 합성을 위한 일 양태에 이용된 바이너리 마스킹 기술 에 관해 어느 정도 상세히 기재되어 있다. 유감스럽게도, '305 특허에 기재된 방법들은 다른 선행 기술 및 장치와 동일한 다수의 단점을 지니고 있다. 어레이는 제조 및 사용에 있어 값이 비싸고, 제조 도중 복수 단계와 장기간 배양/세척 시간을 필요로 하며, 중요하게는 오직 단일층으로만 합성될 수 있다.
이러한 1세대 바이오칩의 낮은 감도를 고려하여, 2세대 바이오칩이 개발되었다.
2세대 바이오칩의 일례는 Conrad 등에게 발행된 미국 특허 5,736,257 및 5,847,019에 기재되어 있다. '257과 '019 특허는 표면 하이드록실 그룹을 지닌 유리와 같은 기질을 제공하고; 기질 표면 하이드록실 그룹을 실란과 반응시켜 기질상의 비닐 그룹의 분자층을 결합시키며; 중합된 네트웍층이 분자층에 결합되도록 유리 라디칼 중합 반응에 관여할 수 있는 아크릴아미드 화합물을 분자층상에 둔 다음; 중합된 네트웍층을 광-활성화시켜 패턴화된 광-활성화된 중합 네트웍을 제조하여; 광-활성화된 중합 네트웍층상에 1 이상의 유사 또는 비유사 생체분자를 두어 합성하여 패턴화된 광-활성화된 중합 네트웍층에 결합시키는 단계를 포함하는 바이오칩의 합성 공정에 관해 기술하고 있다.
'257과 '019 특허에 기재된 바이오칩은 사진석판 기술을 이용하여 어레이에 생체분자를 직접 결합(또는 합성)한다는 점에서 Fodor 등의 1세대 바이오칩과 다소 유사하다. 그러나, 1세대 바이오칩과는 달리, '257과 '019 특허의 바이오칩은 비닐 그룹의 분자층의 상단에서 폴리아크릴아미드 네트웍을 이용하여, 겔 셀에 3차원을 제공한다. 당업자가 익히 알고 있듯이, '257과 '019 특허의 명세서에 따른 바이오 칩의 생성은 값이 비쌀 뿐만 아니라 시간-소모적이다.
Khrapko등의 미국 특허 5,552,270은 고체 지지체와 (원하는 길이의 올리고뉴클레오타이드의 어레이를 포함하는) 매트릭스를 포함하는 2세대 바이오칩을 이용하는 DNA의 서열분석 방법이 기재되어 있다. 매트릭스는 30 ㎛ 이하의 두께를 가진 겔층에 의해 지지체에 부착되고; 겔층은 일정한 간격으로 떨어진 일 세트의 평방 "도트" 형태로 기재되어 있다. '305 특허에 기재된 단일층 포맷과는 달리, '270 특허의 겔층은 능력면에서 기질에 올리고뉴클레오타이드의 3차원 부착을 제공하여 1세대 바이오칩의 단일분자층의 능력을 능가한다. 2세대 바이오칩은 약 30 ㎛ 떨어진 두 개의 유리 슬라이드 사이에서 폴리아크릴아미드 겔을 중합시킨다. 일 슬라이드를 제거하고, 겔-코팅된 하부 슬라이드를 건조시킨다. 겔의 일부를 기계적으로 제거하여 일정한 간격의 도트를 남긴다. Ershov 등에게 발행된 미국 특허 5,741,700, 5,770,721 및 5,756,050에 기재된 폴리아크릴아미드 겔 매트릭스를 이용하는 대안의 양태에서, 겔 부분은 레이저를 이용하여 슬라이드로부터 제거된다.
Ershov 등 특허와 '270 Khrapko 등의 특허에 기재된 폴리아크릴아미드 겔 매트릭스가 약 95% 내지 97%의 수분 함량을 지닌 하이드로겔이고 DNA와 같은 표적 분자에 양호한 확산성을 제공하고 있지만, 상당한 단점들을 가진다. 이러한 2세대 바이오칩에 대한 중요한 단점은 비용이다. Ershov 등에 의해 기재된 폴리아크릴아미드계 바이오칩은 유리 라디칼 개시 또는 자외선 조사 과정에 의한 아크릴아미드 단량체의 중합에 기초하지만; 이러한 폴리아크릴아미드계 겔 바이오칩은 시간이 많이 걸리고 노동 집약적인 다단계 공정으로 제작된다. 이러한 바이오칩의 생성은 중합 및 유리 기질 표면으로 부착; 기질상에서 겔 매트릭스의 마이크로-스퀘어 형성을 위한 기계적 또는 레이저 컷팅; 하이드라진을 이용한 활성화 단계; 및 마지막으로 올리고뉴클레오타이드와의 반응을 포함하는 과중한 다단계 공정을 요구한다. 고유 폴리아크릴아미드 겔의 중합 공정으로 인해, 이들 단계는 독립적으로 수행되어야 한다. 이에 따라, 이러한 방법에 의한 단일 바이오칩을 생성하는 데 필요한 총 시간은 적어도 약 24 내지 48시간이다. 또한, 각 단계 후, 다음 단계 시작 이전에 철저한 세척 및/또는 기타 특별한 주의를 요한다. 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드 유도체화 단계는 장기 배양, 예를 들어 24시간 내지 48시간을 요구한다.
이러한 2세대 바이오칩의 또다른 중요한 단점은 하이드라진 그룹과 올리고뉴클레오타이드와의 반응이 불안정한 모르폴린 유도체를 형성하여 실온에서 대략 36시간의 바이오칩에 대한 매우 짧은 저장 반감기를 야기한다. 이에 따라, 유전자 발견, 유전자 특징 분석, 기능성 유전자 분석 및 관련 연구에 이용될 수 있는 고감도 및 적절한 장기 저장 수명을 가진 신뢰할 만한 다기능성 바이오칩 제작을 위한 간단하고도, 비용 효과적이면서 빠른 방법이 업계에서 상당히 요청된다.
발명의 요약
본 발명은 개선된 바이오칩의 빠르면서, 간단하고, 비용 효과적인 제작 방법과 이러한 방법으로 생성된 개선된 바이오칩을 제공한다. 예를 들어, 본원에 기재된 방법은 겔의 중합 이전 또는 이와 동시에 생체분자 탐침을 결합시켜, 바이오칩 생성을 위한 간단한 1 또는 2 단계 공정을 제공한다. 이에 따라, 지금까지 요청된 다단계, 복수 세척, 및 장기간의 반응 시간을 기본적으로 1 또는 2 단계로 수행할 수 있다. 증가된 감도, 사용 및 저장 수명 측면 모두에서 우수한 안정성, 및 개선된 비용 효과를 가진 개선된 바이오칩이 추가로 제공된다.
이러한 바이오칩은 기질상에 적절히, 예를 들어 공유적으로 부착된 생체분자 탐침을 지닌 하이드로겔 프리폴리머의 광학적으로 투명한 마이크로소적을 분배시켜 형성될 수 있다. 그러나 이소시아네이트-작용성 하이드로겔 프리폴리머의 유기 용매 용액을 제공하고; 생체분자의 완충 수용액을 고정시켜; 두 용액을 혼합하여 중합을 개시하면서 생체분자를 하이드로겔 프리폴리머에 공유결합시킨 다음; 고체 기질상에 중합 하이드로겔 프리폴리머를 분배시켜 중합된 하이드로겔이 기질에 적절히 결합되도록 하여, 고정된 생체분자를 지닌 이소시아네이트-작용성 하이드로겔 바이오칩을 제조함이 바람직할 수 있다. 특정 바람직한 양태에서, 하이드로겔은 충분한 활성 이소시아네이트 그룹을 가지고 있어 하이드로겔 프리폴리머와 생체분자 탐침의 공유결합 및 하이드로겔의 중합 모두에 관여한다.
일 측면에서, 본 발명은 고정된 생체분자를 지닌 하이드로겔 바이오칩을 제조하는 방법을 제공하고 있으며, 방법은 (a) 이소시아네이트-작용성 하이드로겔 프리폴리머의 유기 용매 용액을 제공하고; (b) 생체분자의 용액을 제공하며; (c) 생체분자를 하이드로겔 프리폴리머에 공유결합시킨 다음; (d) 하이드로겔 프리폴리머의 중합을 개시하는 단계를 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 공유결합된 유기 용매 용해성 생체분자를 가진 바이오칩을 제조하는 방법을 제공하고 있으며, 방법은 (a) 상부 표면을 가진 고체 기질을 제공하고; (b) 비양성자성 유기 용매에 생체분자를 포함하는 용액을 제공하 며; (c) 비양성자성 유기 용매에 이소시아네이트-작용성 하이드로겔 프리폴리머를 제공하고; (d) 단계 (b)의 생체분자를 이용하여 프리폴리머를 유도체화시켜; (e) 완충 수용액을 첨가하여 단계 (d)의 유도체화된 하이드로겔 프리폴리머의 중합을 개시한 다음; (f) 단계 (a)의 기질의 상부 표면상으로 단계 (e)의 중합 하이드로겔 용액을 마이크로스폿팅시켜, 기질에 하이드로겔과 고정된 생체분자를 부착시키는 단계를 포함한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 (a) 상부 표면을 지닌 고체 기질; (b) 기질의 상부 표면에 공유결합된 복수개의 하이드로겔 셀(각 하이드로겔 셀은 이소시아네이트-작용성 중합체로 형성됨); 및 (c) 하이드로겔 셀 중 적어도 하나와 그 안에서 공유결합된 생체분자 탐침을 포함하는 바이오칩을 제공한다. 바람직하게는, 상이한 생체분자 탐침은 각 하이드로겔 셀 안에서 결합할 것이고, 바람직하게는 공유결합은 이소시아네이트 그룹에 의한다.
추가 양태에서, 본 발명은 (a) 상부 표면을 가진 고체 기질; (b) 기질의 상부 표면에 공유결합된 복수개의 하이드로겔 셀(하이드로겔은 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 또는 이의 공중합체를 포함함); 및 (c) 상이한 하이드로겔 셀과 그 안에서 공유결합된 상이한 생체분자 탐침을 포함하는 바이오칩을 제공한다.
추가 측면에서, 본 발명은 (a) 상부 표면을 지닌 고체 기질; (b) 기질의 상부 표면에 공유결합된 복수개의 하이드로겔 셀(하이드로겔은 우레탄-우레아 결합을 지닌 중합체를 포함함); 및 (c) 상이한 하이드로겔 셀과 그 안에서 공유결합된 상이한 생체분자 탐침을 포함하는 바이오칩을 제공한다.
