JP3550412B2 - 新規なクロマノール配糖体およびその製造方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、新規なクロマノール配糖体およびその製造方法に関するものである。詳しく述べると、２−置換アルコールに糖を結合させることによる化学的安定性に優れた新規な水溶性抗酸化剤およびその製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
古くより過酸化脂質の生成は食品などの品質劣化の原因として知られていたが、最近では生体においても動脈硬化、老化、癌など様々な疾病に関連していることが明らかになってきている。そこで、活性酸素などによって引き起こされる過酸化脂質の生成を抑えるための抗酸化剤の開発は、食品ばかりではなく化粧品、医薬品など多くの分野において注目を集めている。
【０００３】
天然に存在する抗酸化剤としてはトコフェロール類、没食子酸、アスコルビン酸、グルタチオン、β−カロテンなどが知られており、また食品に添加して油脂の酸化を防止する目的で合成されたブチルヒドロキシアニソールやブチルヒドロキシトルエンなども抗酸化剤として知られている。
【０００４】
これら抗酸化剤のなかにおいて、特にトコフェロール類のその優れた抗酸化活性は注目を集め、食品、化粧品、医薬品分野において多用されている。また、トコフェロールの優れた抗酸化活性はクロマン環に起因していることより、トコフェロールの２位のイソプレノイド側鎖をカルボキシル基に置換した６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸（以下、トロロックス）等は商品として知られており、また、その他にも２−置換アルコール等が知られている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、トコフェロール類は、水に不溶な粘性油状物のため注射剤または内服液等の溶液剤としての利用は不可能である。また、トロロックス、２−置換アルコールも水に対する溶解性は非常に低い。
【０００６】
これら化合物を水溶性にするためには（ａ）界面活性剤の添加、（ｂ）シクロデキストリンによる包括、（ｃ）水溶性化合物を用いた化学修飾（エステル化）等の方法が考えられるが、（ａ）および（ｂ）の場合には、かなりの量の界面活性剤またはシクロデキストリンが必要となり、本来不用な物の多量の混入が問題となる。また、これらの方法では十分な水溶性が得られていないのが現状である（特開昭６１−２１１８４号、特開昭６２−２８１８５５号、特開昭６２−２２６９７５号、特開昭６０−１１６６４３号、特公昭４１−５１１８号等）。また、（ｃ）の方法の６位のフェノール性水酸基を水溶性化合物で修飾する方法では、抗酸化活性を著しく減少させることになる。また、別の問題として、トコフェロールおよびクロマン環をもつ化合物等は熱およびアルカリなどに対して不安定であるなどの欠点も持っている。
【０００７】
したがって、本発明の目的は、優れた抗酸化活性を有するクロマン環を利用して溶液剤としても使用可能で、かつ化学的安定性にも優れた新規な水溶性抗酸化剤であるクロマノール配糖体およびその製造方法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上記目的は、一般式（１）
【０００９】
【化５】
【００１０】
（ただし、式中、Ｒ１ ，Ｒ２ ，Ｒ３ およびＲ４ は同一または異なる水素原子または低級アルキル基、Ｒ５ は水素原子、低級アルキル基または低級アシル基、Ｘは単糖残基またはオリゴ糖残基であり、糖残基の水酸基の水素原子は低級アルキル基または低級アシル基で置換されていてもよく、ｎは０〜４の整数を表わし、またｍは１〜６の整数を表わす）で表わされるクロマノール配糖体により達成される。
【００１１】
上記目的は、一般式（２）
【００１２】
【化６】
【００１３】
（ただし、式中、Ｒ１ ，Ｒ２ ，Ｒ３ およびＲ４ は同一または異なる水素原子または低級アルキル基、Ｒ５ は水素原子、低級アルキル基または低級アシル基を表わし、またｎは０〜４の整数を表わす）で表わされる２−置換アルコールと、オリゴ糖類、可溶性澱粉、澱粉またはシクロデキストリンを、相当する糖転位作用を触媒する酵素の存在下に反応させることを特徴とする一般式（１）
【００１４】
【化７】
【００１５】
（ただし、Ｒ１ ，Ｒ２ ，Ｒ３ ，Ｒ４ ，Ｒ５ ，Ｘおよびｎは前記定義のとおりであり、またｍは１〜６の整数である）で表わされるクロマノール配糖体の製造方法によっても達成される。
【００１６】
上記目的は、一般式（１）
【００１７】
【化８】
【００１８】
（ただし、式中、Ｒ１ ，Ｒ２ ，Ｒ３ およびＲ４ は同一または異なる水素原子または低級アルキル基、Ｒ５ は水素原子、低級アルキル基または低級アシル基、Ｘは単糖残基またはオリゴ糖残基であり、糖残基の水酸基の水素原子は低級アルキル基または低級アシル基で置換されていてもよく、ｎは０〜４の整数を表わし、またｍは１〜６の整数を表わす）で表わされるクロマノール配糖体を有効成分とする抗酸化剤によっても達成される。
【００１９】
一般的に、配糖化された物質は配糖化前の物に比べると、（１）水に対する溶解度の向上、（２）化学的な安定性の向上、（３）味質、生理活性の改変、増大が可能など様々な利点が挙げられており、配糖化が生理活性物質などの性状、物性を高める有用な手段の一つであると考えられている。本発明者らは、クロマン環を保持した水溶性抗酸化剤を開発するため、２−置換アルコール（一般式（２））の２−位の水酸基に糖を結合させた全く知られていない新規な配糖体（一般式（１））を考え出した。
【００２０】
【作用】
本発明に用いる２−置換アルコール（一般式（２））は公知の物質であり、特公平１−４３７５５号、特公平１−４９１３５号等の方法により、得ることができる。また２−置換アルコール（一般式（２）、Ｒ１ ＝Ｒ２ ＝Ｒ３ ＝Ｒ４ ＝ＣＨ３ 、Ｒ５ ＝Ｈ、ｎ＝１）はトロロックスを水素化リチウムアルミニウムの存在下においてジエチルエーテル中で加熱還流処理することなどにより容易に得ることができる。
【００２１】
この配糖体の合成を行うことに当たって、２−置換アルコール（一般式（２））の２−位の水酸基に対してのみ特異的に糖の特定の水酸基を結合させることは化学的合成法では困難である。本発明者らは酵素を用いることにより、非常に効率よく目的のクロマノール配糖体（一般式（１））を簡単に合成させうる方法を発見した。そして得られた新規なクロマノール配糖体の水溶性、安定性の著しい向上また水溶性抗酸化剤としての優れた活性を確認し本研究を完成するに至った。
【００２２】
酵素としては反応に用いる糖の種類によって使い分けることが好ましい。
【００２３】
（１）２−置換アルコールにα結合でグルコース残基を結合させる場合
（ａ）マルトースからマルトテトラオース位のマルトオリゴ糖に対してはα−グルコシダーゼ（α−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ， ＥＣ ３．２．１．２０）を作用させることが望ましい。α−グルコシダーゼとしては、ほぼ全ての起源由来のものを用いることができ、例えば、東洋紡株式会社製のサッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）由来のα−グルコシダーゼ、オリエンタル酵母工業株式会社製のサッカロマイセス セロビイシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のα−グルコシダーゼ、天野製薬株式会社製のアスペルギルス ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）由来のα−グルコシダーゼ、和光純薬工業株式会社製のサッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｓｅｓ ｓｐ．）由来のα−グルコシダーゼ、シグマ（ＳＩＧＭＡ）製のベーカー イースト（Ｂａｋｅｒｓ ｙｅａｓｔ）由来のα−グルコシダーゼ、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属由来のα−グルコシダーゼ等が挙げられる。
【００２４】
（ｂ）可溶性澱粉、澱粉に対しては４−α−グルカノトランスフェラーゼ（４−α−Ｄ−ｇｌｕｃａｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ， ＥＣ ２．４．１．２５）を作用させることが望ましい。
【００２５】
（２）２−置換アルコールにα結合でグルコース残基またはマルトオリゴ糖残基を結合させる場合
マルトオリゴ糖、可溶性澱粉、澱粉またはシクロデキストリン（α、β、γ）などに対してはシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ（ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ ｇｌｕｃａｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ， ＥＣ ２．４．１．１９）を作用させることが望ましい。例えば、天野製薬株式会社製のバチルス マセランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｅｒａｎｓ）由来のシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ、株式会社林原生物化学研究所製のバチルス ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ、その他にはバチルス メガテリウム（Ｂａｃｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス サーキュランス ＡＴＣＣ ９９９５（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓＡＴＣＣ ９９９５）由来のシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼなどが挙げられる。
【００２６】
（３）２−置換アルコールにβ結合でグルコース残基を結合させる場合
（ａ）セロビオース、カードラン、ラミナランなどのβ結合よりなるオリゴ糖に対してはβ−グルコシダーゼ（β−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ， ＥＣ ３．２．１．２１）を作用させることが望ましい。
【００２７】
（ｂ）リン酸存在下のセロビオースに対してはセロビオース ホスホリラーゼ（ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ， ＥＣ ２．４．１．２０）を作用させることが望ましい。
【００２８】
（４）２−置換アルコールにα結合でガラクトース残基を結合させる場合
（ａ）メリビオース、ラフィノースなどに対してはα−ガラクトシダーゼ（α−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ， ＥＣ ３．２．１．２２）を作用させることが望ましい。
【００２９】
（５）２−置換アルコールにβ結合でガラクトース残基を結合させる場合
（ａ）ラクトースなどに対してはβ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ， ＥＣ ３．２．１．２３）を作用させることが望ましい。
【００３０】
（ｂ）アラビノガラクタンなどに対してはエンド−１，４−β−ガラクタナーゼ（Ｅｎｄｏ−１，４−β−ｇａｌａｃｔａｎａｓｅ， ＥＣ ３．２．１．８９）を作用させることが望ましい。。
【００３１】
（６）２−置換アルコールにβ結合でフラクトース残基を結合させる場合
（ａ）ショ糖、ラフィノース、メリビオースなどに対してはレバンシュークラーゼ（ｌｅｖａｎｓｕｃｒａｓｅ， ＥＣ ２．４．１．１０）を作用させることが望ましい。
【００３２】
（ｂ）ショ糖に対してはβ−フルクトフラノシダーゼ（β−ｆｒｕｃｔｏｆｕｒａｎｏｓｉｄａｓｅ， ＥＣ ３．２．１．２６）を作用させることが望ましい。
【００３３】
（ｃ）イヌリンなどに対してはイヌリンフルクトトランスフェラーゼ（ｉｎｕｌｉｎ ｆｒｕｃｔｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ， ＥＣ ２．４．１．９３）を作用させることが望ましい。
【００３４】
クロマノール配糖体（一般式（１）、ｍ＝１）をα−グルコシダーゼを用いて合成する場合の反応条件としては、２−置換アルコール（一般式（２））を糖溶液に溶解させることが望ましい。そのためには有機溶媒の添加が望ましく、例えば、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、メタノール、エタノール、アセトン、アセトニトリルなどが挙げられ、α−グルコシダーゼの転移活性を高めるためにはジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドが好ましい。添加する有機溶媒の濃度は１〜５０（ｖ／ｖ）％、好ましくは反応効率を考えると５〜３５（ｖ／ｖ）％である。
【００３５】
２−置換アルコール（一般式（２））の濃度は、反応液中において飽和濃度もしくはそれに近い濃度にすることが望ましい。用いる糖の種類はマルトースからマルトテトラオース位の低分子のものが良く、好ましくはマルトースである。糖の濃度は１〜７０（ｗ／ｖ）％、好ましくは３０〜６０（ｗ／ｖ）％である。ｐＨは４．５〜７．５、好ましくは５．０〜６．５である。反応温度は１０〜７０℃、好ましくは３０〜６０℃である。反応時間は１〜４０時間、好ましくは２〜２４時間である。但し、これらの条件は使用する酵素量により影響をうける。反応終了後、反応液をＸＡＤ（オルガノ株式会社）を担体として用いたカラムクロマトグラフィーで処理することにより、高純度のクロマノール配糖体（一般式（１）、ｍ＝１）が得られる。
【００３６】
クロマノール配糖体（一般式（１）、ｍ＝１）をシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼを用いて合成する場合の反応条件としては、２−置換アルコール（一般式（２））を糖溶液に溶解させることが望ましい。そのためには有機溶媒の添加が望ましく、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、メタノール、エタノール、アセトン、アセトニトリルなどが挙げられる。添加する有機溶媒の濃度は１〜５０（ｖ／ｖ）％、好ましくは反応効率を考えると５〜３５（ｖ／ｖ）％である。２−置換アルコール（一般式（２））の濃度は反応液中において、飽和濃度もしくはそれに近い濃度にすることが望ましい。
