ES2345378B1 - Uso de un compuesto para la elaboracion de un medicamento destinado al tratamiento de una lesion producida por una reperfusion post-isquemica. - Google Patents
Uso de un compuesto para la elaboracion de un medicamento destinado al tratamiento de una lesion producida por una reperfusion post-isquemica. Download PDFInfo
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Abstract
Uso de un compuesto para la elaboración de un
medicamento destinado al tratamiento de una lesión producida por una
reperfusión post-isquémica.
La presente invención se refiere al uso del
compuesto CR-6
(3,4-dihidro-6-hidroxi-7-metoxi-2,2-dimetil-1(2H)-
benzopirano) o de un compuesto derivado, para el tratamiento de una lesión producida en determinados individuos como consecuencia de la reperfusión tras un episodio de isquemia cerebral. Esta lesión se denomina lesión por reperfusión y se asocia a determinados signos precoces como es la hiperemia reactiva cuando ocurre la reperfusión post-isquémica. En la presente invención se demuestra que no todos los individuos que han sufrido isquemia van a responder favorablemente al tratamiento con este compuesto, sino solamente aquellos que presenten signos de lesión por reperfusión, donde dicho signo es hiperperfusión o hiperemia reactiva. La hiperperfusión se considera que tiene lugar cuando el flujo sanguíneo cerebral aumenta por encimade un 20% del valor basal, condición que no se da en todos los sujetos que han sufrido isquemia/reperfusión cerebral.
benzopirano) o de un compuesto derivado, para el tratamiento de una lesión producida en determinados individuos como consecuencia de la reperfusión tras un episodio de isquemia cerebral. Esta lesión se denomina lesión por reperfusión y se asocia a determinados signos precoces como es la hiperemia reactiva cuando ocurre la reperfusión post-isquémica. En la presente invención se demuestra que no todos los individuos que han sufrido isquemia van a responder favorablemente al tratamiento con este compuesto, sino solamente aquellos que presenten signos de lesión por reperfusión, donde dicho signo es hiperperfusión o hiperemia reactiva. La hiperperfusión se considera que tiene lugar cuando el flujo sanguíneo cerebral aumenta por encimade un 20% del valor basal, condición que no se da en todos los sujetos que han sufrido isquemia/reperfusión cerebral.
Description
Uso de un compuesto para la elaboración de un
medicamento destinado al tratamiento de una lesión producida por una
reperfusión post-isquémica.
La presente invención se refiere al uso del
compuesto CR-6
(3,4-dihidro-6-hidroxi-7-metoxi-2,2-dimetil-1(2H)-benzopirano)
o de un compuesto derivado, para el tratamiento de una lesión
producida en determinados individuos como consecuencia de la
reperfusión tras un episodio de isquemia cerebral. Esta lesión se
denomina lesión por reperfusión y se asocia a determinados signos
precoces como es la hiperemia reactiva cuando ocurre la reperfusión
post-isquémica. En la presente invención se
demuestra que no todos los individuos que han sufrido isquemia van a
responder favorablemente al tratamiento con este compuesto, sino
solamente aquellos que presenten signos de lesión por reperfusión,
donde dicho signo es hiperperfusión o hiperemia reactiva. La
hiperperfusión se considera que tiene lugar cuando el flujo
sanguíneo cerebral aumenta por encima de un 20% del valor basal,
condición que no se da en todos los sujetos que han sufrido
isquemia/reperfusión cerebral.
La reperfusión es actualmente la mejor
estrategia para proteger el cerebro contra el daño isquémico, y la
trombolisis con rtPA es el único tratamiento aprobado para el ictus
isquémico (isquemia) en Europa y Norte América. Estudios preclínicos
han demostrado que una oclusión de la arteria cerebral media (ACM)
seguida de una reperfusión causa menos daño que una oclusión
permanente de la ACM en ratas (Menezawa et al., 1992.
Stroke, 23: 552-559; Rogers et al.,
1997. Stroke; 28: 2060-2065). No obstante, la
reperfusión conlleva algunos riesgos, como una transformación
hemorrágica o edema, los cuales podrían ser atribuidos, al menos en
parte, al daño o herida por reperfusión (Pan et al., 2007.
Neuroradiology, 49: 93-102). El daño
postisquémico asociado a la reperfusión está bien documentado en el
corazón (Kutala et al., 2007. Antioxid. Redox Signal.
