KR100632767B1 - 세라미다제 유전자 - Google Patents

Abstract

세라미다제 활성을 갖는 폴리펩티드, 및 지질 공학용 시약으로서 그리고 아토피성 피부염의 진단 지표로서 유용한 상기 폴리펩티드를 코드하는 유전자, 폴리펩티드의 용이한 검출방법 및 유전자의 검출방법 뿐 아니라 아토피성 피부염의 검출방법을 제공하기 위해서, 본 발명은 서열표의 서열번호 1 로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 서열번호 1 의 아미노산 서열중 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 부가 또는 삽입된 아미노산 서열을 가지며, 세라미다제 활성을 갖는 폴리펩티드; 이러한 폴리펩티드를 코드하는 유전자; 상기 유전자와 엄격한 조건하에서 혼성화할 수 있고, 세라미다제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 유전자; 상기 유전자 또는 그 유전자에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자와 엄격한 조건하에서 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머; 올리고뉴클레오티드 프로브 및/또는 프라이머를 사용하여 세라미다제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 유전자를 검출하는 방법; 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 그의 단편; 항체 또는 그의 단편을 사용하여 세라미다제 활성을 갖는 폴리펩티드를 검출하는 방법; 이 방법을 이용하여 아토피성 피부염을 검출하는 방법에 관한 것이다.

Description

세라미다제 유전자 {CERAMIDASE GENE}

도 1 은 플라스미드 pSCA59 및 pGCB38 의 DNA 삽입을 위한 제한 엔도뉴클레아제 (endonuclease) 지도를 나타낸다.

본 발명은 세라미다제 활성을 갖는 폴리펩티드 및 이 폴리펩티드를 코드하는 유전자에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 세라마이드의 구조 및 기능을 분석하기 위한 지질 공학용 시약으로서, 그리고 아토피성 피부염의 진단 지표로서 유용한 세라미다제의 아미노산 서열 뿐만 아니라 이러한 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 세라미다제 활성을 갖는 폴리펩티드의 유전자 공학적 제조 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 폴리펩티드의 검출 방법, 및 상기 폴리펩티드를 코드하는 유전자의 검출 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 폴리펩티드의 검출 방법 및 상기 유전자의 검출 방법을 이용한 아토피성 피부염의 검출 방법에 관한 것이다.

세라미다제는 스핑고지질의 일종인 세라마이드를 스핑고신 및 지방산으로 가수분해하는 효소이다. 세라미다제에 의한 세라마이드의 가수분해에 의해 형성 된 스핑고신은 프로틴키나제 C 의 저해, 포스포리파제 D 의 활성화, 칼모듈린 의존성 효소의 저해 등과 같은 각종 생리활성을 가지며, 세포 증식 및 세포내 정보 전달에 관계함으로써 세포 기능을 조절하는 역할을 한다고 생각되는 중요한 물질이다. 세라미다제는 이러한 스핑고신 양의 조절에 중요한 역할을 한다.

세라미다제는 최적 pH 에 따라, 산성 세라미다제 및 중성/알칼리성 세라미다제로 분류된다. 산성 영역에서 최적 pH 를 갖는 세라미다제는 래트 뇌 [Biochemistry, 8, 1692-1698 (1969)], 기니피그 상피세포 [J. Biol. Chem., 270, 12677-12684 (1995)], 인간의 신장 [Biochim. Biophys. Acta, 398, 125-131 (1975)], 비장 [Biochim. Biophys. Acta, 1004, 245-251 (1989)], 섬유아세포 [Biochem. J., 205, 419-425 (1982)] 및 상피 [FEBS Lett., 268, 110-112 (1990)]; 인간 뇨 [J. Biol. Chem., 270, 11098-11102 (1995)] 등과 같은 포유류의 조직에 존재한다고 보고되어 있다.

이러한 세라미다제 중, 인간 뇨에서 정제된 세라미다제의 아미노산 서열 및 뉴클레오티드 서열은 확인되어 있다 [J. Biol. Chem., 271, 33110-33115 (1996)]. 이 유전자와의 상동성을 이용하여 마우스의 세라미다제 유전자도 수득되었다 [Genomics, 50, 267-274 (1998)]. 그러나, 이러한 것은 모두 포유류에서 유래된 산성 세라미다제이며, 중성/알칼리성 세라미다제 또는 미생물에서 유래된 세라미다제의 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열은 아직 밝혀지지 않았다.

한편, 아토피성 피부염의 병변부 표피상에는 세라미다제를 생산하는 미생물이 존재한다고 알려져 있고, 이 효소는 아토피성 피부염의 원인이거나 그 증식에 관여한다고 추측된다. 그러나, 이 효소는 알칼리 영역의 최적 pH 를 갖는 세라미다제 (이하, 알칼리성 세라미다제라 칭함) 이다 [J. Biol. Chem., 273, 14368-14373 (1998)].

세라미다제를 생산하는 미생물로부터 천연 세라미다제를 제조하는 경우, 효소의 생산을 유도하기 위해서 고가의 스핑고지질을 배지에 첨가해야 하며, 정제시에는 잔재하는 스핑고지질 또는 이의 분해물을 세라미다제 함유 분획으로부터 분리 및 제거해야 한다. 또한, 배양중 스핑고미엘리나제(sphingomyelinase)와 같은 세라미다제 외의 효소가 동시에 생산되기 때문에, 이들 효소로부터 목적하는 세라미다제만을 단리 및 정제하는 것은 어렵다. 더욱이, 미생물에서 유래된 알칼리성 세라미다제의 아미노산 서열 또는 유전자 구조는 완전히 알려져 있지 않아, 유전자 공학에 의한 세라미다제 생산 방법은 이용할 수 없다.

또한, 세라미다제를 생산하는 미생물의 존재는 아토피성 피부염의 진단 지표 및 치료 효과의 확인 방법으로서 사용되기가 기대되고 있지만, 이러한 미생물을 검출 또는 동정하는 방법은 아직 알려져 있지 않다. 종래에는 미생물을 단리하고 배양한 후, 세라미다제 활성을 측정하는 매우 복잡한 조작이 필요하였다. 따라서, 저가의 미생물로부터 유래된 고순도 세라미다제를 제조하는 방법 뿐만 아니라, 간단하고 단시간의 조작으로 세라미다제 생산 미생물을 검출하는 방법이 요망된다.

본 발명의 제 1 목적은 세라미다제 활성을 갖는 폴리펩티드를 제공하는 것에 있다. 본 발명의 제 2 목적은 상기 폴리펩티드를 코드하는 유전자를 제공하는 것에 있다. 본 발명의 제 3 목적은 상기 유전자를 함유한 형질전환체를 제공하는 것에 있다. 본 발명의 제 4 목적은 상기 형질전환체를 이용한 고순도의 세라미다제를 용이하게 대량으로 제조할 수 있는 제조 방법을 제공하는 것에 있다. 본 발명의 제 5 목적은 본 발명의 유전자에 특이적으로 혼성화(hybridize)될 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브(probe) 또는 프라이머(primer)를 제공하는 것에 있다. 본 발명의 제 6 목적은 본 발명의 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 그의 단편을 제공하는 것에 있다. 본 발명의 제 7 목적은 본 발명의 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머를 이용한 세라미다제 유전자의 검출 방법을 제공하는 것에 있다. 본 발명의 제 8 목적은 본 발명의 항체 또는 그의 단편을 이용한 세라미다제의 검출 방법 및 이 방법에 사용되는 키트 (kit)를 제공하는 것에 있다. 또한, 본 발명의 제 9 목적은 본 발명의 세라미다제 유전자의 검출 방법 또는 세라미다제의 검출 방법을 이용한 아토피성 피부염의 검출 방법을 제공하는 것에 있다.

본 발명자들은 세라미다제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 유전자를 단리하기 위해 집중적인 연구를 수행한 결과, 세라미다제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 유전자의 단리 및 상기 유전자의 뉴클레오티드 서열의 해명에 성공하였다. 또한, 이러한 발견을 토대로, 본 발명자들은 고순도의 세라미다제를 용이하게 대량으로 생산할 수 있는 방법; 세라미다제 활성을 갖는 폴리펩티드의 검출 방법; 및 세라미다제 유전자의 검출 방법을 확립하여 본 발명을 완성하였다. 또한, 상기 세라미다제와 아토피성 피부염의 연관성을 발견함으로써 아토피성 피부염의 용이한 검출 방법을 확립할 수 있게 되었다.

구체적으로, 본 발명의 요지는 하기와 같다:

[1] 서열표의 서열번호: 1 에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 또는 서열번호: 1 의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 부가 또는 삽입된 아미노산 서열을 가지며 세라미다제 활성을 갖는 폴리펩티드;

[2] 상기 [1] 항의 폴리펩티드를 코드하는 유전자;

[3] 상기 [2] 항에 있어서, 서열표의 서열번호: 2 에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자, 또는 서열번호: 2 의 뉴클레오티드 서열에서 하나 이상의 염기가 치환, 결실, 부가 또는 삽입된 뉴클레오티드 서열을 가지며, 세라미다제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 유전자;

[4] 상기 [2] 항의 유전자와 엄격한(stringent) 조건하에 혼성화할 수 있으며, 세라미다제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드할 수 있는 유전자;

[5] 상기 [2] 항의 유전자를 함유한 형질전환체;

[6] 상기 [5] 항의 형질전환체를 배양하고, 수득된 배양물로부터 세라미다제 활성을 갖는 폴리펩티드를 채취하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 세라미다제 활성을 갖는 폴리펩티드의 제조 방법;

[7] 상기 [2] 항의 유전자 또는 이 유전자에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자와 엄격한 조건하에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머;

[8] 상기 [7] 항의 올리고뉴클레오티드 프로브 및/또는 프라이머를 이용하는 것을 특징으로 하는 세라미다제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 유전자의 검출 방법;

[9] 상기 [7] 항의 올리고뉴클레오티드 프로브 및/또는 프라이머를 함유하는, 세라미다제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 유전자의 검출용 키트;

[10] 상기 [1] 항의 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 그의 단편;

[11] 상기 [10] 항의 항체 또는 그의 단편을 이용하는 것을 특징으로 하는 세라미다제 활성을 갖는 폴리펩티드의 검출 방법;

[12] 상기 [10] 항의 항체 또는 그의 단편을 함유하는, 세라미다제 활성을 갖는 폴리펩티드의 검출용 키트;

[13] 상기 [8] 항의 방법에 의해 세라미다제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 유전자를 검출하는 것을 포함하는 아토피성 피부염의 검출 방법; 및

[14] 상기 [11] 항의 방법에 의해 세라미다제 활성을 갖는 폴리펩티드를 검출하는 것을 포함하는 아토피성 피부염의 검출 방법.

(1) 세라미다제 활성을 갖는 폴리펩티드

본 발명에서 용어 "세라미다제" 는 상기에 언급된 바와 같이 세라마이드를 스핑고신과 지방산으로 가수분해하는 활성을 갖는 효소를 말한다.

세라미다제 활성은 예를 들어, 문헌 [Journal of Biological Chemistry, 273, 14368-14373 (1998)] 에 기재된 방법에 따라 측정할 수 있다.

본 발명에서 세라미다제의 기원은 특별히 한정되지 않으나, 예를 들면, 세균류, 방사균류, 효모류, 사상균류, 자양균류 및 단자균류와 같은 미생물 유래의 세라미다제; 또는 식물, 동물 및 곤충과 같은 생물체 유래의 세라미다제가 포함된다. 구체적으로는 예를 들면, 아토피성 피부염 환자의 피부로부터 단리된 슈도모나스 에루기노자 (Pseudomonas aeruginosa) 균주 AN-17 가 본 발명의 세라미다제를 수득하기 위한 재료로서 바람직하다. 상기 균주로부터 유래된 세라미다제의 아미노산 서열은 서열표의 서열번호: 1 에 나타나있다.

또한, 본 발명에서 용어 "세라미다제 활성을 갖는 폴리펩티드" (이 폴리펩티드는 이하, 간단히 세라미다제로 기재된 경우가 있다) 는 서열표에서 서열번호: 1 에 나타난 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 의미한다. 용어 "세라미다제 활성을 갖는 폴리펩티드" 는 천연 세라미다제의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 뿐만 아니라, 상기에 기재된 활성 측정 방법에 의해 측정했을 때 동일한 수준의 세라미다제 활성을 갖는 폴리펩티드라면, 서열번호: 1 에 나타난 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실, 부가 또는 삽입과 같은 변이가 도입된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드도 포함될 수 있다. 또한, 변이에 의해 수득되는 폴리펩티드가 세라미다제 활성을 갖는 변이라면, 폴리펩티드는 이러한 변이를 둘 이상 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 "변이를 갖는 아미노산 서열" 은 자연 발생적인 변이가 도입된 아미노산 서열 뿐만 아니라 인위적인 변이가 도입된 아미노산 서열도 포함된다.