추가 측면에서, 본 발명은 (a) 결합된 적어도 두 개의 하이드로겔 셀을 가진 기질을 포함하는 바이오칩을 제공하고(각 셀은 적어도 약 20 ㎛의 두께를 가지고 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 및 이의 공중합체로 이루어진 그룹 중에서 선택된 대부분의 중합체를 포함하며, 적어도 일 하이드로겔 셀은 공유결합된 생체분자 탐침을 추가로 포함함); (b) 하이브리드화 조건하에 표적 생체분자를 함유한 분석물 용액을 바이오칩과 접촉시키며; (c) 비-특이적으로 결합된 표적 생체분자 및 결합되지 않은 표적 생체분자를 제거하는 조건하에 하이드로겔 바이오칩을 세척한 다음; (d) 결합된 표적 생체분자를 검출하는 단계를 포함하는 하이브리드화 분석을 제공한다.
추가 측면에서, 본 발명은 (a) 약 1 meq/g 이하의 활성 이소시아네이트 함량을 지닌 하이드로겔 프리폴리머의 유기 용매 용액을 제공하고; (b) 생체분자의 용액을 제공하며; (c) 하이드로겔 프리폴리머의 적어도 일부분에 생체분자를 공유결합시킨 다음; (d) 하이드로겔 프리폴리머의 중합을 개시하고; (e) 중합 하이드로겔 프리폴리머를 고체 기질상으로 분배시켜 용액을 적어도 약 20 ㎛의 두께로 기질상에 공유결합하여, 바이오칩을 만들어; (f) 단계 (e)의 바이오칩을 세척 완충액으로 세척시켜 하이드로겔 내부의 나머지 활성 부위를 블로킹시킨 다음; (g) 하이브리드화 조건하에 표적 생체분자를 함유한 분석물 용액을 세척된 바이오칩과 접촉시키고; (h) 단계 (g)의 바이오칩을 제 2 세척 완충액으로 세척하여 비-특이적으로 결합된 표적 생체분자와 결합되지 않은 표적 생체분자를 제거한 다음; (i) 하이드로 겔 칩에 부착된 표적 생체분자를 검출하는 단계를 포함하는 하이브리드화 분석을 제공한다.
바람직하게는 바이오칩상의 하이드로겔의 각 마이크로소적은 상이한 생체분자 탐침을 함유하고 있어, 단일 하이브리드화 분석의 일부분으로서 다량의 생체분자 탐침을 선별할 수 있다. 일 바람직한 양태에서, 바이오칩 제작에 사용된 생체분자 탐침은 전통적인 DNA 및/또는 RNA 올리고뉴클레오타이드와 비교하여 우수한 선별 기능을 제공하는 PNA 탐침이다. 달리, 폴리우레탄계 또는 기타 이소시아네이트-작용성 겔 매트릭스와 함께 DNA, RNA 또는 기타 올리고뉴클레오타이드 탐침이 이용된다.
도 1은 본 발명의 다양한 특성을 구현하는 공정의 일부로서, 유기-용해성 생체분자를 하이드로겔 프리폴리머와 반응시킨데 이어 하이드로겔을 중합하는 개략적인 설명도이다.
도 2는 하이드로겔의 중합 도중 DNA와 같은 수용성 생체분자와 하이드로겔 프리폴리머와의 또다른 반응을 설명하는 개략적인 설명도이다.
바이오칩 생성에 유용한 3차원 겔 매트릭스를 제공하기 위해, 겔 매트릭스를 포함하도록 선택된 중합체는 바람직하게는 다수의 바람직한 특성, 예를 들면 1) 매트릭스 내부와 외부에 분자를 확산시키기 위해 적절한 세공 크기 및 높은 수분 함량; 2) 유리와 같은 기질의 표면에 결합하는 능력; 3) 형광 태그를 이용한 광학적 간섭을 줄이기 위해 충분히 중합된 상태에서 충분한 투명도; 4) 사용 도중 직면하는 힘을 견디기 위해 충분히 중합된 경우 충분한 구조적 보전성; 및 5) 정상 조사 및 임상 사용을 위해 적절한 저장 수명을 가진다. 또한, 선택된 겔은 바람직하게는 생산 및 사용이 쉬워야 한다.
하이드로겔은 이들 기준을 충족시키는 중합체 부류이다. 하이드로겔은 탈수 상태에서 유리와 같고 탄성 겔을 형성하는 수분의 존재하에 팽창하는 친수성 네트웍 중합체이다.
Ershov 등과 Khrapko 등의 폴리아크릴아미드 겔 시스템과는 달리, 이소시아네이트-작용성 하이드로겔은 선행 기술보다 다수의 중요한 이점을 보유하면서 폴리아크릴아미드계 겔의 단점 대부분을 결여하고 있음이 밝혀졌다. 이소시아네이트-작용성 하이드로겔 중합체는 익히 알려져 있고 수술 드레싱, 기저귀, 침대 패드, 생리대 등과 같은 흡수재의 생산에 널리 이용되고 있다.
이소시아네이트-작용성 하이드로겔은 원하는 중합을 수행하는 기능을 담당하고 관련 생체분자와 공유결합하는 이소시아네이트 그룹으로 캐핑된 유기 중합체를 의미한다. 예를 들어, 이는 디이소시아네이트와 폴리에테르 또는 폴리에스테르 폴리올간의 반응에 의해 형성된 폴리우레탄일 수 있다.
이들 이소시아네이트-작용성 하이드로겔을 위한 출발 물질로 이용된 프리폴리머는 바람직하게는 수화된 폴리우레탄, 폴리우레아-우레탄 및/또는 폴리우레아 중합체 겔을 제공한다. 폴리우레탄 중합체가 업계에 익히 알려져 있다. 하이드로겔 중합체는 다양한 프리폴리머로부터 제조되었고 광범위한 용도로 이용되고 있다. 전 형적으로, 하이드로겔은 농축된 형태로 용액을 겔화시키는 3차원 중합체 네트웍을 형성하는 프리폴리머가 가교결합되는 조건하에 수용액에서 친수성 단량체를 중합시켜 형성된다. 폴리우레탄 하이드로겔은 우레아 및 우레탄 결합을 만들기 위해 이소시아네이트-말단-캐핑된 프리폴리머의 중합에 의해 형성된다.
이소시아네이트-작용성 프리폴리머는 종종 이작용성 또는 다작용성 이소시아네이트 화합물과 반응하는 비교적 고분자량의 폴리옥시알킬렌 디올 또는 폴리올로부터 제조된다. 바람직한 프리폴리머는 에틸렌 옥사이드 단위의 단일중합체 또는 에틸렌 옥사이드 단위 및 프로필렌 옥사이드 또는 부틸렌 옥사이드 단위의 혼합물을 함유한 블록 또는 랜덤 공중합체를 포함하는 폴리옥시알킬렌 디올 또는 폴리올로부터 제조된다. 블록 또는 랜덤 공중합체의 경우, 단위의 적어도 75%는 에틸렌 옥사이드 단위여야 한다. 폴리옥시알킬렌 디올 또는 폴리올 분자량은 바람직하게는 2,000 내지 30,000, 좀더 바람직하게는 5,000 내지 30,000이다. 적당한 프리폴리머는 기본적으로 모든 하이드록실 그룹이 폴리이소시아네이트에 의해 캐핑되도록 선택된 폴리옥시알킬렌 디올 또는 폴리올을 폴리이소시아네이트와 약 1.2 내지 약 2.2의 이소시아네이트:하이드록실 비로 반응시켜 제조될 수 있다. 본 발명에 바람직하게 사용된 이소시아네이트-작용성 프리폴리머는 약 0.1 meq/g 내지 약 1 meq/g, 바람직하게는 약 0.2 meq/g 내지 약 0.8 meq/g 양의 활성 이소시아네이트를 함유한다. 일반적으로, 예를 들어 2000 이하의 저분자량의 프리폴리머는 비교적 높은 이소시아네이트 함량(약 1 meq/g 이상)을 함유해야 한다. 이들 프리폴리머 중 몇몇의 중합 반응 속도는 조절이 매우 어려워 중합이 너무 빨라 마이크로스폿팅을 효과적으로 수행할 수 없다. 또한, 이러한 높은 이소시아네이트 함량을 가진 이들 프리폴리머는 중합 이후에 비교적 높은 함량의 유리 아민을 남겨, 양전하가 음으로 하전된 표적 DNA 샘플과의 비-특이적 결합을 증가시킬 수 있어 높은 백그라운드 시그널을 야기한다. 이에 따라, 비교적 낮은 이소시아네이트 함량을 함유한 고분자량의 프리폴리머가 특정 적용에서 바람직하다.
이러한 고분자량의 프리폴리머는 종종 두가지 일반적인 방법 중 하나에 의해 제조되지만, 타 방법들도 이용될 수 있다:
(1) 고분자량의 폴리올(트리올 이상, 분자량 적어도 2000)을 이소포론 디이소시아네이트와 같은 폴리이소시아네이트와 반응시킴;
(2) 고분자량의 디올(분자량 적어도 2000)을 폴리이소시아네이트 및 가교제, 예를 들면 글리세롤, 트리메틸올프로판, 트리메틸올에탄, 트리에탄올아민 또는 유기 트리아민과 반응시킴.