【００３７】
用いる糖の種類はマルトトリオース以上の重合度を持つマルトオリゴ糖、可溶性澱粉、澱粉およびシクロデキストリン（α、β、γ）などが好ましい。糖の濃度は１〜７０（ｗ／ｖ）％、好ましくは５〜５０（ｗ／ｖ）％である。ｐＨは４．５〜８．５、好ましくは５．０〜７．５である。反応温度は１０〜７０℃、好ましくは３０〜６０℃である。反応時間は１〜６０時間、好ましくは２〜５０時間である。但し、これらの条件は使用する酵素量により影響をうける。
【００３８】
この反応により生じるクロマノール配糖体（一般式（１））はｍの数が１から８位の混合物となる。そこで、この混合物をグルコアミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．３）処理することで、クロマノール配糖体（一般式（１））のｍが１のものだけを得ることが出来る。この時の反応温度は２０〜７０℃、好ましくは３０〜６０℃、反応時間は０．１〜４０時間、好ましくは１〜２４時間である。但し、これらの条件は使用する酵素の量により影響をうける。そしてこのグルコアミラーゼ処理後の液を、ＸＡＤ（オルガノ株式会社）を担体として用いたカラムクロマトグラフィー処理することにより、高純度のクロマノール配糖体（一般式（１）、ｍ＝１）が得られる。
【００３９】
クロマノール配糖体（一般式（１）、ｍ＝２）を得る場合は上記条件により、シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼによって得られるクロマノール配糖体（一般式（１）、ｍが１から８位の混合物）にβ−アミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．２）を作用させることにより、クロマノール配糖体（一般式（１））のｍが１と２のものだけを得ることが出来る。この時の反応温度は２０〜７０℃、好ましくは３０〜６０℃、反応時間は０．１〜４０時間、好ましくは１〜２４時間である。但し、これらの条件は使用する酵素量により影響をうける。そしてこのβ−アミラーゼ処理後の液を、ＸＡＤ（オルガノ株式会社）を担体として用いたカラムクロマトグラフィー処理することにより、高純度のクロマノール配糖体（一般式（１）、ｍ＝２）が得られ、また同時にクロマノール配糖体（一般式（１）、ｍ＝１）も得られる。
【００４０】
クロマノール配糖体（一般式（１）、ｍが３以上）を得る場合は上記条件により、シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼによって得られるクロマノール配糖体（一般式（１）、ｍが１から８位の混合物）を、ＨＰＬＣを用いた分取クロマトグラフィーなどで処理することにより、高純度の各ｍ数のクロマノール配糖体（一般式（１））を得ることが出来る。
【００４１】
このようにして得られたクロマノール配糖体の水に対する溶解度はトロロックス、２−置換アルコールに比べ著しく高いものとなり、注射剤または内服液などの溶液剤としての利用が可能となった。また、該クロマノール配糖体の熱安定性およびｐＨ安定性はトコフェロール、トロロックス、２−置換アルコールらに比べ明らかに向上した。
【００４２】
抗酸化活性を評価するためヘキサン−イソプロピルアルコール溶液中における高度不飽和脂肪酸メチルエステルの過酸化速度を測定したところ、トコフェロールと同等の結果を生じた。また生体膜をモデルとして卵黄レシチンでリポソームをつくり、水溶性ラジカル発生剤でリポソームの外側より酸化反応を促進させた際、リポソームの外側にクロマノール配糖体を存在させておくことで、酸化速度を抑えることができた。そしてこの結果は水溶性の抗酸化剤として知られるアスコルビン酸などに比べて、顕著に酸化速度を抑えていることが判った。また、クロマノール配糖体はクロマン環を持っていることにより、一重項酸素など様々な活性酸素の消去能をも有していることは明らかである。
【００４３】
【実施例】
次に実施例により本発明を説明するが、これらにより本発明の範囲がなんら制限されるものでないことは言うまでもない。
【００４４】
参考例１
α−グルコシダーゼ（α−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ，ＥＣ ３．２．１．２０）の活性測定法
４（ｗ／ｖ）％マルトース水溶液１００μｌに１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）３００μｌを加え、３７℃で５分間インキュベートした後、酵素液４０μｌを加え、同温度条件下において２０分間反応させ５分間の煮沸処理により反応を停止させた。そして生成したグルコースをグルコース測定キット（和光純薬工業株式会社製）を用い測定した。なお、１Ｕは上記条件において１分間に１μｍｏｌのマルトースの加水分解を触媒する酵素量とした。
【００４５】
参考例２
シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ（ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ ｇｌｕｃａｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＥＣ ２．４．１．１９）の活性測定法
５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）で調整した０．５５（Ｗ／Ｖ）％可溶性澱粉（Ｍｅｒｃｋ社、Ｎｏ． １２５７）溶液２５０μｌを、４０℃で５分間インキュベートした後、酵素液５０μｌを加え、同温度条件下において１０分間反応させ、０．５Ｍ酢酸溶液を１ｍｌ添加することにより反応を停止させた。
【００４６】
そして、０．０２（ｗ／ｖ）％Ｉ２ ／０．２（ｗ／ｖ）％ＫＩ溶液を１ｍｌ、水を２ｍｌ加え吸光度７００ｎｍを測定することにより、可溶性澱粉の分解率を測定した。なお、１Ｕは上記条件において１分間に１０％の吸光度（７００ｎｍ）を減少させる酵素量とした。
【００４７】
実施例１
５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で調整した６０（ｗ／ｖ）％マルトース溶液８０ｍｌに対し、ジメチルスルホキシドで調整した５（ｗ／ｖ）％の式（３）で示されるＲＳ−２−置換アルコール溶液１６ｍｌおよび４００Ｕの東洋紡株式会社製のサッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）由来のα−グルコシダーゼを加え、４０℃において２０時間反応させた。このときの２−置換アルコールのクロマノール配糖体への転換率はモル比で約４５％であった。この反応液を３０％メタノール溶液で平衡化したＸＡＤ−４（オルガノ株式会社製）カラムにアプライし、非吸着物を３０％メタノール溶液で溶出後、８０％メタノール溶液でクロマノール配糖体を溶出させた。次に得られたクロマノール配糖体画分をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：メタノール，５：１，ｖ／ｖ）処理することで高純度のクロマノール配糖体：式（４）で示される６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−メチル−α−Ｄ−グルコピラノシドを約３００ｍｇ得た。
【００４８】
【化９】
【００４９】
【化１０】
【００５０】
この化合物の赤外吸収スペクトルを図１に示す。
【００５１】
本化合物の１ Ｈ−ＮＭＲ，１３Ｃ−ＮＭＲ，質量分析および比旋光度の結果を示す。
【００５２】
１ Ｈ−ＮＭＲ δ（２７０ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ ６ ）
１．２３および１．２５（ｓ，３Ｈ）
１．６９から１．７６（ｍ，１Ｈ）
１．８７から１．９２（ｍ，１Ｈ）
１．９７（ｓ，３Ｈ）
２．０２（ｓ，３Ｈ）
２．０４（ｓ，３Ｈ）
２．５１（ｂｒｏａｄ ｔ，２Ｈ）
３．０５から４．８８（ｍ，１３Ｈ）
７．３９（ｓ，１Ｈ）
１３Ｃ−ＮＭＲ δ（６７．８ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ ６ 、 プロトンデカップリングスペクトル）
１１．７
１１．７
１２．６
１９．７および１９．８
２２．２および２２．４
２８．２
６０．６および６０．８
７０．０および７０．１
７１．２および７１．５
７１．９
７２．６および７２．９
７３．１
７３．８および７３．９
９８．７および９８．８
１１６．６および１１６．７
１２０．１および１２０．２
１２０．７および１２０．８
１２２．５
１４４．２
１４５．１
質量スペクトル（ＦＡＢ）
ｍ／ｚ ３９８ （分子イオンピーク）
【００５３】
【外１】
【００５４】
実施例２
５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）で調整した１０（ｗ／ｖ）％α−サイクロデキストリン溶液８０ｍｌに対し、ジメチルスルホキシドで調整した５（ｗ／ｖ）％の前記式（３）で示されるＲＳ−２−置換アルコール溶液１６ｍｌおよび１９０００Ｕの株式会社林原生物化学研究所製のバチルス ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼを加え、５０℃において４３時間反応させた。この時のＲＳ−２−置換アルコールのクロマノール配糖体への転換率はモル比で約９５％であり、この反応液中のクロマノール配糖体は、糖の結合数が１から８位の混合物であった。この反応液を１５分間煮沸処理することにより、シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼを失活させ、４００Ｕの東洋紡株式会社製のリゾップス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐ．）由来のグルコアミラーゼを添加し、５０℃において５時間反応させることにより、反応液中のクロマノール配糖体の約９５％以上を糖の結合数が１のものに変換した。この反応液を１０分間煮沸処理することにより、グルコアミラーゼを失活させた後、３０％メタノール溶液で平衡化したＸＡＤ−４（オルガノ株式会社製）カラムにアプライし、非吸着物を３０％メタノールで溶出後、８０％メタノール溶液でクロマノール配糖体を溶出させた。次に得られたクロマノール配糖体画分をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：メタノール、５：１、ｖ／ｖ）処理することで高純度のクロマノール配糖体：前記式（４）で示される６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−メチル−α−Ｄ−グルコピラノシドを約１１００ｍｇ得た。
【００５５】
この化合物の赤外性吸収スペクトルを図２に示す。
【００５６】
本化合物の１ Ｈ−ＮＭＲ，１３Ｃ−ＮＭＲ，質量分析および比旋光度の結果を示す。
【００５７】
１ Ｈ−ＮＭＲ δ（２７０ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ ６ ）
１．２３および１．２５（ｓ，３Ｈ）
１．６９から１．７６（ｍ，１Ｈ）
１．８８から１．９３（ｍ，１Ｈ）
１．９７（ｓ，３Ｈ）
２．０２（ｓ，３Ｈ）
２．０４（ｓ，３Ｈ）
２．５１（ｂｒｏａｄ ｔ，２Ｈ）
３．０６から４．８８（ｍ，１３Ｈ）
７．３９（ｓ，１Ｈ）
１３Ｃ−ＮＭＲ δ（６７．８ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ ６ 、 プロトンデカップリングスペクトル）
１１．７
１１．７
１２．６
１９．７および１９．９
２２．２および２２．４
２８．３
６０．６および６０．８
７０．０および７０．１
７１．１および７１．４
７１．９
７２．６および７２．９
７３．１
７３．８および７３．９
９８．８
１１６．６および１１６．７
１２０．２
１２０．８
１２２．５
１４４．２
１４５．１
質量スペクトル（ＦＡＢ）
ｍ／ｚ ３９８ （分子イオンピーク）
【００５８】
【外２】
【００５９】
実施例３
５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）で調整した１０（ｗ／ｖ）％α−サイクロデキストリン溶液１２０ｍｌに対し、ジメチルスルホキシドで調整した５（ｗ／ｖ）％の前記式（３）で示されるＲＳ−２−置換アルコール溶液２４ｍｌおよび１５００００Ｕの天野製薬株式会社製のバチルス マセランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｅｒａｎｓ）由来のシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼを加え、５０℃において４３時間反応させた。この時のＲＳ−２−置換アルコールのクロマノール配糖体への転換率はモル比で約５５％であり、この反応液中のクロマノール配糖体は、糖の結合数が１から８位の混合物であった。この反応液を１５分間煮沸処理することにより、シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼを失活させ、６００Ｕの東洋紡株式会社製のリゾップス属（Ｒｈｉｚｏｐ ｕｓ ｓｐ．）由来のグルコアミラーゼを添加し、５０℃において５時間反応させることにより、反応液中のクロマノール配糖体の約９５％以上を糖の結合数が１のものに変換した。この反応液を１０分間煮沸処理することにより、グルコアミラーゼを失活させた後、３０％メタノール溶液で平衡化したＸＡＤ−４（オルガノ株式会社製）カラムにアプライし、非吸着物を３０％メタノールで溶出後、８０％メタノール溶液でクロマノール配糖体を溶出させた。次に得られたクロマノール配糖体画分をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：メタノール、５：１、ｖ／ｖ）処理することで高純度のクロマノール配糖体：前記式（４）で示される６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−メチル−α−Ｄ−グルコピラノシドを約９５０ｍｇ得た。
【００６０】
この化合物の赤外吸収スペクトルを図３に示す。
【００６１】
本化合物の１ Ｈ−ＮＭＲ，１３Ｃ−ＮＭＲ，質量分析および比旋光度の結果を示す。
【００６２】
１ Ｈ−ＮＭＲ δ（２７０ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ ６ ）
１．２３および１．２５（ｓ，３Ｈ）