(2) 세라미다제 유전자

본 발명의 세라미다제 유전자는 세라미다제 활성을 갖는 상기폴리펩티드를 코드하는 유전자, 즉 세라미다제 활성을 갖는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산을 의미한다. 본 발명의 세라미다제 유전자로는 예를 들면, 슈도모나스 에루기노자 균주 AN-17 로부터 유래된 세라미다제를 코드하는 유전자가 포함되며, 이의 뉴클레오티드 서열은 서열표에서 서열번호: 2 에 나타나 있다. 본 발명의 세라미다제 유전자에는 상기 천연 세라미다제의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 부가 또는 삽입된 아미노산 서열을 가지며, 세라미다제 활성을 갖는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 코드하는 유전자도 포함된다.

또한, 본 발명의 유전자에는 서열표에서 서열번호: 2 에 나타난 뉴클레오티드 서열에서 하나 이상의 염기가 치환, 결실, 부가 또는 삽입된 뉴클레오티드 서열을 가지며, 세라미다제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 유전자도 포함된다.

본 명세서에서, "치환, 결실, 부가 또는 삽입을 갖는 뉴클레오티드 서열" 에는 자연발생적 변이 또는 인위적인 변이가 도입된 핵산 서열이 포함된다.

또한, 본 발명의 유전자에는 상기의 세라미다제 유전자에 엄격한 조건하에 혼성화할 수 있으며, 세라미다제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 유전자도 포함된다. 혼성화는 예를 들면, 문헌 [T. Maniatis et al. 편, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 제2판, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989] 에 기재된 방법에 의해 수행될 수 있다. 혼성화의 조건은 6 ×SSC (1 ×SSC 의 조성: 0.15 M NaCl, 0.015 M 시트르산나트륨, pH 7.0), 0.5 % SDS, 5 ×덴하르트 (Denhardt) 시약 및 100 ㎎/㎖ 청어 정자 DNA 를 함유한 용액중에 프로브와 함께 60 ℃ 에서 하룻밤 배양하는 조건을 예로 들 수 있다.

본 발명에 의해 세라미다제의 일차 구조 및 유전자 구조가 밝혀짐에 따라, 본 발명의 유전자에 랜덤(random) 변이 또는 부위 특이적 변이의 도입에 의해, 천연 세라미다제의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 잔기에 결실, 부가, 삽입 또는 치환중 적어도 한 가지가 도입된 폴리펩티드를 코드하는 유전자를 수득하는 것이 가능하다. 이에 따라, 세라미다제 활성을 갖지만, 최적 온도, 안정 온도, 최적 pH 및 안정 pH 와 같은 성질이 다소 상이한 세라미다제를 코드하는 유전자를 수득하는 것이 가능해졌다. 또한, 유전자 공학적으로 이러한 세라미다제를 제조하는 것도 가능해졌다.

랜덤변이를 도입하는 방법으로는 예를 들면, 아황산수소나트륨을 사용한 화학적 처리에 의해 사이토신(cytosine) 염기를 우라실(uracil) 염기로 전환시키는 천이변이(transition mutation)를 일으키는 방법 [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 79, 1408-1412 (1982)]; 망간을 함유한 반응액 중에서 PCR 을 수행하여 DNA 합성시 뉴클레오티드 도입의 정확성(fidelity)을 낮추는 방법 [Anal. Biochem., 224, 347-353 (1995)] 등이 있다.

부위 특이적 변이를 도입하는 방법으로는 예를 들면, 암버변이(amber mutation)를 이용하는 방법 [gapped duplex 법; Nucleic Acids Res., 12, 9441-9456 (1984)]; dut (dUTPase) 및 ung (우라실-DNA 글리코실라제) 유전자를 결실시킨 숙주를 이용하는 방법 [Kunkel 법; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82, 488-492 (1985)]; 암버변이를 이용하여 PCR 을 수행하는 것을 포함하는 방법 (WO98/02535) 등이 있다. 이러한 방법으로 목적하는 유전자에 부위 특이적인 변이를 도입하기 위한 각종 키트가 시판중이며, 상기 키트를 이용함으로써 목적하는 변이가 도입된 유전자를 용이하게 수득할 수 있게 되었다.

이하에, 혼성화 법을 이용하여 미생물 유래의 세라미다제 유전자를 수득하는 방법을 설명한다.

1) 먼저, 세라미다제 유전자의 클로닝용 프로브를 작성하기 위한 정보로서 세라미다제의 부분 아미노산 서열을 조사한다. 정제된 세라미다제를 다른 처리없이 통상적인 에드만(Edman) 분해법에 따라 [J. Biol. Chem., 256, 7990-7997 (1981)] 아미노산 서열 분석을 수행하거나, 라이실엔도펩티다제(lysyl endopeptidase) 및 N-토실-L-페닐알라닐 클로로메틸 케톤 (TPCK)-트립신과 같은 기질 특이성이 높은 단백질 분해 효소를 사용하여 제한적 가수분해를 수행하여 수득된 펩티드 혼합물로부터 단리정제된 정제 펩티드 단편을 아미노산 서열 분석을 수행한다. 상기에서 밝혀진 부분 아미노산 서열의 정보를 토대로, 혼성화용 프로브로서 사용하기 위한 올리고뉴클레오티드를 설계하고 화학적으로 합성한다.

2) 세라미다제를 생산하는 미생물의 게놈 DNA 를 제조하고, 이를 적당한 제한 효소로 완전히 소화시켜 아가로스 젤 전기영동에 의해 분리한 후, 통상적인 방법에 따라 나일론 막에 블로트(blot)한다. 나일론 막상의 DNA 단편과 상기 합성 올리고뉴클레오티드 프로브의 혼성화는 일반적인 조건하에서 수행한다. 예를 들면, 연어 정자 DNA 를 함유한 예비-혼성화 (pre-hybridization) 용액중에서 나일론 막을 차단한 후, 이를 ³²P 로 표식된 합성 올리고뉴클레오티드 프로브와 함께 하룻밤 항온배양한다. 나일론 막을 세척한 후, 오토라디오그램(autoradiogram)을 작성하고, 합성 올리고뉴클레오티드 프로브와 혼성화된 DNA 단편을 검출한다.

3) 오토라디오그램상의 시그널에 상응하는 DNA 단편을 아가로스 젤로부터 추출 및 정제한다. 이렇게 수득된 DNA 단편을 통상적인 방법에 따라 플라스미드 벡터와 같은 벡터내로 삽입하여 재조합 DNA 분자를 제조한다. 벡터는 임의의 각종 시판벡터를 사용할 수 있다. 그 다음, 재조합 DNA 분자를 대장균과 같은 적당한 숙주내로 도입하여 형질전환체를 수득한다. 형질전환 방법은 통상적인 방법, 예를 들면 상기 문헌 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 제2판] 등에 기재된 방법으로부터, 사용되는 벡터에 따라 선택하여 이용할 수 있다.

4) 그 다음, 세라미다제 유전자의 단편을 갖는 형질전환체를 선별한다. 선별 방법은 벡터의 종류에 따라, 콜로니 혼성화, 플라크 혼성화 등에서 적당하게 선택할 수 있다. 또한, 콜로니 또는 플라크를 그 자체 시료로서 이용한 PCR 법, 또는 세라미다제 활성의 발현을 지표로 하는 방법을 이용할 수도 있다.

5) 세라미다제 유전자의 단편이 삽입된 재조합 DNA 분자를 상기 단편을 함유한 형질전환체로부터 제조하고, 그 단편의 뉴클레오티드 서열을 해석한다. 뉴클레오티드 서열은 통상의 방법, 예를 들면 디데옥시 방법에 의해 결정될 수 있다. 이와 같이 결정된 뉴클레오티드 서열을 미리 수득한 세라미다제의 부분 아미노산 서열 및 세라미다제의 분자량과 비교함으로써, 수득한 DNA 단편이 목적하는 세라미다제 유전자의 전부인지, 아니면 그의 일부인지를 결정할 수 있다.

6) 수득한 DNA 단편이 세라미다제 유전자의 전체 길이를 함유하지 않은 경 우, 상기 단편의 일부를 프로브로 사용하여, 게놈 DNA 를 다른 제한효소로 소화시키고; 동일한 방법으로 혼성화를 수행하여 결손된 구역을 수득함으로써 목적하는 세라미다제 유전자의 전체 길이를 수득할 수 있다. 이렇게 수득된 세라미다제 유전자를 함유한 DNA 단편을 기준으로 하여, 세라미다제 유전자의 구조 및 세라미다제의 전체 아미노산 서열을 결정한다.

상기한 혼성화 방법 이외에, PCR 법을 이용하여 본 발명의 세라미다제 유전자를 수득할 수 있다. 예를 들면, 세라미다제의 N-말단 아미노산 서열 또는 내부의 부분 아미노산 서열로부터 설계된 프라이머를 사용하는 PCR 법, 또는 상기 프라이머 이외에 카세트 DNA 및 카세트 프라이머를 사용하는 PCR 법을 이용하여 세라미다제 유전자를 수득할 수 있다.

다음으로, 슈도모나스 에루기노자 AN-17 에서 유래된 세라미다제를 예로 들어 하기에서 구체적으로 설명한다. 상기 세라미다제는 최적 pH 가 pH 8.0 내지 9.0 인 알칼리성 세라미다제이다.

먼저, 슈도모나스 에루기노자 AN-17 에 의해 생산된 세라미다제의 부분 아미노산 서열을 조사한다. 상기 세라미다제의 N-말단 아미노산 서열은 그에 대응하는 코돈(codon)의 종류가 많고, 프라이머 서열의 조합수가 매우 커진다. 또한, 상기 프라이머를 사용하여 PCR 을 수행할 경우, 비특이적인 증폭 산물이 다수 형성되고, 이들 산물중 목적하는 유전자로부터 유래된 산물을 동정하는 것이 불가능하다. 본 발명자들은 프라이머를 설계하는데 사용되는 아미노산 서열로서 대응 코돈 축퇴(degeneracy)가 더 작은 서열을 수득하기 위해 단백질 분해 효소 또는 통상 브롬화시안으로 대표되는 단백질 한정 분해용 시약을 사용하여 펩티드 지도 제작(mapping)을 수행한 다음, 프라이머 설계를 시도한다. 그러나, 하기 실시예에서 기술하는 바와 같이, 4 종의 프라이머를 조합하여 PCR 을 시도하지만, 이로써 특이적인 증폭 산물을 수득할 수는 없다. 따라서, 본 발명자들은 수득한 아미노산 서열을 기준으로 하여, 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머, 즉, 세라미다제의 부분 아미노산 서열 C-89 (서열번호: 3) 로부터 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머 C-89-1 (서열번호: 13), 및 부분 아미노산 서열 C-91 (서열번호: 4)로부터 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머 C-91-c1 (서열번호: 14)를 각각 추가로 합성하였다. 주형으로서 슈도모나스 에루기노자 균주 AN-17 의 게놈 DNA 와 함께 상기 2 종류의 프라이머를 사용하여 PCR 을 수행하고, 그로써 특이적으로 증폭된 DNA 단편을 수득한다. 상기 단편의 뉴클레오티드 서열을 조사하고, 그 결과를 상기한 것 이외의 세라미다제의 부분 아미노산 서열에서의 결과와 비교함으로써, 상기 단편이 세라미다제를 코드하는 유전자의 일부를 함유하고 있음을 알게 되었다.

상기의 증폭 DNA 단편을 프로브로서 사용하여 혼성화 등을 수행하고, 이로써 세라미다제의 전체 길이를 코드하는 유전자를 클로닝한다.

상기에서 수득된 슈도모나스 에루기노자 균주 AN-17 에서 유래한 세라미다제를 코드하는 유전자의 전체 뉴클레오티드 서열은 서열표의 서열번호: 16 에 나타난 바와 같다. 또한, 상기 뉴클레오티드 서열에서 추정된 세라미다제의 아미노산 서열은 서열표의 서열번호: 15 에 나타난 바와 같다. 또한, 상기 아미노산 서열을 서열표의 서열번호: 8 에 나타난 슈도모나스 에루기노자 균주 AN-17 에서 유래한 세라미다제의 N-말단 아미노산 서열과 비교함으로써, 상기 균주가 생산한 세라미다제는 번역후 N-말단의 24 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드가 제거된 성숙형 효소로 전환될 수 있음을 발견하였다. 상기의 성숙형 세라미다제의 아미노산 서열은 서열표의 서열번호:1 에 나타난 바와 같고, 상기의 세라미다제 유전자의 뉴클레오티드 서열중 성숙형 세라미다제를 코드하는 부분의 뉴클레오티드 서열은 서열표의 서열번호:2 에 나타난 바와 같다. 상기의 슈도모나스 에루기노자 균주 AN-17 에서 유래한 세라미다제의 아미노산 서열 및 그를 코드하는 염기 서열이 공지된 산성 세라미다제의 아미노산 서열 및 뉴클레오티드 서열과 상동성을 나타내지 않기 때문에, 상기 슈도모나스 에루기노자 균주 AN-17 에서 유래한 효소는 신규 부류에 속하는 세라미다제임을 시사한다.