방향족, 지방족 또는 지환족 폴리이소시아네이트를 이용할 수 있다. 고분자량의 지방족 이소시아네이트-캐핑된 프리폴리머가 전형적으로 약 20 내지 90분내에 수화된 중합체 상태로 겔화되지만 방향족 폴리이소시아네이트로 캐핑된 프리폴리머는 좀더 빠르게 겔화된다. 적당한 이- 및 다작용성 이소시아네이트의 예는 하기와 같다: 톨루엔-2,4-디이소시아네이트, 톨루엔-2,6-디이소시아네이트, 이소포론 디이소시아네이트, 에틸렌 디이소시아네이트, 에틸리덴 디이소시아네이트, 프로필렌-1,2-디이소시아네이트, 사이클로헥실렌-1,2-디이소시아네이트, 사이클로헥실렌-1,4-디이소시아네이트, m-페닐렌 디이소시아네이트, 3,3"-디페닐-4,4"-비페닐렌 디 이소시아네이트, 1,6-헥사메틸렌 디이소시아네이트, 1,4-테트라메틸렌 디이소시아네이트, 1,10-데카메틸렌 디이소시아네이트, 큐멘-2,4-디이소시아네이트, 1,5-나프탈렌 디이소시아네이트, 메틸렌 디사이클로헥실 디이소시아네이트, 1,4-사이클로헥실렌 디이소시아네이트, p-테트라메틸 크실릴렌 디이소시아네이트, p-페닐렌 디이소시아네이트, 4-메톡시-1,3-페닐렌 디이소시아네이트, 4-클로로-1,3-페닐렌 디이소시아네이트, 4-브로모-1,3-페닐렌 디이소시아네이트, 4-에톡실-1,3-페닐렌 디이소시아네이트, 2,4-디메틸-1,3-페닐렌 디이소시아네이트, 2,4-디메틸-1,3-페닐렌 디이소시아네이트, 5,6-디메틸-1,3-페닐렌 디이소시아네이트, 1,4-디이소시아나토디페닐에테르, 4,4'-디이소시아나토디페닐에테르, 벤지딘 디이소시아네이트, 4,6-디메틸-1,3-페닐렌 디이소시아네이트, 9,10-안트라센 디이소시아네이트, 4,4'-디이소시아나토디-벤질, 3,3'-디메틸-4,4'-디이소시아나토디페닐메탄, 1,6-디메틸-4,4'-디이소시아나토디페닐, 2,4-디이소시아나토스틸벤, 3,3'-디메톡시-4,4'-디이소시아나토디페닐, 1,4-안트라센디이소시아네이트, 2,5-플루오론디이소시아네이트, 1,8-나프탈렌 디이소시아네이트, 2,6-디이소시아나토벤즈루란, 2,4,6-톨루엔 트리이소시아네이트, p,p',p"-트리페닐메탄 트리이소시아네이트, 이소포론 디이소시아네이트의 삼작용성 삼량체(이소시아누레이트), 헥사메틸렌 디이소시아네이트의 삼작용성 뷰렛, 헥사메틸렌 디이소시아네이트의 삼작용성 삼량체(이소시아누레이트), 중합체 4,4'-디페닐메탄 디이소시아네이트, 크실릴렌 디이소시아네이트 및 m-테트라메틸 크실릴렌 디이소시아네이트.
프리폴리머를 형성하기 위해 폴리이소시아네이트를 이용한 선택된 디올 또는 폴리올의 캐핑은 화학량론적 양의 반응물을 이용하여 수행될 수 있다. 이소시아네이트:하이드록실 그룹의 비는 업계에 공지된 바와 같이 달라질 수 있지만 바람직하게는 약 1 내지 약 3, 좀더 바람직하게는 약 1.2 내지 약 2.2이다. 캐핑 반응은 적당한 방법 또는 과정, 예를 들어 약 20℃ 내지 약 150℃에서, 건조 질소하에, 약 2시간 내지 약 14일간, 바람직하게는 촉매의 부재하에 수행될 수 있다. 바람직한 온도는 약 60℃ 내지 100℃이다. 반응은 이소시아네이트 농도가 이론치에 가까와질 경우에 종료한다.
바람직한 프리폴리머는 톨루엔 디이소시아네이트로 말단-캐핑된 폴리에틸렌 글리콜, 톨루엔 디이소시아네이트 및 임의로 트리메틸올프로판과 에틸렌 옥사이드 및 프로필렌 옥사이드의 공중합체, 톨루엔 디이소시아네이트-폴리에틸렌 글리콜-트리메틸올프로판, 메틸렌 디이소시아네이트-메틸렌 단일중합체, 중합체 메틸렌 디이소시아네이트-폴리에틸렌 글리콜, 이소포론 디이소시아네이트 및 에틸렌 옥사이드-프로필렌 옥사이드-트리메틸올프로판의 중합체, 및 톨루엔 디이소시아네이트 폴리에틸렌 글리콜 트리락테이트를 포함한다. 이러한 프리폴리머는 매사추세츠 렉싱턴 소재의 Hampshire Chemical Corp.로부터 HYPOL PreMAR, HYPOLR 2000, HYPOLR 3000, HYPOLR 4000 및 HYPOLR 5000 형태로 입수가능하고 폴리에틸렌 옥사이드와 소량의 폴리프로필렌 옥사이드의 공중합체를 포함한다.
모든 점을 고려할 때, 하이드로겔 중합체의 주쇄는 바람직하게는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 또는 폴리에틸렌 글리콜과 폴리프로필렌 글리콜의 공중합체로 구성된다. 이론적인 메카니즘에 구속되지는 않지만, 비-이온성, 친수성의 폴리에틸렌 글리콜과 폴리프로필렌 글리콜 하이드로겔이 하이드로겔에 대한 분석물의 비특이적 결합을 낮은 수준으로 제공하고 고정된 생체분자와의 우수한 화합성을 제공하여 본래 형태 및 이의 생물반응성을 유지시키는 것으로 여겨진다. 이소시아네이트-작용성 하이드로겔은 유리하게는 다량의 액체를 빠르고도 비교적 일정한 방식으로 흡수하여 겔 물질의 기본적인 전체 형상을 유지시킨다. 추가로, 이들 물질에 의해 흡수된 수분은 적용된 압력하에서 조차 흡수재에 유지된다. 이러한 이소시아네이트-작용성 하이드로겔, 예를 들어 폴리우레탄계 하이드로겔은 미국 특허 3,939,123(Mathews 등) 및 4,110,286(Vandegaer 등)에 기재되어 있다. 이들 폴리우레탄계 하이드로겔은 표면 코팅제로서 광범위하게 이용되어 왔고 유연성 또는 견고한 포움을 형성할 뿐만 아니라 해당 화학적 화합물이 부착되는 3차원 매트릭스를 형성한다.
바람직한 양태에서, 바이오칩은 고분자량의 폴리에틸렌 옥사이드, 폴리프로필렌 옥사이드의 디올 또는 트리올, 또는 폴리에틸렌 옥사이드와 폴리프로필렌 옥사이드의 공중합체에 기초한 이소시아네이트-작용성 하이드로겔을 이용하여 제조되고, 수-활성 디이소시아네이트로 캐핑된 다음 임의로는 적당한 가교제에 의해 약하게 가교결합되어, 활성 이소시아네이트의 양, 예를 들어 바람직하게는 최대 약 0.8 meq/g를 예측할 수 있다. 일반적으로 바람직한 디이소시아네이트는 방향족계 디이소시아네이트, 예를 들어 톨루엔 디이소시아네이트 또는 메틸렌 디페닐-이소시아네이트, 및 지방족 디이소시아네이트, 예를 들어 이소포론 디이소시아네이트를 포함한다. 수-혼화성 유기 용매에서 미리 제형될 수 있는 프리폴리머의 중합은 단순히 물을 첨가하여 일어나는 우레아 결합의 형성에 의해 일어난다. 이는 자외선 조사 또는 마찬가지로 엄격한 반응 조건이 중합을 개시하는 데 필요한 앞서 공지된 하이드로겔계 바이오칩과는 구별되는 이점이다. 본 발명의 수-활성화된 중합 시스템이 좀더 안전할 뿐만 아니라, 비용이 적게 들고 조절이 손쉬워, 중합 이전 또는 이와 동시에 적절한 생체분자 탐침을 이용한 프리폴리머의 유도체화를 허용한다.
본원에 기재된 일 양태에서, 하이드로겔은 생체분자와 프리폴리머의 이소시아네이트간의 단순한 2 내지 3분 반응을 이용하여 유기 용매에서 용해되는 생체분자와의 중합 이전에 유도된다. 유기-용해성 생체분자란 아민으로 미리 유도체화되고 본래 유기 용매에서 용해성인 PNA 및 용해되도록 변형된 PNA와 같은 분자를 의미한다. 본 양태에서 하이드로겔의 조기 중합을 막기 위해, 유도체화 반응은 예를 들어 디메틸포름아미드(DMF), N-메틸-2-피롤리디논(NMP), 아세톤, 아세토니트릴 따위 또는 이들의 혼합물과 같은 비양성자성 수-혼화성 유기 용매에서 수행된다. 이에 따라, 하이드로겔의 팽창 또는 기질상으로 하이드로겔의 분배 이전에, 생체분자 탐침은 폴리우레탄계 프리폴리머 겔에 공유결합된다. 이러한 유도체화에 이어, 물을 첨가하면 중합이 개시되어, 생체분자-유도체화된 하이드로겔, 예를 들어 PNA-유도체화된 하이드로겔을 만든다.
하이드로겔의 유도체화에서 비양성자성 용매의 이러한 사용 및 존재는 다수의 이점을 가진다. 첫째, 이는 물에서 프리폴리머의 균질 용액의 생성을 돕는다. 둘째, 이는 중합 단계로부터 유도체화 단계를 분리하여, 하이드로겔로의 생체분자 유도체화의 조절된 수율이 달성될 수 있다. 셋째, 이는 중합 단계 도중 이산화탄소의 생성 및, 중합 혼합물의 점도를 효과적으로 낮추어 이산화탄소의 발생을 낮춘다. 몇몇 경우에 바람직한 폴리우레탄계 하이드로겔의 중합에서, 하이드로겔 프리폴리머의 이소시아네이트 그룹이 물과 반응하여 이산화탄소가 발생한다. 이러한 반응식은 예를 들어 도 1과 2에서 설명되고 있으며, 이러한 프리폴리머로부터 바이오칩을 제조할 경우 이산화탄소 발생과 겔로부터 이의 방출의 조절이 매우 중요할 수 있다. 중합이 높은 점성 혼합물에서 너무 빠르게 일어나면, 이렇게 생성된 이산화탄소는 빠져나올 수 없어 겔 내부에 갖히게 되어 별도의 포움 매트릭스를 만들어내는데 이는 성공적인 하이브리드화의 지표인 정확하고 효과적인 형광 검출을 보장하기 위해 바이오칩에서 중요할 수 있는 겔 매트릭스의 연속체에 문제를 야기할 수 있다. 이산화탄소의 생성은 비양성자성 용매를 첨가하여 물/하이드록사이드의 전체 반응성을 감소시키고 반응 속도의 알맞은 조절을 제공하는 비교적 낮은 염기성 pH 완충액(pH 약 7 내지 약 8.4)를 이용하여 조절된다.
하이드로겔을 유도체화시키는데 있어 비양성자성 용매의 사용에 대한 네 번째, 최종 이점은 프리폴리머의 침전을 감소시켜 하이드로겔의 광학 투명도를 향상시키는 데 있다. 겔의 목적하는 느린 중합을 허용하여, 연속 및 투명 겔 매트릭스를 초래하는 CO2의 느린 생성을 허용하기 위해, 비양성자성 용매 대 물의 비는 적어도 약 0.25 내지 1, 바람직하게는 그 이상, 예를 들면 0.3-0.35 내지 1이어야 함이 발견되었다. 하이드로겔의 유도체화 및 중합은 일반적으로 약 30분 내에 달성되는 데, 이는 폴리아크릴아미드계 바이오칩의 제조를 위해 필요한 24 내지 48시간과 뚜렷이 대조된다. 추가로, 프리폴리머에 결합된 생체분자, 예를 들어 PNA의 양은 반응에 첨가되는 생체분자의 양을 단순히 다양하게 함으로써 용이하게 조정될 수 있어(예를 들면, PNA가 겔에 결합될 생체분자이면, PNA 약 10 fmol 내지 약 1 pmol이 각 마이크로소적에 대해 사용될 수 있다), 각 하이드로겔 마이크로소적 내의 생체분자 탐침 농도의 제어를 허용한다.