9: 1193-1206) y en los órganos trasplantados
(Jamieson y Friend, 2008. Front. Biosci., 13:
221-235), pero la evidencia de que ocurre lesión por
reperfusión en el cerebro humano ha resultado más difícil de
encontrar. Datos experimentales obtenidos en ciertos modelos de
ratas sometidas a la oclusión intraluminal de la ACM (Aronowski
et al., 1997. J. Cereb. Blood Flow Metab., 17:
1048-1056) evidencian el daño de la reperfusión en
el contexto preclínico. Estos estudios evidencian que las
manifestaciones del daño por reperfusión pueden depender de varios
factores como la duración de la oclusión de la ACM o factores
genéticos. Esto sugiere que la lesión por reperfusión podría ser una
variable en el ictus humano (isquémico o hemorrágico), así como
factores genéticos también podrían estar involucrados, al igual que
la duración y el grado de reducción del flujo pueden diferir en cada
paciente. El daño por reperfusión se atribuye a varios efectos de
ésta, como el estrés oxidativo (Chan, 1996. Stroke, 27:
1124-1129), el daño de la barrera hematoencefálica
(BBB) (del Zoppo y Mabuchi, 2003. J. Cereb. Blood Flor.
Metab., 23: 879-894), y de la acumulación de
leucocitos en los vasos sanguíneos (del Zoppo et al., 1991.
Stroke, 22: 1276-1283), la infiltración al
parénquima cerebral (Zhang et al., 1994. J. Neurol.
Sci., 125: 3-10) de plaquetas (Chong et
al., 2001. Acta Pharmacol. Sin., 22:
679-684), la activación del complemento (D' Ambrosio
et al., 2001. Mol. Med., 7: 367-382) y
la transformación hemorrágica (Pan et al., 2007.
Neuroradiology, 49: 93-102). La reperfusión
puede inducir un incremento en el flujo sanguíneo por encima de
niveles basales, como se ha visto en animales (Tasdemiroglu et
al., 1992. Am. J. Phvsiol., 263:H533-6;
Tsuchidate et al., 1997. J. Cereb. Blood Flow. Metab.,
17: 1066-1073). En humanos, la hiperperfusión
después de una trombolisis se encontró en el 40% de los pacientes
(Kidwell et al., 2001. Neurology, 57:
2015-2021).
El CR-6 es un derivado sintético
de la vitamina E con capacidad de secuestrar especies reactivas de
nitrógeno. Se ha demostrado previamente que CR-6
tiene efectos beneficiosos contra el daño causado por el estrés
oxidativo in vitro (Montoliu et al., 1999. Biochem.
Pharmacol., 58: 255-61; Sanvicens et al.,
2006. J. Neurochem., 98: 735-747) e in
vivo (Miranda et al., 2007. Free Radic. Biol.
Med., 43: 1494-1498). Los ensayos clínicos con
otros compuestos antioxidantes para el tratamiento de la
isquemia/reperfusión han fracasado, pese a las evidencias
preclínicas de sus beneficios. Por tanto, sería necesario aumentar
el número de recuperaciones de pacientes que sufran lesiones como
consecuencia de haber padecido una isquemia.
La presente invención se refiere al uso del
compuesto CR-6
(3,4-dihidro-6-hidroxi-7-metoxi-2,2-dimetil-1(2H)-benzopirano)
o de un compuesto derivado, para el tratamiento de una lesión
producida como consecuencia de una hiperperfusión ocurrida después
de una isquemia. En la presente invención se demuestra que no todos
los individuos que han sufrido isquemia van a responder
favorablemente al tratamiento con CR-6 o de un
compuesto derivado, sino solamente aquellos que presenten signos de
lesión por reperfusión, donde la reperfusión es hiperperfusión o
hiperemia reactiva. La hiperperfusión se considera que tiene lugar
cuando el flujo sanguíneo cerebral aumenta por encima de un 20% de
los valores basales, condición que no se da en todos los sujetos que
han sufrido isquemia/reperfusión cerebral.