상기한 바와 같은 전체 뉴클레오티드 서열이 밝혀진 세라미다제 유전자의 전체 또는 일부분을 혼성화용 프로브로 사용함으로써, 슈도모나스 에루기노자 균주 AN-17 이외의 생물체로부터 수득한 게놈 DNA 또는 cDNA 라이브러리(library)로부터 세라미다제 유전자와 상동성이 높은 DNA 를 선별할 수 있다. 혼성화는 통상적으로 사용되는 조건하에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 슈도모나스 에루기노자 균주 AN-17 이외의 생물로부터 수득한 게놈 DNA 또는 cDNA 라이브러리를 고정화한 나일론막을 제조한다. 6 ×SSC, 0.5 % SDS, 5 ×덴하르트 시약, 100 mg/ml 의 청어 정자 DNA 를 함유한 예비 혼성화 용액중, 65 ℃ 에서 나일론막을 차단한후, ³²P 로 표지된 상기 프로브를 첨가하여 65 ℃ 에서 밤새 배양한다. 상기 나일론막을 먼저 6 ×SSC 중, 실온에서 10 분간; 이후 0.1 % SDS 를 함유한 2 ×SSC 중, 실온에서 10 분간; 그리고 추가로 0.1 % SDS 를 함유한 0.2 ×SSC 중, 45 ℃ 에서 30 분간 세정한다. 그후, 오토라디오그램을 제조하여 프로브와 혼성화한 DNA 를 검출한다. 흔히, 세정과 같은 조건을 변경함으로써 다양한 상동성을 가진 유전자를 수득할 수 있다.

한편, 본 발명의 세라미다제 유전자의 뉴클레오티드 서열을 기준으로 하여 PCR 용 프라이머를 설계할 수 있다. 상기 프라이머를 이용하여 PCR 을 수행함으로써, 본 발명의 유전자와 상동성이 높은 유전자 단편을 검출하거나, 또는 그러한 유전자 전체를 수득하는 것, 그리고 또한 세라미다제를 생산하는 생물을 검출하는 것이 가능하다.

상기 혼성화 또는 PCR 에 의해 수득한 유전자가 세라미다제 활성을 가지는 폴리펩티드를 코드하는 유전자인지의 여부를 확인하기 위해, 수득한 유전자의 뉴클레오티드 서열을 본 발명의 세라미다제 유전자의 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열과 비교함으로써 추정할 수 있다. 다르게는, 하기에 기재하는 방법을 사용하여 수득한 유전자에 의해 코드되는 폴리펩티드를 제조하고, 세라미다제 활성을 측정함으로써 수득한 유전자가 목적하는 유전자인지의 여부를 확인할 수 있다.

(3)세라미다제 유전자를 함유하는 형질 전환체

본 발명의 형질 전환체는 상기 세라미다제 유전자를 함유하는 형질 전환체이다.

본 발명의 유전자는, 다양한 숙주 내에서 유전자를 공지된 벡터 등에 결찰함으로써 발현될 수 있다. 덧붙여 말하자면, 코돈 사용은 본 발명의 유전자가 발현되는 숙주에 따라 다르므로, 몇 몇 경우 숙주 내에서 발현 정도가 억제될 수 있다. 이러한 경우 본 발명의 유전자에서 사용되는 코돈은 사용되는 숙주에 따른 코돈으로 변화시켜 사용될 수 있다. 부가적으로, 상기 발현 벡터는, 벡터가 본 발명의 목적을 달성하는 것을 방해하지 않는 한 플라스미드 벡터로만 한정되지 않고, 파아지 벡터, 코스미드 벡터 등이 사용될 수 있다. 본 발명의 폴리펩디드의 용이 및 대량 생산의 관점에서, 외래 유전자를 유도 및 발현할 수 있는 벡터, 리포터 유전자 생성물 등과 융합 단백질로 발현이 가능한 벡터 등이 바람직하다.

본 발명의 형질 전환체는 숙주를 세라미다제 유전자를 운반하는 벡터와 형질 전환하므로써 수득될 수 있다. 숙주로는 대장균과 같은 미생물; 동물 세포; 및 식물 세포 등이 사용될 수 있다. 이어서, 통상 사용되는 조건 하에서 형질 전환체를 배양하여 세라미다제 활성을 가지는 폴리펩티드를 생성할 수 있다.

상기 슈도모나스 에루기노자 AN-17 유래 세라미다제 유전자를 함유하는 형질 전환체는 대장균 JM109/pTCDS7 로 명명 및 표시되고, 통상산업성 공업기술원 생명공학 공업기술 연구소[주소: 일본, 이바라키-현, 추쿠바-시, 히가시 1-코메, 1-3(우편번호 305-8566)]에 1998년 8월 4일(원기탁일) 자로 기탁되어 있다[수탁번호:FERM BP-6728].

세라미다제의 발현은 세라미다제 활성을 측정하므로써 확인할 수 있다. 세라미다제 활성은 예를 들어 문헌 [Journal of Biological Chemistry, 273, 14368-14373(1998)]에 기재된 방법에 따라 형질 전환체의 세포 추출액을 시료로 사용하여 측정될 수 있다. 부가하여, 세라미다제에 대한 항체가 사용될 수 있고, 세라미다제가 다른 종류의 폴리펩티드와 융합체로 발현되는 경우에는, 폴리펩티드 부분에 대한 항체가 사용될 수 있다. 항체가 사용될 때, 세라미다제는 예를 들어, 형질 전환체의 세포 추출액을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동하고, 폴리비닐리덴 플루오리드(PVDF)멤브레인에 전사하고, 상기 멤브레인 상에서, 상응하는 세라미다제 항체를 이용하여 검출하므로써 검출될 수 있다.

(4) 세라미다제 활성을 가지는 폴리펩티드 제조방법

본 발명의 세라미다제 활성을 가지는 폴리펩티드 제조방법은 상기에 기재된 형질 전환체의 배양, 및 생성된 배양물로부터 세라미다제 활성을 가지는 폴리펩티드를 채취하는 것을 포함함을 큰 특징으로 한다.

본 발명의 방법에서, 형질 전환체가 미생물 또는 배양 세포인 경우, 배지 조성물, 배지의 pH, 배양 온도, 배양 시간, 사용되는 유도 물질의 양 및 사용 시간에 관한 세라미다제 발현의 최적 조건은 조절될 수 있고 그에 의해 세라미다제를 효과적으로 생성할 수 있다.

통상의 방법으로 형질 전환체의 배양물로부터 세라미다제를 정제할 수 있다. 대장균의 경우와 같이 형질 전환체가 세포내에 세라미다제를 축적하는 경우, 배양 완료 후 원심분리하여 형질 전환 세포를 수득한다. 수득한 세포를 초음파 처리 등으로 파괴한 후, 원심분리하여 무세포 추출액을 수득한다. 이 무세포 추출액이 이온 교환, 겔 필터레이션, 소수성 및 친화성 크로마토그라피와 같은 다양한 크로마토그라피 뿐만 아니라, 염석과 같은 일반적으로 사용되는 단백질 정제 방법을 수행하기 위한 출발 물질로 사용된다. 여기서 사용되는 몇 몇 형질 전환체에서, 발현 생성물은 세포 외로 분비되고, 이와 같은 경우 생성물은 배양 상청액으로부터 유사하게 정제될 수 있다.

형질 전환체에 의해 생성되는 세라미다제가 세포내에서 생성될때, 다양한 세포 내 효소 및 단백질 또한 공존하나, 발현된 세라미다제에 비해 극히 소량으로 존재하고, 따라서 정제는 극히 간단하다. 또한, 세포외 분비 형의 벡터가 벡터로서 사용될 때, 세라미다제는 세포외로 분비되고 세라미다제 함유 부분 또한 배지 성분 등과 공존한다. 그럼에도 불구하고, 이 부분은 통상 본질적으로 세라미다제 정제에 불리한 영향을 미치는 단백질 성분을 함유하지 않으므로, 예를 들어 슈도모나스 에루기노자 AN-17 균주의 배양물로부터 세라미다제를 정제하기 위해 필요한 복잡한 단리 및 정제 공정은 필요하지 않다.

또한, 대장균이 숙주로 사용될때, 발현 생성물은 불용성 봉입체(inclusion body)로 될 수 있다. 이 경우, 배양 종료 후 원심 분리에 의해 세포를 수득하고, 수득한 세포를 예를 들어 초음파 처리에 의해 파괴한다. 그 후, 생성된 파괴 세포를 원심 분리하여 봉입체를 함유하는 불용성 부분을 수집한다. 봉입체를 세척한 후, 우레아 또는 구아니딘 히드로클로리드와 같은 통상 사용되는 단백질용 가용화제로 가용화하고, 필요하다면 가용화된 봉입체를 이온 교환, 겔 필트레이션, 소수성 및 친화성 크로마토그라피와 같은 다양한 크로마토그라피를 수행하여 정제한 후, 투석 공정 또는 희석 공정에 의한 리-폴딩(re-folding) 조작을 더 행하여 세라미다제 활성을 유지하는 폴리펩티드 함유 제제를 수득한다. 필요하다면, 이와 같이 수득한 제제를 다양한 크로마토그라피로 더 정제하여 세라미다제 활성을 가지는 고-순도 폴리펩티드를 수득할 수 있다.

(5) 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머

본 발명의 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머는, 상기 기재 세라미다제 유전자 또는 그들과 상보적 뉴클레오티드 서열을 가지는 유전자와 엄격한 조건 하에서 혼성화가 가능한 한 특별히 제한되지 않는다.

"엄격한 조건"이라는 용어는 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, 유전자가 6×SSC, 0.5 % SDS, 5×덴하르트 시약, 및 청어 정자 DNA 100 mg/ml 를 함유하는 용액 내에서 [Tm-25 ℃] 의 온도로 밤새 항온 배양되는 조건을 의미한다.

예를 들어 18 뉴클레오티드 이상을 가지는 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머를 위한 Tm 은 하기에 나타낸 식에 의해 산출된다:

Tm = 81.5-16.6(log₁₀[Na⁺])+0.41(%G+C)-(600/N)

식중 "N" 은 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머의 사슬 길이이고; "%G+C" 는 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머 내의 구아닌 및 시토신 잔기의 함량이다. 이와 달리, 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머가 18 뉴클레오티드 보다 짧은 경우, Tm 은 예를 들어, 2 ℃ 씩 A+T(아데닌+티민)잔기를 곱하고 및 4 ℃ 씩 G+C 잔기를 곱하여, 두 수를 합하여 산출할 수 있다.

상기 기재 올리고뉴클레오티드 프로브는, 예를 들어 본 발명의 세라미다제 유전자의 뉴클레오티드 서열에 기초한 고안에 따라 통상적인 방법으로 화학 합성에 의해 제조될 수 있다.

상기 기재 올리고뉴클레오티드 프로브의 길이는 특별히 제한되지 않고, 비-특이적 혼성화 방지 측면에서, 프로브는 15 염기 이상으로 이루어지는 것이 바람직하고 18 염기 이상이 보다 바람직하다.

또한, 본 발명의 프라이머는 상기 기재 올리고뉴클레오티드 프로브의 뉴클레오티드 서열과 유사한 뉴클레오티드 서열을 가지는 핵산을 포함한다. 예를 들어, 프라이머는 본 발명의 유전자의 뉴클레오티드 서열에 기초한 고안에 따라 화학 합성에 의해 제조될 수 있다. 프라이머의 길이는 특별히 제한되지 않고, 프라이머는 15 내지 40의 염기로 이루어질 수 있고, 17 내지 30의 염기가 바람직하다. 상기 기재 프라이머에 예를 들어 폴리머라제 사슬 반응(PCR)법과 같은 다양한 유전자 증폭법을 수행할 수 있고 그에 의해 본 발명의 세라미다제 유전자를 검출할 수 있다.

또한, 상기 기재 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머로서, 자연-발생 세라미다제를 코드하는 핵산을 제한 효소 처리 또는 엑소뉴클레아제 처리와 같은 효소 처리, 또는 초음파 처리와 같은 물리적 처리에 의해 단편화 하고; 이와 같이 수득한 단편을 아가로스 겔 전기영동으로 예시할 수 있는 다양한 핵산 분리 방법에 의해 단리 및 정제하여 수득한 핵산이 사용될 수 있다. 상기 기재된 바와 같이 수득한 핵산은 세라미다제에 대해 특징적 서열을 가지는 부분으로부터 유래하는 것이 바람직하다.

상기 기재 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머는 공지된 방법에 의해 적절한 표식으로 표식될 수 있고, 본 발명의 세라미다제 유전자를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 표식은 특별히 제한되지 않고, 방사성 동위원소 외에도 형광 물질 및 바이오틴과 디곡시제닌 같은 리간드를 포함한다.