이의 중합 개시 후 및 이의 중합 완료 전에, 하이드로겔이 PNA로 유도체화된 다음 고체 기질에 침착될 때 이는 편리한 방법, 예를 들면 바람직하게는 겔을 침착시켜 마이크로소적의 어레이를 형성하는 통상의 마이크로스폿팅기의 사용으로 달성될 수 있다. 겔이 본래 일부 기질에 비-공유적으로 부착될 수 있지만, 기질 표면은 일반적으로 하이드로겔의 첨가 전에 유도체화되어 겔의 기질에의 최대 부착을 달성한다. 예를 들면, 유리가 기질로서 사용되는 일 바람직한 양태에서, 유리는 중합 하이드로겔의 이의 표면으로의 침착 전에 아민으로 유도체화된다. 따라서, PNA 또는 DNA와 같은 생체분자 탐침으로 유도체화된, 중합 하이드로겔은 프리폴리머내 활성 이소시아네이트 그룹과 유리 표면에 위치하는 아민의 반응을 통해, 유도체화된 유리 기질에 침착될 때 기질에 강하게 결합하여, 하이드로겔의 기질에의 공유접합을 제공한다.
바이오칩 기질은 결합 분석 및 각 바이오칩 셀에 결합하는 분자의 후속 검출에서 사용하는 중에 자동화 취급을 인도하는 다양한 물질 및 포맷으로 구성될 수 있다. 예를 들면, 유리 또는 폴리스티렌과 같은 광학적으로 투명한 기질이 셀을 통 한 투과광 검출을 허용할 것이고 형광 또는 광 흡수를 사용하는 검출 양식을 위해 편리하다. 3차 하이드로겔 셀의 고 결합능 때문에, 반사성 광학적 방법 또한 가능하고 불투명 기질의 사용을 허용한다. 단단한 기질의 사용은 바이오칩의 상 검출 중에 정렬의 정확성을 허용하지만, 이는 검출을 촉진하기 위해 적당한 정렬이 셀에 도입되면 필요하지 않을 수도 있다. 그 예는 자기 테입의 사용과 유사한 스캐닝 방식으로 정확하게 검출될 수 있는, 테입 또는 필라멘트와 같은 가요성 포맷일 것이다. 광학적 방법 및 적당한 기질이 간단하기 때문에 바람직하지만, 방사능 제제의 검출을 포함한, 생화학에서 사용되는 다른 검출 방법이 사용될 수 있다.
유리하게는, 이 시스템에 관여하는 반응, 즉 (1) 하이드로겔 프리폴리머의 생체분자 탐침으로의 유도체화, (2) 하이드로겔의 중합 및 (3) 유도체화된 하이드로겔의 기질 표면에의 결합은 강력한 우레아 또는 우레탄(카바메이트) 결합의 형성을 포함한다. 이들 결합은 마이크로소적 어레이의 기계적 보전을 제공하고 선행기술의 폴리아크릴아미드계 바이오칩과 비교하여, 바이오칩의 반감기를 상당히 증가시킨다.
이 후에 설명되는 특정 바람직한 양태에서, 하이드로겔 소적은 기질에서 중합시, 두께가 약 20 ㎛ 내지 100 ㎛이고; 바람직하게는 이들의 두께가 적어도 약 30 ㎛, 더 바람직하게는 약 30 ㎛ 내지 약 50 ㎛이다. 겔 소적(또는 셀)의 더 큰 전체 크기는 그 안에 고정되는 생체분자 탐침량의 상당한 증가를 허용하여, 바이오칩의 감도를 증가시키고 이의 사용을 촉진한다.
본원에서 고려된 대안의 양태에서, 전술한 유기-가용성 생체분자 대신 DNA 또는 다른 올리고뉴클레오타이드와 같은 수용성 생체분자가 하이드로겔에 결합된다. 수용성 생체분자는 본래 수용성인 DNA 및 RNA와 같은 분자와, 수용성이도록 변형된 다른 분자를 의미한다. 이러한 양태에서, 하이드로겔 프리폴리머를 1차 유도체화한 다음 중합을 개시하는 것은 실행 가능하지 않다. 그러나, 폴리우레탄계 하이드로겔은 유리하게도 반응이 이에 수착된 수용성 생체분자 탐침의 예견 가능한 양을 가지는 유도체화된 하이드로겔을 제공하도록 적당하게 제어되면서 단독 반응으로 유도체화되고 중합될 수 있다. 특히, 이러한 하이드로겔 프리폴리머는 유기 용매에 1차 용해된다. 이어서 완충 수용액 중의 DNA 또는 다른 수용성 생체분자가 하이드로겔이 생체분자 탐침으로 유도체화되고 중합되도록 하는 양으로 및 적당한 조건하에서 이러한 프리폴리머에 첨가된다. 하이드로겔이 중합될 때 및 중합이 완료되기 전에, 전술한 바와 같은 적당한 기질에 마이크로스폿팅된다.
이와 달리, DNA, RNA 및 다수의 단백질과 같은 수용성 생체분자는 이들이 비양성자성 유기 용매에서 가용성이도록 화학적으로 변형될 수 있어, 중합 전에 이들의 이소시아네이트-작용성 하이드로겔로의 유도체화를 허용한다. 변형은 지질과의 접합 및 이온 그룹의 가역성 블로킹과 같은 공유적 변형과, 이온쌍 형성제의 사용과 같은 비-공유적 변형을 포함할 수 있다. 마찬가지로, PNA는 만족스러운 수용성이도록 화학적으로 변형될 수 있다.
하이드로겔 제형물의 최적화
최종 중합체의 팽윤능, 중합시간 및 투명도와 강도(즉, 안정성)는 바이오칩에 사용하기 위해 하이드로겔을 평가할 때 중요한 특징이다. 이들 특징의 최적화가 최적의 하이드로겔을 제공한다.
팽윤능은 물 함량을 반영하기 때문에 하이드로겔의 중요한 특징이다. 일반적으로, 중합된 겔의 물 함량이 증가할수록, 겔에서 및 겔 밖에서 분자의 확산이 더욱 신속해진다. 바이오칩의 경우에, 분자, 예를 들어 DNA 샘플의 확산이 더욱 신속해질수록, 하이브리드화 반응은 더욱 효율적이다. 간단한 팽윤 중합체에서 분자 확산의 수학은 하기의 반-실험식을 기본으로 한다(Davis B. K. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 21:3120, 1974):
Dp = D0 exp [-0.05 + (10-6 M) P]
여기에서,
Dp = 중합체 용액에서 특정된 분자의 확산 계수
D0 = 순수한 물에서 특정된 분자의 확산 계수
M = 특정된 분자의 분자량
P = 중합체 함량%
따라서, 이 식으로부터 물 함량이 증가할수록, 중합체에서 및 중합체 밖에서 분자의 확산이 더욱 신속해진다. 하이드로겔 중합체의 밀도 및 다공성은 반응물 농도, 반응성 그룹의 밀도 및 전체 반응 운동학을 포함하는 다양한 파라미터에 의해 조절될 수 있다.
하이드로겔의 중합을 위해 필요한 시간의 최적화는 바이오칩의 프로세싱에서 특히 중요하다. 이상적으로, 중합을 위해 필요한 시간은 중합이 완료되기 전에 통 상의 마이크로스폿팅기로 유리 기질의 표면으로 중합 겔의 분배를 허용하기에 충분한 장시간이어야 하지만, 일단 분배되면, 하이드로겔이 이 후 즉시 완전히 중합되기에 충분한 단시간이어야 한다. 이러한 필요조건을 기본으로, 약 30분의 중합시간 및 평형상태에서 약 96% 내지 97%의 팽윤능을 가지는 하이드로겔이 양호한 성능을 보임이 측정되었다. 다양한 실험이 최적의 하이드로겔 제형물을 제공하기에 가장 적당한 제형 및 반응조건을 결정하기 위해 수행되었다. 이러한 실험은 겔 투명도 및 중합속도 측면에서 프리폴리머-용매 비, 용매형 및 완충 조건의 평가를 포함한다. 결과는 하기 단락에 약술되었다.
1. 프리폴리머 및 중합체-물 비의 평가
초기 실험에서, 특정 방향족 폴리이소시아네이트로 캐핑된 하이드로겔 프리폴리머가 바이오칩 생산에 사용하기 위해 탈이온수로 처리하면 2-3분 내에, 즉 매우 신속하게 중합됨이 발견되었다. 반대로, 특정 지방족 폴리이소시아네이트로 캐핑된 하이드로겔 프리폴리머는 동일한 조건하에서 중합을 완료하는 데 35분 이상이 걸리고, 이는 추가의 최적화를 위해 선별될 것을 요한다. 프리폴리머-물 비를 최적화하기 위해, 약 0.4 meq/g의 활성 이소시아네이트 함량을 가지는 프리폴리머의 다양한 양을 약 pH 7에서 물에 용해시키고, 각 중합시간을 측정한다. 표 1에서 보여지는 것처럼, 중합시간은 수용액 중의 프리폴리머의 비율이 감소함에 따라 연장된다. 예를 들면, 5% 프리폴리머 용액은 48시간 후에도, 주로 표면에서 중합된다. 반대로, 비완충 탈이온수에서, 10% 프리폴리머 함량을 가지는 프리폴리머 용액은 3시간 내에 중합되고, 20% 용액은 약 35분 내에 완전히 중합된다. 이러한 초기 실험으 로부터, 적어도 약 5%, 바람직하게는 약 10% 이상, 더 바람직하게는 적어도 약 20%의 프리폴리머 용액이 바이오칩의 제조에서 이 pH에서 사용되어야 하는 것 같지만; 임시 결론이 pH 또는 일부 다른 반응조건의 변화에 의해 어떻게 변동될지는 불확실하다.
수용액 중의 프리폴리머% 중합시간
5% >48시간
10% 3시간
20% 35분
2. pH가 중합에 끼치는 영향
하이드로겔 제형물의 최적화를 위한 다음 단계는 pH가 중합속도에 끼치는 영향을 측정하는 것이다. 표 2에 이 실험의 결과를 요약하였다.
