KR100560002B1 - 허혈 재관류 장해 예방 및 치료제 - Google Patents

허혈 재관류 장해 예방 및 치료제 Download PDF

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Abstract

하기 일반식 (1)
Figure 112000016432325-pct00009
(단 식중, R1, R2, R3 및 R4 는 동일 또는 상이한 수소원자 또는 저급알킬기를 나타내며, R5 는 수소원자, 저급알킬기 또는 저급아실기를 나타내며, X 는 당 잔기 내의 수산기의 수소원자가 저급알킬기 또는 저급아실기로 치환되어도 좋은 단당 잔기 또는 올리고당 잔기를 나타내며, n은 0∼6의 정수이고, m은 1∼6의 정수이다)의 크로마놀 배당체를 유효성분으로 하는 허혈 재관류 장해 예방 및 치료제이다. 안전하며 또한 소용량으로 환부에 효과적으로 작용하여 심장, 위, 소장, 간장, 췌장, 신장, 뇌, 피부, 장기이식 등에 있어서 허혈 재관류 장해를 예방, 치료할 수 있다.
허혈, 재관류장해, 크로마놀 배당체

Description

허혈 재관류 장해 예방 및 치료제 {Preventives and remedies for ischemic reflow disorder}
본 발명은 신규한 허혈 재관류(再灌流) 장해 예방 및 치료제에 관한 것이다. 상세하게는 수용성의 크로마놀 배당체를 유효성분으로 하는 허혈 재관류 장해 예방 및 치료제에 관한 것이다.
인간의 세포나 조직은 장시간에 걸쳐 허혈에 빠지면 위독한 피해를 입고 최종적으로는 세포사에 다다른다. 한편 일정시간의 허혈 재관류에 의해 급격히 산소부하가 가해진 경우에 있어서는 더욱 위독한 장해를 야기할 수 있다. 이러한 허혈 재관류 장해는 임상적으로는 장기이식이나 심근경색에 대한 관혈행 재건술시 볼 수 있는 질환으로서 종래부터 알려져 있지만, 최근 고양이의 소장을 사용한 허혈 재관류에 의한 조직장해에 자유라디칼반응이 관여하고 있다는 사실이 지적된 이래 (Granger, D.N. et.al.: Superoxide radicals in feline intestinal ischemia. Gastroentero1. 22-29, 1981), 이 분야의 연구는 크게 확대되어 소장 뿐 아니라 뇌, 심장, 위, 간장, 신장 등에서도 허혈 재관류 장해와 활성산소·자유라디칼의 관여도 보고되고 있다. 따라서 외인성 라디칼 소거제 투여에 의해 병태가 가벼워지지 않을까하는 관점에서 많은 연구가 진행되고 있지만, 체내 동태 및 반응 장소 등 여 러가지 문제가 있으며, 라디칼 소거제라고 해서 허혈 재관류에 의한 조직장해를 효과적으로 억제할 수 있다는 것은 아니다(一守康史 외: 재관류 장해와 자유라디칼에 관한 문제 제기, J.Act.Oxyg.Free Rad.: 757-766, 1991). 또한 이것은 의약품으로서 라디칼 소거제가 대부분 인가를 받지 못한 현상을 봐도 분명하다.
한편, 본 발명에 쓰이는 크로마놀 배당체는 공지 화합물이다(특개평7-118287호 공보). 해당 크로마놀 배당체는 대표적 비타민 E인 α-토코페롤의 크로만환의 2번 위치의 피틸기를 알코올로 치환하고, 나아가 당을 결합시켜 얻어지는 것으로서 높은 수용성과 우수한 항산화작용을 갖는다. 그러나 해당 크로마놀 배당체를 허혈 재관류 장해의 예방 및 치료에 사용하는 것은 알려져 있지 않다.
본 발명은 상기 종래 기술이 갖는 문제점을 감안하여 이루어진 것으로서, 그 목적은 부작용 없이 소용량으로 효과적으로 작용하여 허혈 재관류에 의해 야기되는 각종 장해를 예방 또는 병태를 개선, 치유할 수 있는 신규의 허혈 재관류 장해 예방 및 치료제를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은, 우수한 항산화작용을 가지며 각종 장기의 허혈 재관류 장해 환부에 있어서 자유라디칼 반응을 효과적으로 억제, 조절할 수 있는 신규의 허혈 재관류 장해 예방 및 치료제를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은, 유효성분을 고농도로 함유하는 수성제제로 할 수 있는 신규의 허혈 재관류 장해 예방 및 치료제를 제공하는 데 있다.
본 발명자들은 허혈 재관류 장해의 예방 및 치료제에 대해 예의 연구를 거듭 한 결과, 상기 크로마놀 배당체가 허혈 재관류 장해의 병변을 극적으로 예방 및 개선하는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
즉 본 발명은, 하기 일반식 (1)
Figure 112000016432325-pct00001
(단 식중, R1, R2, R3 및 R4는 동일 또는 상이한 수소원자 또는 저급알킬기를 나타내며, R5는 수소원자, 저급알킬기 또는 저급아실기를 나타내고, X는 당 잔기내 수산기의 수소원자가 저급알킬기 또는 저급아실기로 치환되어도 좋은 단당 잔기 또는 올리고당 잔기를 나타내며, n은 0∼6의 정수이고, m은 1∼6의 정수이다)의 크로마놀 배당체를 유효성분으로 하는 허혈 재관류 장해 예방 및 치료제이다.
또한 본 발명에 있어서, 상기 크로마놀 배당체는 2-(α-D-글루코피라노실)메틸-2,5,7,8-테트라메틸크로만-6-올인 상기 허혈 재관류 장해 예방 및 치료제이다.
또한 본 발명에 있어서, 상기 허혈 재관류 장해는 소장 점막 장해 또는 뇌 허혈 재관류 장해인 상기 허혈 재관류 장해 예방 및 치료제이다.
본 발명은 또한 수성제제인 상기 허혈 재관류 장해 예방 및 치료제이다.
본 발명의 허혈 재관류 장해 예방 및 치료제는, 상기 일반식 (1)의 크로마놀 배당체가 유효성분인 것을 특징으로 한다.