(6)유전자 검출 방법

본 발명의 유전자 검출 방법은 상기 기재 올리고뉴클레오티드 프로브 및/또는 프라이머를 이용하여 시료 내의 유전자를 검출하는 것이 큰 특징이다.

본 발명의 검출 방법에서, 유전자의 검출은 상기 기재 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여 혼성화 방법 등에 의해 수행될 수 있고, 또는 이와 달리 유전자의 검출은 상기 기재 프라이머를 이용하여 PCR 법과 같은 DNA 증폭 방법에 의해 수행될 수도 있다.

올리고뉴클레오티드가 사용될 때, 검출되는 시료로는 예를 들어, 미생물 군체 또는 조직 단편의 시료, 멤브레인 상에 고정된 이러한 시료 중의 DNA 또는 RNA, 및 이러한 시료로부터 추출한 DNA 또는 RNA를 들 수 있다. 이러한 시료들 중에서, 멤브레인 상에 고정된 DNA 또는 추출된 DNA가 시료의 안정성 면에서 바람직하다.

올리고뉴클레오티드를 이용할 때, 유전자는 문헌 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed.] 등에 기재된 것과 같은 공지된 혼성화 방법으로 검출될 수 있다.

상기 기재 혼성화 조건은, 사용되는 프로브의 Tm 값 및 표적 DNA 의 CG 함량과 같은 인자에 따라 적절히 선택될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed.] 에 기재된 조건이 적용될 수 있다.

프라이머를 이용할 때, 검출되는 시료로는 미생물 시료, 예를 들어, 미생물 배양 배지, 미생물 군체, 및 미생물 세포뿐만 아니라 피부, 조직 및 조직 단편과 같은 생체 시료를 들 수 있다.

상기 기재 프라이머 시료를 이용할 때 검출되는 시료는 단리된 미생물 자체도 될 수 있고, 또는 단리된 미생물에 적절한 처리를 더 한 것도 될 수 있다. 조직과 같은 고체 시료가 추출액 또는 현탁액의 형태로 사용될 수 있다. 또한, 이와 같은 시료의 상청액 또는 시료를 그의 상청액뿐만 아니라 계면활성제 처리를 사용하여 더 세포 용해 처리하여 수득한 것 또한 사용될 수 있다. 검출될 핵산이 불리하게 영향 받지 않는다면, 시료 내의 기타 성분을 제거하기 위한 어떠한 조작도 또한 수행될 수 있다.

상기 기재 프라이머를 이용하여 PCR 방법에 의해 검출이 행해질 때, PCR 조건은 사용되는 프라이머의 Tm 값 및 검출될 증폭된 부분의 길이와 같은 인자에 따라 적절히 선택될 수 있다.

상기 기재 프라이머를 이용할 때, 검출은 PCR 법과 같은 DNA 증폭법을 이용하여 증폭; 및 PCR-증폭 생성물의 존재 또는 부재 확인에 의해 수행될 수 있다. 증폭의 존재 또는 부재 확인 방법은 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어 핵산 증폭의 반응 혼합물을 아가로스 겔 전기영동하고; 그 후, 겔을 에티듐 브로미드, SYBER 그린 I 등과 같은 적절한 핵산 스테이닝 시약으로 스테이닝 하고; 자외선 조사로 생긴 밴드의 존재 또는 부재를 검출하여 증폭을 확인할 수 있다. 밴드는 육안 관찰로 검출될 수도 있고, 또는 예를 들어, 형광 이미지 분석기 등을 사용하여 검출될 수도 있다.

본 발명의 검출 방법에서, 상기 기재 프로브 및 프라이머는 검출 감도를 증가시키기 위해 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 기재 프라이머를 이용하여 시료 내에 극소량으로 존재하는 세라미다제 유전자를 PCR 법으로 증폭하고, 그 후, 프로브를 이용하여 유전자와 혼성화 하고, 그에 의해 고감도 및 정확한 검출이 이루어진다.

세라미다제 유전자가 본 발명의 검출 방법에 의해 검출되고 나아가 유전자의 발현량이 측정될 때, 혼성화 프로브에 기인한 신호 강도 또는 프라이머를 사용하여 증폭된 생성물에 기인한 밴드의 형광 강도 등이 정량될 수 있다.

(7)본 발명의 유전자 검출용 키트

본 발명의 유전자 검출용 키트는 상기 기재 올리고뉴클레오티드 프로브 및/또는 프로브를 함유하는 것이 특징이다.

본 발명의 키트는 통상 핵산 고정용 멤브레인 및 혼성화 완충액으로 예시되는 다양한 혼성화 시약; 열안정성 DNA 폴리머라제, dNTP 혼합물 및 PCR 완충액과 같은 PCR 시약; 프로브 또는 증폭된 DNA 검출 시약; 미생물 증식용 배지; 및 시료로부터의 핵산 추출용 시약을 더 함유할 수 있다.

(8) 세라미다제 활성을 갖는 폴리펩티드에 특이적으로 결합 가능한 항체 또는 그의 단편

본 발명의 폴리펩티드에 특이적으로 결합 가능한 항체 또는 그의 단편은, 폴리펩티드에 특이적으로 결합 가능한 한 특별히 제한되지 않고, 폴리클로날 항체 또는 모노 클로날 항체 어느 것도 될 수 있다. 또한, 공지된 방법으로 변형된 항체 또는 항체의 유도체도 사용될 수 있고, 예를 들어, 인간화 항체, Fab 단편, 단쇄 항체 등이 포함된다. 또한, 본 발명의 항체는 예를 들어 문헌 [Current Protocols in Immunology; John E. Coligan 편집, John Wiley ＆ Sons 사 발행(1992)]에 기재된 방법에 의해, 본 발명의 폴리펩티드 전부 또는 일부를 이용하여 토끼 또는 쥐를 면역시킴으로써 쉽게 수득될 수 있다. 항체는 또한 유전자 공학 기술에 의해 제조될 수 있다. 부가하여, 폴리펩티드의 특정 부분 단편에 특이적으로 결합 가능한 항체 또는 그의 단편이 또한 내포될 수 있다.

또한, 항체의 단편은 이와 같이 수득한 항체를 정제한 후, 펩티다제 등으로 처리하므로써 수득된다. 이와 같이 수득한 항체 또는 그의 단편은 세라미다제-생성 미생물의 검출, 친화성 크로마토그라피, 각종 라이브러리 선별(게놈 DNA 또는 cDNA), 조제약, 진단 약제, 연구 및 개발용 시약 등에 적용될 수 있다.

게다가, 본 발명의 항체 또는 그의 단편은 또한 효소 면역 측정법, 형광 면역 측정법, 발광 면역 측정법 등에 의한 검출을 촉진하기 위해 다양한 방법으로 변형될 수 있다.

(9) 폴리펩티드 검출 방법

본 발명의 폴리펩티드 검출 방법은 상기 기재 항체 또는 그의 단편을 이용하여 세라미다제 활성을 갖는 폴리펩티드를 검출하는 것이 큰 특징이다.

본 발명에서, 검출되는 시료로는 예를 들어 미생물 세포 파괴물, 피부와 같은 조직을 세척하여 수득한 추출액 또는 생성물, 및 조직 또는 미생물 유래 단백질이 고정되는 멤브레인과 같은 단백질 시료가 포함된다.

상기 기재 폴리펩티드에 항체 또는 그의 단편이 특이적으로 결합하는 것의 검출은 효소 면역 측정법, 형광 면역 측정법, 발광 면역 측정법 등과 같은 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다.

(10) 본 발명의 폴리펩티드 검출 방법용 키트

본 발명의 폴리펩티드 검출 방법용 키트의 특징 중 하나는 키트가 상기 기재 항체 또는 그의 단편을 함유하는 것이다.

본 발명의 키트는 반응 완충액, 표식 2차 항체, 발색 시약 등을 더 함유할 수 있다.

(11) 아토피성 피부염 검출 방법

상기에 기재된 바와 같이, 세라미다제 생성 미생물은 아토피성 피부염의 원인이 되거나 또는 악화에 관여한다고 생각된다.

본 발명의 아토피성 피부염 검출 방법에 따라, 피부 유래 시료에서 세라미다제 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 그와 같은 폴리펩티드를 코드하는 유전자를 검출하므로써 아토피성 피부염이 검출될 수 있다.

본 발명의 아토피성 피부염 검출 방법에 사용되는 피부 유래 시료는 특별히 제한되지 않고, 시험할 사람의 피부 인설, 피부를 면 솜 또는 가제로 닦아 수득한 피부 도말, 피부 세척 수득물 등이 될 수 있다. 이러한 시료를 수집하는 방법은 특별히 제한되지 않는다. 그 예로는 시험할 사람의 피부로부터 직접 인설을 수집하는 방법; 시험할 사람의 피부를 면 솜 또는 가제로 닦아내는 방법; 또는 적당한 크기의 실린더를 시험할 사람의 피부에 밀착시키고, 실린더를 생리 식염수 또는 인산 완충액과 같은 적당한 세척용 수액으로 충진한 후, 피부를 세척용 수액으로 세척하는 것을 포함하는 세척 생성물 수집 방법이 포함된다.

이와 같이 수득된 시료들은, 상기 기재 폴리펩티드 검출용 또는 그와 같은 폴리펩티드를 코드하는 유전자의 검출용으로 직접 이용될 수 있다. 또한, 시료에 함유된 미생물을 배양하여 수득한 배양물은 적절한 배지에서 배양될 수 있고, 검출될 시료로 사용될 수 있고, 그에 의해 검출 감도를 높일 수 있다. 미생물 배양용 배지는, 시료 내의 피부 유래 미생물이 생장 가능하고, 배지가 세라미다제를 효과적으로 생성할 수 있는 한 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 탄소원 및/또는 질소원으로 글리세롤, 글루코스, 수크로스, 시럽, 이스트 추출액, 펩톤, 옥수수주, 고기 추출액, 탈지 대두, 암모늄 술페이트, 암모늄 니트레이트 등을 함유하는 배지가 적절히 이용된다. 상기에 열거된 것 이외에, 나트륨 염, 칼륨 염, 마그네슘 염, 아연 염, 인산 염 등과 같은 무기물 및 금속 염 또한 포함될 수 있다. 또한, 세라미다제 발현량을 증가시키고, 그에 의해 검출 감도를 높이기 의해 스핑고미엘린 및 세라미드와 같은 지질 또는 타우로데옥시콜레이트와 같은 계면활성제 0.001 내지 1 % 가 또한 배지에 첨가될 수 있다. 미생물 배양 조건은 특별히 제한되지 않고, 미생물을 25 내지 37 ℃ 에서 1 내지 7 일간 배양하는 것이 바람직하다. 배양 완료 후 배양물은 검출 공정용으로 바로 사용될 수도 있고, 또는 이와 달리 폴리펩티드를 검출할 때는 배양물을 원심분리하여 수득한 배양 상청액을 시료로 사용할 수도 있다.

본 발명의 아토피성 피부염 검출 방법은 상기 기재 올리고뉴클레오티드 프로 브 또는 프라이머를 이용하여 세라미다제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 유전자를 검출하므로써 또는 세라미다제 활성을 갖는 폴리펩티드에 특이적으로 결합 가능한 상기 기재 항체 또는 그의 단편을 이용하여 세라미다제 활성을 갖는 폴리펩티드를 검출하므로써 수행될 수 있다. 또한, 아토피성 피부염을 간단히 검출하기 위해, 상기 기재 세라미다제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 유전자 검출용 키트 또는 상기 기재 세라미다제 활성을 갖는 폴리펩티드 검출용 키트를 사용할 수 있다. 상기 기재 키트는 예를 들어 면 솜 및 배양 배지를 더 함유하는 키트를 포함하여, 하기 기재 시료를 수득하기 위한 수단을 더 함유할 수 있다.

본 발명의 아토피성 피부염 검출 방법에서, 세라미다제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 유전자를 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용하여 검출할 때, 예를 들어 시험할 사람의 피부 유래 시료로부터 공지된 방법으로 제조한 핵산이, 형성되는 하이브리드 검출에 적합한 혼성화 조건하에서 세라미다제 유전자의 뉴클레오티드 서열에 기초하여 고안된 올리고뉴클레오티드 프로브와 혼성화된다. 예를 들어, 세라미다제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 유전자는, 피부 유래 시료로부터 제조된 핵산이 니트로셀룰로스 멤브레인 등에 고정된 곳에서, 도트 블로트 혼성화에 의해 검출될 수 있다. 이와 달리, 시료를 니트로셀룰로스 멤브레인에 직접 고정시키고, 시료에 함유된 핵산에 적합한 용해 처리를 한 후, 혼성화하고, 그에 의해 형성된 하이브리드를 검출할 수도 있다.