１．６９から１．７８（ｍ，１Ｈ）
１．９１から１．９３（ｍ，１Ｈ）
１．９７（ｓ，３Ｈ）
２．０２（ｓ，３Ｈ）
２．０４（ｓ，３Ｈ）
２．５１（ｂｒｏａｄ ｔ，２Ｈ）
３．０７から４．８８（ｍ，１３Ｈ）
７．４０（ｓ，１Ｈ）
１３Ｃ−ＮＭＲ δ（６７．８ＭＨｚ、 ＤＭＳＯ−ｄ ６ 、 プロトンデカップリングスペクトル）
１１．７
１１．７
１２．６
１９．９
２２．３
２８．２
６０．６
６９．９
７１．１
７１．９
７２．６
７３．０および７３．１
７３．８
９８．８
１１６．６および１１６．７
１２０．２
１２０．８および１２０．９
１２２．５
１４４．２
１４５．１
質量スペクトル（ＦＡＢ）
ｍ／ｚ ３９８ （分子イオンピーク）
【００６３】
【外３】
【００６４】
実施例４
５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）で調整した１０（ｗ／ｖ）％α−サイクロデキストリン溶液８０ｍｌに対し、ジメチルスルホキシドで調整した５（ｗ／ｖ）％の前記式（３）で示されるＲＳ−２−置換アルコール溶液１６ｍｌおよび１９０００Ｕの株式会社林原生物化学研究所製のバチルス ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼを加え、５０℃において４３時間反応させた。この時のＲＳ−２−置換アルコールのクロマノール配糖体への転換率はモル比で約９５％であり、この反応液中のクロマノール配糖体は、糖の結合数が１から８位の混合物であった。この反応液を１５分間煮沸処理することにより、シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼを失活させ、７０ｍｌの１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を加えた。そして２５００Ｕのシグマ（ＳＩＧＭＡ ＣＨＥＭＩＣＡＬ ＣＯ．）製ＴｙｐｅＩ−Ｂのスイートポテト由来のβ−アミラーゼを添加し、５０℃において４時間反応させることにより、反応液中のクロマノール配糖体の約９８％以上を糖の結合数が１と２のものに変換した。この反応液を１０分間煮沸処理することにより、β−アミラーゼを失活させた後、３０％メタノール溶液で平衡化したＸＡＤ−４（オルガノ株式会社製）カラムにアプライし、非吸着物を３０％メタノールで溶出後、８０％メタノール溶液でクロマノール配糖体を溶出させた。次に得られたクロマノール配糖体画分をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：メタノール、５：１、ｖ／ｖ）処理することで高純度のクロマノール配糖体：前記式（４）で示される６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−メチル−α−Ｄ−グルコピラノシドを約５２０ｍｇ、式（５）で示される６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−メチル−α−Ｄ−マルトピラノシドを約６１０ｍｇ得た。
【００６５】
得られた前記式（４）で示される６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−メチル−α−Ｄ−グルコピラノシドの赤外線吸収スペクトルは図２と同一であり、また１ Ｈ−ＮＭＲ，１３Ｃ−ＮＭＲ，質量分析および比旋光度の結果は実施例２と同一であった。
【００６６】
【化１１】
【００６７】
得られた前記式（５）で示される６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−メチル−α−Ｄ−マルトピラノシドの赤外吸収スペクトルを図４に示す。
【００６８】
本化合物の１ Ｈ−ＮＭＲ，１３Ｃ−ＮＭＲ，質量分析および比旋光度の結果を示す。
【００６９】
１ Ｈ−ＮＭＲ δ（２７０ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ ６ ）
１．２２および１．２５（ｓ，３Ｈ）
１．６９から１．７４（ｍ，１Ｈ）
１．８９（ｍ，１Ｈ）
１．９７（ｓ，３Ｈ）
２．０１（ｓ，３Ｈ）
２．０４（ｓ，３Ｈ）
２．５１（ｂｒｏａｄ ｔ，２Ｈ）
３．０９から５．４３（ｍ，２３Ｈ）
７．３９（ｓ，１Ｈ）
１３Ｃ−ＮＭＲ δ（６７．８ＭＨｚ、 ＤＭＳＯ−ｄ ６ 、 プロトンデカップリングスペクトル）
１１．７
１１．７
１２．６
１９．７および１９．８
２１．８および２２．３
２８．１および２８．５
５９．７および６０．２
６０．７
６９．７
７０．６および７０．７
７１．０
７１．５
７２．４および７２．５
７２．８および７２．９
７３．２
７３．３
７３．７および７３．９
７９．８
９８．４および９８．６
１００．８および１００．９
１１６．６
１２０．１および１２０．２
１２０．９
１２２．６
１４４．１および１４４．２
１４５．２
質量スペクトル（ＦＡＢ）
ｍ／ｚ ５６０ （分子イオンピーク）
【００７０】
【外４】
【００７１】
実施例５
５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）で調整した１０（ｗ／ｖ）％α−サイクロデキストリン溶液１２０ｍｌに対し、ジメチルスルホキシドで調整した５（ｗ／ｖ）％の前記式（３）で示されるＲＳ−２−置換アルコール溶液２４ｍｌおよび１５００００Ｕの天野製薬株式会社製のバチルス マセランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｅｒａｎｓ）由来のシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼを加え、５０℃において４３時間反応させた。この時のＲＳ−２−置換アルコールのクロマノール配糖体への転換率はモル比で約５５％であり、この反応液中のクロマノール配糖体は、糖の結合数が１から８位の混合物であった。この反応液を１５分間煮沸処理することにより、シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼを失活させ、１００ｍｌの１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を加えた。そして４０００Ｕのシグマ（ＳＩＧＭＡ ＣＨＥＭＩＣＡＬ ＣＯ．）製ＴｙｐｅＩ−Ｂのスイートポテト由来のβ−アミラーゼを添加し、５０℃において４時間反応させることにより、反応液中のクロマノール配糖体の約９８％以上を糖の結合数が１と２のものに変換した。この反応液を１０分間煮沸処理することにより、β−アミラーゼを失活させた後、３０％メタノール溶液で平衡化したＸＡＤ−４（オルガノ株式会社製）カラムにアプライし、非吸着物を３０％メタノールで溶出後、８０％メタノール溶液でクロマノール配糖体を溶出させた。次に得られたクロマノール配糖体画分をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：メタノール、５：１、ｖ／ｖ）処理することで高純度のクロマノール配糖体：前記式（４）で示される６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−メチル−α−Ｄ−グルコピラノシドを約４５０ｍｇ、前記式（５）で示される６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−メチル−α−Ｄ−マルトピラノシドを約４４０ｍｇ得た。
【００７２】
得られた前記式（４）で示される６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−メチル−α−Ｄ−グルコピラノシドの赤外吸収スペクトルは図３と同一であり、また１ Ｈ−ＮＭＲ，１３Ｃ−ＮＭＲ，質量分析および比旋光度の結果は実施例３と同一であった。
【００７３】
得られた前記式（５）で示される６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−メチル−α−Ｄ−マルトピラノシドの赤外吸収スペクトルを図５に示す。
【００７４】
本化合物の１ Ｈ−ＮＭＲ，１３Ｃ−ＮＭＲ，質量分析および比旋光度の結果を示す。
【００７５】
１ Ｈ−ＮＭＲ δ（２７０ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ ６ ）
１．２２および１．２６（ｓ，３Ｈ）
１．７５（ｍ，１Ｈ）
１．８９（ｍ，１Ｈ）
１．９７（ｓ，３Ｈ）
２．０２（ｓ，３Ｈ）
２．０３（ｓ，３Ｈ）
２．５０（ｂｒｏａｄ ｔ，２Ｈ）
３．０９から５．４３（ｍ，２３Ｈ）
７．３９（ｓ，１Ｈ）
１３Ｃ−ＮＭＲ δ（６７．８ＭＨｚ、 ＤＭＳＯ−ｄ ６ 、 プロトンデカップリングスペクトル）
１１．７
１１．７
１２．６
１９．８
２１．８および２２．３
２８．５
５９．７
６０．７
６９．７
７０．６および７０．７
７１．０
７１．４
７２．５
７２．９
７３．２
７３．３
７３．７および７３．９
７９．８
９８．４および９８．６
１００．８および１００．９
１１６．６
１２０．１および１２０．２
１２０．８
１２２．６
１４４．１
１４５．１
質量スペクトル（ＦＡＢ）
ｍ／ｚ ５６０ （分子イオンピーク）
【００７６】
【外５】
【００７７】
実施例６
５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で調整した６０（ｗ／ｖ）％マルトース溶液９０ｍｌに対し、ジメチルスルホキシドで調整した２．５（ｗ／ｖ）％の式（６）で示されるＲＳ−２−置換アルコール溶液３０ｍｌおよび４００Ｕの東洋紡株式会社製のサッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）由来のα−グルコシダーゼを加え、４０℃において２０時間反応させた。このときの２−置換アルコールのクロマノール配糖体への転換率はモル比で約５５％であった。この反応液を３０％メタノール溶液で平衡化したＸＡＤ−４（オルガノ株式会社製）カラムにアプライし、非吸着物を３０％メタノール溶液で溶出後、８０％メタノール溶液でクロマノール配糖体を溶出させた。次に得られたクロマノール配糖体画分をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：メタノール、７：１、ｖ／ｖ）処理することで高純度のクロマノール配糖体：式（７）で示される６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−エチルーα−Ｄ−グルコピラノシドを約５５０ｍｇ得た。
【００７８】
【化１２】
【００７９】
【化１３】
【００８０】
この化合物の赤外吸収スペクトルを図６に示す。
【００８１】
本化合物の １Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ、質量分析および比旋光度の結果を示す。
【００８２】
１Ｈ−ＮＭＲ δ（２７０ＭＨｚ、 ＤＭＳ０−ｄ ６ ）
１．２１および１．２２（ｓ，３Ｈ）
１．７６から１．８１（ｍ，４Ｈ）
１．９８（ｓ，３Ｈ）
２．０２（ｓ，３Ｈ）
２．０５（ｓ，３Ｈ）
２．５１（ｂｒｏａｄ ｔ，２Ｈ）
３．０３から４．８９（ｍ，１３Ｈ）
７．３９（ｓ，１Ｈ）
１３Ｃ−ＮＭＲδ（６７．８ＭＨｚ、ＤＭＳ０−ｄ ６ 、プロトンデカップリングスペクトル）
１１．６
１１．７
１２．７
２０．１
２４．０および２４．１
３１．５および３１．６
３７．９および３８．０
６０．７および６０．８
６２．９および６３．０
７０．１および７０．２
７１．８
７２．７および７２．８
７３．０および７３．１
７３．２
９８．６および９８．７
１１６．６
１２０．３
１２０．９
１２２．５
１４４．１
１４５．１
質量スペクトル（ＦＡＢ）
ｍ／ｚ ４１２ （分子イオンピーク）
【００８３】
【外６】
【００８４】
実施例７
５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）で調整した１０（ｗ／ｖ）％α−サイクロデキストリン溶液１２０ｍｌに対し、ジメチルスルホキシドで調整した２．５（ｗ／ｖ）％の式（６）で示されるＲＳ−２−置換アルコール溶液４０ｍｌおよび２００００Ｕの株式会社林原生物化学研究所製のバチルス ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼを加え、５０℃において４３時間反応させた。この時のＲＳ−２−置換アルコールのクロマノール配糖体への転換率はモル比で約３５％であり、この反応液中のクロマノール配糖体は、糖の結合数が１から８位の混合物であった。この反応液を１５分間煮沸処理することにより、シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼを失活させ、６００Ｕの東洋紡株式会社製のリゾップス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐ．）由来のグルコアミラーゼを添加し、５０℃において５時間反応させることにより、反応液中のクロマノール配糖体の約９５％以上を糖の結合数が１のものに変換した。この反応液を１０分間煮沸処理することにより、グルコアミラーゼを失活させた後、３０％メタノール溶液で平衡化したＸＡＤ−４（オルガノ株式会社製）カラムにアプライし、非吸着物を３０％メタノールで溶出後、８０％メタノール溶液でクロマノール配糖体を溶出させた。次に得られたクロマノール配糖体画分をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：メタノール、７：１、ｖ／ｖ）処理することで高純度のクロマノール配糖体：前記式（７）で示される６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−エチル−α−Ｄ−グルコピラノシドを約３９０ｍｇ得た。
【００８５】
この化合物の赤外吸収スペクトルを図７に示す。
【００８６】
本化合物の１ Ｈ−ＮＭＲ，１３Ｃ−ＮＭＲ，質量分析および比旋光度の結果を示す。
【００８７】
１ Ｈ−ＮＭＲ δ（２７０ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ ６ ）
１．２２（ｓ，３Ｈ）
１．７６から１．８１（ｍ，４Ｈ）
１．９８（ｓ，３Ｈ）
２．０１（ｓ，３Ｈ）
２．０５（ｓ，３Ｈ）
２．５１（ｂｒｏａｄ ｔ，２Ｈ）
３．０６から４．８６（ｍ，１３Ｈ）
７．３８（ｓ，１Ｈ）
１３Ｃ−ＮＭＲ δ（６７．８ＭＨｚ、 ＤＭＳＯ−ｄ ６ 、 プロトンデカップリングスペクトル）
１１．６
１１．７
１２．６
２０．１
２４．０および２４．１
３１．５および３１．６
３７．９および３８．０