상기 일반식 (1)에 있어서 R1, R2, R3, R4 및 R5의 저급알킬기로는, 탄소원자수가 1∼8, 바람직하게는 1∼6의 저급알킬기가 좋으며, 예컨대 메틸기, 에틸기, 프로필기, 이소프로필기, 부틸기, 이소부틸기, 펜틸기, 이소펜틸기, 헥실기, 헵틸기, 옥틸기 등을 들 수 있다. 이들 중에서는 메틸기 또는 에틸기가 바람직하다. 또한 R5의 저급아실기로는 탄소원자수가 1∼8, 바람직하게는 1∼6의 저급아실기가 좋으며, 예컨대 포르밀기, 아세틸기, 프로피오닐기, 부티릴기, 이소부티릴기, 발레릴기, 이소발레릴기, 피발로일기, 헥사노일기, 헵타노일기, 옥타노일기 등을 들 수 있다. 이들 중에서는 아세틸기, 프로피오닐기 또는 부티릴기가 바람직하다. 또한 X의 단당 잔기로는 글루코오스, 갈락토오스, 푸코스, 크실로오스, 만노오스, 람노오스, 프락토오스, 아라비노오스, 릭소스, 리보오스, 알로오스, 알트로스, 이도오스, 탈로스, 디옥시리보오스, 2-디옥시리보오스, 퀴노보오스, 아베크오스 등의 당 잔기를 들 수 있다. X의 올리고당 잔기로는 상기 단당이 2∼4개 결합된 것, 예컨대 말토오스, 락토오스, 셀로비오스, 라피노오스, 크실로비오스, 수크로오스의 당 잔기 등을 들 수 있다. 이들 중에서는 글루코오스, 갈락토오스, 푸코스, 크실로오스, 람노오스, 만노오스, 프락토오스 등의 단당 잔기가 바람직하다. 또한 X의 당 잔기 내 수산기의 수소원자는 저급알킬기, 바람직하게는 탄소원자수가 1∼8인 저급알킬기, 또는 저급아실기, 바람직하게는 탄소원자수가 1∼10인 저급아실기로 치환되어도 좋다. 또한 n은 0∼6, 바람직하게는 1∼4의 정수이고, m은 1∼6, 바람직하게는 1∼3의 정수이다. 일 반식 (1)의 크로마놀 배당체의 바람직한 예로는, 2-(α-D-글루코피라노실)메틸-2,5,7,8-테트라메틸크로만-6-올, 2-(β-D-갈락토피라노실)메틸-2,5,7,8-테트라메틸크로만-6-올, 2-(β-L-푸코피라노실)메틸-2,5,7,8-테트라메틸크로만-6-올, 2-(α-L-람노피라노실)메틸-2,5,7,8-테트라메틸크로만-6-올, 2-(β-D-크실로피라노실)메틸-2,5,7,8-테트라메틸크로만-6-올, 2-(β-D-글루코피라노실)메틸-2,5,7,8-테트라메틸크로만-6-올, 2-(β-D-프락토피라노실)메틸-2,5,7,8-테트라메틸크로만-6-올, 2-(α-D-만노피라노실)메틸-2,5,7,8-테트라메틸크로만-6-올 등을 들 수 있다.
본 발명에 사용되는 크로마놀 배당체는, 예컨대 특개평7-118287호 공보에 기재된 방법에 의해, 하기 일반식 (2):
Figure 112000016432325-pct00002
(단 식중, R1, R2, R3, R4, R5 및 n은 상기와 동일하다)의 2-치환 알코올 및 올리고당류, 가용성 전분, 전분 또는 시클로덱스트린을 당 전위작용을 촉매하는 적절한 효소의 존재하에서 반응시켜 2-치환 알코올의 2번 위치의 수산기에 대하여 특이하게 당의 특정 수산기를 결합시킴으로써 이루어지는 효소반응에 의해 제조된다(효소법).
상기 반응에 있어서 원료로서 사용되는 일반식 (2)의 2-치환 알코올(이하, 간 단히「2-치환 알코올」이라고 칭함)은 공지의 물질로서, 예컨대 일본특허공고 평1-43755호 공보나 일본특허공고 평1-49135호 공보 등에 개시된 방법에 의해 얻을 수 있다. 또한 예컨대 일반식 (2) 중 R1, R2, R3 및 R4가 메틸기, R5가 수소원자이고, n이 1인 2-치환 알코올은, 트로록스를 수소화리튬알루미늄의 존재하에 디에틸에테르 중에서 가열환류처리하는 등에 의해 용이하게 얻을 수 있다.
상기 반응에 있어서 사용되는 당 전위작용을 촉매하는 효소는, 해당 반응에 사용하는 당의 종류에 따라 아래와 같이 적절하게 사용하는 것이 바람직하다.
(1) 2-치환 알코올에 α-결합으로 글루코오스잔기를 결합시키는 경우:
(a) 말토오스에서 말토테트라오스 위치의 말토올리고당에 대해서는 α-글루코시다아제(α-glucosidase, EC3.2.1.20)를 작용시키는 것이 바람직하다. α-글루코시다아제로는 거의 모든 기원 유래의 것을 사용할 수 있으며 구체적으로는 도요방적주식회사제의 사카로마이세스속(Saccharomyces sp.) 유래의 α-글루코시다아제, 오리엔탈효모공업주식회사제의 사카로마이세스 셀로비시에(Saccharomyces cerevisiae) 유래의 α-글루코시다아제, 아마노제약주식회사제의 아스페르길루스 니거(Aspergillus niger) 유래의 α-글루코시다아제, 와코쥰야쿠공업주식회사제의 사카로마이세스속(Saccharomyses sp.) 유래의 α-글루코시다아제, 시그마(SIGMA)제 베이커 이스트(Bakers yeast) 유래의 α-글루코시다아제, 바실루스속(Bacillus) 유래의 α-글루코시다아제 등을 들 수 있다.
(b) 가용성 전분 또는 전분에 대해서는 4-α-글루카노트란스페라제(4-α-D-glucanotransferase,EC2.4.1.25)를 작용시키는 것이 바람직하다.