본 발명의 아토피성 피부염 검출 방법에서, 세라미다제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 유전자를 유전자 증폭에 의해 검출할때, 반응 혼합물은 시험할 사 람의 피부 유래 시료 또는 그와 같은 시료 및 세라미다제 유전자의 뉴클레오티드 서열에 기초하여 고안된 프라이머로부터 제조된 핵산으로부터 제조되고, 반응 혼합물을 유전자 증폭 반응시킨다. 유전자 증폭 반응으로 PCR 법을 이용할 때, 상기 (6) 부분에 기재된 공정을 수행하여 DNA 를 증폭한 후, 증폭된 DNA 를 검출한다. 예를 들어, 세라미다제 유전자의 뉴클레오티드 서열에 기초하여 제조된 한 쌍의 프라이머 및 피부 유래 시료를 DNA 폴리머라제 및 dNTP와 함께 가하므로써 반응 혼합물을 제조하고, 프라이머 서열 및 증폭하고자 하는 부분의 길이에 적합한 조건하에서 증폭반응을 수행한다. 반응 종료 후, 아가로스 겔 전기영동 등에 의해 반응 혼합물을 분석하여 목적하는 유전자로부터 유래한 DNA 단편의 증폭이 존재 또는 부재하는지를 조사한다.

세라미다제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 유전자가 피부 유래 시료에서 상기 기재 방법에 의해 검출될 때, 시료가 채취된 피부 부위가 아토피성 피부염을 가지는 것으로 진단된다.

본 발명의 아토피성 피부염 검출 방법에서, 세라미다제 활성을 갖는 폴리펩티드를 검출할 때, 세라미다제 활성을 갖는 폴리펩티드에 특이적으로 결합 가능한 항체 또는 그의 단편을 이용하여 시험할 사람의 피부 유래 시료내에 상기 기재 항체 또는 그의 단편에 결합한 폴리펩티드가 존재 또는 부재하는지를 조사한다. 이와 같은 폴리펩티드의 검출은 면역 확산법, 라텍스 응집법 및 효소 면역 측정법과 같은 공지된 면역학적 실험 공정에 의해 수행될 수 있다. 검출 감도 및 조작의 간편성 측면에서, 효소 면역 측정법이 가장 실용적인 방법이다.

세라미다제 활성을 갖는 폴리펩티드를 전술된 방법으로 피부의 시료로부터 검출하는 경우, 시료를 채취한 피부의 부위가 아토피성 피부염에 걸린 것으로 진단한다.

(12) 아토피성 피부염 검출용 키트

전술한 아토피성 피부염의 검출을 좀더 단순하게 하기 위하여, 전술한 세라미다제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 검출하는 키트 또는 전술한 세라미다제 활성을 갖는 폴리펩티드를 검출하는 키트는 면 솜 및 배양배지와 같은 시료 수집용 기구를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 따라, 처음으로 알칼리성 세라미다제의 아미노산 서열 및 이를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 제공하며, 이로 상기 유전자를 이용한 세라미다제 활성을 갖는 폴리펩티드의 유전공학적 제조방법, 세라미다제의 검출방법, 및 또한 아토피성 피부염의 검출방법을 제공하게 된다. 본 발명의 세라미다제의 제조방법에 있어서, 스핑고지질을 세라미다제의 발현 유도용 배지에 첨가할 필요가 없고, 스핑고미엘리나제를 포함하는 효소를 동시에 유도할 수 있는 효소의 오염이 없거나, 또는 배지에 첨가된 스핑고지질의 혼합물 또는 이의 분해 산물이 없기 때문에, 원하는 세라미다제를 용이하게 정제할 수 있다. 또한, 본 발명의 세라미다제 유전자와 특이적으로 혼성화할 수 있는 프로브 또는 프라이머, 본 발명의 세라미다제 활성을 갖는 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 수 있는 이의 단편 또는 항체가 제공된다. 상기 프로브, 프라이머 및 이의 항체 또는 단편을 사용함으로써, 세라미다제는 고감도에서 단순하게 검출될 수 있다. 또한, 상기 프로브, 프라이머 및 이의 항체 또는 단편을 사용함으로써 아토피성 피부염은 단순하게 검출될 수 있다는 우수한 효과가 나타난다.

실시예

본 발명은 본 발명의 범위를 제한함이 없이 다음의 실시예를 통해 구체적으로 설명된다.

실시예 1 세라미다제의 구조유전자의 클로닝

(1) Genomic DNA 의 추출 및 정제

세라미다제 생산 미생물 슈도모나스 에루기노자 (Pseudomonas aeruginosa) 균주 AN-17 를 200 ml의 PY 배지(0.5% 폴리펩톤, 0.1% 이스트 추출물, 0.5% 염화나트륨, pH7.2) 에 접종하여 25℃ 에서 23 시간동안 배양했다. 배양 종결후, 수득한 배양 배지를 원심분리하여 세포를 수거하였다. 수거된 세포를 10ml 의 TE 완충액(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0) 에 현탁시킨후, 여기에 0.2 ml 의 50 mg/ml 알부민 라이소자임 용액을 첨가시켜 30℃ 에서 15 분간 반응시켰다. 이어서, 반응 종결후 수득한 용액에 2 ml 의 10% SDS 를 첨가하고, 혼합물을 부드럽게 교반하였다. 용액이 점성된 직후, 10ml 의 TE 완충액-포화 페놀 및 1.5ml 의 5M NaCl 를 용액에 첨가하고, 실온에서 1 시간동안 부드럽게 교반하였다. 교반후 수득한 용액을 2500rpm 에서 10 분간 원심분리시켜, 상층액을 수집하였다. 이렇게 수득한 용액에, 동량의 클로로포름을 가하고 10 분간 교반한후, 1500 rpm 에서 10 분간 원심분리하여 상층액을 수집하였다. 이 수득한 상층액에 한번 더 동량의 클로로포름을 가하고, 교반 및 원심분리하여 상층액을 수집하였다 (이후 일련의 이런 작업은 페놀-클로로포름 처리라 부른다). 이렇게 수집된 상층액에, 동량의 이소프로판올을 서서히 가하고, 계면상에 침전된 DNA 를 파스퇴르 피펫으로 감어 수집한후, 10ml 의 TE 완충액에 용해시켰다. 이렇게 수득한 용액에, 20㎕ 의 RNase A (10mM Tris-HCl, pH7.5, 15 mM NaCl 에 RNase 를 용해시켜 10 mg/ml 의 농도를 갖도록 한후, 100℃ 에서 15 분간 열처리하여 제조한 것) 를 가하고, 혼합물을 50℃ 에서 1 시간동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션후 용액에, 10㎕의 20mg/ml 프로테아제 K 용액, 200㎕ 의 5 M NaCl, 및 400㎕ 의 10% SDS 를 추가로 가하고, 이 혼합물을 37℃ 에서 1 시간동안 인큐베이션시켜 반응을 실시하였다. 반응후 용액은 실온으로 냉각시켜 페놀-클로로페놀 처리시켰다. 이 처리를 2 회 반복하고, 수득한 수상에 동량의 이소프로판올 및 1/10 부피의 3M 아세트산나트륨을 가하였다. 혼합물을 -20℃ 에서 1 시간동안 냉각시킨후, 10,000rpm 에서 10 분간 원심분리하여 침전시켰다. 수득한 침전물을 70% 에탄올로 헹궈, TE 완충액에 용해시켜 genomic DNA 용액을 수득하였다. 상기 절차에 의해, 1.1mg 의 genomic DNA 가 수득되었다.

(2) 세라미다제의 부분 아미노산 서열의 결정

슈도모나스 에루기노자 균주 AN-17 로 생성된 세라미다제를 Journal of Biological Chemistry, 273, NO.23, 14368-14373 (1998) 에 기재된 방법에 따라 정제하였다. 수득한 약 5㎍ 의 세라미다제를 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동시켰다. 이어서, 일렉트로블롯팅을 이용하여 겔상의 단백질을 PVDF 막 ("Immobilon-P", Milipore사제) 로 옮겼다. 이 막상의 세라미다제 밴드에 해당하는 영역 (50 pmol) 을 절단하여, 라이실 엔도펩티다아제 (0.9U) 0.2mg 및 8% 아세토니트릴을 함유하는 100㎕ 의 20 mM Tris-HCl 완충액에서 진탕하면서 37℃ 에서 16 시간동안 효소소화시켰다. 이 효소-소화된 용액을 역상 크로마토그래피에 적용하여 펩티드 단편을 정제하였다. 이렇게 수득한 펩티드 단편은 기상 펩티드 서열기 Model 477 (Applied Biosystem 사제) 을 이용하여 에드만 분해로 분석하여 세라미다제 내부 부분 아미노산 서열 C-89 (서열 표의 서열 번호 : 3), C-91(서열 표의 서열 번호 : 4), S-90 (서열 표의 서열 번호 : 5), C-86 (서열 표의 서열 번호 : 6) 및 C-121 (서열 표의 서열 번호 : 7) 을 결정하였다.

한편, 상기와 별개로, 전술한 PVDF 막을 라이실 엔도펩티다아제 처리없이 펩티드 서열기에 적용하여 N-말단 아미노산 서열 N-Term (서열 표의 서열 번호 : 8) 을 결정하였다.

(3) 세라미다제 유전자 함유 DNA 단편의 PCR 증폭

실시예 1-(2) 에서 결정된 내부 부분 아미노산 서열 및 N-말단 아미노산 서열에 기초하여, 서열목록의 서열 번호 : 9 내지 11 의 각각에 나타낸 바와 같은 각각의 프라이머를 설계하여 DNA 합성기로 합성하였다.

구체적으로는, 각각 서열 번호 : 5 에 나타낸 S-90 에 대응하는, 서열 번호 : 9 에 나타낸 센스 믹스 프라이머 S90-1 및 서열 번호 : 10 에 나타낸 센스 믹스 프라이머 S90-2; 각각 서열 번호 : 3 에 나타낸 C-89 에 대응하는, 서열 번호 : 11 에 나타낸 안티센스 믹스 프라이머 C89-c1, 서열 번호 : 12 에 나타낸 안티센스 믹스 프라이머 C89-c2 및 서열 번호 : 13 에 나타낸 안티센스 믹스 프라이머 C89-1 ; 서열 번호 : 4 에 나타낸 C-91 에 대응하는, 서열 번호 : 14 에 나타낸 안티센스 믹스 프라이머 C91-c1 를 각각 합성하였다.

이러한 프라이머의 각각을 PCR 반응시켰다. PCR 은 Gene Amp Reagent Kit (Perkin Elmer 사제) 를 이용하여 실시하였다. 이 반응을 40-반응 주기로 실시하며, 1 주기는 94℃ 에서 0.5 분, 51℃ 에서 0.5 분, 및 72℃ 에서 1 분으로 이루어졌다.

주형으로써 실시예 1-(1) 에서 수득한 genomic DNA 를 이용한 프라이머 C89-1 과 프라이머 C91-c1 의 조합의 PCR 반응에서, 약 350bp 에 대응하는 특이적 밴드의 증폭이 검출되었다. S90-1과 C89-c1의 조합, S90-1과 C89-c2의 조합, S90-2와 C89-c1의 조합, 및 S90-2와 C89-c2의 조합은 어느 것도 특이적 밴드의 증폭을 보이지 않았다.

상기에서 수득한 약 350bp 의 증폭된 DNA 단편은 아가로스 겔 전기영동후 겔로부터 수집하고, 수집된 DNA 단편을 pGEM-T 이지(easy) 벡터 (Promega 사제) 에 결찰시켜 재조합 플라스미드를 제조하였다. 이러한 플라스미드를 주형으로 사용하여, 수득한 증폭된 DNA 단편의 뉴클레오티드 서열은 디데옥시법으로 결정하였다. 그 결과, 수득한 뉴클레오티드 서열은 세라미다제의 부분 아미노산 서열의 각각을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 즉, C-89, C-86, C-121 및 C-91 을 갖는 것이 발견되어, 이 증폭된 DNA 단편은 목적하는 세라미다제를 코딩하는 유전자의 일부임이 분명해졌다.

(4) 세라미다제 유전자 함유 DNA 단편의 검출

실시예 1-(3) 에서 수득한 PCR 증폭된 DNA 단편은 세라미다제 유전자를 함유하는 genomic DNA 단편을 선별하는데 프로브로 사용하였다.

우선, 실시예 1-(1) 에서 제조된 genomic DNA 5㎍ 를 제한효소 SphI, ApaI, KpnI, XhoI, SalI, HincII, HindIII, EcoRV, EcoRI, PstI, SmaI, BamHI, NotI 및 SacII 각각의 100U 로 37℃ 에서 22 시간동안 소화시켜, 생성된 제한효소-소화된 DNA 를 1% 아가로오즈 겔 전기영동시켰다. 전기영동후, DNA 를 서던 블롯팅으로 나일론막 [Hybond-N⁺, Amersham 사제] 로 옮겼다. 혼성화 프로브로서, DNA 라벨잉 키트 (ReadyTo Go, Pharmacia 사제) 를 이용하여 DNA 라벨링 키트의 프로토콜에 따라 실시예 1-(3) 에서 수득한 PCR-증폭 DNA 단편 0.1㎍ 을 ³²P 로 표식하여 수득한 프로브를 사용하였다.