CR-6 o compuestos derivados
mejoran la eficacia del tratamiento de daños por isquemia con
reperfusión consiguiendo un efecto sorprendente en el tratamiento de
las lesiones. El significado del término eficacia que se emplea en
la presente invención se refiere al mayor número de recuperaciones
de individuos, tratados con CR-6 o derivados, que
sufren lesiones asociadas a hiperemia
post-isquémica, respecto del colectivo de pacientes
con isquemia con reperfusión que no muestran signos que anticipan
que se va a producir lesión por reperfusión. Gracias a este aumento
de la eficacia se pueden seleccionar antioxidantes derivados de
CR-6, no contemplados en el estado de la técnica
para este uso, para poder curar las lesiones citadas y asimismo,
esta selección evitaría el posible abandono del tratamiento de la
isquemia con reperfusión con estos compuestos por falta de eficacia
en el colectivo de pacientes que padezcan isquemia con reperfusiones
de cualquier tipo, con hiperemia o sin ella.
Es decir, la selección de pacientes con las
características citadas, es un aspecto determinante en el
tratamiento de la isquemia con reperfusión mediante
CR-6 o sus derivados cuando aparecen signos precoces
que anticipan que se va a producir lesión por reperfusión. Un signo
precoz es la hiperperfusión o hiperemia reactiva cuando ocurre la
reperfusión post-isquémica. La hiperperfusión se
considera que tiene lugar cuando el flujo sanguíneo cerebral aumenta
por encima de un 20% del valor basal.
Como se muestra en los ejemplos, se ha ensayado
el compuesto CR-6 en ratas sometidas a un episodio
de isquemia cerebral por oclusión de la arteria cerebral media de 90
minutos de duración, seguido de reperfusión. CR-6 se
ha administrado de forma oral dos horas después del comienzo de la
isquemia. De estos resultados se deriva que es factible trasladar
este tratamiento a la práctica clínica. Además, se ha valorado el
déficit neurológico de los animales, se ha cuantificado el volumen
de infarto cerebral, el flujo sanguíneo durante la isquemia y en la
reperfusión, y se ha correlacionado la hiperperfusión con un mayor
daño cerebral. También se ha determinado el contenido tisular de
glutatión, y se ha determinado la expresión en el cerebro de
proteínas pro- inflamatorias como la isoforma inducible de la
ciclooxigenasa (Cox-2), que se ha localizado
primordialmente en neuronas de la zona afectada por la isquemia.
Los resultados muestran que CR-6
atenúa el déficit neurológico, reduce el volumen de infarto
cerebral, reduce el consumo de glutatión, así como ciertos procesos
inflamatorios, y previene la rotura de la barrera hematoencefálica,
particularmente en los sujetos que desarrollan hiperemia
reactiva.
En determinados sujetos, la reperfusión puede
inducir un daño adicional denominado "lesión por reperfusión"
caracterizada por mayor estrés oxidativo, mayor consumo de
antioxidantes endógenos (glutatión), mayor rotura de barrera
hematoencefálica, mayor activación de ciertas vías de señalización
relacionadas con estrés oxidativo y con inflamación, y como
consecuencia de todo ello se produce mayor daño cerebral y mayor
déficit neurológico. Uno de los marcadores de este tipo de lesión es
la hiperemia reactiva que se asocia a esta lesión por reperfusión.
Por tanto, el tratamiento con CR-6 en la
isquemia/reperfusión sería adecuado si se detecta hiperemia reactiva
u otro signo precoz de lesión por reperfusión. La hiperemia reactiva
se detecta con técnicas que permiten valorar la perfusión cerebral,
por ejemplo, pero sin limitarse, con láser Doppler o técnicas no
invasivas de neuroimagen como por ejemplo pero sin limitarse, la
tomografía computerizada o resonancia magnética. Estas técnicas se
aplican de manera rutinaria en la práctica clínica.
En este sentido, un aspecto de la presente
invención es el uso de un compuesto de fórmula general (I), para la
elaboración de un medicamento destinado al tratamiento de una lesión
producida por una reperfusión post-isquémica, donde
el flujo sanguíneo de la reperfusión es igual o mayor de un 20% del
valor basal,
El compuesto tiene la fórmula general (I), donde
R_{1} y R_{4} son iguales o diferentes y se seleccionan de entre
H ó un alquilo que tiene de entre 1 y 4 átomos de carbono
(C_{1}-C_{4});
R_{2} y R_{3} son iguales o diferentes y se
seleccionan de entre H, OH, un alquilo que tiene de entre 1 y 4
átomos de carbono (C_{1}-C_{4}) o un alcoxilo
(OR_{a});
R_{5} se selecciona de entre H ó un grupo
alquilo que tiene de entre 1 y 4 átomos de carbono
(C_{1}-C_{4}) y
R_{6} es un grupo alquilo lineal o ramificado
que tiene de entre 1 y 10 átomos de carbono
(C_{1}-C_{10}).