(2) 2-치환 알코올에 α-결합으로 글루코오스 잔기 또는 말토올리고당 잔기를 결합시키는 경우:
말토올리고당, 가용성 전분, 전분 또는 시클로덱스트린(α,β,γ) 등에 대해서는 시클로덱스트린 글루카노트란스페라제(cyclodextrin glucanotransferase, EC 2.4.1.19)를 작용시키는 것이 바람직하다. 대표적인 예로는, 아마노제약주식회사제의 바실루스 마세란스(Bacillus macerans) 유래의 시클로덱스트린 글루카노트란스페라제, 주식회사 하야시바라생물화학연구소제의 바실루스 스테아로서모필루스(Bacillus stearothermophilus) 유래의 시클로덱스트린 글루카노트란스페라제, 그 외에는 바실루스 메가테리움(Baccillus megaterium), 바실루스 서큐란스 ATCC 9995(Bacillus circulans ATCC 9995) 유래의 시클로덱스트린 글루카노트란스페라제 등을 들 수 있다.
(3) 2-치환 알코올에 β-결합으로 글루코스잔기를 결합시키는 경우:
(a) 셀로비오스, 카드란 또는 라미나란 등의 β-결합으로 이루어진 올리고당에 대해서는 β-글루코시다아제(β-glucosidase, EC3.2.1.21)를 작용시키는 것이 바람직하다.
(b) 인산 존재하의 셀로비오스에 대해서는 셀로비오스 포스포리라아제(cellobiose phosphorylase, EC2.4.1.20)를 작용시키는 것이 바람직하다.
(4) 2-치환 알코올에 α-결합으로 갈락토오스잔기를 결합시키는 경우:
(a) 메리비오스 또는 라피노오스 등에 대해서는 α-갈락토시다아제(α- galactosidase, EC3.2.1.22)를 작용시키는 것이 바람직하다.
(5) 2-치환 알코올에 β-결합으로 갈락토오스잔기를 결합시키는 경우:
(a) 락토오스 등에 대해서는 β-갈락토시다아제(β-galactosidase, EC3.2.1.23)를 작용시키는 것이 바람직하다.
(b) 아라비노갈락탄 등에 대해서는 엔도-1,4-β-갈락타나아제(Endo-1,4-β-galactanase, EC3.2.1.89)를 작용시키는 것이 바람직하다.
(6) 2-치환 알코올에 β-결합으로 프락토오스잔기를 결합시키는 경우:
(a) 자당, 라피노오스 또는 메리비오스 등에 대해서는 레반수크라아제(levansucrase, EC2.4.1.10)를 작용시키는 것이 바람직하다.
(b) 자당에 대해서는 β-프룩토푸라노시다아제(β-fructofuranosidase, EC3.2.1.26)를 작용시키는 것이 바람직하다.
(c) 이눌린 등에 대해서는 이눌린프룩토트란스페라제(inulin fructotransferase, EC2.4.1.93)를 작용시키는 것이 바람직하다.
상기 반응에 있어서 반응조건은, 사용하는 크로마놀 배당체나 효소의 종류에 따라 달라지지만, 예컨대 일반식 (1) 중의 m이 1인 크로마놀 배당체를 α-글루코시다아제를 사용하여 합성하는 경우에는, 2-치환 알코올을 당(糖)용액에 용해시키는 것이 바람직하다. 이를 위해서는 유기용매의 첨가가 바람직하며, 예컨대 디메틸술폭시드, N,N-디메틸포름아미드, 메탄올, 에탄올, 아세톤 및 아세토니트릴 등을 들 수 있고, α-글루코시다아제의 전이활성을 높이는 점을 고려하면 디메틸술폭시드나 N,N-디메틸포름아미드가 바람직하게 사용된다. 유기용매의 첨가농도는 1∼50(v/v)% 이고 반응효율을 고려하면 5∼35(v/v)%인 것이 바람직하다.
2-치환 알코올의 농도는 반응액 중에 있어서 포화농도 또는 그에 가까운 농도로 하는 것이 바람직하다. 사용하는 당의 종류는 말토오스에서 말토테트라오스 위치가 저분자인 것이 좋고, 바람직하게는 말토오스이다. 당의 농도는 1∼70(w/v)%, 바람직하게는 30∼60(w/v)%이다. pH는 4.5∼7.5, 바람직하게는 5.0∼6.5이다. 반응온도는 10∼70℃, 바람직하게는 30∼60℃이다. 반응시간은 1∼40시간, 바람직하게는 2∼24시간이다. 단 이들 조건은 사용하는 효소량 등에 의해 영향을 받는 것은 말할 필요도 없다. 반응 종료 후 반응액을 XAD(오가노주식회사)를 담체로서 사용한 칼럼크로마토그래피로 처리함으로써 목적으로 하는 크로마놀 배당체를 고순도로 얻을 수 있다.
또한 예컨대 일반식 (1) 중의 m이 1인 크로마놀 배당체를 시클로덱스트린 글루카노트란스페라제를 사용하여 합성하는 경우의 반응조건으로는, 2-치환 알코올을 당용액에 용해시키는 것이 바람직하다. 이를 위해서는 유기용매의 첨가가 바람직하며, 디메틸술폭시드, N,N-디메틸포름아미드, 메탄올, 에탄올, 아세톤 및 아세토니트릴 등을 들 수 있다. 첨가하는 유기용매의 농도는 1∼50(v/v)%, 바람직하게는 반응효율을 고려하면 5∼35(v/v)%이다. 2-치환 알코올의 농도는 반응액 중에 있어서, 포화농도 또는 그에 근접한 고농도로 하는 것이 바람직하다.