６０．７および６０．８
６２．９および６３．０
７０．１
７１．８
７２．７および７２．８
７３．０および７３．１
７３．２
９８．６および９８．７
１１６．６
１２０．２
１２０．９
１２２．５
１４４．１
１４５．１
質量スペクトル（ＦＡＢ）
ｍ／ｚ ４１２ （分子イオンピーク）
【００８８】
【外７】
【００８９】
実施例８
５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）で調整した１０（ｗ／ｖ）％α−サイクロデキストリン溶液１２０ｍｌに対し、ジメチルスルホキシドで調整した２．５（ｗ／ｖ）％の前記式（６）で示されるＲＳ−２−置換アルコール溶液４０ｍｌおよび２００００Ｕの株式会社林原生物化学研究所製のバチルス ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼを加え、５０℃において４３時間反応させた。この時のＲＳ−２−置換アルコールのクロマノール配糖体への転換率はモル比で約３５％であり、この反応液中のクロマノール配糖体は、糖の結合数が１から８位の混合物であった。この反応液を１５分間煮沸処理することにより、シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼを失活させ、１１０ｍｌの１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）加えた。そして６０００Ｕのシグマ（ＳＩＧＭＡ ＣＨＥＭＩＣＡＬ ＣＯ．）製ＴｙｐｅＢ−Ｉのスイートポテト由来のβ−アミラーゼを添加し、５０℃において４時間反応させることにより、反応液中のクロマノール配糖体の約９８％以上を糖の結合数が１と２のものに変換した。この反応液を１０分間煮沸処理することにより、β−アミラーゼを失活させた後、３０％メタノール溶液で平衡化したＸＡＤ−４（オルガノ株式会社製）カラムにアプライし、非吸着物を３０％メタノールで溶出後、８０％メタノール溶液でクロマノール配糖体を溶出させた。次に得られたクロマノール配糖体画分をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：メタノール、７：１、ｖ／ｖ）処理することで高純度のクロマノール配糖体：前記式（７）で示される６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−エチル−α−Ｄ−グルコピラノシドを約１７０ｍｇ、式（８）で示される６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−エチル−α−Ｄ−マルトピラノシドを約２００ｍｇ得た。
【００９０】
得られた前記式（７）で示される６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−エチル−α−Ｄ−グルコピラノシドの赤外線吸収スペクトルは図７と同一であり、また１ Ｈ−ＮＭＲ，１３Ｃ−ＮＭＲ，質量分析および比旋光度の結果は実施例７と同一であった。
【００９１】
得られた式（８）で示される６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−エチル−α−Ｄ−マルトピラノシドの赤外線吸収スペクトルを図８に示す。
【００９２】
【化１４】
【００９３】
本化合物の１ Ｈ−ＮＭＲ，１３Ｃ−ＮＭＲ，質量分析および比旋光度の結果を示す。
【００９４】
１ Ｈ−ＮＭＲ δ（２７０ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ ６ ）
１．２１（ｓ，３Ｈ）
１．７８から１．８５（ｍ，４Ｈ）
１．９８（ｓ，３Ｈ）
２．０１（ｓ，３Ｈ）
２．０５（ｓ，３Ｈ）
２．５０（ｂｒｏａｄ ｔ，２Ｈ）
３．０６から５．４１（ｍ，２３Ｈ）
７．３８（ｓ，１Ｈ）
１３Ｃ−ＮＭＲ δ（６７．８ＭＨｚ、 ＤＭＳＯ−ｄ ６ 、 プロトンデカップリングスペクトル）
１１．６
１１．７
１２．６
２０．１
２３．８および２４．１
３１．５
３７．９および３８．０
６０．２
６０．７
６３．１
６９．８
７０．９
７１．０
７１．４
７２．５
７３．０
７３．０
７３．２および７３．３
７９．８
９８．４
１００．８
１１６．６
１２０．３
１２０．９
１２２．５
１４４．１
１４５．１
質量スペクトル（ＦＡＢ）
ｍ／ｚ ５７４ （分子イオンピーク）
【００９５】
【外８】
【００９６】
実施例９
実施例１〜５によって得られたクロマノール配糖体（前記式（４）、６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−メチル−α−Ｄ−グルコピラノシド）、実施例６〜８によって得られたクロマノール配糖体（前記式（７）、６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−エチル−α−Ｄ−グルコピラノシド）、実施例４〜５によって得られたクロマノール配糖体（前記式（５）、６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−メチル−α−Ｄ−マルトピラノシド）および実施例８によって得られたクロマノール配糖体（前記式（８）、６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−エチル−α−Ｄ−マルトピラノシド）の抗酸化活性をリノール酸メチルのラジカル連鎖自動連鎖反応の抑制により評価した。１３２μｍｏｌのリノール酸メチル、１６．５μｍｏｌの脂溶性ラジカル発生剤（２，２´−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル））、０．１μｍｏｌのクロマノール配糖体、ブチルヒドロキシトルエンまたはα−トコフェロールからなるヘキサン／イソプロピルアルコール（１：１、ｖ／ｖ）溶液１．１ｍｌを３７℃でインキュベートし、経時的にサンプリングし、高速液体クロマイトグラフィーでリノール酸メチルハイドロパーオキサイドの生成量を測定した。図９および図１０に示すように、クロマノール配糖体前記式（４）、前記式（５）、前記式（７）および前記式（８）の有機溶媒中における抗酸化活性はブチルヒドロキシトルエンより優れており、またα−トコフェロールと同等であることが判る。
【００９７】
実施例１０
実施例１〜５によって得られたクロマノール配糖体（前記式（４）、６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−メチル−α−Ｄ−グルコピラノシド）、実施例６〜８によって得られたクロマノール配糖体（前記式（７）、６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−エチル−α−Ｄ−グルコピラノシド）、実施例４〜５によって得られたクロマノール配糖体（前記式（５）、６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−メチル−α−Ｄ−マルトピラノシド）および実施例８によって得られたクロマノール配糖体（前記式（８）、６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−エチル−α−Ｄ−マルトピラノシド）の抗酸化活性を多重層リポソームのラジカル連鎖自動酸化反応の抑制により評価した。５．５μｍｏｌの卵黄ホスファチジルコリンの多重層リポソーム、１６．５μｍｏｌの水溶性ラジカル発生剤（２，２´−アゾビス（２−アミジノプロパン）二塩酸塩）、０．１μｍｏｌのクロマノール配糖体またはアスコルビン酸からなる反応液を１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）１．１ｍｌで調整後、３７℃でインキュベートし、経時的にサンプリングし、高速液体クロマイトグラフィーでホスファチジルコリンハイドロパーオキシサイドの生成量を測定した。図１１および図１２に示すように、クロマノール配糖体前記式（４）、前記式（５）、前記式（７）および前記式（８）は水溶性の抗酸化剤であるアスコルビン酸より、明らかに効果的な抗酸化剤であることが判る。
【００９８】
実施例１１
実施例１〜５によって得られたクロマノール配糖体（前記式（４）、６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−メチル−α−Ｄ−グルコピラノシド）、実施例６〜８によって得られたクロマノール配糖体（前記式（７）、６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−エチル−α−Ｄ−グルコピラノシド）、実施例４〜５によって得られたクロマノール配糖体（前記式（５）、６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−メチル−α−Ｄ−マルトピラノシド）および実施例８によって得られたクロマノール配糖体（前記式（８）、６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−エチル−α−Ｄ−マルトピラノシド）の熱に対する安定性を評価した。５ｍＭのクロマノール配糖体溶液（水／エタノール、１：３、ｖ／ｖ）を各温度条件でインキュベートし、所定時間でサンプリングし、残存量を高速液体クロマイトグラフィーで測定した。比較として前記式（３）および前記式（６）で示される２−置換アルコールおよびα−トコフェロール、トロロックスも同様に評価した。
【００９９】
表１および表２に１００時間後の残存率の結果を示す。これらの表により２−置換アルコールを配糖体化することによる熱安定性の向上が認められた。
【０１００】
【表１】
【０１０１】
【表２】
【０１０２】
実施例１２
実施例１〜５によって得られたクロマノール配糖体（前記式（４）、６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−メチル−α−Ｄ−グルコピラノシド）、実施例６〜８によって得られたクロマノール配糖体（前記式（７）、６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−エチル−α−Ｄ−グルコピラノシド）、実施例４〜５によって得られたクロマノール配糖体（前記式（５）、６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−メチル−α−Ｄ−マルトピラノシド）および実施例８によって得られたクロマノール配糖体（前記式（８）、６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−エチル−α−Ｄ−マルトピラノシド）の各ｐＨに対する安定性を評価した。各ｐＨの５．５ｍＭのクロマノール配糖体溶液（緩衝液／エタノール、５：１、ｖ／ｖ）を４０℃でインキュベートし、所定時間でサンプリングし、残存量を高速液体クロマイトグラフィーで測定した。比較として前記式（３）および前記式（６）で示される２−置換アルコールおよびトロロックスも同様に評価した。
【０１０３】
表３および４に１００時間後の残存率の結果を示す。これらの表により２−置換アルコールを配糖体化することによるｐＨ安定性の向上が認められた。なお、用いた緩衝液はｐＨ５．５：１００ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ７．０：１００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ８．５：１００ｍＭトリスー塩酸緩衝液である。
【０１０４】
【表３】
【０１０５】
【表４】
【０１０６】
実施例１３
実施例１〜５によって得られたクロマノール配糖体（前記式（４）、６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−メチル−α−Ｄ−グルコピラノシド）、実施例６〜８によって得られたクロマノール配糖体（前記式（７）、６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−エチル−α−Ｄ−グルコピラノシド）、実施例４〜５によって得られたクロマノール配糖体（前記式（５）、６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−メチル−α−Ｄ−マルトピラノシド）および実施例８によって得られたクロマノール配糖体（前記式（８）、６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−エチル−α−Ｄ−マルトピラノシド）の水に対する溶解度を評価した。過剰量のクロマノール配糖体を水１ｍｌに加え、２５℃でインキュベートし、２０時間撹拌（２００ｒｐｍ）後、サンプレップＣＯ２−ＬＧ（ミリポア社製）に液を移し、遠心分離（４１００×ｇ、１０分、２０℃）することにより不溶物を除去し、得られた水溶液中のクロマノール配糖体の溶解量を高速液体クロマトグラフィーで測定した。比較として前記式（３）および前記式（６）で示される２−置換アルコールおよびトロロックス同様に評価した。
【０１０７】
表５および６に示すようにクロマノール配糖体の優れた水に対する溶解性が明らかになった。表中の値は１ｍｌの水に溶解した量を示す。
【０１０８】
【表５】
【０１０９】
【表６】
【０１１０】
【発明の効果】
本発明による新規クロマノール配糖体およびその製造方法は、前記のとおりであるから新規であるばかりではなく、特に水溶液中において非常に有効な新規な抗酸化剤であり、また優れた熱およびｐＨ安定性により、化粧品、衣料品、食品、化成品などの原料として非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】は、本発明によるクロマノール配糖体の実施例１における赤外線吸収スペクトルである。
【図２】は、本発明によるクロマノール配糖体の実施例２における赤外線吸収スペクトルである。
【図３】は、本発明によるクロマノール配糖体の実施例３における赤外線吸収スペクトルである。
【図４】は、本発明によるクロマノール配糖体の実施例４における赤外線吸収スペクトルである。
【図５】は、本発明によるクロマノール配糖体の実施例５における赤外線吸収スペクトルである。
【図６】は、本発明によるクロマノール配糖体の実施例６における赤外線吸収スペクトルである。
【図７】は、本発明によるクロマノール配糖体の実施例７における赤外線吸収スペクトルである。
【図８】は、本発明によるクロマノール配糖体の実施例８における赤外線吸収スペクトルである。
【図９】は、本発明によるクロマノール配糖体の抗酸化活性を示すグラフである。
【図１０】は、本発明によるクロマノール配糖体の抗酸化活性を示すグラフである。