전술한 나일론 막은 0.5M 처취법 포스페이트 완충액 [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81, 1991-1995 (1984)], pH 7.0, 7% SDS 및 1mM EDTA 를 함유한 혼성화 용액에서 65℃ 에서 1 시간이상 예비혼성화시킨후, 여기에 전술한 표식된 프로브를 가하여 6 fmol/ml 의 농도를 갖도록 하고, 혼성화를 65℃ 에서 밤새워 실행하였다. 이어서, 나일론 막은 미리 65℃ 로 데워진 세정용액 (조성 :1% SDS, 40mM 소듐 포스페이트 완충액) 으로 매회 65℃ 에서 15 분간 3 회 세정하였다. 나일론 막으로부터 과량의 수분을 제거한후, 나일론 막을 이메징 플레이트 (Fuji Photo Film Co., Ltd 제) 와 20 분간 접촉시켜 감광화시켰다. 감광화후, 이메징 플레이트를 BAS 1000 이메징 분석기 (Fuji Photo Film Co., Ltd 제) 로 분석하여 나일론막상의 프로브를 검출하였다. 그 결과 SphI, ApaI, KpnI, XhoI, SalI, HincII, HindIII, EcoRV, EcoRI, PstI, SmaI, BamHI, NotI 및 SacII 에 의한 소화 생성물은 각각 약 7.1 kb, 2.8kb, 12.6kb, 5.8kb, 1.8kb, 1.8kb, 13.7kb, 12.6kb, 9kb, 6kb, 3.5kb, 6.7kb, 11.8kb 및 1.5kb 의 부위에서 혼성화된 프로브에 기인되는 시그널을 갖는 것으로 밝혀졌다.

(5) 세라미다제 유전자 클로닝

실시예 1-(4) 의 결과에 기초하여, 약 2.8 kb ApaI 단편을 클로닝했다. 10 mg 의 ApaI-소화 genomic DNA 를 1% 아가로오스 겔 전기영동으로 분리시키고, 약 2.8kb 의 크기에 해당하는 위치의 아가로오스겔을 절단하였다. Sephaglas BandPrep Kit (Amersham Pharmacia 사제) 를 이용하여, DNA 단편을 겔로부터 추출하여 정제하고, 이 DNA 단편을 pBluescript II SK (Toyobo Co., Ltd 제) 의 ApaI 부위에 삽입하여 재조합 플라스미드를 제조하였다. 대장균주 JM109 을 이 플라스미드로 형절전환시켜, 100㎍/ml 의 암피실린을 함유한 아가 배지 (조성: 1% 트립톤, 0.5% 이스트 추출물, 1% NaCl, pH7.2) 의 L 플레이트상에서 밤새워 배양하고, 300 개의 콜로니가 형성된 콜로니로부터 선택하여 동일한 아가 플레이트상에 있는 나일론막 [Hybond-N, Amersham 사제] 에 접종하였다. 37℃ 에서 16 시간동안 배양한후, 나일론 막을 알칼리 변성 용액 (조성 : 0.5M NaOH, 1.5 M NaCl) 에 침지시킨 여과지상에서 5 분간 (변성), 중화용액 [조성 : 0.5M Tris-HCl (pH 7.5), 3M NaCl] 에 침지시킨 여과지에서 5 분간 처리하고 (중화), 이어서 2 x SSC(1 x SSC 의 조성 : 0.15M NaCl, 0.015M 소듐 시트레이트, pH 7.0) 으로 헹구었다.

이 나일론막은 전술한 조건하 실시예 1-(3) 에서 수득한 PCR-증폭된 DNA 단편을 프로브로 사용하여 혼성화시킨 결과, 두 콜로니가 시그널을 나타내었다. 이 콜로니들중 하나를 사용하여 플라스미드 (pSCA59 로 명명) 를 제조하여 플라스미드내 삽입된 DNA 단편의 뉴클레오티드 서열을 결정하는데 사용하였다. 그 결과, 실시예 1-(2), C-89, C-86, C-121 및 C-91 에서 수득한 아미노산 서열에 해당하는 뉴클레오티드 서열이 동일한 프레임내 종결코돈과 함께 발견되는 반면, N-말단 아미노산 서열 N-Term 또는 S-90 에 해당하는 뉴클레오티드 서열은 발견되지 않았다. 즉, 이 플라스미드는 세라미다제 유전자의 종결코돈을 함유한 3' 말단 (C-말단 영역) 을 포함하나, 5'말단 (N-말단 영역) 은 포함하지 않는 것이 분명했다.

이어서, 전장의 세라미다제 유전자를 수득하기 위해서, pSCA59 에서 결실된 N-말단 부근의 영역을 코딩하는 DNA 단편을 전술한 것과 동일한 방법으로 서던 혼성화 방법으로 선별하였다. 여기에서 사용하는 프로브는 세라미다제 유전자의 5' 말단 부근의 서열을 포함하는 약 560 bp 크기의 pSCA59 의 KpnI/SacII-소화 단편이었다. 아가로오스 겔 전기영동에 의해 단리된 약 560bp 크기의 KpnI/SacII 단편은 전술한 것과 동일한 방법으로 ³²P 로 표지하여, 전술한 것과 동일한 방법으로 서던 혼성화시켰다. 그 결과, 각각의 프로브는 약 7.1 kb 의 부위에서 SphI-소화 단편, 약 2.8 kb 의 부위에서 ApaI-소화 단편, 약 5.8 kb 의 부위에서 XhoI-소화 단편, 약 9 kb 의 부위에서 EcoRI-소화 단편, 약 6 kb 의 부위에서 PstI-소화 단편, 약 3.5 kb 의 부위에서 SmaI-소화 단편, 약 2.1 kb 의 부위에서 BamHI-소화 단편, 약 2.5 kb 의 부위에서 SacII-소화 단편 각각과 혼성화되었다.

상기의 결과를 기초로, 약 2.1 kb BamHI 단편을 클로닝하였다. 10 mg 의 BamHI-소화 genomic DNA 를 1% 아가로오스 겔 전기영동으로 분리시키고, 아가로오스 겔을 약 2.1kb 의 크기에 해당하는 위치에서 절단하고, Sephaglas BandPrep Kit 를 이용하여 겔로부터 추출 및 정제된 DNA 단편을 pGEM-3Zf(+) (Promega 사제) 의 BamHI 부위에 삽입하였다. 9 개의 양성 콜로니를 상기 플라스미드로 대장균주 JM109 를 형질전환시키고, 전술한 것과 동일한 방법으로 콜로니 혼성화시켜 수득하였다. 플라스미드는 이러한 콜로니들중의 하나로부터 제조하고, pGCB38 로 명명하였다. 이후, 전술한 pGCB38 내의 삽입된 DNA 단편의 뉴클레오티드 서열을 결정하였다. 첫째, 상기 플라스미드를 제한효소 PstI 및 XbaI 로 소화시켜 다양한 결실 돌연변이체를 제조한후, 표준방법에 따라 엑소뉴클레아제 III(Nipon Gene 사제) 및 멍빈 뉴클레아제 (Mung Bean Nuclease) (Nippon Gene 사제) 로 처리하여 제조하였다. pGCB38 내 삽입된 세라미다제 유전자의 뉴클레오티드 서열은 상기의 돌연변이체 및 pGCB38 의 뉴클레오티드 서열을 디데옥시법을 이용하여 결정하였다. 그 결과, 세라미다제 N-말단 아미노산 서열 N-Term 및 S-90 에 해당하는 뉴클레오티드 서열이 발견되어, pGCB38 은 세라미다제 유전자의 N-말단을 코딩하는 영역을 포함함이 분명해졌다.

플라스미드 pSCA59 및 pGCB 28 의 삽입된 DNA 단편의 제한효소 지도는 도 1 에 나타내었다. 양 플라스미드의 뉴클레오티드 서열의 분석 결과에 기초하여,세라미다제 유전자의 전 뉴클레오티드서열 및 세라미다제의 아미노산 서열을 결정하였다. 슈도모나스 에루기노자 균주 AN-17 에 의해 생성된 세라미다제를 코딩하는 개방판독틀 (ORF) 의 뉴클레오티드 서열은 서열목록내 서열 번호 : 16 에 나타낸 바와같고, 이러한 ORF 에 의해 코딩된 아미노산 서열은 서열목록의 서열 번호 : 15 에 나타낸 바와 같다. 실시예 1-(2) 에서 수득한 세라미다제의 N-말단 아미노산 서열 N-Term (서열목록내 서열 번호 : 8) 에 의해 밝혀진, 성숙한 세라미다제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열목록내 서열 번호 : 2 에 나타내었다. 이러한 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 성숙한 세라미다제의 아미노산 서열은 서열목록의 서열 번호 : 1 에 나타내었다.

실시예 2 세라미다제 폴리펩티드를 발현하는 플라스미드의 구축

세라미다제를 발현하는 플라스미드는 후술되는 절차에 따라 구축되었다.

실시예 1-(5) 에서 제조한 플라스미드 pGCB38 의 결실 돌연변이체, pGCB38-D13 은 세라미다제를 코딩하는 ORF 의 개시코돈의 상류에 15 bp 이하의 삽입부를 가졌다. 제한효소 HindIII 및 BamHI 로 상기 플라스미드를 소화시켜 생성된 약 1.3kb의 DNA 단편은 1% 아가로오스 겔 전기영동으로 단리 및 정제하여 DNA 단편-1 을 수득하였다. 한편, 제한효소 HindIII 및 BamHI 로 상기 플라스미드 pSCA59 를 소화시켜 생성된 약 1.6kb의 DNA 단편은 1% 아가로오스 겔 전기영동으로 단리 및 정제하여 DNA 단편-2 를 수득하였다. 이어서, HindIII-소화 플라스미드 pTV119N (Takara Shuzo Co., Ltd 제) 를 상기에서 수득한 DNA 단편-1 및 DNA 단편-2 의 혼합물과 결찰시켰다. 이후, 삽입단편이 pTV119N 의 lac 프로모터의 하류에, DNA 단편-1 및 DNA 단편-2 의 순으로 적절하게 삽입된 재조합 플라스미드를 선택하여 pTCD11 로 명명하였다. 또한, pTCD11 은 제한효소 SmaI 로 소화시켜 500 SmaI 단편이 결실된 플라스미드 pTCDS7 를 제조하였다. 이러한 플라스미드로 형질전환된 대장균주 JM109 를 기탁번호 FERM BP-6728 하 JM109/pTCDS7 로 명명하고 통상산업성 공업기술원 생명공학 공업기술 연구소에 기탁하였다.

실시예 3 형질전환된 대장균에서의 세라미다제의 발현

실시예 2 에서 수득한 대장균주 JM109/pTCDS7 을 100㎍/ml 의 암피실린을 함유하는 L 배지 5 ml 에 접종하고, 37℃ 에서 밤새워 진탕하여 배양하고, 배양 배지의 1 ml 분량을 동일한 L 배지 200ml 에 접종시킨다. 혼탁도(600nm 에서의 흡광) 가 약 0.6 에 도달할때 까지 37℃ 에서 배양한후, 생성된 배양물에 이소프로필-β-D- 티오갈락토시드(IPTG) 를 첨가하여 0.1mM 의 최종농도를 만들고, 이어서 추가로 37℃ 에서 8 시간동안 진탕하면서 배양하였다. 배양의 종결후, 배양배지를 원심분리하여 세포를 수집하고, 0.5mM 4-(2-아미노에틸)벤젠술포닐 플루오라이드 하이드로클로라이드를 함유하는 10mM Tris-HCl 완충액 (pH 8.0) 3ml 에 현탁시키고, 초음파처리하여 세포를 파괴시켰다. 이렇게 수득한 파괴된 세포 유체를 원심분리하여 상층액을 수집한후 이를 조 효소용액으로 사용하였다.

이 조효소 용액은 문헌 [Journal of Biological Chemistry, 273, 14368-14373(1998)] 에 기재되어 있는 방법에 따라 기질로서 C12-NBD-세라미드를 이용하여 이의 세라미다제에 대한 활성을 검정하였다. 구체적으로는, 550 pmol 의 C12-NBD-세라미드, 2.5mM 염화칼슘, 0.25% (w/v) Triton X-100 및 적량의 조효소 용액을 20㎕ 의 25mM Tris-HCl 완충액 (pH8.5) 에 용해시켜 반응 용액을 제조하고, 이 반응 용액을 37℃ 에서 20 분간 인큐베이션시켰다. 생성된 반응 혼합물은 5 분간 끓는물에서 인큐베이션시켜 반응을 종결시키고, 반응 혼합물을 추가로 감압하 건조시켰다. 건조된 생성물을 클로로포름/메탄올 =2/1(중량비) 용액에 용해시키고, 실리카겔 박층 크로마토그래피 [용출액:클로로포름/메탄올/25% 수성 암모니아 = 90/20/0.5 (부피비)] 에 걸었다. 전개후, 475 nm 의 여기파장 및 525 nm 의 형광파장에서의 C12-NBD-세라미드 및 이의 분해 산물 C12-NBD-지방산의 함량을 CS-9300 크로마토스캐너 (Shimadzu Corporation 사제) 으로 검정하였다. 이러한 효소의 1 유니트는 전술한 조건하 1 분당 1 μmol 의 C12-NBD-지방산의 형성에 필요한 효소의 양으로 정의된다. 그 결과, 본 발명에 따른 세라미다제 유전자를 포함하는 대장균주 JM109/pTCDS7 은 배양 배지의 1L 당 세라미다제를 약 32 유니트 생산함이 보여졌다.