수용액 중의 프리폴리머% pH 7.2 pH 8.4
5% 90분 20분
10% 17분 3분

이 실험에서, pH 7.2 및 8.4에서 50 mM 나트륨 비카보네이트 수성 완충액이 하이드로겔의 중합속도를 상당히 가속함이 발견되었다. 따라서, 예를 들면, 단지 5%의 프리폴리머 제형물이 사용되면, 중합시간은 pH 7.2에서는 >48시간에서 90분으로, pH 8.4에서는 단지 20분으로 단축된다. 유사하게, 10% 프리폴리머 용액은 pH 7.2에서 17분 내에, pH 8.4에서 3분 내에 완전히 중합된다. 이러한 실험은 중합 반 응 용액의 pH를 조정함으로써, 적은 프리폴리머 함량, 즉 5% 또는 10%가 하이드로겔 제형에 사용될 수 있음을 의미한다.
중합시간과 아울러, 겔의 팽윤성 또한 고려되어야 한다. 중합이 신속하게 일어날 수 있지만, 겔은 적어도 약 95%, 바람직하게는 약 96% 내지 97%의 목적하는 물 함량에 도달할 때 가장 유용하다. 따라서, 상이한 중합체 함량 제형물의 팽윤 특징 또한 분석되었고, 표 2A는 5% 하이드로겔 제형물 및 10% 하이드로겔 제형물의 팽윤 프로파일을 비교한다. 물 함량은 팽윤비로 기록되고, 팽윤비는 하이드로겔의 전체 중량을 프리폴리머의 중량으로 나눔으로써 계산된다.
시간과 % 프리폴리머의 함수로서 팽윤비
시간
조성 1 1½ 3 24
5% 프리폴리머 23 25 27.5 40
10% 프리폴리머 12 13 15 25

이 시험 결과로부터, 10% 프리폴리머 용액을 사용하여 제조되는 하이드로겔은 약 25의 팽윤비에 대등한, 96%의 최적 물 함량을 달성하는 데 약 하루가 필요함을 알 수 있다. 또한, 완전히 팽윤되면, 하이드로겔의 용적은 중합이 개시된 직후 용적의 약 두배이고, 이는 이 하이드로겔의 구조적 보전을 유지하기가 어렵게 한다. 반대로, 5% 프리폴리머 용액으로 생성되는 하이드로겔은 약 1시간 내에 96%의 물 함량에 도달하고 구조적 보전의 손실이 없다. 따라서, 이러한 약간의 염기성 용액 및 팽윤 프로파일로의 두 중합속도를 기본으로, 5% 프리폴리머 용액이 추가의 최적화를 위해 선택된다.
3. 하이드로겔의 투명성 최적화
수용액으로부터 제조된 대부분의 하이드로겔의 중요한 단점은 이들의 일반적인 불투명성이다. 바이오칩에 가장 유용하기 위해, 겔은 투명해야 하고, 특히 형광 태그와 같은 특정 분자 마커 또는 표지로의 간섭이 최소화되도록 광학적으로 투명해야 한다. 광학적 투명성을 달성하기 위해, 하이드로겔 프리폴리머는 아세토니트릴, 아세톤, DMF, NMP 또는 이들의 혼합물과 같은 비양성자성 유기 용매에 1차 용해되고, 생성 용액은 pH 7.2 또는 8.4에서 50 mM 나트륨 비카보네이트 완충액으로 처리되어 중합이 개시된다. NaHCO3는 약 8.4의 pH에서 수용액을 정상적으로 완충할 것이지만; 약간의 완충능이 손실되어도, 산, 예를 들어 HCl 또는 염기, 예를 들어 NaOH의 첨가가 예를 들면, 7.0에서 9.5로 연장하는 범위를 확대시키기 위해 완충된 pH를 약간 변동시키는 데 사용될 수 있다. 바람직한 5% 중합체 용액을 사용하여, 비양성자성 용매 대 수성 완충액의 비는 중합시간 및 광학적 투명성 측면에서 최적의 제형을 결정하기 위해 조정된다. 표 3은 완충액 대 비양성자성 용매, 이 경우에는 아세토니트릴의 다양한 비를 가지는 5 가지의 상이한 하이드로겔 제형물의 시험 결과를 보여준다.


제형물 번호 아세토니트릴: 완충액 중합시간
탈이온수
대조 0.3 g: 0.65 g 3시간
pH 8.4 완충액
1 0.1 g: 0.85 g 45분
2 0.2 g: 0.75 g 42분
3 0.3 g: 0.65 g 35분
4 0.4 g: 0.55 g 35분
5 0.5 g: 0.45 g 32분
pH 7.2 완충액
6 0.1 g: 0.85 g 180분
7 0.2 g: 0.75 g 170분
8 0.3 g: 0.65 g 180분
9 0.4 g: 0.55 g 180분
10 0.5 g: 0.45 g 150분

pH 8.4 및 pH 7.2에서 시험된 각 제형물은 아세토니트릴 대 완충액 비의 비교적 큰 차이에 상관없이, 각각 약 30-45분 및 150-180분 내에 중합된다. pH가 증가할수록, 중합은 신속해진다. 미리 제조된 나트륨 비카보네이트 완충액의 pH는 완충액으로부터 CO2 기체의 방출로 인해 시간에 따라 증가하고; 따라서 나트륨 비카보네이트가 완충액 시스템으로 사용되면, 동일한 날 신선하게 제조되고 사용되어야함이 발견되었다. 또다른 완충액 시스템, 50 mM 보레이트 완충액이 시험되고 신선하게-제조된 나트륨 비카보네이트 완충액과 유사한 시간으로 중합 완료를 달성함이 발견되었다. 보레이트 완충액은 비율이 약 7.0 내지 약 9.5의 pH를 제공하도록 다양해질 수 있는 나트륨 테트라보레이트와 붕산을 함유하는 수용액이다.
각 생성 하이드로겔의 가시적 투명성은 유기 용매 대 수성 완충액의 비 측면에서 다양하다. 투명성은 CO2의 방출 및/또는 프리폴리머의 침전에 의해 영향을 받는다고 생각된다. 가시적 투명성은 유기 용매 대 수성 완충액의 비가 증가할 때 개 선되는것 같고, 이는 하기의 추가 실험을 수행하도록 촉구한다.
하이드로겔의 가시적 불투명성이 형광의 광학적 강도에 끼치는 영향을 측정하기 위해, 하기의 실험이 3 가지 제형물(10 중량%, 20 중량% 및 30 중량% 비양성자성 용매)을 사용하여 수행된다.
제형물 Ⅰ:
Hypol PreMa G-50 0.2 g을 아세토니트릴 0.22 g 및 NMP 0.22 g에 용해시킨다. 생성 용액을 50 mM 보레이트 완충액(pH 8.0) 3.8 ㎖ 중의 DNA 용액과 반응시킨다(올리고뉴클레오타이드 농도, G11, 즉, 5'-CTAAACCTCCAA-3' 0.75 mg/완충액 ㎖). 제형물은 유기 용매 약 10 중량%를 함유한다.
제형물 Ⅱ:
Hypol PreMa G-50 0.2 g을 아세토니트릴 0.44 g 및 NMP 0.44 g에 용해시킨다. 생성 용액을 pH 8.0에서 50 mM 보레이트 완충액 3.36 ㎖ 중의 DNA 용액과 반응시킨다(올리고뉴클레오타이드 농도, G11, 0.84 mg/완충액 ㎖). 제형물 Π는 유기 용매 약 20 중량%를 함유한다.
제형물 Ⅲ:
Hypol PreMa G-50 0.2 g을 아세토니트릴 0.67 g 및 NMP 0.67 g에 용해시킨다. 생성 용액을 pH 8.0에서 50 mM 보레이트 완충액 2.89 ㎖ 중의 DNA 용액과 반응시킨다(올리고뉴클레오타이드 농도, G11, 1 mg/완충액 ㎖). 제형물 Ⅲ은 유기 용매 약 30 중량%를 함유한다.
제형물 Ⅰ, Ⅱ 및 Ⅲ을 하기 실시예 Ⅲ에서 더욱 상세히 설명된 것처럼, 통 상의 마이크로스폿팅기를 사용하여 유리 슬라이드에 마이크로스폿팅한다. 약 95% 상대습도의 제어되는 가습기 챔버에서 1시간 경화시킨 후에, 생성 슬라이드를 세척 완충액으로 세척하고 형광-표지 표적 샘플과 20분간 하이브리드화한다. 각 제형물의 강도는 CCD 카메라로 측정된다. 결과는 표 3A에 설명되었고 이로부터 불투명성은 유기 용매의 상대 %에 따라 좌우되고 형광 강도에 영향을 끼침이 명백하다.
가시적 불투명성이 형광 강도에 끼치는 영향
(유기용매) 가시적 불투명성 형광 강도
제형물 Ⅰ(10%) 불투명 2044(±217)
제형물 Ⅱ(20%) 보통의 불투명 8223(±779)
제형물 Ⅲ(30%) 투명 10209(±632)
상기 시험의 결과로서, 중합되는 전체 용액의 적어도 약 20 중량%, 바람직하게는 적어도 약 30 중량%의 유기 용매 및 바람직하게는 적어도 약 15%의 아세토니트릴을 이용하는 하이드로겔 제형이 광학적 투명이 최종 바이오칩에서 목적하는 바일 때 바람직함이 판명되었다.
4. 비양성자성 유기 용매의 비교
본 발명의 바이오칩을 위한 하이드로겔의 최적화에서 다음 단계는, 비양성자성 용매의 비교이다. 섹션 Ⅱ에 설명된 것과 유사한 실험을 다양한 비양성자성 용매, 즉 DMF, NMP 및 아세톤을 사용하여 수행한다. 이러한 대안의 유기 용매가 아세토니트릴과 유사하게 작용한다고 생각되지만, 경우에 따라서는 그렇지 않다. 30% DMF, NMP 또는 아세톤을 가지는 하이드로겔 제형물의 중합 연구 결과는 표 4에 요약되었다.