【図１１】は、本発明によるクロマノール配糖体の抗酸化活性を示すグラフである。
【図１２】は、本発明によるクロマノール配糖体の抗酸化活性を示すグラフである。
【産業上の利用分野】
本発明は、新規なクロマノール配糖体およびその製造方法に関するものである。詳しく述べると、２−置換アルコールに糖を結合させることによる化学的安定性に優れた新規な水溶性抗酸化剤およびその製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
古くより過酸化脂質の生成は食品などの品質劣化の原因として知られていたが、最近では生体においても動脈硬化、老化、癌など様々な疾病に関連していることが明らかになってきている。そこで、活性酸素などによって引き起こされる過酸化脂質の生成を抑えるための抗酸化剤の開発は、食品ばかりではなく化粧品、医薬品など多くの分野において注目を集めている。
【０００３】
天然に存在する抗酸化剤としてはトコフェロール類、没食子酸、アスコルビン酸、グルタチオン、β−カロテンなどが知られており、また食品に添加して油脂の酸化を防止する目的で合成されたブチルヒドロキシアニソールやブチルヒドロキシトルエンなども抗酸化剤として知られている。
【０００４】
これら抗酸化剤のなかにおいて、特にトコフェロール類のその優れた抗酸化活性は注目を集め、食品、化粧品、医薬品分野において多用されている。また、トコフェロールの優れた抗酸化活性はクロマン環に起因していることより、トコフェロールの２位のイソプレノイド側鎖をカルボキシル基に置換した６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸（以下、トロロックス）等は商品として知られており、また、その他にも２−置換アルコール等が知られている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、トコフェロール類は、水に不溶な粘性油状物のため注射剤または内服液等の溶液剤としての利用は不可能である。また、トロロックス、２−置換アルコールも水に対する溶解性は非常に低い。
【０００６】
これら化合物を水溶性にするためには（ａ）界面活性剤の添加、（ｂ）シクロデキストリンによる包括、（ｃ）水溶性化合物を用いた化学修飾（エステル化）等の方法が考えられるが、（ａ）および（ｂ）の場合には、かなりの量の界面活性剤またはシクロデキストリンが必要となり、本来不用な物の多量の混入が問題となる。また、これらの方法では十分な水溶性が得られていないのが現状である（特開昭６１−２１１８４号、特開昭６２−２８１８５５号、特開昭６２−２２６９７５号、特開昭６０−１１６６４３号、特公昭４１−５１１８号等）。また、（ｃ）の方法の６位のフェノール性水酸基を水溶性化合物で修飾する方法では、抗酸化活性を著しく減少させることになる。また、別の問題として、トコフェロールおよびクロマン環をもつ化合物等は熱およびアルカリなどに対して不安定であるなどの欠点も持っている。
【０００７】
したがって、本発明の目的は、優れた抗酸化活性を有するクロマン環を利用して溶液剤としても使用可能で、かつ化学的安定性にも優れた新規な水溶性抗酸化剤であるクロマノール配糖体およびその製造方法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上記目的は、一般式（１）
【０００９】
【化５】
（ただし、式中、Ｒ１ ，Ｒ２ ，Ｒ３ およびＲ４ は同一または異なる水素原子または低級アルキル基、Ｒ５ は水素原子、低級アルキル基または低級アシル基、Ｘは単糖残基またはオリゴ糖残基であり、糖残基の水酸基の水素原子は低級アルキル基または低級アシル基で置換されていてもよく、ｎは０〜４の整数を表わし、またｍは１〜６の整数を表わす）で表わされるクロマノール配糖体により達成される。
【００１１】
上記目的は、一般式（２）
【００１２】
【化６】
（ただし、式中、Ｒ１ ，Ｒ２ ，Ｒ３ およびＲ４ は同一または異なる水素原子または低級アルキル基、Ｒ５ は水素原子、低級アルキル基または低級アシル基を表わし、またｎは０〜４の整数を表わす）で表わされる２−置換アルコールと、オリゴ糖類、可溶性澱粉、澱粉またはシクロデキストリンを、相当する糖転位作用を触媒する酵素の存在下に反応させることを特徴とする一般式（１）
【００１４】
【化７】
（ただし、Ｒ１ ，Ｒ２ ，Ｒ３ ，Ｒ４ ，Ｒ５ ，Ｘおよびｎは前記定義のとおりであり、またｍは１〜６の整数である）で表わされるクロマノール配糖体の製造方法によっても達成される。
【００１６】
上記目的は、一般式（１）
【００１７】
【化８】
（ただし、式中、Ｒ１ ，Ｒ２ ，Ｒ３ およびＲ４ は同一または異なる水素原子または低級アルキル基、Ｒ５ は水素原子、低級アルキル基または低級アシル基、Ｘは単糖残基またはオリゴ糖残基であり、糖残基の水酸基の水素原子は低級アルキル基または低級アシル基で置換されていてもよく、ｎは０〜４の整数を表わし、またｍは１〜６の整数を表わす）で表わされるクロマノール配糖体を有効成分とする抗酸化剤によっても達成される。
【００１９】
一般的に、配糖化された物質は配糖化前の物に比べると、（１）水に対する溶解度の向上、（２）化学的な安定性の向上、（３）味質、生理活性の改変、増大が可能など様々な利点が挙げられており、配糖化が生理活性物質などの性状、物性を高める有用な手段の一つであると考えられている。本発明者らは、クロマン環を保持した水溶性抗酸化剤を開発するため、２−置換アルコール（一般式（２））の２−位の水酸基に糖を結合させた全く知られていない新規な配糖体（一般式（１））を考え出した。
【００２０】
【作用】
本発明に用いる２−置換アルコール（一般式（２））は公知の物質であり、特公平１−４３７５５号、特公平１−４９１３５号等の方法により、得ることができる。また２−置換アルコール（一般式（２）、Ｒ１ ＝Ｒ２ ＝Ｒ３ ＝Ｒ４ ＝ＣＨ３ 、Ｒ５ ＝Ｈ、ｎ＝１）はトロロックスを水素化リチウムアルミニウムの存在下においてジエチルエーテル中で加熱還流処理することなどにより容易に得ることができる。
【００２１】
この配糖体の合成を行うことに当たって、２−置換アルコール（一般式（２））の２−位の水酸基に対してのみ特異的に糖の特定の水酸基を結合させることは化学的合成法では困難である。本発明者らは酵素を用いることにより、非常に効率よく目的のクロマノール配糖体（一般式（１））を簡単に合成させうる方法を発見した。そして得られた新規なクロマノール配糖体の水溶性、安定性の著しい向上また水溶性抗酸化剤としての優れた活性を確認し本研究を完成するに至った。
【００２２】
酵素としては反応に用いる糖の種類によって使い分けることが好ましい。
【００２３】
（１）２−置換アルコールにα結合でグルコース残基を結合させる場合
（ａ）マルトースからマルトテトラオース位のマルトオリゴ糖に対してはα−グルコシダーゼ（α−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ， ＥＣ ３．２．１．２０）を作用させることが望ましい。α−グルコシダーゼとしては、ほぼ全ての起源由来のものを用いることができ、例えば、東洋紡株式会社製のサッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）由来のα−グルコシダーゼ、オリエンタル酵母工業株式会社製のサッカロマイセス セロビイシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のα−グルコシダーゼ、天野製薬株式会社製のアスペルギルス ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）由来のα−グルコシダーゼ、和光純薬工業株式会社製のサッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｓｅｓ ｓｐ．）由来のα−グルコシダーゼ、シグマ（ＳＩＧＭＡ）製のベーカー イースト（Ｂａｋｅｒｓ ｙｅａｓｔ）由来のα−グルコシダーゼ、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属由来のα−グルコシダーゼ等が挙げられる。
【００２４】
（ｂ）可溶性澱粉、澱粉に対しては４−α−グルカノトランスフェラーゼ（４−α−Ｄ−ｇｌｕｃａｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ， ＥＣ ２．４．１．２５）を作用させることが望ましい。
【００２５】
（２）２−置換アルコールにα結合でグルコース残基またはマルトオリゴ糖残基を結合させる場合
マルトオリゴ糖、可溶性澱粉、澱粉またはシクロデキストリン（α、β、γ）などに対してはシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ（ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ ｇｌｕｃａｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ， ＥＣ ２．４．１．１９）を作用させることが望ましい。例えば、天野製薬株式会社製のバチルス マセランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｅｒａｎｓ）由来のシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ、株式会社林原生物化学研究所製のバチルス ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ、その他にはバチルス メガテリウム（Ｂａｃｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス サーキュランス ＡＴＣＣ ９９９５（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓＡＴＣＣ ９９９５）由来のシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼなどが挙げられる。
【００２６】
（３）２−置換アルコールにβ結合でグルコース残基を結合させる場合
（ａ）セロビオース、カードラン、ラミナランなどのβ結合よりなるオリゴ糖に対してはβ−グルコシダーゼ（β−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ， ＥＣ ３．２．１．２１）を作用させることが望ましい。
【００２７】
（ｂ）リン酸存在下のセロビオースに対してはセロビオース ホスホリラーゼ（ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ， ＥＣ ２．４．１．２０）を作用させることが望ましい。
【００２８】
（４）２−置換アルコールにα結合でガラクトース残基を結合させる場合
（ａ）メリビオース、ラフィノースなどに対してはα−ガラクトシダーゼ（α−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ， ＥＣ ３．２．１．２２）を作用させることが望ましい。
【００２９】
（５）２−置換アルコールにβ結合でガラクトース残基を結合させる場合
（ａ）ラクトースなどに対してはβ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ， ＥＣ ３．２．１．２３）を作用させることが望ましい。
【００３０】
（ｂ）アラビノガラクタンなどに対してはエンド−１，４−β−ガラクタナーゼ（Ｅｎｄｏ−１，４−β−ｇａｌａｃｔａｎａｓｅ， ＥＣ ３．２．１．８９）を作用させることが望ましい。。
【００３１】
（６）２−置換アルコールにβ結合でフラクトース残基を結合させる場合
（ａ）ショ糖、ラフィノース、メリビオースなどに対してはレバンシュークラーゼ（ｌｅｖａｎｓｕｃｒａｓｅ， ＥＣ ２．４．１．１０）を作用させることが望ましい。
【００３２】
（ｂ）ショ糖に対してはβ−フルクトフラノシダーゼ（β−ｆｒｕｃｔｏｆｕｒａｎｏｓｉｄａｓｅ， ＥＣ ３．２．１．２６）を作用させることが望ましい。
【００３３】
（ｃ）イヌリンなどに対してはイヌリンフルクトトランスフェラーゼ（ｉｎｕｌｉｎ ｆｒｕｃｔｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ， ＥＣ ２．４．１．９３）を作用させることが望ましい。
【００３４】
クロマノール配糖体（一般式（１）、ｍ＝１）をα−グルコシダーゼを用いて合成する場合の反応条件としては、２−置換アルコール（一般式（２））を糖溶液に溶解させることが望ましい。そのためには有機溶媒の添加が望ましく、例えば、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、メタノール、エタノール、アセトン、アセトニトリルなどが挙げられ、α−グルコシダーゼの転移活性を高めるためにはジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドが好ましい。添加する有機溶媒の濃度は１〜５０（ｖ／ｖ）％、好ましくは反応効率を考えると５〜３５（ｖ／ｖ）％である。
【００３５】
２−置換アルコール（一般式（２））の濃度は、反応液中において飽和濃度もしくはそれに近い濃度にすることが望ましい。用いる糖の種類はマルトースからマルトテトラオース位の低分子のものが良く、好ましくはマルトースである。糖の濃度は１〜７０（ｗ／ｖ）％、好ましくは３０〜６０（ｗ／ｖ）％である。ｐＨは４．５〜７．５、好ましくは５．０〜６．５である。反応温度は１０〜７０℃、好ましくは３０〜６０℃である。反応時間は１〜４０時間、好ましくは２〜２４時間である。但し、これらの条件は使用する酵素量により影響をうける。反応終了後、反応液をＸＡＤ（オルガノ株式会社）を担体として用いたカラムクロマトグラフィーで処理することにより、高純度のクロマノール配糖体（一般式（１）、ｍ＝１）が得られる。
【００３６】
クロマノール配糖体（一般式（１）、ｍ＝１）をシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼを用いて合成する場合の反応条件としては、２−置換アルコール（一般式（２））を糖溶液に溶解させることが望ましい。そのためには有機溶媒の添加が望ましく、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、メタノール、エタノール、アセトン、アセトニトリルなどが挙げられる。添加する有機溶媒の濃度は１〜５０（ｖ／ｖ）％、好ましくは反応効率を考えると５〜３５（ｖ／ｖ）％である。２−置換アルコール（一般式（２））の濃度は反応液中において、飽和濃度もしくはそれに近い濃度にすることが望ましい。