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El término "alquilo" se refiere, en la
presente invención, a cadenas alifáticas, lineales o ramificadas,
que tienen de 1 a 10 átomos de carbono, por ejemplo, metilo, etilo,
n-propilo, i-propilo,
n-butilo, terc-butilo,
sec-butilo, n-pentilo,
n-hexilo, etc. Preferiblemente el grupo alquilo
tiene entre 1 y 4 átomos de carbono.
El término "alcoxilo" se refiere en la
presente invención a un grupo de fórmula -OR_{a} en la que R_{a}
es un alquilo (C_{1}-C_{4}), por ejemplo, pero
sin limitarse a metoxilo, etoxilo ó propoxilo.
Una realización preferida de la presente
invención es el uso del compuesto de fórmula general (I), o de
cualquiera de sus sales, donde R_{1} es H, R_{2} es un alcoxilo
(O-(C_{1})), R_{3} es un hidroxilo, R_{4} es H, R_{5} es un
grupo alquilo (C_{1}-C_{4}) y R_{6} es un
grupo alquilo (C_{1}-C_{4}). Una realización aún
más preferida es el uso del compuesto de fórmula general (I), donde
R_{5} es un grupo metilo y R_{6} es también un grupo metilo.
En adelante, se hará referencia a cualquiera de
los compuestos anteriores como "compuestos de la invención" o
"compuestos de la presente invención".
El medicamento comprende, al menos, cualquiera
de los compuestos de la invención. Cualquiera de los compuestos de
la presente invención, derivados farmacéuticamente aceptables o sus
profármacos, se formulan en una composición farmacéutica apropiada,
en la cantidad terapéuticamente efectiva, junto con uno o más
vehículos, adyuvantes o excipientes farmacéuticamente aceptables. El
medicamento se emplea para el tratamiento de una lesión por
reperfusión (post-isquémica) que se manifiesta con
signos como la hiperemia reactiva (hiperperfusión
post-isquémica), donde el flujo sanguíneo de la
reperfusión es igual o mayor de un 20% del valor basal.
Por un "derivado farmacéuticamente
aceptable" se entiende cualquier sal, farmacéuticamente aceptable
o cualquier otro compuesto que después de su administración, es
capaz de proporcionar (directa o indirectamente) cualquiera de los
compuestos de la invención.
Un "vehículo farmacéuticamente aceptable"
se refiere a aquellas sustancias, o combinación de sustancias,
conocidas en el sector farmacéutico, utilizadas en la elaboración de
formas farmacéuticas de administración e incluye, pero sin
limitarse, sólidos, líquidos, disolventes o tensioactivos.
El término "tratamiento" tal como se
entiende en la presente invención supone combatir los efectos
causados como consecuencia de una reperfusión post- isquémica para
estabilizar el estado de los individuos o prevenir daños
posteriores. El término "prevención" tal como se entiende en la
presente invención consiste en evitar la aparición de daños cuya
causa sea la reperfusión post-isquémica.
La perfusión es la acción de introducir lenta y
continuamente un líquido, como la sangre o una sustancia
medicamentosa, por vía intravenosa o en el interior de órganos,
cavidades o conductos. El término "reperfusión" hace referencia
a la restauración del flujo sanguíneo después de la ocurrencia de
una isquemia. La restauración del flujo sanguíneo se produce de
forma espontánea, aunque en este caso la restauración es muy lenta,
o se produce de forma inducida por medio de la administración de
compuestos que se encargan de deshacer el trombo cuando ésta es la
causa de la isquemia. En este último caso, se suele administrar un
tratamiento trombolítico con activador de plasminógeno tisular
recombinante rt-PA y a partir del momento en el que
se administra el compuesto trombolítico se comienza la restauración
del flujo sanguíneo a la zona afectada.