용매 완충액의 pH 중합시간
DMF 비완충된 탈이온수 미중합
8.4 미중합
9.15 20분
9.5 8분
10 미중합
NMP 비완충된 탈이온수 미중합
8.4 미중합
9.15 미중합
9.5 미중합
10 미중합
아세톤 비완충된 탈이온수 미중합
8.4 30분

이러한 실험으로부터, DMF 중의 제형물은 중합하기 위해 높은 pH를 요하지만, 동일한 조건하에서 NMP 중의 제형물은 전혀 중합하지 않음이 발견되었다. 아세톤 중의 제형물이 이들이 중합하기 위해 단지 약간의 염기성 pH를 요한다는 점에서 아세토니트릴 제형물과 가장 유사하다. 놀랍게도, DMF 또는 아세톤 제형물로부터 생성된 중합 하이드로겔은 아세토니트릴 제형물로 생산된 중합 하이드로겔에 비해 구조적 강도가 열등하다. 따라서, 이러한 최적화 연구로부터, 아세토니트릴이 최적의 바이오칩의 추가 개발에 사용하기에 바람직한 비양성자성 용매로 선택되고; 후속 실험은 테트라하이드로퓨란 및 디옥산과 같은 다른 비양성자성 유기 용매가 아세토니트릴 및 아세톤과 유사한 완전한 중합을 달성하기 위한 성향을 보임을 나타낸다.
전술한 모든 시험을 기본으로, 일반적으로 중합 용액의 pH가 약 7.0 내지 약 9.5, 바람직하게는 약 7.2 내지 약 8.6, 더 바람직하게는 약 7.4 내지 약 8.4, 가장 바람직하게는 약 7.6 내지 약 8.2이어야 한다고 생각된다.
5. 중합 중에 습도 영향의 평가
마이크로스폿팅 중에 또는 이 후에, 침착된 마이크로소적은 강력한 탈수 또는 유기 용매의 즉각적인 손실을 회피해야 한다. 이러한 손실은 기질에서의 중합 중에 지나친-가교결합을 초래할 수 있고 고분자량 표적 샘플의 낮은 확산성을 초래한다. 이 잠재적인 문제점은 중합 바이오칩을 마이크로스폿팅 직후에 제어되는 습도 챔버에 둠으로써 해결된다. 제어되는 가습기는 디지털 슬링 건습구 습도계(Model THWD-1, Amprobe Instrument)로 측정된 대략 97% 내지 98%의 습도로 구축되고 유지된다. 마이크로스폿팅 후에, 바이오칩을 즉시 가습기 챔버에 둔다. 이와 달리, 제어되는 습도 챔버는 마이크로스폿팅 공정 환경으로 연장될 수 있다.
표 5는 중합 중에 습도가 결합된 생체분자의 최종 형광 강도에 끼치는 영향을 보여준다.
중합 중 습도의 영향
조건 형광 강도
건조 762(±207)
습도 97-98% 7161(±2454)

시험은 중합이 건조한 조건하에서 수행되면 강도가 거의 10배 감소함을 보여준다. 이 차이는 가습 조건이 이용되지 않아 그 결과 표적 샘플의 확산성이 낮을 때 중합된 마이크로소적의 지나친-가교결합에 기여한다. 따라서 마이크로스폿팅 바이오칩을 중합 중에 적어도 약 90%의 상대습도에 노출시키는 것이 바람직하다.
6. 하이드로겔 중합의 온도 조절
프리폴리머를 수성 DNA 완충액과 혼합한 후에, 중합이 일어나기 시작하여, 바이오칩 기질에 적용되면서 혼합물의 점도를 서서히 증가시킨다. 연속 혼합 및 분배 공정이 사용될 수 있지만, 반응 운동학의 간단한 조절이 뱃치식 공정이 중합 하이드로겔의 제조 및 마이크로스폿팅을 위해 사용되도록 허용할 것임이 발견되었다. 실온에서, 상당한 점도 변화가 5분 내지 10분 동안 관찰되었고, 이는 분배 중에 마이크로소적의 크기 및 높이에 영향을 줄 수 있다. 이 잠재적인 문제점은 7℃의 저온 박스에서 마이크로스폿팅함으로써 본질적으로 해결된다. 온도 하강은 중합 공정을 느리게 하여 더욱 일관적인 점도를 초래한다.
이소시아네이트 - 작용성 하이드로겔 Hypol PreMa G-50 0.2 g을 아세토니트릴 0.67 g 및 N-메틸-2-피롤리디논 0.67 g에 용해시키고, 생성 혼합물을 pH 8.0에서 50 mM 보레이트 완충액 2.89 g을 첨가함으로써 중합한다. 중합은 실온(약 24℃) 및 7℃에서 수행된다. 완전히 중합되는 시간이 관찰되어 표 6에 나타나 있다.
상이한 온도에서의 중합시간
온도 중합시간
실온 50분
7℃ 2시간

이 시험은 완전한 중합이 마이크로소적을 저온에 가함으로써 지연될 수 있음을 보여주는데, 바람직하게는 약 10℃ 이하의 온도가 사용된다.
7. 두께가 감도에 끼치는 영향
용액을 Hypol PreMa G-50 0.2 g을 아세토니트릴 0.67 g 및 N-메틸-2-피롤리디논 0.67 g에 용해시킴으로써 제조한다. 생성 용액을 pH 8.0에서 50 mM 보레이트 완충액 2.89 ㎖ 중의 DNA 용액과 반응시키는데; DNA는 올리고뉴클레오타이드 G11, 즉 5'-CTAAACCTCCAA-3' 1 mg의 농도/완충액 ㎖ 형태이다. 전체 제형물은 전체 중량의 약 30%의 유기 용매를 함유한다.
하이드로겔의 중합 용액을 통상의 마이크로스폿팅기를 사용하여 유리 슬라이드에 마이크로스폿팅한다. 제어되는 가습기 챔버에서 1시간 동안 경화시킨 후에, 생성 슬라이드를 세척 완충액으로 세척한 다음 20분간 형광-표지 표적 샘플과 하이브리드화한다. 각 제형물의 강도는 CCD 카메라로 측정된다.
하이드로겔 마이크로소적의 3 가지 상이한 높이, 21 ㎛, 32 ㎛ 및 52 ㎛가 마이크로스폿팅 메카니즘을 적당하게 조정함으로써 동일한 하이드로겔 제형물을 사용하여 생성된다. 마이크로소적의 높이는 두께 측정 장치인 KLA-Tencor P11로 측정된다. 하이드로겔 셀은 표준 과정을 사용하여 하이브리드화 되고, 생성 형광 강도는 광학적으로 검출되고 측정된다. 결과는 표 7에 요약되었다.
하이드로겔 두께가 형광에 끼치는 영향
두께(㎛) 형광 강도
21 2728(±480)
32 4404(±640)
52 5616(±432)

시험 결과는 하이드로겔 셀이 두꺼울수록, 감도가 증가함을 보여준다.
하이드로겔의 생체분자 탐침으로의 유도체화
펩타이드 핵산 탐침으로의 유도체화
A. 반응조건의 최적화
명시된 것처럼 하이드로겔 제형물 및 이의 중합을 최적화하면, 겔을 적당한 생체분자 탐침으로 유도체화하여 더욱 안정하다고 생각되는, PNA를 지니는 바이오칩을 생성하는 데 주의를 기울인다. PNA 탐침은 바람직한 하이드로겔 제형물을 유도체화하는 데 사용하기 위해 이렇게 생산된다.
PNA를 하이드로겔을 제조하기 위해, 바람직한 비양성자성 용매인 아세토니트릴에 1차 용해시키지만, PNA는 아세토니트릴에서 약간만 가용성임이 발견되었다. 더욱 극성인 용매, 즉 NMP가 NMP를 사용하는 하이드로겔 제형물이 시험된 다양한 조건하에서는 중합되지 않지만, NMP와 아세토니트릴을 모두 함유하는 용액이 최적화될 수 있어 PNA의 적당한 가용성 및 하이드로겔의 유리한 중합을 제공하는 지를 관찰하기 위해 시험을 위해 선택되었다. 상이한 아세토니트릴/NMP 비로의 다수의 실험이 최적의 제형물은 두 비양성자성 용매가 사용되었을 때 아세토니트릴 대 NMP의 비 3:1 내지 1:1 범위의 용매비를 가져야 함이 판명되었다. 50 mM 나트륨 비카보네이트의 수용액은 이어서 약 pH 8.0에서 중합체/PNA 용액을 완충하는 데 사용되어, 20-30분 내에 완전히 중합되는 제형물을 초래한다. 도 1은 하이드로겔 프리폴리머와 PNA와 같은 유기-가용성 생체분자의 반응 및 유도체화된 프리폴리머의 중합을 개략적으로 도해한다.
B. PNA 유도체화가 하이드로겔의 중합에 끼치는 영향
제 1 바람직한 양태에 따른 PNA 바이오칩 제공에서 다음 단계는, PNA로의 유도체화 정도가 하이드로겔의 중합에 영향을 끼치는 정도를 평가하는 것이다. 일반적으로 아세토니트릴 중의 하이드로겔 제형물은 적어도 약 0.1 meq/g 내지 약 1 meq/g 이하의 활성 이소시아네이트 함량을 가져야 하고, 약 0.2-0.8 meq/g이 마찬가지로 바람직할 것이라고 생각된다. 이 범위 내의 프리폴리머를 사용하여, 활성 이소시아네이트의 상이한 %가 시험 화합물인 벤질아민으로 5분간 유도체화되는 실험을 수행하는데; 하이드로겔은 약 0.4 meq/g의 활성 이소시아네이트 농도를 사용한다. 이어서 유도체화된 하이드로겔을 pH 8.0에서 50 mM 나트륨 비카보네이트 완충액으로 처리함으로써 중합한다. 활성 이소시아네이트 10%의 벤질아민으로의 유도체화는 비유도체화 중합된 하이드로겔과 유사한 특징을 가지는 중합 하이드로겔을 초래한다. 반대로, 활성 이소시아네이트의 적어도 약 20%가 벤질아민으로 유도체화되면, 생성 제형물이 중합되지 않는데, 이는 활성 이소시아네이트 불충분량이 이 후에 중합을 위해 이용가능함을 의미한다. 따라서, 겔의 활성 이소시아네이트의 약 10%의 유도체화가 바람직하고 활성 이소시아네이트의 약 15% 이하가 이렇게 반응할 것이라고 생각된다. 활성 이소시아네이트의 10%가 PNA로 유도체화되면, PNA 약 1 내지 2 pmol이 약 1 나노리터의 하이드로겔의 소적에서 결합할 것이라고 평가된다. 이 파라미터의 대조는 PNA 또는 프리폴리머 용액에 첨가되는 다른 생체분자의 양으로 실행된다.