상기 반응에 있어서 사용되는 당의 종류로는, 말토트리오스 이상의 중합도를 가지는 말토올리고당, 가용성전분, 전분 및 시클로덱스트린(α,β,γ) 등을 바람직한 것으로 들 수 있다. 당의 농도는 1∼70(w/v)%, 바람직하게는 5∼50(w/v)%이다. pH는 4.5∼8.5, 바람직하게는 5.0∼7.5이다. 반응온도는 10∼70℃, 바람직하게는 30∼60℃ 이다. 반응시간은 1∼60시간, 바람직하게는 2∼50시간이다. 단 이들 조건은 사용하는 효소량에 의해 영향을 받는다. 이와 같은 반응에 의해 얻어진 크로마놀 배당체는 m의 수가 1에서 8 정도의 혼합물이 된다. 그래서 이 혼합물을 글루코아밀라아제(EC3.2.1.3)를 사용하여 처리함으로써 일반식 (1) 중의 m이 1인 크로마놀 배당체만을 얻을 수 있다. 이 때의 반응온도는 20∼70℃, 바람직하게는 30∼60℃이고, 반응시간은 0.1∼40시간, 바람직하게는 1∼24시간이다. 단, 이들 조건은 사용하는 효소량에 의해 영향을 받는다. 다음에 상기 글루코아밀라아제 처리 후의 액을 XAD(오가노주식회사)를 담체로 사용한 칼럼크로마토그래피처리함으로써 일반식 (1) 중의 m이 1인 크로마놀 배당체를 고순도로 얻을 수 있다.
일반식 (1) 중의 m이 2인 크로마놀 배당체를 얻는 경우에는, 상기와 같은 조건하에서 시클로덱스트린 글루카노트란스페라제에 의해 얻어지는 일반식 (1)에 있어서 m이 1에서 8 정도의 혼합물 형태를 갖는 크로마놀 배당체에 β-아밀라아제(EC3.2.1.2)를 작용시킴으로써, 일반식 (1)에 있어서 m이 1 또는 2인 크로마놀 배당체만 얻어진다. 이 때의 반응온도는 20∼70℃, 바람직하게는 30∼60℃이고, 반응시간은 0.1∼40시간, 바람직하게는 1∼24시간이다. 단 이들 조건은 사용하는 효소량에 의해 영향을 받는다. β-아밀라아제 처리 후의 액은 XAD(오가노주식회사)를 담체로 사용한 칼럼크로마토그래피처리에 의해, 일반식 (1)에 있어서 m이 2인 크로마놀 배당체가 고순도로 얻어짐과 동시에 일반식 (1)에 있어서 m이 1인 크로마놀 배당체도 얻어진다.
일반식 (1)에 있어서 m이 3 이상인 크로마놀 배당체를 얻는 경우에는, 상기와 같은 조건하에서 시클로덱스트린 글루카노트란스페라제에 의해 얻어지는 일반식 (1)에 있어서 m이 1부터 8 정도의 혼합물 형태를 갖는 크로마놀 배당체를, HPLC를 사용한 분취 크로마토그래피 등으로 처리함으로써 고순도의 크로마놀 배당체를 각 m마다 얻을 수 있다.
상기 실시 태양에서는 2-치환 알코올에 글루코오스잔기나 말토올리고당 잔기를 당 잔기로서 결합시키는 경우의 태양을 기재하였지만, 갈락토오스잔기, β-글루코오스잔기, 만노오스잔기, 프락토오스잔기 등을 당 잔기로서 2-치환 알코올에 결합시키는 경우의 태양도 본 발명에서는 바람직하게 사용할 수 있다. 이러한 태양에 있어서는, 상기 당전위작용을 촉매하는 효소의 페이지에서 설명한 적절한 효소를 각각 사용하는 것 외에는 상기 실시 태양과 동일한 조작을 수행함으로써 목적으로 하는 크로마놀 배당체를 고순도로 얻을 수 있다(특개평9-249688호 공보, 특원평9-176174호).
한편 본 발명에 사용되는 크로마놀 배당체는, 특원평10-75599호 공보에 기재된 방법에 의해 상기 2-치환 알코올의 6번 위치의 수산기를 보호기로 보호한 것(이하「당수용체」라 한다)과, 아노머 위치에 이탈기를 도입하고 다른 수산기를 보호기로 보호한 당의 유도체(이하,「당 공여체」라 한다)를 축합반응시키는 방법에 의해서도 제조할 수 있다(유기합성법).
상기 반응에 있어서 사용되는 당 수용체의 6번 위치의 수산기를 보호하는 보호기로는 아세틸기, 벤조일기, 피발로일기, 클로로아세틸기, 레브리노일기, 벤질 기, p-메톡시벤질기, 알릴기, t-부틸디메틸실릴기, t-부틸디페닐실릴기, 트리메틸실릴기 및 트리틸기 등을 들 수 있으며, 특히 아세틸기 및 벤조일기가 바람직하다.
상기 반응에 있어서 사용되는 당 공여체의 아노머 위치에 도입되는 이탈기로는 염소, 브롬 또는 불소 등의 할로겐원자, 티오메틸기, 티오에틸기나 티오페닐기 등의 황화합물 및 트리클로로아세트이미드기 등을 들 수 있고, 특히 브롬, 염소, 티오메틸기, 티오에틸기, 티오페닐기 및 트리클로로아세트이미드기가 바람직하다. 또한 아노머 위치 이외의 수산기를 보호하는 보호기로는 아세틸기, 벤조일기, 피발로일기, 클로로아세틸기 및 레브리노일기 등의 아실계 보호기, 및 벤질기, p-메톡시벤질기, 알릴기, t-부틸디메틸실릴기, t-부틸디페닐실릴기, 트리메틸실릴기 및 트리틸기 등의 에테르계 보호기를 들 수 있으며, 그 중에서도 아실계 보호기, 특히 아세틸기가 바람직하다.
이들 당 공여체는 주지의 방법에 따라 당의 모든 수산기에 보호기를 도입하고, 이어서 아노머 위치를 이탈기로 치환함으로써 용이하게 제조할 수 있다.
상기 당 수용체와 당 공여체의 축합반응에 대해 나타내면, 우선 당 수용체와 당 공여체를 비극성 용매로 용해한다. 당 수용체와 당 공여체의 주입량은, 당 수용체에 대한 당 공여체의 몰비가 1.0∼1.5, 바람직하게는 1.1∼1.3이 좋다. 비극성 용매로는 염화메틸렌, 벤젠 등을 들 수 있다.