실시예 4 아토피성 피부염의 검출

전술한 세라미다제 유전자의 뉴클레오티드 서열에 기초하여, 상류용 프라이머인 프라이머 382U, 및 하류용 프라이머인 프라이머 884L 를, 세라미다제 유전자 검출용 프라이머로서 설계 및 합성하였다. 프라이머 382U 및 프라이머 884L 의 뉴클레오티드 서열은 서열목록에 서열 번호 : 17 및 18 로 나타낸 바와 같았다. 상기 두 프라이머를 사용하고, 서열목록의 서열 번호 : 2 에 나타낸 뉴클레오티드서열의 세라미다제 유전자를 주형으로 사용하여 PCR 을 실시하는 경우, 523bp 의 DNA 단편이 증폭되었다.

피부유래 시료를 24 명의 아토피성 피부염 환자 및 8 명의 정상인 각각으로부터 하기 절차에 따라 수집하였다. 시험하고자하는 사람의 피부를 살균 면 솜으로 닦고, 그 솜을 200㎕ 의 살균증류수에 침지시켜, 시료 수집전에 격렬하게 교반하였다. 수집된 시료를 100℃ 에서 5 분간 가열하여 PCR 에 사용할 시료 용액을 수득하였다.

EXTaq (Takara Shuzo Co., Ltd. 제) 를 이용하여 PCR 을 실시하였다. 5㎕ 의 시료 용액, 각각 0.2 μM 의 프라이머 382U 및 프라이머 884L, 각각 0.2 mM 의 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP, 2.5 U 의 EXTaq 를 함유하는 PCR 반응 용액 100㎕ 를 40 주기용 EXTaq 에 부속되어 있는 반응 완충액을 이용하여 제조하였다. 1 주기는 94℃에서 1분, 60℃ 에서 1분, 및 72℃ 에서 1 분으로 이루어졌다. 생성된 반응 혼합물의 일부를 아가로오스 겔 전기영동시키고, 전기영동후 생성된 겔은 에티듐 브로마이드로 염색하여 DAN 단편의 증폭의 존재 또는 부재를 조사하였다.

그 결과, 아토피성 피부염 환자 24 명중 15 명의 시료에서, 약 500bp 의 DNA 단편의 특이적 증폭, 즉, 세라미다제 유전자의 존재에 대한 지표가 발견되었다. 한편 단편의 이러한 증폭은 정상인으로부터 유래한 임의의 8 개의 시료에서는 발견되지 않았다.

균등범위

본 발명은 본 발명의 취지 또는 본질적 특성에서 벗어남 없이 기타의 특이적 형태로 구체화될 수 있다. 그러므로 본 발명의 태양은 모든 면에서 제한적인 것이 아닌 설명적인 것으로 여겨야하며, 본 발명의 범위는 앞서의 명세서에 의하기 보단 첨부된 청구항에 의해 나타나며, 따라서 청구항과 동등의 범위 및 의미내의 모든 변화는 여기 포함될 것이다.

본 발명은 세라미다제 활성을 갖는 폴리펩티드, 및 지질 공학용 시약으로서 그리고 아토피성 피부염의 진단 지표로서 유용한 상기 폴리펩티드를 코드하는 유전자, 폴리펩티드의 검출방법 및 유전자의 검출방법 뿐 아니라 아토피성 피부염의 검출방법을 제공한다.