DNA 탐침으로의 유도체화
대안의 양태에서, 본 발명의 하이드로겔은 DNA(또는 유사 올리고뉴클레오타이드) 탐침으로 유도체화된다. 그러나 PNA와 달리, DNA는 유기 용매에서 가용성이 아니다. 따라서, DNA가 생체분자 탐침으로 사용되면, 유도체화 및 중합 단계가 분리되지 않지만 단일 단계의 일부로 수행된다. 아울러 PNA와 달리, DNA는 중합체의 활성 이소시아네이트와 결합하기 위해 이용가능한 활성 아민(또는 기타) 그룹을 가지지 않는데; 따라서 DNA는 바람직하게는 프리폴리머와 반응하기 전에, 예를 들면 활성 1차 아민을 제공할 디아민 또는 타 반응물과의 반응, 표준 아미다이트(amidite) 화학을 사용함으로써, 적당한 활성 그룹을 첨가하도록 변형된다.
하이드로겔이 PNA로 유도체화되는 전술한 양태처럼, 유기 용매 및 완충액 수용액의 양 및 반응조건은 중합시간, 겔 투명성 및 관련 특징 측면에서 하이드로겔 중합을 최적화하기 위해 선택된다. 약 4-10%의 중합체 함량 및 적어도 약 20%(더 바람직하게는 적어도 약 30%)의 유기 용매 함량이 바람직하다고 발견되었다. 유사하게 약 20% 이하, 바람직하게는 약 15% 이하, 더 바람직하게는 약 10% 이하의 하이드로겔의 활성 이소시아네이트가 DNA 탐침과의 결합에 의해 유도체화된다고 생각된다. 따라서, 예를 들면, 하기에 예시된 것처럼, 하이드로겔의 활성 이소시아네이트 약 2.5%가 DNA 탐침으로 유도체화될 수 있는데, 중합은 바람직하게는 약 pH 7.2 내지 약 8.6, 더 바람직하게는 약 7.6 내지 약 8.2에서 염기성 완충된 수용액을 사용하여 달성된다.
이 유도체화된 하이드로겔을 제조하기 위해, 프리폴리머는 유기 용매, 예를 들면 아세토니트릴에 1차 용해되고, 유도체화된 DNA(또는 다른 수용성 올리고뉴클레오타이드) 탐침은 수성 완충액에서 제조된다. 이어서 DNA 용액이 프리폴리머 용액에 철저하게 혼합하면서 첨가되어, 겔의 유도체화 및 중합의 개시를 모두 초래한다. 폴리우레탄계 하이드로겔을 유기 용매에 용해시키고 수용액 중의 수용성 생체분자 탐침을 첨가하는 이 일반적인 방법은 올리고뉴클레오타이드 외의 다수의 수용성 탐침에 적용가능하다. 도 2는 DNA와 같은 수용성 생체분자와 하이드로겔 프리폴리머의 연속 반응 및 하이드로겔의 중합을 개략적으로 도해한다.
하이드로겔의 기질 표면에의 결합
최종 단계는 유도체화된 하이드로겔 프리폴리머 제형물을 적당한 기질에 하이드로겔의 기질 표면에의 결합을 허용하는 적당한 조건하에서 분배하는 것이다. 선택된 기질이 투명하면, 바이오칩이 투과광에 의해 스캐닝될 때 시그널 검출로의 간섭을 감소시키기 위해, 바람직한 기질은 표면이 중합 하이드로겔의 공유결합을 위한 활성 부위를 제공하기 위해 아민으로 1차 유도체화된 유리이다. 유도체화된 하이드로겔을 유도체화된 유리 기질에 분배하기 직전에, 중합은 수성 완충액의 유도체화된 프리폴리머에의 첨가(유기-용매-가용성 생체분자로의 유도체화 경우) 또는 수용성 생체분자를 포함하는 수성 완충액의 첨가에 의해 개시된다. 이어서 중합 하이드로겔은 유리 기질에 마이크로스폿팅되어 가장 바람직하게는 약 30 내지 50 ㎛의 두께를 가지는 마이크로소적의 어레이를 형성한다.
50 mM 나트륨 비카보네이트 완충 수용액(pH 약 7.2 내지 약 8.4)이 하이드로 겔의 중합을 개시하기 위해 사용될 수 있고, 하이드로겔 제형물은 이러한 유도체화된 유리의 표면에 중합의 개시 후 약 1 내지 10분 내에 단단히 결합한다. PNA 또는 또다른 유기-가용성 탐침이 사용되면, 유도체화된 프리폴리머가 유도체화 직후에 사용될 필요는 없지만, 중합의 개시 전에 수성 완충액의 첨가에 의해 적당한 조건하에서 저장될 수 있다. 반대로, 프리폴리머가 수용성 탐침으로 유도체화되면, 중합 및 유도체화는 탐침의 프리폴리머 용액에의 첨가시 개시되어 중합 하이드로겔은 직후에 분배되어야 한다.
유리하게는, 이러한 이소시아네이트-작용성 하이드로겔은 매우 안정한 마이크로소적으로 신속하게 중합되고, 이들은 바람직하게는 기질에 분배되어 적어도 약 20 ㎛ 높이, 더 바람직하게는 적어도 약 30 ㎛ 높이, 가장 바람직하게는 약 30 ㎛ 내지 약 50 ㎛ 높이의 마이크로소적을 형성한다. 하이드로겔 소적 간의 컨시스턴시는 마이크로스폿팅을 사용하여 중합 겔을 분배시킴으로써 수득되거나 두꺼운 겔 소적, 또는 겔 셀 등을 제공하는 유사 자동화기는 바이오칩의 민감도를 현저히 증가시킬 수 있다.
겔로부터 물이 증발함에 따라 중합체 농도의 증가를 일으킬 수 있고 또한 겔 소적의 표면에 주름을 일으킬 수도 있는, 중합 겔의 과도한 가교결합을 방지하기 위하여, 바이오칩은 바람직하게는 습실과 같은 습한 환경에서 경화되고, 이어서 탈이온수로 세척된다.
유리 기질에 대한 중합 하이드로겔의 점도와 외장성은 어레이 전역에 걸쳐 소적의 적당하고 일관된 형상을 제공하는 데 중요할 수 있다. 이상적인 상황에서, 중합 하이드로겔의 점도는 서서히 직선식으로 증가한다. 그러나, 유감스럽게도, 하이드로겔의 점도는 중합 동안에는 대수적으로 증가하기 쉽다. 중합 동안 하이드로겔의 더 많은 선형 팽창을 촉진하기 위하여, 이의 점도는 다양한 분자량의 폴리에틸렌 글리콜 같은 증점제를 사용하여 변형시킬 수 있다. 중합 동안 하이드로겔의 점도는 예를 들면 점도계로 측정될 수 있으며, 뒤이어 증점제가 첨가된다. 실험으로부터, 약 1,000 이상의 분자량, 예를 들면 프리폴리머의 분자량만큼 높은 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜의 첨가가 제제의 점도와 외장성을 현저히 향상시킬 수 있는 것으로 측정되었다. 따라서, 특정의 바람직한 양태에서, 폴리에틸렌 글리콜 또는 유사 증점제가 이의 중합 중에 하이드로겔에 첨가되어 중합 속도를 조절한다.
실시예 1; PNA 바이오칩의 제조와 시험
서열 NH2-CATTGCTCAAAC-CO2H를 갖는 1 mg PNA(0.3 ㎛)의 용액을 NMP 0.1 g에 제조한다. 이어서, 약 0.4 meq/g의 활성 이소시아네이트 함량을 갖는 폴리우레탄 프리폴리머인 Hypol PreMa G-50 0.05 g의 용액을 0.2 g 아세토니트릴 중에 제조하고 PNA-NMP 용액에 가한다. 생성 용액을 약 pH 8.0에서 50 mM NaHCO3 용액 0.65 g으로 처리한다. 철저히 혼합한 후, 생성 용액 2 소적을 모세관 마이크로튜브를 사용하여 실란 처리 유리 슬라이드에 손으로 스폿팅한다. 소적은 유리 표면에서 약 15분 후에 중합된다. 음성 대조로서, PNA를 함유하지 않는 두 하이드로겔 소적을 PNA-함유 하이드로겔 소적 옆에 스폿팅한다.
하이드로겔 소적이 놓인 유리 슬라이드를 세척 완충액(0.05% SDS를 함유하는 5 mM 나트륨 포스페이트 완충액, pH 7.0) 중에 30분간 액침시켜 유기 용매를 제거하고 잔류 활성 부위를 블로킹하여 시험 DNA의 비-특이적 결합을 방지한다. 이어서, 10 mM 나트륨 포스페이트 완충액 600 ㎕와 0.1% SDS를 함유하는 하이브리드화 완충액(pH 7.0) 중, 실온에서 슬라이드를 상보적인 형광-표지 DNA, 3′-TAGTAACGAGTTTGCC-5′-플루오레신 1 mg으로 1시간 동안 처리한다. 비-특이적으로 결합된 DNA를 세척 완충액 중에서 2시간 동안 세척하여 제거한다. 생성되는 슬라이드를 휴대용 형광 검출기(모델 UVGL-25, UVP)로 관찰한다. 시험 DNA를 하이드로겔 마이크로소적 중으로 확산시키고 상보적인 PNA 포획 탐침 서열과 하이브리드하면 강한 형광 시그널이 제공되며, 반면에 시험 DNA는 시그널을 생성하지 않은 음성 대조 소적으로부터 씻겨져 나간다. 시험은 이러한 하이드로겔 바이오칩의 유용성을 입증한다.
실시예 2: DNA 바이오칩의 제조와 시험
Hypol PreMa G-50 0.025 g의 용액을 0.15 g 아세토니트릴에 제조한다. 이어서, 50 mM NaHCO3 수성 완충액 0.32 g, pH 8.0 중, 5′말단에 헥산아민을 갖고, 서열 NH2(CH2)6-CATTGCTCAAAC-3′을 갖는 1 mg DNA(0.3 ㎛)의 용액을 제조한다. DNA 용액을 프리폴리머 용액에 가하고 철저히 혼합한다. 생성 용액의 소적을 모세관 마이크로튜브를 사용하여 실란 처리 유리 슬라이드상에 손으로 스폿팅한다. 음성 대조로서, DNA를 함유하지 않는 하이드로겔 소적을 DNA-함유 하이드로겔 소적 옆에 스 폿팅한다.