다음에, 무수 조건하에서 활성화제의 존재하에 당 공여체 및 당 수용체의 축합반응을 실시한다. 활성화제로는 삼불화붕산·에테르착체, 과염소산은, 트리플루오로메탄술폰산은, 브롬화수은, 시안화수은, N-요오도호박산이미드-트리플루오로메탄 술폰산, 디메틸메틸티오설포늄트리플라트, p-톨루엔술폰산 등을 들 수 있으며, 특히 브롬을 당 유도체의 이탈기로서 사용한 경우에는 과염소산은 등의 중금속염을 사용하는 것이 바람직하다. 반응온도는 5∼30℃, 바람직하게는 10∼25℃가 좋으며, 반응시간은 12∼48시간, 바람직하게는 20∼30시간이 좋다.
다음으로, 얻어진 반응물을 실리카겔 칼럼크로마토그래피 등으로 정제하고 보호기를 수산화나트륨 및 메탄올성 염산 등으로 탈보호함으로써 2-(β-L-푸코피라노실)메틸-2,5,7,8-테트라메틸크로만-6-올, 2-(α-L-람노피라노실)메틸-2,5,7,8-테트라메틸크로만-6-올, 2-(β-D-크실로피라노실)메틸-2,5,7,8-테트라메틸크로만-6-올 등을 얻을 수 있다(특원평10-75599호).
상기 효소법 또는 유기합성법에 의해 얻어진 크로마놀 배당체는, 일반적으로 매우 높은 수용성(약 1OOg/1OO㎖)을 가지며 또한 유용성(油溶性)도 풍부한(옥탄올/수계 분배계수 > 3) 양친매성 분자이다. 다시 말하면 본 발명에 따른 크로마놀 배당체는, 높은 지질친화성을 갖춘 수용성 비타민 E라고 할 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 크로마놀 배당체는, 종래 물에 불용성 또는 난용성인 비타민 E 유도체와는 달리, 물에 용해하여 사용해도 높은 지질친화성을 유지하기 때문에 세포막을 투과하여 세포내로도 더 들어갈 수 있으며, 생체내의 항산화 방어계를 보강하고, 허혈 재관류 장해의 환부에 있어서 활성산소 및 자유라디칼을 효과적으로 억제, 조절하여 허혈 재관류 장해를 예방하며, 또한 허혈 재관류 장해의 병태를 비약적으로 개선시킨다. 또한 상기 반응에 의해 얻어진 크로마놀 배당체는, 열안정성 및 pH 안정성에 관해서도 토코페롤, 트로록스 또는 2-치환 알코올에 비해 현저히 향상된 것이다.
본 발명의 허혈 재관류 장해의 예방 및 치료제는, 상기 크로마놀 배당체를 제약상 허용되는 담체와 배합한 또는 제약상 허용되는 용제에 용해 또는 현탁한 조성물로서, 경구적 또는 비경구적으로 환자에게 투여할 수 있다.
본 제제를 경구 투여용으로 사용하는 경우에는, 상기 크로마놀 배당체를 적당한 첨가제, 예컨대 유당, 자당, 만니톨, 옥수수 전분, 합성 또는 천연고무, 결정셀룰로오스의 부형제, 전분, 셀룰로오스 유도체, 아라비아고무, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등의 결합제, 카르복시메틸셀룰로오스칼슘, 카르복시메틸셀룰로오스나트륨, 전분, 콘 스타치, 알긴산나트륨 등의 붕해제, 탈크, 스테아린산마그네슘, 스테아린산나트륨 등의 활택제, 탄산칼슘, 탄산나트륨, 인산칼슘, 인산나트륨 등의 충전제 또는 희석제 등과 적절히 혼합하여 정제, 산제(분말), 환제 및 과립제 등의 고형제제로 할 수 있다. 또한 경질 또는 연질 젤라틴캡슐 등을 사용하여 캡슐제로 해도 좋다. 이들 고형 제제에는 히드록시프로필메틸셀룰로오스프탈레이트, 히드록시프로필메틸셀룰로오스아세테이트숙시네이트, 셀룰로오스아세테이트프탈레이트, 메타아크릴레이트폴리머 등의 피복용 기제를 사용하여 장용성 피복을 해도 좋다. 나아가 상기 크로마놀 배당체를 정제수 등의 일반적으로 사용되는 불활성 희석제에 용해하고, 필요에 따라 이 용액에 침윤제, 유화제, 분산조제, 계면활성제, 감미료, 향미제, 방향물질 등을 적절히 첨가하여 시럽제, 엘릭실제 등의 액상 제제로 할 수도 있다.
또한 본 발명의 허혈 재관류 장해의 예방 및 치료제를 비경구 투여용으로 하는 경우에는 상기 크로마놀 배당체를 정제수, 인산 완충액 등의 적당한 완충액, 생리적 식염수, 링거용액, 로크용액 등의 생리적 염류용액, 에탄올, 글리세린 및 통상 사용되는 계면활성제 등과 적당히 조합한 멸균된 수용액, 비수용액, 현탁액, 리포좀 또는 에멀젼으로서 바람직하게는 주사용 주입용 또는 분무용 멸균 수용액으로서 정맥내, 피하, 근육내, 복강내, 장내, 기관지내 등에 투여된다. 이 때 액상 제제는 생리학적인 pH, 바람직하게는 6∼8의 범위내의 pH를 갖는 것이 바람직하다. 더욱이 본 발명의 허혈 재관류 장해의 예방 및 치료제는, 펠릿에 의한 매립 또는 좌약용 기제를 사용한 좌약으로서 투여되는 것도 가능하다.
상술한 내용 중에서 바람직한 제제나 투여 형태 등은 담당 의사에 의해 선택된다.