<110> Takara Shuzo Co., Ltd. <120> CERAMIDASE GENE <150> JP 98-234769 <151> 1998-08-20 <160> 18 <170> KOPATIN 1.5 <210> 1 <211> 646 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 1 Asp Asp Leu Pro Tyr Arg Phe Gly Leu Gly Lys Ala Asp Ile Thr Gly 1 5 10 15 Glu Ala Ala Glu Val Gly Met Met Gly Tyr Ser Ser Leu Glu Gln Lys 20 25 30 Thr Ala Gly Ile His Met Arg Gln Trp Ala Arg Ala Phe Val Ile Glu 35 40 45 Glu Ala Ala Ser Gly Arg Arg Leu Val Tyr Val Asn Thr Asp Leu Gly 50 55 60 Met Thr Phe Gln Ala Val His Leu Lys Val Leu Ala Arg Leu Lys Ala 65 70 75 80 Lys Tyr Pro Gly Val Tyr Asp Glu Asn Asn Val Met Leu Ala Ala Thr 85 90 95 His Thr His Ser Gly Pro Gly Gly Phe Ser His Tyr Ala Met Tyr Asn 100 105 110 Leu Ser Val Leu Gly Phe Gln Glu Lys Thr Phe Asn Ala Ile Val Asp 115 120 125 Gly Ile Val Arg Ser Ile Glu Arg Ala Gln Ala Arg Leu Gln Pro Gly 130 135 140 Arg Leu Phe Tyr Gly Ser Gly Glu Leu Arg Asn Ala Ser Arg Asn Arg 145 150 155 160 Ser Leu Leu Ser His Leu Lys Asn Pro Asp Ile Ala Gly Tyr Glu Asp 165 170 175 Gly Ile Asp Pro Gln Met Ser Val Leu Ser Phe Val Asp Ala Asn Gly 180 185 190 Glu Leu Ala Gly Ala Ile Ser Trp Phe Pro Val His Ser Thr Ser Met 195 200 205 Thr Asn Ala Asn His Leu Ile Ser Pro Asp Asn Lys Gly Tyr Ala Ser 210 215 220 Tyr His Trp Glu His Asp Val Ser Arg Lys Ser Gly Phe Val Ala Ala 225 230 235 240 Phe Ala Gln Thr Asn Ala Gly Asn Leu Ser Pro Asn Leu Asn Leu Lys 245 250 255 Pro Gly Ser Gly Pro Phe Asp Asn Glu Phe Asp Asn Thr Arg Glu Ile 260 265 270 Gly Leu Arg Gln Phe Ala Lys Ala Tyr Glu Ile Ala Gly Gln Ala Gln 275 280 285 Glu Glu Val Leu Gly Glu Leu Asp Ser Arg Phe Arg Phe Val Asp Phe 290 295 300 Thr Arg Leu Pro Ile Arg Pro Glu Phe Thr Asp Gly Gln Pro Arg Gln 305 310 315 320 Leu Cys Thr Ala Ala Ile Gly Thr Ser Leu Ala Ala Gly Ser Thr Glu 325 330 335 Asp Gly Pro Gly Pro Leu Gly Leu Glu Glu Gly Asn Asn Pro Phe Leu 340 345 350 Ser Ala Leu Gly Gly Leu Leu Thr Gly Val Pro Pro Gln Glu Leu Val 355 360 365 Gln Cys Gln Ala Glu Lys Thr Ile Leu Ala Asp Thr Gly Asn Lys Lys 370 375 380 Pro Tyr Pro Trp Thr Pro Thr Val Leu Pro Ile Gln Met Phe Arg Ile 385 390 395 400 Gly Gln Leu Glu Leu Leu Gly Ala Pro Ala Glu Phe Thr Val Met Ala 405 410 415 Gly Val Arg Ile Arg Arg Ala Val Gln Ala Ala Ser Glu Ala Ala Gly 420 425 430 Ile Arg His Val Val Phe Asn Gly Tyr Ala Asn Ala Tyr Ala Ser Tyr 435 440 445 Val Thr Thr Arg Glu Glu Tyr Ala Ala Gln Glu Tyr Glu Gly Gly Ser 450 455 460 Thr Leu Tyr Gly Pro Trp Thr Gln Ala Ala Tyr Gln Gln Leu Phe Val 465 470 475 480 Asp Met Ala Val Ala Leu Arg Glu Arg Leu Pro Val Glu Thr Ser Ala 485 490 495 Ile Ala Pro Asp Leu Ser Cys Cys Gln Met Asn Phe Gln Thr Gly Val 500 505 510 Val Ala Asp Asp Pro Tyr Ile Gly Lys Ser Phe Gly Asp Val Leu Gln 515 520 525 Gln Pro Arg Glu Ser Tyr Arg Ile Gly Asp Lys Val Thr Val Ala Phe 530 535 540 Val Thr Gly His Pro Lys Asn Asp Leu Arg Thr Glu Lys Thr Phe Leu 545 550 555 560 Glu Val Val Asn Ile Gly Lys Asp Gly Lys Gln Thr Pro Val Thr Val 565 570 575 Ala Thr Asp Asn Asp Trp Asp Thr Gln Tyr Arg Trp Glu Arg Val Gly 580 585 590 Ile Ser Ala Ser Lys Ala Thr Ile Ser Trp Ser Ile Pro Pro Gly Thr 595 600 605 Glu Pro Gly His Tyr Tyr Ile Arg His Tyr Gly Asn Ala Lys Asn Phe 610 615 620 Trp Thr Gln Lys Ile Ser Glu Ile Gly Gly Ser Thr Arg Ser Phe Glu 625 630 635 640 Val Leu Gly Thr Thr Pro 645 <210> 2 <211> 1941 <212> DNA <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 2 gacgacctgc cctaccgctt cggcctgggc aaggcggaca tcaccggcga agccgccgaa 60 gtcggcatga tgggttactc ctccctcgaa cagaagaccg ccggcatcca catgcgccag 120 tgggcgcgtg ccttcgtgat cgaggaagcg gccagcggac gtcgcctggt ctacgtcaac 180 accgacctgg ggatgacctt ccaggccgtg cacctgaagg tcctggcccg gctcaaggcg 240 aagtaccccg gtgtctacga cgagaacaac gtgatgctcg ccgccaccca cacccactcc 300 ggtccgggcg gcttctccca ctacgcgatg tacaacctgt cggtgctcgg cttccaggaa 360 aagaccttca acgccatcgt cgacggcatc gtccgctcca tcgagcgggc ccaggccagg 420 ttgcagcccg gccgcctgtt ctacggcagc ggcgagctgc gcaacgccag ccgcaaccgt 480 tcgctgctgt cgcacctgaa gaatccggac atcgccggct acgaggatgg catcgacccg 540 cagatgagcg tgctcagctt cgtcgacgcc aacggcgagc tggccggcgc gatcagttgg 600 ttcccggtgc acagcacctc gatgaccaac gccaatcacc tgatctcccc ggacaacaag 660 ggctacgcct cctatcactg ggagcacgac gtcagccgca agagcggttt cgtcgccgcc 720 ttcgcccaga ccaatgccgg caacctgtcg cccaacctga acctgaagcc cggctccggt 780 cccttcgaca acgagttcga caacacccgc gagatcggtc tgcgccaatt cgccaaggcc 840 tacgagatcg ccggccaggc ccaggaggaa gtgctcggcg aactggattc gcgcttccgt 900 ttcgtcgact tcacccgcct gccgatccgc ccggagttca ccgacggcca gccgcgccag 960 ttgtgcaccg cggccatcgg caccagcctg gccgccggta gcaccgaaga cggtccaggc 1020 ccgctggggc tggaggaagg caacaatccg ttcctctcgg cccttggcgg gttgctcacc 1080 ggcgtgccgc cgcaggaact ggtgcaatgc caggcggaaa agaccatcct cgccgacacc 1140 ggcaacaaga aaccctaccc ctggacgccg acggtgctgc cgatccagat gttccgcatc 1200 ggccagttgg aactgctcgg cgcccccgcc gagttcaccg tgatggccgg ggtgcggatc 1260 cgccgcgcgg tgcaggcggc cagcgaagcg gccggtatcc gccatgtggt cttcaatggc 1320 tacgcgaatg cctatgccag ctacgtcacc acccgcgagg aatacgccgc ccaggaatac 1380 gaaggcggct cgaccctcta cggcccctgg acccaggccg cctaccagca gttgttcgtc 1440 gacatggcgg tggcgctgcg cgaacgcctg ccggtggaaa cctcggcgat agcgccggac 1500 ctgtcctgct gccagatgaa cttccagacc ggagtagtgg ccgatgatcc ctatatcggc 1560 aagtccttcg gcgacgtgtt gcaacaaccc agggaaagtt atcgcatcgg cgacaaggtg 1620 accgtcgctt tcgtgaccgg acatccgaag aatgacttgc gcaccgagaa gactttcctg 1680 gaagtggtga atatcggcaa ggatggcaaa cagacgcccg tgaccgttgc caccgataat 1740 gactgggata cccaataccg ctgggagaga gtgggtatat ctgcctcgaa agcgactatc 1800 agctggtcca ttccaccagg gaccgagccc ggccattact acatcaggca ctatggcaac 1860 gcgaagaact tctggaccca gaagatcagc gaaatcggcg gctcgacccg ctccttcgag 1920 gtgctcggca ccactcccta g 1941 <210> 3 <211> 18 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 3 Ser Phe Gly Asp Val Leu Gln Gln Pro Arg Glu Ser Tyr Arg Ile Gly 1 5 10 15 Asp Lys <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 4 Ile Ser Glu Ile Gly Gly Ser Thr Arg Ser Phe Glu Val Leu Gly Thr 1 5 10 15 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 5 Asp Asp Leu Pro Tyr Arg Phe Gly Leu Gly Lys 1 5 10 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 6 Val Thr Xaa Ala Phe Val Thr Gly His Pro Lys 1 5 10 <210> 7 <211> 10 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 7 Thr Phe Leu Glu Val Val Asn Ile Gly Lys 1 5 10 <210> 8 <211> 25 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 8 Asp Asp Leu Pro Tyr Arg Phe Gly Leu Gly Lys Ala Asp Ile Thr Gly 1 5 10 15 Glu Ala Ala Glu Val Gly Met Met Gly 20 25 <210> 9 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide based on the amino acid sequence represe nted in SEQ ID:NO. 5 <400> 9 gaygayctnc cntaymg 17 <210> 10 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide based on the amino acid sequence represe nted in SEQ ID:NO. 5 <400> 10 gaygayttrc cntaymg 17 <210> 11 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed ologonucleotide based on the amino acid sequence represe nted in SEQ ID:NO. 3 <400> 11 ccratnckrt asgaytc 17 <210> 12 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide based on the amino acid sequence represe nted in SEQ ID:NO. 3 <400> 12 ccratnckrt agctytc 17 <210> 13 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide based on the amino acid sequence represe nted in SEQ ID:NO. 3 <400> 13 gaygtsytsc arcarcc 17 <210> 14 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide based on the amino acid sequence represe nted in SEQ ID:NO. 4 <400> 14 aagctycasr asccvtg 17 <210> 15 <211> 670 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 15 Met Ser Arg Ser Ala Phe Thr Ala Leu Leu Leu Ser Cys Val Leu Leu 1 5 10 15 Ala Leu Ser Met Pro Ala Arg Ala Asp Asp Leu Pro Tyr Arg Phe Gly 20 25 30 Leu Gly Lys Ala Asp Ile Thr Gly Glu Ala Ala Glu Val Gly Met Met 35 40 45 Gly Tyr Ser Ser Leu Glu Gln Lys Thr Ala Gly Ile His Met Arg Gln 50 55 60 Trp Ala Arg Ala Phe Val Ile Glu Glu Ala Ala Ser Gly Arg Arg Leu 65 70 75 80 Val Tyr Val Asn Thr Asp Leu Gly Met Thr Phe Gln Ala Val His Leu 85 90 95 Lys Val Leu Ala Arg Leu Lys Ala Lys Tyr Pro Gly Val Tyr Asp Glu 100 105 110 Asn Asn Val Met Leu Ala Ala Thr His Thr His Ser Gly Pro Gly Gly 115 120 125 Phe Ser His Tyr Ala Met Tyr Asn Leu Ser Val Leu Gly Phe Gln Glu 130 135 140 Lys Thr Phe Asn Ala Ile Val Asp Gly Ile Val Arg Ser Ile Glu Arg 145 150 155 160 Ala Gln Ala Arg Leu Gln Pro Gly Arg Leu Phe Tyr Gly Ser Gly Glu 165 170 175 Leu Arg Asn Ala Ser Arg Asn Arg Ser Leu Leu Ser His Leu Lys Asn 180 185 190 Pro Asp Ile Ala Gly Tyr Glu Asp Gly Ile Asp Pro Gln Met Ser Val 195 200 205 Leu Ser Phe Val Asp Ala Asn Gly Glu Leu Ala Gly Ala Ile Ser Trp 210 215 220 Phe Pro Val His Ser Thr Ser Met Thr Asn Ala Asn His Leu Ile Ser 225 230 235 240 Pro Asp Asn Lys Gly Tyr Ala Ser Tyr His Trp Glu His Asp Val Ser 245 250 255 Arg Lys Ser Gly Phe Val Ala Ala Phe Ala Gln Thr Asn Ala Gly Asn 260 265 270 Leu Ser Pro Asn Leu Asn Leu Lys Pro Gly Ser Gly Pro Phe Asp Asn 275 280 285 Glu Phe Asp Asn Thr Arg Glu Ile Gly Leu Arg Gln Phe Ala Lys Ala 290 295 300 Tyr Glu Ile Ala Gly Gln Ala Gln Glu Glu Val Leu Gly Glu Leu Asp 305 310 315 320 Ser Arg Phe Arg Phe Val Asp Phe Thr Arg Leu Pro Ile Arg Pro Glu 325 330 335 Phe Thr Asp Gly Gln Pro Arg Gln Leu Cys Thr Ala Ala Ile Gly Thr 340 345 350 Ser Leu Ala Ala Gly Ser Thr Glu Asp Gly Pro Gly Pro Leu Gly Leu 355 360 365 Glu Glu Gly Asn Asn Pro Phe Leu Ser Ala Leu Gly Gly Leu Leu Thr 370 375 380 Gly Val Pro Pro Gln Glu Leu Val Gln Cys Gln Ala Glu Lys Thr Ile 385 390 395 400 Leu Ala Asp Thr Gly Asn Lys Lys Pro Tyr Pro Trp Thr Pro Thr Val 405 410 415 Leu Pro Ile Gln Met Phe Arg Ile Gly Gln Leu Glu Leu Leu Gly Ala 420 425 430 Pro Ala Glu Phe Thr Val Met Ala Gly Val Arg Ile Arg Arg Ala Val 435 440 445 Gln Ala Ala Ser Glu Ala Ala Gly Ile Arg His Val Val Phe Asn Gly 450 455 460 Tyr Ala Asn Ala Tyr Ala Ser Tyr Val Thr Thr Arg Glu Glu Tyr Ala 465 470 475 480 Ala Gln Glu Tyr Glu Gly Gly Ser Thr Leu Tyr Gly Pro Trp Thr Gln 485 490 495 Ala Ala Tyr Gln Gln Leu Phe Val Asp Met Ala Val Ala Leu Arg Glu 500 505 510 Arg Leu Pro Val Glu Thr Ser Ala Ile Ala Pro Asp Leu Ser Cys Cys 515 520 525 Gln Met Asn Phe Gln Thr Gly Val Val Ala Asp Asp Pro Tyr Ile Gly 530 535 540 Lys Ser Phe Gly Asp Val Leu Gln Gln Pro Arg Glu Ser Tyr Arg Ile 545 550 555 560 Gly Asp Lys Val Thr Val Ala Phe Val Thr Gly His Pro Lys Asn Asp 565 570 575 Leu Arg Thr Glu Lys Thr Phe Leu Glu Val Val Asn Ile Gly Lys Asp 580 585 590 Gly Lys Gln Thr Pro Val Thr Val Ala Thr Asp Asn Asp Trp Asp Thr 595 600 605 Gln Tyr Arg Trp Glu Arg Val Gly Ile Ser Ala Ser Lys Ala Thr Ile 610 615 620 Ser Trp Ser Ile Pro Pro Gly Thr Glu Pro Gly His Tyr Tyr Ile Arg 625 630 635 640 His Tyr Gly Asn Ala Lys Asn Phe Trp Thr Gln Lys Ile Ser Glu Ile 645 650 655 Gly Gly Ser Thr Arg Ser Phe Glu Val Leu Gly Thr Thr Pro 660 665 670 <210> 16 <211> 2013 <212> DNA <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 16 atgtcacgtt ccgcattcac cgcgctcttg ctgtcctgcg tcctgctggc gctctccatg 60 cctgccaggg ccgacgacct gccctaccgc ttcggcctgg gcaaggcgga catcaccggc 120 gaagccgccg aagtcggcat gatgggttac tcctccctcg aacagaagac cgccggcatc 180 cacatgcgcc agtgggcgcg tgccttcgtg atcgaggaag cggccagcgg acgtcgcctg 240 gtctacgtca acaccgacct ggggatgacc ttccaggccg tgcacctgaa ggtcctggcc 300 cggctcaagg cgaagtaccc cggtgtctac gacgagaaca acgtgatgct cgccgccacc 360 cacacccact ccggtccggg cggcttctcc cactacgcga tgtacaacct gtcggtgctc 420 ggcttccagg aaaagacctt caacgccatc gtcgacggca tcgtccgctc catcgagcgg 480 gcccaggcca ggttgcagcc cggccgcctg ttctacggca gcggcgagct gcgcaacgcc 540 agccgcaacc gttcgctgct gtcgcacctg aagaatccgg acatcgccgg ctacgaggat 600 ggcatcgacc cgcagatgag cgtgctcagc ttcgtcgacg ccaacggcga gctggccggc 660 gcgatcagtt ggttcccggt gcacagcacc tcgatgacca acgccaatca cctgatctcc 720 ccggacaaca agggctacgc ctcctatcac tgggagcacg acgtcagccg caagagcggt 780 ttcgtcgccg ccttcgccca gaccaatgcc ggcaacctgt cgcccaacct gaacctgaag 840 cccggctccg gtcccttcga caacgagttc gacaacaccc gcgagatcgg tctgcgccaa 900 ttcgccaagg cctacgagat cgccggccag gcccaggagg aagtgctcgg cgaactggat 960 tcgcgcttcc gtttcgtcga cttcacccgc ctgccgatcc gcccggagtt caccgacggc 1020 cagccgcgcc agttgtgcac cgcggccatc ggcaccagcc tggccgccgg tagcaccgaa 1080 gacggtccag gcccgctggg gctggaggaa ggcaacaatc cgttcctctc ggcccttggc 1140 gggttgctca ccggcgtgcc gccgcaggaa ctggtgcaat gccaggcgga aaagaccatc 1200 ctcgccgaca ccggcaacaa gaaaccctac ccctggacgc cgacggtgct gccgatccag 1260 atgttccgca tcggccagtt ggaactgctc ggcgcccccg ccgagttcac cgtgatggcc 1320 ggggtgcgga tccgccgcgc ggtgcaggcg gccagcgaag cggccggtat ccgccatgtg 1380 gtcttcaatg gctacgcgaa tgcctatgcc agctacgtca ccacccgcga ggaatacgcc 1440 gcccaggaat acgaaggcgg ctcgaccctc tacggcccct ggacccaggc cgcctaccag 1500 cagttgttcg tcgacatggc ggtggcgctg cgcgaacgcc tgccggtgga aacctcggcg 1560 atagcgccgg acctgtcctg ctgccagatg aacttccaga ccggagtagt ggccgatgat 1620 ccctatatcg gcaagtcctt cggcgacgtg ttgcaacaac ccagggaaag ttatcgcatc 1680 ggcgacaagg tgaccgtcgc tttcgtgacc ggacatccga agaatgactt gcgcaccgag 1740 aagactttcc tggaagtggt gaatatcggc aaggatggca aacagacgcc cgtgaccgtt 1800 gccaccgata atgactggga tacccaatac cgctgggaga gagtgggtat atctgcctcg 1860 aaagcgacta tcagctggtc cattccacca gggaccgagc ccggccatta ctacatcagg 1920 cactatggca acgcgaagaa cttctggacc cagaagatca gcgaaatcgg cggctcgacc 1980 cgctccttcg aggtgctcgg caccactccc tag 2013 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 17 ggcttctccc actacgcgat g 21 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 18 cgaattggcg cagaccgatc t 21

Claims (14)

1. 서열표의 서열번호 1 로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드.
2. 제 1 항의 폴리펩티드를 코드하는 유전자.
3. 제 2 항에 있어서, 서열표의 서열번호 2로 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자.
4. 삭제
5. 제 2 항의 유전자를 함유하고 있는 형질전환체.
6. 제 5 항의 형질전환체를 배양하고, 수득된 배양물로 부터 세라미다제 활성을 갖는 폴리펩티드를 채취하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 세라미다제 활성 을 갖는 폴리펩티드의 제조방법.
7. 서열표의 서열번호 17 또는 18의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 프라이머.
8. 제 7 항의 프라이머를 사용하는 것을 특징으로 하는, 세라미다제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 유전자의 검출방법.
9. 제 7 항의 프라이머를 함유하는, 세라미다제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 유전자의 검출용 키트.
10. 제 1 항의 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 그의 단편.
11. 제 10 항의 항체 또는 그의 단편을 사용하는 것을 특징으로 하는 세라미다제 활성을 갖는 폴리펩티드의 검출방법.
12. 제 10 항의 항체 또는 그의 단편을 함유하는, 세라미다제 활성을 갖는 폴리펩티드의 검출용 키트.
13. 삭제
14. 삭제

Images