En la presente invención, la reperfusión
post-isquémica donde el flujo sanguíneo de la
reperfusión es igual o mayor de un 20% del valor basal se denomina
hiperperfusión. El término "hiperperfusión" tal como se
entiende en la presente invención es el fluir de la sangre por el
interior de órganos, cavidades o conductos con un flujo sanguíneo
superior al flujo que se da en un individuo en condiciones normales
(valores basales). En la presente invención, el término hiperemia
puede emplearse como un sinónimo de hiperperfusión.
El término "post-isquémica"
indica que la hiperperfusión se da después de una isquemia. La
isquemia es una reducción del flujo sanguíneo hasta niveles que son
insuficientes para mantener el metabolismo necesario para la función
y estructura normales de un tejido o de un órgano. La reducción del
flujo sanguíneo causa la disminución del aporte de oxígeno a las
células de un tejido biológico y como consecuencia se puede llegar a
la muerte celular. La causa de una isquemia puede ser, pero sin
limitarse, una embolia causada por un émbolo que provoca la oclusión
o bloqueo de un vaso sanguíneo de menor diámetro al del émbolo.
El término "hiperperfusión
post-isquémica" se utiliza como sinónimo de
"hiperemia reactiva". A lo largo de la memoria, estos dos
términos se pueden utilizar indistintamente.
En la presente invención, el medicamento se
destina al tratamiento de una lesión producida por una reperfusión
post-isquémica, donde dicha reperfusión presenta un
flujo sanguíneo igual o mayor de un 20% del valor basal. El término
"valor basal" tal como se entiende en la presente invención se
refiere al valor del flujo sanguíneo de un individuo antes de que se
produzca la isquemia o bien al valor del flujo sanguíneo de la
región homologa del hemisferio cerebral contralateral. El valor del
flujo sanguíneo de la vasculatura del hemisferio en el que no se
produce la isquemia puede servir para establecer el valor basal con
el que comparar el valor del flujo sanguíneo cuando se produce la
reperfusión. Tal como se ha comentado anteriormente, en los casos en
que la causa de la isquemia es un trombo se suele administrar un
tratamiento trombolítico con activador de plasminógeno tisular
recombinante rt-PA y a partir del momento en el que
se administra el compuesto trombolítico se comienza la restauración
del flujo sanguíneo a la zona afectada. En ese momento se puede
llevar a cabo la medida del flujo sanguíneo para compararla con el
flujo basal.
La hiperperfusión reactiva se puede detectar con
técnicas que permiten valorar el flujo sanguíneo cerebral de la
reperfusión cerebral como por ejemplo, pero sin limitarse, láser
Doppler o técnicas no invasivas de neuroimagen como la tomografía
computerizada o resonancia magnética.
La hiperperfusión puede ocurrir en cualquier
parte del cuerpo de un animal después de sufrir una isquemia que se
selecciona de la lista que comprende, pero sin limitarse, isquemia
cerebral, isquemia miocárdica o isquemia renal. Preferiblemente el
animal es un mamífero. Preferiblemente el mamífero es un humano.
Los ejemplos que se presentan en la presente
invención se llevan a cabo in vivo en ratas. El efecto
conseguido mediante la administración del compuesto de la presente
invención al mamífero rata, puede extrapolarse al resto de mamíferos
ya que los mecanismos de acción de cualquiera de los compuestos de
la invención, se conservan en todos los mamíferos. Por otra parte se
ha demostrado que la hiperperfusión en pacientes después de sufrir
una isquemia, no sólo ocurre en ratas sino que también puede ocurrir
en pacientes, o bien de forma espontánea, o después de
administración de un tratamiento trombolítico con activador de
plasminógeno tisular recombinante rt-PA (Kidwell
et al., 2001. Neurology,
57:2015-2021).
Otra realización preferida se refiere al uso del
compuesto donde la hiperperfusión post-isquémica es
cerebral. A título informativo, las causas más frecuentes de
isquemia cerebral son: infarto lacunar (en pacientes con
hipertensión vascular), infartos dependientes de las carótidas (por
mecanismos hemodinámicos) o embolias cerebrales de origen
cardíaco.
Según otra realización preferida, el medicamento
se presenta en una forma adaptada a la administración oral o
parenteral. Una realización más preferida se refiere a un compuesto
donde el medicamento se presenta en una forma adaptada a la
administración oral.