본 발명의 허혈 재관류 장해의 예방 및 치료제에 포함되는 크로마놀 배당체의 농도는 투여형태, 질병의 종류나 위독한 정도 또는 목적으로 하는 투여량 등에 따라 다양하지만, 일반적으로는 원료의 전중량에 대하여 O.1∼100중량%, 바람직하게는 1∼90중량%이다. 특히 본 발명의 제제가 경구 투여되는 경우에는 원료의 전중량에 대하여 1∼100중량%, 바람직하게는 5∼90중량%이고, 비경구 투여되는 경우에는 원료의 전용량에 대하여 0.1∼90용량%, 바람직하게는 1∼80용량%인 것이 바람직하다. 이 때 크로마놀 배당체의 농도가 상기 상한치를 넘으면 과잉 투여량에 어울리는 병태 개선효과를 얻을 수 없으며 상기 하한치 미만이면 병태 개선효과를 충분히 기대할 수 없어 어느 쪽도 바람직하지 않다.
본 발명의 허혈 재관류 장해의 예방 및 치료제의 상기 투여량은 환자의 연령, 체중 및 증상, 목적으로 하는 투여 형태나 방법, 치료 효과 및 처치 기간 등에 따라 다르며, 정확한 양은 의사에 의해 결정되지만 통상 본 제제가 경구 투여되는 경우에는 크로마놀 배당체의 투여량 환산으로 O.1∼1OOOOmg/kg체중/일의 투여량 범위로서 1일 1∼3회에 나누어 투여된다. 이 때 1일당 경구 투여량이 많은 경우에는 1회에 여러개의 정제 등의 제제를 투여해도 좋다. 또한 본 발명의 허혈 재관류 장해의 예방 및 치료제를 비경구 투여하는 경우에는 크로마놀 배당체의 투여량 환산으로 O.O1∼1OOOmg/kg체중/일의 투여량이 되도록 1일 1∼3회에 나누어 투여된다.
본 발명의 허혈 재관류 장해의 예방 및 치료제는, 허혈 재관류에 의해 야기되는 심장, 위, 소장, 간장, 췌장, 신장, 뇌, 안구, 피부 등 각 부위의 장해나 장기이식 등에 있어서 각종 장해의 예방 및 치료에 사용할 수 있다. 구체적으로는 뇌허혈 재관류 장해나 심근허혈 재관류 장해 등 뇌경색, 심근경색, 폐경색 등의 각종 경색에 있어서 관혈행 재건시, 심폐 바이패스 형성술시, 장기 이식시 등에 있어서 발생하는 장해, 소장 점막 장해 등의 스트레스 등에 기인하는 소화관 점막이나 안구 표면 등의 미세한 순환 장해 등이 포함된다. 상기 뇌허혈 재관류 장해에는 허혈성 뇌부종 등이 포함되고, 상기 심근 허혈 재관류 장해에는 관동맥 경련(spasm)의 해제나 혈전 융해에 의한 혈류 재개통 후에 볼 수 있는 심실성 부정맥, 경색조직 내 출혈에 의한 심파열, 심장 수술시 우연히 마주치는 인공 심폐 이탈 후의 심기능 회복 부전이나 스턴 심근(stunned myocardium) 등이 포함된다.
약리시험
다음에 본 발명의 허혈 재관류 장해의 예방 및 치료제의 약리효과를, 동물을 사용한 약리시험에 의해 더욱 상세하게 설명한다.
각 약리시험에 있어서는, 크로마놀 배당체로서 특개평7-118287호 공보의 실시예 1에 기재된 방법으로 제조한 하기 식 (3)의 2-(α-D-글루코피라노실)메틸-2,5,7,8-테트라메틸크로만-6-올(TMG)을 사용했다.
Figure 112000016432325-pct00003

[소장 허혈 재관류 장해모델에 의한 병변 억제 효과]
랫트의 복강 동맥을 묶고, 동시에 위장 간막 동맥 혈류를 클립으로 30분간 차단하고, 60분간 재관류 후에 소장의 점막 장해를 평가하는 소장 허혈 재관류 장해 모델을 작성하였다. 소장의 점막 병변이 발생하면 소장 관강으로의 출혈, 단백누출이나 점막중 티오바르비투르산(TBA) 반응물질(지질과산화의 지표)의 증가가 인식된다. 이들 물질을 지표로 같은 모델을 사용하여 크로마놀 배당체에 의한 허혈 재관류 장해의 병변 억제 효과를 조사하였다.
SD계 웅성 랫트(체중180∼200g)를 1군 6마리로 하여 18시간 절식후 사용하였다. 우레탄 마취하(1OOOmg/kg)에 한가운데를 개복하여, 복강 동맥을 묶은 후 위장 간막 동맥근부의 혈류를 클립으로 차단하여 허혈 상태를 만들었다. 30분 후 TMG를 생리식염수 내에 0.8mg/㎖의 농도로 완전히 용해하여 조정한 TMG 제제 4mg/kg 체중을 정맥주사로 투여하고, 이어서 클립을 제거하여 재관류하였다. 재관류 60분 후 대동맥에서 혈액을 빼내어 도살하고 소장을 적출하여 소장 관강 누출 헤모글로빈 및 누출 단백 그리고 소장 점막내 TBA 반응물질을 정량하였다.
이들 결과를, 허혈 재관류처리 및 TMG 제제 투여를 하지 않은 정상군 및 허혈후 재관류 전에 TMG 제제 대신에 생리식염수를 동량씩 정맥주사로 투여한 대조군의 결과와 함께 표 1에 나타낸다. 또 상기 평가항목은 이하의 방법에 의해 측정하였다.
(1) 소장 관강 누출 헤모글로빈 및 누출 단백 측정법
허혈 재관류 소장 점막 장해의 지표로서, 소장 관강내로의 누출 헤모글로빈 및 누출 단백을 측정하였다. 회장 말단으로부터 5cm 떨어진 부위에서 입쪽 30cm 부분의 소장을 적출하여 차가운 생리식염수 10㎖로 입쪽에서 소장 관강내를 세척, 회수한 세척액을 측정에 제공했다. 누출 헤모글로빈은 시안메트헤모글로빈법 (Canhan,R.K.: Am.J.Clin.Path., 44, 207-210, 1965)에 의해 헤모글로빈 측정용 키트(헤모글로빈-테스트와코, 와코쥰야쿠공업주식회사제)를 사용하여 측정하였다. 즉 발색시약 5㎖(0.78mM 시안화칼륨 + 0.61mM 페리시안화칼륨)에 장관 세척액 0.2㎖를 혼합한 후, 실온에서 5분간 방치하고 파장 540nm에서 분광광도계(JASCO Ubest-30,UV/VIS Spectrophotometer, 쟈스코엔지니어링주식회사제)로 흡광도를 측정하였다. 시안메트헤모글로빈표준액(헤모글로빈 18g/dl + 3.1mM 시안화칼륨 + 0.61mM 페리시안화칼륨)에서 미리 얻어진 검량선에서 세척액 중의 헤모글로빈량을 산출하고 소장의 단위 길이당 헤모글로빈량으로서 나타냈다. 또한 누출단백은 로우리법 (Lowry,O.H.: J.Biol.Chem., 193, 265-275, 1951)에 의해 단백정량키트(Sigma Chemical Co. Ltd.제)를 사용하여 측정하였다.