하이드로겔 소적이 놓인 유리 슬라이드를 세척 완충액(0.5 M NaCl과 0.1% SDS를 함유하는 10 mM 나트륨 포스페이트 완충액, pH 7.0) 중에 30분간 액침시켜 유기 용매를 제거하고 잔류 활성 부위를 블로킹하여 시험 DNA의 비-특이성 결합을 방지한다. 이어서, 600 ㎕ 하이브리드화 완충액(0.5 M NaCl과 0.1% SDS을 함유하는 10 mM 나트륨 포스페이트 완충액, pH 7.0)중 실온에서 1시간 동안 슬라이드를 상보적인 형광-표지 DNA, 3′-TAGTAACGAGTTTGCC-5′-플루오레신 1 mg으로 처리한다. 비-특이적으로 결합된 DNA를 세척 완충액 중에서 2시간 동안 세척하여 제거한다. 슬라이드를 휴대용 형광 검출기(모델 UVGL-25, UVP)로 관찰한다. 상보적인 시험 DNA를 하이드로겔 마이크로소적 중으로 확산시켜 겔-결합 DNA 포획 탐침 서열과 하이브리드화시키면 강한 형광 시그널이 생성되지만, 이는 음성 대조 소적으로부터는 씻겨져 나가며, 이는 DNA 하이브리드화 분석에서 본 발명 하이드로겔 바이오칩의 신뢰성과 유용성을 입증한다.
실시예 3. 어레이 DNA 바이오칩의 제조 및 인간 β-글로빈 유전자 서열 검출에서의 시험
DNA 바이오칩을 다음과 같이 제조한다:
1. 하기 두 반응물 용액을 제조한다:
용액 A = 0.33 g 아세토니트릴 및 0.33 g NMP 중 0.1 g Hypol Pre-Ma G-50(4.5:15:15의 중량비)
용액 B = 50 mM 보레이트 완충액(pH 8.0) 1 ㎖중 올리고뉴클레오타이드 1 mg.
2. 용액 A(34.5 부)를 용액 B(65.5 부)와 혼합하고, 생성 용액을 유리 슬라이드에 마이크로스폿팅한다. 마이크로스폿팅은 개방된 구조의 핀인 Conception Technologies 제공의 CT MicroPipets DP-120 ㎛로 수행된다.
3. 마이크로스폿팅한 슬라이드를 통제된 가습 챔버에 1시간 동안 둔 다음 10분간 세척 완충액으로 세척하여, 바이오칩의 제조를 완료한다.
이러한 바이오칩의 시험은 표적의 분자량에 비례하여, 하이브리드화 완충 시스템에서 20분 내지 2시간 동안 형광 태그 등을 상이한 농도로 운반하는 표적 샘플과 하이브리드화시켜 수행된다. 임의 비-특이적으로 결합된 표적을 하이브리드화 완충액으로 세척해 내고, 이어서 바이오칩을 스캐닝하여 광학 형광성에 의해 결합된 표적을 검출한다.
DNA 탐침을 운반하는 이들 바이오칩의 성능을 유효하게 하기 위해서, 표준 아미다이트 화학을 사용하여 각각의 5′말단에 1차 아민으로 유도체화된 하기 20종의 12량체 올리고뉴클레오타이드를 이러한 방식으로 제조된 바이오칩의 일부로서 분리된 하이드로겔 셀 상에 고정시킨다:
Figure 112001027363488-pct00001
인간 β-글로빈 유전자의 서열로부터 표적 30량체 DNA 샘플을 합성하고 태깅 분자, 즉 플루오레신으로 5′말단에 표준 아미다이트 화학을 이용하여 표지한다. 이러한 표적 샘플의 서열은 다음과 같다:
5′-(플루오레신)-TTGGAGGTTTAGTTCGGAGATGAACTTAGG-3′
G1, G6, G11, G16, G17, G18 및 G19의 서열은 표적 샘플의 상이한 영역에 완전히 상보적이다. G20의 서열은 G11의 것과는 내부에 1 염기쌍 미스매치가 있다. 시험 결과를 하기의 표 8에 수록하였다:

올리고뉴클레오타이드 G1 G6 G11 G16 G17 G18 G19 G20
강도 1528 2713 5630 650 841 2098 6066 2181
표준편차 77 151 238 164 127 354 638 225
표 8에서 알 수 있는 바와 같이, 완전 매치(G11) 및 1 염기쌍 미스매치(G20)의 하이브리드화 구별은 우수하다(5630 대 2181의 형광 강도). G2, G3, G4, G5, G7, G8, G9, G10, G12, G13, G14 및 G15의 비-조절 올리고뉴클레오타이드, 및 블랭크 하이드로겔 셀은 하이드로겔에 대한 최소 비-특이성 결합을 보이는 백그라운드 바로 위의 강도를 입증한다.
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본원에 기술된 이소시아네이트-작용성 바이오칩의 제조방법, 바이오칩 시스템 및 하이브리드화 분석은 현재 고려되는 최상 모드를 포함하는 특정 양태로서 기술된다. 그러나, 당업자는 선택된 특정 비양성자성 용매, 원하고/거나 사용된 중합 시간, 및 하이드로겔과의 결합에 선택된 생체분자 탐침과 같은 특정 파라미터가 본원에 기술된 본 발명의 취지로부터 일탈함이 없이 변형될 수 있음을 감지할 것이다. 따라서, 본 발명의 범위는 상기 설명만을 기준으로 결정되어서는 안 되며 첨부 특허청구범위와 이의 균등물 전 범위를 기준으로 하여야 한다.

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  34. (a)상부 표면을 갖는 고체 기질;
    (b)기질의 상부 표면에 부착된, 각각의 개별 두께가 20㎛ 내지 100㎛인 복수개의 하이드로겔 셀; 및
    (c)하나 이상의 하이드로겔 셀과 그 안에서 공유결합된 생체분자 탐침을 포함하는 바이오칩에 있어서,
    셀이 이소시아네이트-작용성 하이드로겔 중합체로 형성되고 광학적으로 투명하며, 상이한 탐침이 다양한 셀과 그 안에서 결합됨을 특징으로 하는 바이오칩.
  35. 제 34 항에 있어서, 각각의 하이드로겔 셀은 우레탄과 우레아의 결합을 갖는 중합체를 포함하고, 이 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 또는 이들의 공중합체를 포함하며, 기질은 투명하고 이소시아네이트 작용기의 결과로 기질에 하이드로겔을 공유결합시키는 반응성 분자를 상부 표면에 가짐을 추가 특징으로 하는 바이오칩.
  36. 제 34 항 또는 제 35 항에 있어서, 생체분자 탐침이 DNA, RNA 또는 PNA를 포함하는 바이오칩.
  37. (a)상부 표면을 갖는 고체 기질을 제공하는 단계;
    (b)하이드로겔 프리폴리머의 유기 용매 용액을 제공하는 단계;
    (c)생체분자의 용액을 제공하는 단계;
    (d)하이드로겔 프리폴리머에 생체분자를 공유결합시키는 단계; 및
    (e)물을 첨가함으로써 하이드로겔 프리폴리머의 중합을 개시하는 단계를 포함하는, 생체분자가 고정된 바이오칩의 제조방법에 있어서,
    프리폴리머가 이소시아네이트-작용성 하이드로겔 프리폴리머이고, 생성되는 하이드로겔이 이의 완전히 중합된 상태에서 광학적으로 투명하도록 중합이 조절됨을 특징으로 하는 방법.
  38. 제 37 항에 있어서, 하이드로겔은 이소시아네이트 가교결합으로부터 형성된 우레탄-우레아 결합을 갖는 중합체를 포함하고, 생체분자는 기질의 이소시아네이트 반응성으로부터 생기는 결합을 통해 프리폴리머에 공유결합됨을 추가 특징으로 하는 방법.
  39. 제 38 항에 있어서, 프리폴리머는 생체분자의 1차 아민과 반응하고, 기질은 이의 상부 표면에 이소시아네이트 그룹과 또한 반응하여 하이드로겔을 기질에 공유결합시키는 활성 아민을 가지는 방법.
  40. 제 38 항에 있어서, 하이드로겔 프리폴리머는 비양성자성 용매(aprotic solvent)에서 0.1 meq/g 내지 1 meq/g의 활성 이소시아네이트를 갖는 5% 이하 하이드로겔 프리폴리머의 용액으로서 제공되고, 이 프리폴리머는 디이소시아네이트로 캐핑된 폴리에틸렌 옥사이드, 폴리프로필렌 옥사이드 또는 폴리에틸렌 옥사이드와 폴리프로필렌 옥사이드의 공중합체를 포함하며, 약하게 가교결합될 수 있음을 추가 특징으로 하는 방법.
  41. 제 37 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항에 있어서, 생체분자와 하이드로겔 프리폴리머의 공유결합 단계 및 하이드로겔 프리폴리머의 중합 개시 단계를 동시에 수행함을 추가 특징으로 하는 방법.
  42. 제 37 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항에 있어서, 용액은 수성이고 7.0 내지 9.5의 pH에서 완충되며, 하이드로겔 용액에 존재하는 비양성자성 용매의 pH와 양을 이용하여 이산화탄소 발생을 조절하고 이소시아네이트-작용성 프리폴리머의 침전을 피함으로써, 생성되는 하이드로겔의 불투명도를 최소화하고, 중합은 90% 이상의 상대 습도에서 수행됨을 추가 특징으로 하는 방법.
  43. 제 37 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항에 있어서, 생체분자는 비양성자성 유기 용매에 용해되고, 하이드로겔 프리폴리머의 중합은 완충된 수용액의 첨가에 의해 개시되며, 하이드로겔이 중합될 때 유기 용매 : 물의 비는 0.25 : 1 이상이고, 중합 하이드로겔 용액을 기질의 상부 표면에 마이크로스폿팅하여 하이드로겔과 고정된 생체분자를 기질에 부착시키는 단계를 추가로 포함함을 추가 특징으로 하는 방법.
  44. 제 37 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항에 있어서, 하이드로겔 프리폴리머의 활성 이소시아네이트 함량은 0.2 내지 0.8 meq/g이며, 프리폴리머내 반응성 이소시아네이트의 10% 이하가 반응하여 생체분자 탐침을 고정하고, 나머지의 반응성 이소시아네이트는 기질과 공유결합하여 가교결합된 하이드로겔을 형성하는 방법.
  45. (a)두 개 이상의 하이드로겔 셀이 결합된 기질을 포함하는 바이오칩을 제공하는 단계(각각의 셀은 20 ㎛ 내지 100㎛의 두께를 갖고 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 또는 이들의 공중합체로부터 제조된 이소시아네이트-작용성 하이드로겔 프리폴리머로부터 형성된 중합체를 포함하며, 두 개 이상의 하이드로겔 셀은 이에 공유결합된 생체분자 탐침을 추가로 포함한다);
    (b)바이오칩을 하이브리드화 조건하에서, 표적 생체분자를 함유하는 분석물 용액과 접촉시키는 단계;
    (c)하이드로겔 바이오칩을 비-특이적으로 결합된 표적 생체분자 및 비결합된 표적 생체분자를 제거하는 조건하에서 세척하는 단계; 및
    (d)결합된 표적 생체분자를 검출하는 단계를 포함하는 하이브리드화 분석방법.
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