【００３７】
用いる糖の種類はマルトトリオース以上の重合度を持つマルトオリゴ糖、可溶性澱粉、澱粉およびシクロデキストリン（α、β、γ）などが好ましい。糖の濃度は１〜７０（ｗ／ｖ）％、好ましくは５〜５０（ｗ／ｖ）％である。ｐＨは４．５〜８．５、好ましくは５．０〜７．５である。反応温度は１０〜７０℃、好ましくは３０〜６０℃である。反応時間は１〜６０時間、好ましくは２〜５０時間である。但し、これらの条件は使用する酵素量により影響をうける。
【００３８】
この反応により生じるクロマノール配糖体（一般式（１））はｍの数が１から８位の混合物となる。そこで、この混合物をグルコアミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．３）処理することで、クロマノール配糖体（一般式（１））のｍが１のものだけを得ることが出来る。この時の反応温度は２０〜７０℃、好ましくは３０〜６０℃、反応時間は０．１〜４０時間、好ましくは１〜２４時間である。但し、これらの条件は使用する酵素の量により影響をうける。そしてこのグルコアミラーゼ処理後の液を、ＸＡＤ（オルガノ株式会社）を担体として用いたカラムクロマトグラフィー処理することにより、高純度のクロマノール配糖体（一般式（１）、ｍ＝１）が得られる。
【００３９】
クロマノール配糖体（一般式（１）、ｍ＝２）を得る場合は上記条件により、シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼによって得られるクロマノール配糖体（一般式（１）、ｍが１から８位の混合物）にβ−アミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．２）を作用させることにより、クロマノール配糖体（一般式（１））のｍが１と２のものだけを得ることが出来る。この時の反応温度は２０〜７０℃、好ましくは３０〜６０℃、反応時間は０．１〜４０時間、好ましくは１〜２４時間である。但し、これらの条件は使用する酵素量により影響をうける。そしてこのβ−アミラーゼ処理後の液を、ＸＡＤ（オルガノ株式会社）を担体として用いたカラムクロマトグラフィー処理することにより、高純度のクロマノール配糖体（一般式（１）、ｍ＝２）が得られ、また同時にクロマノール配糖体（一般式（１）、ｍ＝１）も得られる。
【００４０】
クロマノール配糖体（一般式（１）、ｍが３以上）を得る場合は上記条件により、シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼによって得られるクロマノール配糖体（一般式（１）、ｍが１から８位の混合物）を、ＨＰＬＣを用いた分取クロマトグラフィーなどで処理することにより、高純度の各ｍ数のクロマノール配糖体（一般式（１））を得ることが出来る。
【００４１】
このようにして得られたクロマノール配糖体の水に対する溶解度はトロロックス、２−置換アルコールに比べ著しく高いものとなり、注射剤または内服液などの溶液剤としての利用が可能となった。また、該クロマノール配糖体の熱安定性およびｐＨ安定性はトコフェロール、トロロックス、２−置換アルコールらに比べ明らかに向上した。
【００４２】
抗酸化活性を評価するためヘキサン−イソプロピルアルコール溶液中における高度不飽和脂肪酸メチルエステルの過酸化速度を測定したところ、トコフェロールと同等の結果を生じた。また生体膜をモデルとして卵黄レシチンでリポソームをつくり、水溶性ラジカル発生剤でリポソームの外側より酸化反応を促進させた際、リポソームの外側にクロマノール配糖体を存在させておくことで、酸化速度を抑えることができた。そしてこの結果は水溶性の抗酸化剤として知られるアスコルビン酸などに比べて、顕著に酸化速度を抑えていることが判った。また、クロマノール配糖体はクロマン環を持っていることにより、一重項酸素など様々な活性酸素の消去能をも有していることは明らかである。
【００４３】
【実施例】
次に実施例により本発明を説明するが、これらにより本発明の範囲がなんら制限されるものでないことは言うまでもない。
【００４４】
参考例１
α−グルコシダーゼ（α−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ，ＥＣ ３．２．１．２０）の活性測定法
４（ｗ／ｖ）％マルトース水溶液１００μｌに１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）３００μｌを加え、３７℃で５分間インキュベートした後、酵素液４０μｌを加え、同温度条件下において２０分間反応させ５分間の煮沸処理により反応を停止させた。そして生成したグルコースをグルコース測定キット（和光純薬工業株式会社製）を用い測定した。なお、１Ｕは上記条件において１分間に１μｍｏｌのマルトースの加水分解を触媒する酵素量とした。
【００４５】
参考例２
シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ（ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ ｇｌｕｃａｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＥＣ ２．４．１．１９）の活性測定法
５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）で調整した０．５５（Ｗ／Ｖ）％可溶性澱粉（Ｍｅｒｃｋ社、Ｎｏ． １２５７）溶液２５０μｌを、４０℃で５分間インキュベートした後、酵素液５０μｌを加え、同温度条件下において１０分間反応させ、０．５Ｍ酢酸溶液を１ｍｌ添加することにより反応を停止させた。
【００４６】
そして、０．０２（ｗ／ｖ）％Ｉ２ ／０．２（ｗ／ｖ）％ＫＩ溶液を１ｍｌ、水を２ｍｌ加え吸光度７００ｎｍを測定することにより、可溶性澱粉の分解率を測定した。なお、１Ｕは上記条件において１分間に１０％の吸光度（７００ｎｍ）を減少させる酵素量とした。
【００４７】
実施例１
５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で調整した６０（ｗ／ｖ）％マルトース溶液８０ｍｌに対し、ジメチルスルホキシドで調整した５（ｗ／ｖ）％の式（３）で示されるＲＳ−２−置換アルコール溶液１６ｍｌおよび４００Ｕの東洋紡株式会社製のサッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）由来のα−グルコシダーゼを加え、４０℃において２０時間反応させた。このときの２−置換アルコールのクロマノール配糖体への転換率はモル比で約４５％であった。この反応液を３０％メタノール溶液で平衡化したＸＡＤ−４（オルガノ株式会社製）カラムにアプライし、非吸着物を３０％メタノール溶液で溶出後、８０％メタノール溶液でクロマノール配糖体を溶出させた。次に得られたクロマノール配糖体画分をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：メタノール，５：１，ｖ／ｖ）処理することで高純度のクロマノール配糖体：式（４）で示される６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−メチル−α−Ｄ−グルコピラノシドを約３００ｍｇ得た。
【００４８】
【化９】
【化１０】
この化合物の赤外吸収スペクトルを図１に示す。
【００５１】
本化合物の１ Ｈ−ＮＭＲ，１３Ｃ−ＮＭＲ，質量分析および比旋光度の結果を示す。
【００５２】
１ Ｈ−ＮＭＲ δ（２７０ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ ６ ）
１．２３および１．２５（ｓ，３Ｈ）
１．６９から１．７６（ｍ，１Ｈ）
１．８７から１．９２（ｍ，１Ｈ）
１．９７（ｓ，３Ｈ）
２．０２（ｓ，３Ｈ）
２．０４（ｓ，３Ｈ）
２．５１（ｂｒｏａｄ ｔ，２Ｈ）
３．０５から４．８８（ｍ，１３Ｈ）
７．３９（ｓ，１Ｈ）
１３Ｃ−ＮＭＲ δ（６７．８ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ ６ 、 プロトンデカップリングスペクトル）
１１．７
１１．７
１２．６
１９．７および１９．８
２２．２および２２．４
２８．２
６０．６および６０．８
７０．０および７０．１
７１．２および７１．５
７１．９
７２．６および７２．９
７３．１
７３．８および７３．９
９８．７および９８．８
１１６．６および１１６．７
１２０．１および１２０．２
１２０．７および１２０．８
１２２．５
１４４．２
１４５．１
質量スペクトル（ＦＡＢ）
ｍ／ｚ ３９８ （分子イオンピーク）
【００５３】
【外１】
実施例２
５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）で調整した１０（ｗ／ｖ）％α−サイクロデキストリン溶液８０ｍｌに対し、ジメチルスルホキシドで調整した５（ｗ／ｖ）％の前記式（３）で示されるＲＳ−２−置換アルコール溶液１６ｍｌおよび１９０００Ｕの株式会社林原生物化学研究所製のバチルス ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼを加え、５０℃において４３時間反応させた。この時のＲＳ−２−置換アルコールのクロマノール配糖体への転換率はモル比で約９５％であり、この反応液中のクロマノール配糖体は、糖の結合数が１から８位の混合物であった。この反応液を１５分間煮沸処理することにより、シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼを失活させ、４００Ｕの東洋紡株式会社製のリゾップス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐ．）由来のグルコアミラーゼを添加し、５０℃において５時間反応させることにより、反応液中のクロマノール配糖体の約９５％以上を糖の結合数が１のものに変換した。この反応液を１０分間煮沸処理することにより、グルコアミラーゼを失活させた後、３０％メタノール溶液で平衡化したＸＡＤ−４（オルガノ株式会社製）カラムにアプライし、非吸着物を３０％メタノールで溶出後、８０％メタノール溶液でクロマノール配糖体を溶出させた。次に得られたクロマノール配糖体画分をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：メタノール、５：１、ｖ／ｖ）処理することで高純度のクロマノール配糖体：前記式（４）で示される６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−メチル−α−Ｄ−グルコピラノシドを約１１００ｍｇ得た。
【００５５】
この化合物の赤外性吸収スペクトルを図２に示す。
【００５６】
本化合物の１ Ｈ−ＮＭＲ，１３Ｃ−ＮＭＲ，質量分析および比旋光度の結果を示す。
【００５７】
１ Ｈ−ＮＭＲ δ（２７０ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ ６ ）
１．２３および１．２５（ｓ，３Ｈ）
１．６９から１．７６（ｍ，１Ｈ）
１．８８から１．９３（ｍ，１Ｈ）
１．９７（ｓ，３Ｈ）
２．０２（ｓ，３Ｈ）
２．０４（ｓ，３Ｈ）
２．５１（ｂｒｏａｄ ｔ，２Ｈ）
３．０６から４．８８（ｍ，１３Ｈ）
７．３９（ｓ，１Ｈ）
１３Ｃ−ＮＭＲ δ（６７．８ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ ６ 、 プロトンデカップリングスペクトル）
１１．７
１１．７
１２．６
１９．７および１９．９
２２．２および２２．４
２８．３
６０．６および６０．８
７０．０および７０．１
７１．１および７１．４
７１．９
７２．６および７２．９
７３．１
７３．８および７３．９
９８．８
１１６．６および１１６．７
１２０．２
１２０．８
１２２．５
１４４．２
１４５．１
質量スペクトル（ＦＡＢ）
ｍ／ｚ ３９８ （分子イオンピーク）
【００５８】
【外２】
実施例３
５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）で調整した１０（ｗ／ｖ）％α−サイクロデキストリン溶液１２０ｍｌに対し、ジメチルスルホキシドで調整した５（ｗ／ｖ）％の前記式（３）で示されるＲＳ−２−置換アルコール溶液２４ｍｌおよび１５００００Ｕの天野製薬株式会社製のバチルス マセランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｅｒａｎｓ）由来のシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼを加え、５０℃において４３時間反応させた。この時のＲＳ−２−置換アルコールのクロマノール配糖体への転換率はモル比で約５５％であり、この反応液中のクロマノール配糖体は、糖の結合数が１から８位の混合物であった。この反応液を１５分間煮沸処理することにより、シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼを失活させ、６００Ｕの東洋紡株式会社製のリゾップス属（Ｒｈｉｚｏｐ ｕｓ ｓｐ．）由来のグルコアミラーゼを添加し、５０℃において５時間反応させることにより、反応液中のクロマノール配糖体の約９５％以上を糖の結合数が１のものに変換した。この反応液を１０分間煮沸処理することにより、グルコアミラーゼを失活させた後、３０％メタノール溶液で平衡化したＸＡＤ−４（オルガノ株式会社製）カラムにアプライし、非吸着物を３０％メタノールで溶出後、８０％メタノール溶液でクロマノール配糖体を溶出させた。次に得られたクロマノール配糖体画分をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：メタノール、５：１、ｖ／ｖ）処理することで高純度のクロマノール配糖体：前記式（４）で示される６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−メチル−α−Ｄ−グルコピラノシドを約９５０ｍｇ得た。
【００６０】
この化合物の赤外吸収スペクトルを図３に示す。
【００６１】
本化合物の１ Ｈ−ＮＭＲ，１３Ｃ−ＮＭＲ，質量分析および比旋光度の結果を示す。
【００６２】
１ Ｈ−ＮＭＲ δ（２７０ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ ６ ）
１．２３および１．２５（ｓ，３Ｈ）
１．６９から１．７８（ｍ，１Ｈ）
１．９１から１．９３（ｍ，１Ｈ）
１．９７（ｓ，３Ｈ）
２．０２（ｓ，３Ｈ）