(2) 소장 점막내 TBA 반응물질 측정법
오가와법에 의해 측정한(Ohkawa, H.Anal.: Biochem., 95, 351-358, 1979). 회장 말단으로부터 5cm 떨어진 부위에서 입쪽 1Ocm 부분의 소장을 적출하고 장축방향으로 절개 후 슬라이드글라스 2장에 의해 점막을 박리하였다. 10mM 인산완충액-30mM 염화칼륨용액으로 10배(중량%)로 희석 균질화하고(Pyrex 10㎖ 균질기용 글라스, Digital H omogenizer 1OOOrpm, 이우찌하네이도주식회사), 그 중 O.2㎖에 증류수 0.6㎖ 및 8.1% 나트륨디설페이트 0.2㎖를 가하고 pH 3.5의 20% 인산완충액 1.5㎖, 0.8% TBA 1.5㎖ 및 1% BHT 40㎕을 가하여 오일배스(OH-50P, 타이테크주식회사제)로 95℃에서 1시간 가열한 후 10분간 냉각하였다. 또한 증류수 1.O㎖ 및 부탄올-피리딘(부탄올:피리딘=15:1,v/v) 5.0㎖를 가하여 교반하고 실온으로 원심분리 후(1500g,10분) 얻어진 상청을 파장 535㎚에서 분광광도계(JASCO Ubest-30, UV/VIS Spectrophotometer, 쟈스코엔지니어링주식회사제)로 흡광도를 측정하였다. 소장 점막 균질화액 0.2㎖ 및 증류수 0.6㎖ 대신에 증류수 0.8㎖로 한 것을 블랭크, 증류수 0.3㎖ 및 TEP 0.5㎖로 한 것을 표준으로 하여 양자로부터 검량선을 얻어 검체의 TBA 반응물질을 측정하였다.
소장관강내 누출 헤모글로빈(㎎/㎝) 소장관강내 누출 단백(㎍/㎝) 소장점막내 TBA반응 물질(nmol/g습중량)
정상군 0.5±0.4 0.3±0.1 57.1±9.3
대조군 3.4±1.5 1.6±0.3 285.6±105.7
TMG투여군 (4㎎/㎏) i.v. 0.4±0.3** 0.5±0.1** 112.8±33.6*

결과는 평균치±표준오차
유의차 검정은 일원분산분석을 실시하고, 유의인 경우는 쉐페(Scheffe)의 다중검정에 의해 실행하였다.
* 대조군에 대한 유의차 있음(P < 0.05)
** 대조군에 대한 유의차 있음(P < 0.01)
표 1에서 알 수 있듯이, 허혈 재관류 장해모델(대조군)에서는 소장관강으로의 출혈, 단백누출 및 점막중 TBA 반응물질의 증가가 인식되지만, TMG 제제 투여군에서는 이들이 유의할 정도로 억제되어 있으며, 본 발명의 허혈 재관류 장해 예방 및 치료제는 허혈 재관류에 의해 야기되는 소장의 점막장해를 현저히 억제한다는 것을 알았다.
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[뇌허혈 재관류 장해모델에 의한 병변 억제 효과]
랫트를 사용한 뇌허혈 재관류 모델로서 4혈관 폐색모델(뇌신경, 47권, 369-375페이지, 1995년)을 사용하여 5분간 뇌를 허혈시킨 후, 120분간의 재관류를 함으로써 뇌허혈 재관류 장해모델을 만들었다. 허혈 재관류의 결과, 뇌실질의 세포내 및 세포 외강, 경우에 따라서는 그 양쪽에 이상한 수분량의 저류, 증가를 초래하는 병태인 뇌부종의 발생이 인식된다. 뇌부종을 지표로 동 모델을 사용하여 크로마놀 배당체에 의한 뇌허혈 재관류 장해의 병변억제효과를 조사하였다.
위스터(Wister)계 웅성 랫트(체중 250∼300g)를 1군 6마리로서 실험에 사용했 다. 마취는 추골 동맥 폐색을 시행할 때에는 포수클로랄(360mg/kg)을 복강내 투여하였다. 실험중 쥐의 체온은 웜 매트(warm mat), 웜 랩(warm rap)을 사용하여 직장 온도를 37℃로 유지하였다.
랫트의 배를 바닥으로 하여 랫트 고정기에 두부를 고정, 후경부를 약 2cm 한가운데를 절개하였다. 여기서 현미경(Nagashima Medical Instrument Co.Ltd, Japan)을 사용하여 제2경추 부위에서 양측 후두직근을 박리하여 좌우의 추골 동맥을 확인하고, 결합조직에서 각각 박리하여 노출시켰다. 정밀수술(microsurgery)용 양극 응고제(bipolar coagulator)를 사용하여 선택적으로 제2경추의 부위에서 좌우 각각의 추골 동맥을 전기 응고시켰다. 나아가 정밀수술용 가위를 사용하여 응고 부위를 절단하고, 절단면을 전기 응고시킴으로써 추골 동맥을 확실히 폐색할 수 있었다. 견사로 피부를 봉합하여 추골 동맥의 처리를 마쳤다. 다음에 랫트의 등을 바닥으로 하여 전경부 한가운데를 약 2㎝ 세로 절개 후, 마찬가지로 현미경하에서 양측 총경동맥을 노출·박리하고 견사를 좌우 총경동맥에 걸쳐 창부(創部)에 수납하여 수술용 스테이플로 창부를 폐쇄하였다. 수술 다음날, 전경 창부의 수술용 스테이플을 제거하고 수납해 놓은 견사를 가볍게 끌어 올리며, 총경동맥에 수기타(Sugita)의 뇌동맥 조임용 클립(No.52)을 사용하여 양측 총경동맥을 좌우 각각 폐색하여 4혈관 폐색모델로 하였다.