２．０４（ｓ，３Ｈ）
２．５１（ｂｒｏａｄ ｔ，２Ｈ）
３．０７から４．８８（ｍ，１３Ｈ）
７．４０（ｓ，１Ｈ）
１３Ｃ−ＮＭＲ δ（６７．８ＭＨｚ、 ＤＭＳＯ−ｄ ６ 、 プロトンデカップリングスペクトル）
１１．７
１１．７
１２．６
１９．９
２２．３
２８．２
６０．６
６９．９
７１．１
７１．９
７２．６
７３．０および７３．１
７３．８
９８．８
１１６．６および１１６．７
１２０．２
１２０．８および１２０．９
１２２．５
１４４．２
１４５．１
質量スペクトル（ＦＡＢ）
ｍ／ｚ ３９８ （分子イオンピーク）
【００６３】
【外３】
実施例４
５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）で調整した１０（ｗ／ｖ）％α−サイクロデキストリン溶液８０ｍｌに対し、ジメチルスルホキシドで調整した５（ｗ／ｖ）％の前記式（３）で示されるＲＳ−２−置換アルコール溶液１６ｍｌおよび１９０００Ｕの株式会社林原生物化学研究所製のバチルス ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼを加え、５０℃において４３時間反応させた。この時のＲＳ−２−置換アルコールのクロマノール配糖体への転換率はモル比で約９５％であり、この反応液中のクロマノール配糖体は、糖の結合数が１から８位の混合物であった。この反応液を１５分間煮沸処理することにより、シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼを失活させ、７０ｍｌの１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を加えた。そして２５００Ｕのシグマ（ＳＩＧＭＡ ＣＨＥＭＩＣＡＬ ＣＯ．）製ＴｙｐｅＩ−Ｂのスイートポテト由来のβ−アミラーゼを添加し、５０℃において４時間反応させることにより、反応液中のクロマノール配糖体の約９８％以上を糖の結合数が１と２のものに変換した。この反応液を１０分間煮沸処理することにより、β−アミラーゼを失活させた後、３０％メタノール溶液で平衡化したＸＡＤ−４（オルガノ株式会社製）カラムにアプライし、非吸着物を３０％メタノールで溶出後、８０％メタノール溶液でクロマノール配糖体を溶出させた。次に得られたクロマノール配糖体画分をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：メタノール、５：１、ｖ／ｖ）処理することで高純度のクロマノール配糖体：前記式（４）で示される６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−メチル−α−Ｄ−グルコピラノシドを約５２０ｍｇ、式（５）で示される６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−メチル−α−Ｄ−マルトピラノシドを約６１０ｍｇ得た。
【００６５】
得られた前記式（４）で示される６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−メチル−α−Ｄ−グルコピラノシドの赤外線吸収スペクトルは図２と同一であり、また１ Ｈ−ＮＭＲ，１３Ｃ−ＮＭＲ，質量分析および比旋光度の結果は実施例２と同一であった。
【００６６】
【化１１】
得られた前記式（５）で示される６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−メチル−α−Ｄ−マルトピラノシドの赤外吸収スペクトルを図４に示す。
【００６８】
本化合物の１ Ｈ−ＮＭＲ，１３Ｃ−ＮＭＲ，質量分析および比旋光度の結果を示す。
【００６９】
１ Ｈ−ＮＭＲ δ（２７０ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ ６ ）
１．２２および１．２５（ｓ，３Ｈ）
１．６９から１．７４（ｍ，１Ｈ）
１．８９（ｍ，１Ｈ）
１．９７（ｓ，３Ｈ）
２．０１（ｓ，３Ｈ）
２．０４（ｓ，３Ｈ）
２．５１（ｂｒｏａｄ ｔ，２Ｈ）
３．０９から５．４３（ｍ，２３Ｈ）
７．３９（ｓ，１Ｈ）
１３Ｃ−ＮＭＲ δ（６７．８ＭＨｚ、 ＤＭＳＯ−ｄ ６ 、 プロトンデカップリングスペクトル）
１１．７
１１．７
１２．６
１９．７および１９．８
２１．８および２２．３
２８．１および２８．５
５９．７および６０．２
６０．７
６９．７
７０．６および７０．７
７１．０
７１．５
７２．４および７２．５
７２．８および７２．９
７３．２
７３．３
７３．７および７３．９
７９．８
９８．４および９８．６
１００．８および１００．９
１１６．６
１２０．１および１２０．２
１２０．９
１２２．６
１４４．１および１４４．２
１４５．２
質量スペクトル（ＦＡＢ）
ｍ／ｚ ５６０ （分子イオンピーク）
【００７０】
【外４】
実施例５
５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）で調整した１０（ｗ／ｖ）％α−サイクロデキストリン溶液１２０ｍｌに対し、ジメチルスルホキシドで調整した５（ｗ／ｖ）％の前記式（３）で示されるＲＳ−２−置換アルコール溶液２４ｍｌおよび１５００００Ｕの天野製薬株式会社製のバチルス マセランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｅｒａｎｓ）由来のシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼを加え、５０℃において４３時間反応させた。この時のＲＳ−２−置換アルコールのクロマノール配糖体への転換率はモル比で約５５％であり、この反応液中のクロマノール配糖体は、糖の結合数が１から８位の混合物であった。この反応液を１５分間煮沸処理することにより、シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼを失活させ、１００ｍｌの１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を加えた。そして４０００Ｕのシグマ（ＳＩＧＭＡ ＣＨＥＭＩＣＡＬ ＣＯ．）製ＴｙｐｅＩ−Ｂのスイートポテト由来のβ−アミラーゼを添加し、５０℃において４時間反応させることにより、反応液中のクロマノール配糖体の約９８％以上を糖の結合数が１と２のものに変換した。この反応液を１０分間煮沸処理することにより、β−アミラーゼを失活させた後、３０％メタノール溶液で平衡化したＸＡＤ−４（オルガノ株式会社製）カラムにアプライし、非吸着物を３０％メタノールで溶出後、８０％メタノール溶液でクロマノール配糖体を溶出させた。次に得られたクロマノール配糖体画分をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：メタノール、５：１、ｖ／ｖ）処理することで高純度のクロマノール配糖体：前記式（４）で示される６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−メチル−α−Ｄ−グルコピラノシドを約４５０ｍｇ、前記式（５）で示される６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−メチル−α−Ｄ−マルトピラノシドを約４４０ｍｇ得た。
【００７２】
得られた前記式（４）で示される６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−メチル−α−Ｄ−グルコピラノシドの赤外吸収スペクトルは図３と同一であり、また１ Ｈ−ＮＭＲ，１３Ｃ−ＮＭＲ，質量分析および比旋光度の結果は実施例３と同一であった。
【００７３】
得られた前記式（５）で示される６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−メチル−α−Ｄ−マルトピラノシドの赤外吸収スペクトルを図５に示す。
【００７４】
本化合物の１ Ｈ−ＮＭＲ，１３Ｃ−ＮＭＲ，質量分析および比旋光度の結果を示す。
【００７５】
１ Ｈ−ＮＭＲ δ（２７０ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ ６ ）
１．２２および１．２６（ｓ，３Ｈ）
１．７５（ｍ，１Ｈ）
１．８９（ｍ，１Ｈ）
１．９７（ｓ，３Ｈ）
２．０２（ｓ，３Ｈ）
２．０３（ｓ，３Ｈ）
２．５０（ｂｒｏａｄ ｔ，２Ｈ）
３．０９から５．４３（ｍ，２３Ｈ）
７．３９（ｓ，１Ｈ）
１３Ｃ−ＮＭＲ δ（６７．８ＭＨｚ、 ＤＭＳＯ−ｄ ６ 、 プロトンデカップリングスペクトル）
１１．７
１１．７
１２．６
１９．８
２１．８および２２．３
２８．５
５９．７
６０．７
６９．７
７０．６および７０．７
７１．０
７１．４
７２．５
７２．９
７３．２
７３．３
７３．７および７３．９
７９．８
９８．４および９８．６
１００．８および１００．９
１１６．６
１２０．１および１２０．２
１２０．８
１２２．６
１４４．１
１４５．１
質量スペクトル（ＦＡＢ）
ｍ／ｚ ５６０ （分子イオンピーク）
【００７６】
【外５】
実施例６
５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で調整した６０（ｗ／ｖ）％マルトース溶液９０ｍｌに対し、ジメチルスルホキシドで調整した２．５（ｗ／ｖ）％の式（６）で示されるＲＳ−２−置換アルコール溶液３０ｍｌおよび４００Ｕの東洋紡株式会社製のサッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）由来のα−グルコシダーゼを加え、４０℃において２０時間反応させた。このときの２−置換アルコールのクロマノール配糖体への転換率はモル比で約５５％であった。この反応液を３０％メタノール溶液で平衡化したＸＡＤ−４（オルガノ株式会社製）カラムにアプライし、非吸着物を３０％メタノール溶液で溶出後、８０％メタノール溶液でクロマノール配糖体を溶出させた。次に得られたクロマノール配糖体画分をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：メタノール、７：１、ｖ／ｖ）処理することで高純度のクロマノール配糖体：式（７）で示される６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−エチルーα−Ｄ−グルコピラノシドを約５５０ｍｇ得た。
【００７８】
【化１２】
【化１３】
この化合物の赤外吸収スペクトルを図６に示す。
【００８１】
本化合物の １Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ、質量分析および比旋光度の結果を示す。
【００８２】
１Ｈ−ＮＭＲ δ（２７０ＭＨｚ、 ＤＭＳ０−ｄ ６ ）
１．２１および１．２２（ｓ，３Ｈ）
１．７６から１．８１（ｍ，４Ｈ）
１．９８（ｓ，３Ｈ）
２．０２（ｓ，３Ｈ）
２．０５（ｓ，３Ｈ）
２．５１（ｂｒｏａｄ ｔ，２Ｈ）
３．０３から４．８９（ｍ，１３Ｈ）
７．３９（ｓ，１Ｈ）
１３Ｃ−ＮＭＲδ（６７．８ＭＨｚ、ＤＭＳ０−ｄ ６ 、プロトンデカップリングスペクトル）
１１．６
１１．７
１２．７
２０．１
２４．０および２４．１
３１．５および３１．６
３７．９および３８．０
６０．７および６０．８
６２．９および６３．０
７０．１および７０．２
７１．８
７２．７および７２．８
７３．０および７３．１
７３．２
９８．６および９８．７
１１６．６
１２０．３
１２０．９
１２２．５
１４４．１
１４５．１
質量スペクトル（ＦＡＢ）
ｍ／ｚ ４１２ （分子イオンピーク）
【００８３】
【外６】
実施例７
５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）で調整した１０（ｗ／ｖ）％α−サイクロデキストリン溶液１２０ｍｌに対し、ジメチルスルホキシドで調整した２．５（ｗ／ｖ）％の式（６）で示されるＲＳ−２−置換アルコール溶液４０ｍｌおよび２００００Ｕの株式会社林原生物化学研究所製のバチルス ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼを加え、５０℃において４３時間反応させた。この時のＲＳ−２−置換アルコールのクロマノール配糖体への転換率はモル比で約３５％であり、この反応液中のクロマノール配糖体は、糖の結合数が１から８位の混合物であった。この反応液を１５分間煮沸処理することにより、シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼを失活させ、６００Ｕの東洋紡株式会社製のリゾップス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐ．）由来のグルコアミラーゼを添加し、５０℃において５時間反応させることにより、反応液中のクロマノール配糖体の約９５％以上を糖の結合数が１のものに変換した。この反応液を１０分間煮沸処理することにより、グルコアミラーゼを失活させた後、３０％メタノール溶液で平衡化したＸＡＤ−４（オルガノ株式会社製）カラムにアプライし、非吸着物を３０％メタノールで溶出後、８０％メタノール溶液でクロマノール配糖体を溶出させた。次に得られたクロマノール配糖体画分をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：メタノール、７：１、ｖ／ｖ）処理することで高純度のクロマノール配糖体：前記式（７）で示される６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−エチル−α−Ｄ−グルコピラノシドを約３９０ｍｇ得た。
【００８５】
この化合物の赤外吸収スペクトルを図７に示す。
【００８６】
本化合物の１ Ｈ−ＮＭＲ，１３Ｃ−ＮＭＲ，質量分析および比旋光度の結果を示す。
【００８７】
１ Ｈ−ＮＭＲ δ（２７０ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ ６ ）
１．２２（ｓ，３Ｈ）
１．７６から１．８１（ｍ，４Ｈ）
１．９８（ｓ，３Ｈ）
２．０１（ｓ，３Ｈ）
２．０５（ｓ，３Ｈ）
２．５１（ｂｒｏａｄ ｔ，２Ｈ）
３．０６から４．８６（ｍ，１３Ｈ）
７．３８（ｓ，１Ｈ）
１３Ｃ−ＮＭＲ δ（６７．８ＭＨｚ、 ＤＭＳＯ−ｄ ６ 、 プロトンデカップリングスペクトル）
１１．６
１１．７
１２．６
２０．１
２４．０および２４．１
３１．５および３１．６
３７．９および３８．０
６０．７および６０．８
６２．９および６３．０
７０．１
７１．８
７２．７および７２．８
７３．０および７３．１
７３．２
９８．６および９８．７
１１６．６
１２０．２
１２０．９
１２２．５
１４４．１
１４５．１
質量スペクトル（ＦＡＢ）
ｍ／ｚ ４１２ （分子イオンピーク）
【００８８】
【外７】
実施例８
５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）で調整した１０（ｗ／ｖ）％α−サイクロデキストリン溶液１２０ｍｌに対し、ジメチルスルホキシドで調整した２．５（ｗ／ｖ）％の前記式（６）で示されるＲＳ−２−置換アルコール溶液４０ｍｌおよび２００００Ｕの株式会社林原生物化学研究所製のバチルス ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼを加え、５０℃において４３時間反応させた。この時のＲＳ−２−置換アルコールのクロマノール配糖体への転換率はモル比で約３５％であり、この反応液中のクロマノール配糖体は、糖の結合数が１から８位の混合物であった。この反応液を１５分間煮沸処理することにより、シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼを失活させ、１１０ｍｌの１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）加えた。そして６０００Ｕのシグマ（ＳＩＧＭＡ ＣＨＥＭＩＣＡＬ ＣＯ．）製ＴｙｐｅＢ−Ｉのスイートポテト由来のβ−アミラーゼを添加し、５０℃において４時間反応させることにより、反応液中のクロマノール配糖体の約９８％以上を糖の結合数が１と２のものに変換した。この反応液を１０分間煮沸処理することにより、β−アミラーゼを失活させた後、３０％メタノール溶液で平衡化したＸＡＤ−４（オルガノ株式会社製）カラムにアプライし、非吸着物を３０％メタノールで溶出後、８０％メタノール溶液でクロマノール配糖体を溶出させた。次に得られたクロマノール配糖体画分をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：メタノール、７：１、ｖ／ｖ）処理することで高純度のクロマノール配糖体：前記式（７）で示される６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−エチル−α−Ｄ−グルコピラノシドを約１７０ｍｇ、式（８）で示される６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−エチル−α−Ｄ−マルトピラノシドを約２００ｍｇ得た。
【００９０】
得られた前記式（７）で示される６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−エチル−α−Ｄ−グルコピラノシドの赤外線吸収スペクトルは図７と同一であり、また１ Ｈ−ＮＭＲ，１３Ｃ−ＮＭＲ，質量分析および比旋光度の結果は実施例７と同一であった。
【００９１】
得られた式（８）で示される６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−エチル−α−Ｄ−マルトピラノシドの赤外線吸収スペクトルを図８に示す。
【００９２】
【化１４】
本化合物の１ Ｈ−ＮＭＲ，１３Ｃ−ＮＭＲ，質量分析および比旋光度の結果を示す。
【００９４】
１ Ｈ−ＮＭＲ δ（２７０ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ ６ ）
１．２１（ｓ，３Ｈ）
１．７８から１．８５（ｍ，４Ｈ）
１．９８（ｓ，３Ｈ）
２．０１（ｓ，３Ｈ）
２．０５（ｓ，３Ｈ）
２．５０（ｂｒｏａｄ ｔ，２Ｈ）
３．０６から５．４１（ｍ，２３Ｈ）
７．３８（ｓ，１Ｈ）
１３Ｃ−ＮＭＲ δ（６７．８ＭＨｚ、 ＤＭＳＯ−ｄ ６ 、 プロトンデカップリングスペクトル）
１１．６
１１．７
１２．６
２０．１
２３．８および２４．１
３１．５
３７．９および３８．０
６０．２
６０．７
６３．１
６９．８
７０．９
７１．０
７１．４
７２．５
７３．０
７３．０
７３．２および７３．３
７９．８
９８．４
１００．８
１１６．６
１２０．３
１２０．９
１２２．５
１４４．１
１４５．１
質量スペクトル（ＦＡＢ）
ｍ／ｚ ５７４ （分子イオンピーク）
【００９５】
【外８】
実施例９
実施例１〜５によって得られたクロマノール配糖体（前記式（４）、６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−メチル−α−Ｄ−グルコピラノシド）、実施例６〜８によって得られたクロマノール配糖体（前記式（７）、６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−エチル−α−Ｄ−グルコピラノシド）、実施例４〜５によって得られたクロマノール配糖体（前記式（５）、６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−メチル−α−Ｄ−マルトピラノシド）および実施例８によって得られたクロマノール配糖体（前記式（８）、６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−エチル−α−Ｄ−マルトピラノシド）の抗酸化活性をリノール酸メチルのラジカル連鎖自動連鎖反応の抑制により評価した。１３２μｍｏｌのリノール酸メチル、１６．５μｍｏｌの脂溶性ラジカル発生剤（２，２´−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル））、０．１μｍｏｌのクロマノール配糖体、ブチルヒドロキシトルエンまたはα−トコフェロールからなるヘキサン／イソプロピルアルコール（１：１、ｖ／ｖ）溶液１．１ｍｌを３７℃でインキュベートし、経時的にサンプリングし、高速液体クロマイトグラフィーでリノール酸メチルハイドロパーオキサイドの生成量を測定した。図９および図１０に示すように、クロマノール配糖体前記式（４）、前記式（５）、前記式（７）および前記式（８）の有機溶媒中における抗酸化活性はブチルヒドロキシトルエンより優れており、またα−トコフェロールと同等であることが判る。
【００９７】
実施例１０
実施例１〜５によって得られたクロマノール配糖体（前記式（４）、６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−メチル−α−Ｄ−グルコピラノシド）、実施例６〜８によって得られたクロマノール配糖体（前記式（７）、６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−エチル−α−Ｄ−グルコピラノシド）、実施例４〜５によって得られたクロマノール配糖体（前記式（５）、６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−メチル−α−Ｄ−マルトピラノシド）および実施例８によって得られたクロマノール配糖体（前記式（８）、６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−エチル−α−Ｄ−マルトピラノシド）の抗酸化活性を多重層リポソームのラジカル連鎖自動酸化反応の抑制により評価した。５．５μｍｏｌの卵黄ホスファチジルコリンの多重層リポソーム、１６．５μｍｏｌの水溶性ラジカル発生剤（２，２´−アゾビス（２−アミジノプロパン）二塩酸塩）、０．１μｍｏｌのクロマノール配糖体またはアスコルビン酸からなる反応液を１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）１．１ｍｌで調整後、３７℃でインキュベートし、経時的にサンプリングし、高速液体クロマイトグラフィーでホスファチジルコリンハイドロパーオキシサイドの生成量を測定した。図１１および図１２に示すように、クロマノール配糖体前記式（４）、前記式（５）、前記式（７）および前記式（８）は水溶性の抗酸化剤であるアスコルビン酸より、明らかに効果的な抗酸化剤であることが判る。
【００９８】
実施例１１
実施例１〜５によって得られたクロマノール配糖体（前記式（４）、６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−メチル−α−Ｄ−グルコピラノシド）、実施例６〜８によって得られたクロマノール配糖体（前記式（７）、６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−エチル−α−Ｄ−グルコピラノシド）、実施例４〜５によって得られたクロマノール配糖体（前記式（５）、６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−メチル−α−Ｄ−マルトピラノシド）および実施例８によって得られたクロマノール配糖体（前記式（８）、６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−エチル−α−Ｄ−マルトピラノシド）の熱に対する安定性を評価した。５ｍＭのクロマノール配糖体溶液（水／エタノール、１：３、ｖ／ｖ）を各温度条件でインキュベートし、所定時間でサンプリングし、残存量を高速液体クロマイトグラフィーで測定した。比較として前記式（３）および前記式（６）で示される２−置換アルコールおよびα−トコフェロール、トロロックスも同様に評価した。
【００９９】
表１および表２に１００時間後の残存率の結果を示す。これらの表により２−置換アルコールを配糖体化することによる熱安定性の向上が認められた。
【０１００】
【表１】
【表２】
実施例１２
実施例１〜５によって得られたクロマノール配糖体（前記式（４）、６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−メチル−α−Ｄ−グルコピラノシド）、実施例６〜８によって得られたクロマノール配糖体（前記式（７）、６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−エチル−α−Ｄ−グルコピラノシド）、実施例４〜５によって得られたクロマノール配糖体（前記式（５）、６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−メチル−α−Ｄ−マルトピラノシド）および実施例８によって得られたクロマノール配糖体（前記式（８）、６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−エチル−α−Ｄ−マルトピラノシド）の各ｐＨに対する安定性を評価した。各ｐＨの５．５ｍＭのクロマノール配糖体溶液（緩衝液／エタノール、５：１、ｖ／ｖ）を４０℃でインキュベートし、所定時間でサンプリングし、残存量を高速液体クロマイトグラフィーで測定した。比較として前記式（３）および前記式（６）で示される２−置換アルコールおよびトロロックスも同様に評価した。
【０１０３】
表３および４に１００時間後の残存率の結果を示す。これらの表により２−置換アルコールを配糖体化することによるｐＨ安定性の向上が認められた。なお、用いた緩衝液はｐＨ５．５：１００ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ７．０：１００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ８．５：１００ｍＭトリスー塩酸緩衝液である。
【０１０４】
【表３】
【表４】
実施例１３
実施例１〜５によって得られたクロマノール配糖体（前記式（４）、６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−メチル−α−Ｄ−グルコピラノシド）、実施例６〜８によって得られたクロマノール配糖体（前記式（７）、６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−エチル−α−Ｄ−グルコピラノシド）、実施例４〜５によって得られたクロマノール配糖体（前記式（５）、６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−メチル−α−Ｄ−マルトピラノシド）および実施例８によって得られたクロマノール配糖体（前記式（８）、６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−エチル−α−Ｄ−マルトピラノシド）の水に対する溶解度を評価した。過剰量のクロマノール配糖体を水１ｍｌに加え、２５℃でインキュベートし、２０時間撹拌（２００ｒｐｍ）後、サンプレップＣＯ２−ＬＧ（ミリポア社製）に液を移し、遠心分離（４１００×ｇ、１０分、２０℃）することにより不溶物を除去し、得られた水溶液中のクロマノール配糖体の溶解量を高速液体クロマトグラフィーで測定した。比較として前記式（３）および前記式（６）で示される２−置換アルコールおよびトロロックス同様に評価した。
【０１０７】
表５および６に示すようにクロマノール配糖体の優れた水に対する溶解性が明らかになった。表中の値は１ｍｌの水に溶解した量を示す。
【０１０８】
【表５】
【表６】
【発明の効果】
本発明による新規クロマノール配糖体およびその製造方法は、前記のとおりであるから新規であるばかりではなく、特に水溶液中において非常に有効な新規な抗酸化剤であり、また優れた熱およびｐＨ安定性により、化粧品、衣料品、食品、化成品などの原料として非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】は、本発明によるクロマノール配糖体の実施例１における赤外線吸収スペクトルである。
【図２】は、本発明によるクロマノール配糖体の実施例２における赤外線吸収スペクトルである。
【図３】は、本発明によるクロマノール配糖体の実施例３における赤外線吸収スペクトルである。
【図４】は、本発明によるクロマノール配糖体の実施例４における赤外線吸収スペクトルである。
【図５】は、本発明によるクロマノール配糖体の実施例５における赤外線吸収スペクトルである。
【図６】は、本発明によるクロマノール配糖体の実施例６における赤外線吸収スペクトルである。
【図７】は、本発明によるクロマノール配糖体の実施例７における赤外線吸収スペクトルである。
【図８】は、本発明によるクロマノール配糖体の実施例８における赤外線吸収スペクトルである。
【図９】は、本発明によるクロマノール配糖体の抗酸化活性を示すグラフである。
【図１０】は、本発明によるクロマノール配糖体の抗酸化活性を示すグラフである。
【図１１】は、本発明によるクロマノール配糖体の抗酸化活性を示すグラフである。
【図１２】は、本発明によるクロマノール配糖体の抗酸化活性を示すグラフである。
Claims (3)
- 一般式（１）
- 一般式（２）
- 一般式（１）
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