양측 총경동맥 폐색시간을 5분으로 하여 전뇌 허혈을 부여하고, 재관류 직전 TMG를 생리식염수 중에 1.5mg/㎖의 농도로 완전히 용해하여 제조한 TMG 제제 4mg/kg체중을 정맥주사로 투여하고 총경동맥의 클립을 떼어 재관류하였다. 재관류 120분 후 바로 머리를 잘라 양측 대뇌반구를 재빨리 채취하여 습중량을 측정하였다. 이어서 건조기에서 100℃, 48시간 건조시켜 뇌중량을 측정하여 건조전 중량과의 차를 수분량으로서 구하였다. 그리고 건조전의 뇌중량에 대한 수분량의 비(뇌함수 비율)를 구하였다.
이 결과를 허혈후 재관류 직전에 TMG제제 대신에 생리식염수를 동량 정맥주사로 투여한 대조군의 결과와 함께 표 2에 나타낸다.
뇌함수비율(%)
대조군 78.66±0.51
TMG투여군(4㎎/㎏체중) 78.05±0.28*

결과는 평균치±표준편차
유의차 검정은 스튜던트(student) t-검정에 의해 실행했다.
* 대조군에 대한 유의차 있음(P<0.05)
표 2에서 알 수 있듯이 TMG 투여군에 의해 뇌 함수 비율은 유의할 정도로 억제되어 있다는 것을 알 수 있다.
급성 독성시험
본 발명의 혈관 장해성 뇌부종 예방 및 치료제에 대해 급성 독성시험을 하여 그 안전성을 확인하였다. 4∼5주된 ICR계 마우스를 1군 3마리로 하여 사용하고 크로마놀 배당체로서 상기와 같은 TMG를 5% 아라비아고무액에 현탁한 후, TMG 환산으로 500mg/kg을 경구 투여하여 1주간 관찰하였다. 이 때 대조군으로서 5% 아라비아고무액을 0.3㎖ 경구 투여하였다. 그 결과 어느 투여군에서도 마우스의 사망예는 인식되지 않았다.
제제예
[제제예 1]
TMG 100g, 유당 800g 및 옥수수 전분 100g을 블렌더로 혼합하여 산제를 얻었다.
[제제예 2]
TMG 100g, 유당 450g 및 저치환도 히드록시프로필셀룰로오스 10Og을 혼합한 후 10% 히드록시프로필셀룰로오스 수용액 350g을 더하여 혼련하였다. 이것을 압출하고 조립기(造粒機)를 사용하여 조립, 건조하여 과립제를 얻었다.
[제제예 3]
TMG 100g, 유당 550g, 옥수수 전분 215g, 결정셀룰로오스 130g 및 스테아린산 마그네슘 5g을 블렌더로 혼합한 후 정제기로 타정하여 정제를 얻었다.
[제제예 4]
TMG 10g, 유당 110g, 옥수수 전분 58g 및 스테아린산마그네슘 2g을 V형 혼합기를 사용하여 혼합한 후 3호 캡슐에 180mg씩 충전하여 캡슐제를 얻었다.
[제제예 5]
TMG 200mg 및 글루코오스 100mg을 정제수 2㎖에 용해한 후 여과하고 여액을 2㎖ 앰플에 분주, 봉입한 후 멸균하여 주사제를 얻었다.
상술한 바와 같이 본 발명의 허혈 재관류 장해 예방 및 치료제는 크로마놀 배당체를 유효성분으로 하기 때문에 생체내의 항산화 방어계를 보강하고 허혈 재관류 장해의 환부에 있어서 활성산소 및 자유라디칼을 효과적으로 억제, 조절하여 허혈 재관류 장해에 있어서의 병변을 현저히 억제하여 병태를 비약적으로 개선할 수 있다.
또한 본 발명은 높은 수용성을 갖는 크로마놀 배당체를 유효성분으로 하기 때문에 고형제제로서 사용하는 것 외에 유효성분을 고농도로 함유하는 수성제제로 할 수 있으며 소용량으로 환부에 효과적으로 작용하여 허혈 재관류 장해를 예방, 치료하는 것이 가능함과 동시에 부작용이 없기 때문에 매우 안전하게 사용할 수 있다.
본 발명의 허혈 재관류 장해의 예방 및 치료제는, 허혈 재관류에 의해 야기되는 심장, 위, 소장, 간장, 췌장, 신장, 뇌, 안구, 피부 등 각 부위의 장해나 장기이식 등에 있어서 장해 등의 예방 및 치료에 사용할 수 있다.

Claims (4)

  1. 하기 일반식 (1)
    Figure 112005052565192-pct00008
    (단, 식 중, R1, R2, R3 및 R4는 동일 또는 상이한 수소 원자 또는 저급알킬기를 나타내며, R5는 수소 원자를 나타내고, X는 당 잔기 내의 수산기의 수소 원자가 저급알킬기 또는 저급아실기로 치환되어도 좋은 단당 잔기를 나타내며, n은 0∼3의 정수이고, m은 1∼3의 정수이다)의 크로마놀 배당체를 유효성분으로 하는 허혈 재관류 장해 예방 및 치료제.
  2. 제1항에 있어서, 상기 크로마놀 배당체는 2-(α-D-글루코피라노실)메틸-2,5,7,8-테트라메틸크로만-6-올인 허혈 재관류 장해 예방 및 치료제.
  3. 제1항에 있어서, 상기 허혈 재관류 장해가 소장 점막 장해 또는 뇌 허혈 재관류 장해인 허혈 재관류 장해 예방 및 치료제.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 수성 제제인 허혈 재관류 장해 예방 및 치료제.
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