En cada caso la forma de presentación del
medicamento se adaptará al tipo de administración utilizada, por
ello, la composición de la presente invención se puede presentar
bajo la forma de soluciones o cualquier otra forma de administración
clínicamente permitida y en una cantidad terapéuticamente
eficaz.
La forma adaptada a la administración oral se
refiere a un estado físico que pueda permitir su administración
oral. La forma adaptada a la administración oral se selecciona de la
lista que comprende, pero sin limitarse, gotas, jarabe, tisana,
elixir, suspensión, suspensión extemporánea, vial bebible,
comprimido, cápsula, granulado, sello, píldora, tableta, pastilla,
trocisco o liofilizado.
La forma adaptada a la administración parenteral
se refiere a un estado físico que pueda permitir su administración
inyectable, es decir, preferiblemente en estado líquido. La
administración parenteral se puede llevar a cabo por vía de
administración intramuscular, intraarterial, intravenosa,
intradérmica, subcutánea o intraósea pero sin limitarse únicamente a
estos tipos de vías de administración parenteral. El compuesto de
fórmula general (I) puede ir asociado, por ejemplo, pero sin
limitarse, con liposomas o micelas. Un liposoma es una vesícula
esférica con una membrana fosfolipídica. El liposoma contiene un
núcleo de solución acuosa. La micela es un lípido esférico que
contiene material no acuoso. Tanto los liposomas como las micelas
pueden utilizarse como transportadores de diversas sustancias entre
el exterior y el interior de la célula.
Otra posibilidad es que el medicamento se
presente en una forma adaptada a la administración sublingual,
nasal, intracatecal, bronquial, linfática, rectal, transdérmica o
inhalada. La forma adaptada a la administración rectal se selecciona
de la lista que comprende, pero sin limitarse, supositorio, cápsula
rectal, dispersión rectal o pomada rectal. La forma adaptada a la
administración transdérmica se selecciona de la lista que comprende,
pero sin limitarse, parche transdérmico o iontoforesis.
Otra realización preferida se refiere al uso del
compuesto, donde el medicamento incluye al menos un excipiente
farmacológicamente aceptable.
El término "excipiente" hace referencia a
una sustancia que ayuda a la absorción de cualquiera de los
compuestos de la presente invención (sustancia activa), estabiliza
dicha sustancia activa o ayuda a la preparación del medicamento en
el sentido de darle consistencia o aportar sabores que lo hagan más
agradable. Así pues, los excipientes podrían tener la función de
mantener los ingredientes unidos como por ejemplo almidones,
azúcares o celulosas, función de endulzar, función de colorante,
función de protección del medicamento como por ejemplo para aislarlo
del aire y/o la humedad, función de relleno de una pastilla, cápsula
o cualquier otra forma de presentación como por ejemplo el fosfato
de calcio dibásico, función desintegradora para facilitar la
disolución de los componentes y su absorción en el intestino, sin
excluir otro tipo de excipientes no mencionados en este párrafo.
El término excipiente "farmacológicamente
aceptable" hace referencia a que el excipiente esté permitido y
evaluado de modo que no cause daño a los organismos a los que se
administra.
Además, el excipiente debe ser
farmacológicamente adecuado, es decir, un excipiente que permita la
actividad del principio activo o de los principios activos, es
decir, que sea compatible con el principio activo, en este caso, el
principio activo es cualquiera de los compuestos de la presente
invención.
Otra realización preferida se refiere al uso de
cualquiera de los compuestos de la invención, donde el medicamento
incluye al menos un vehículo farmacológicamente aceptable.
\newpage
El vehículo, al igual que el excipiente, es una
sustancia que se emplea en el medicamento para diluir cualquiera de
los compuestos de la presente invención hasta un volumen o peso
determinado. El vehículo farmacológicamente aceptable es una
sustancia inerte o de acción análoga a cualquiera de los compuestos
de la presente invención. La función del vehículo es facilitar la
incorporación de otros compuestos, permitir una mejor dosificación y
administración o dar consistencia y forma al medicamento. Cuando la
forma de presentación es líquida, el vehículo farmacológicamente
aceptable es el diluyente.
Según otra realización preferida, el vehículo
farmacológicamente aceptable es una sustancia grasa y el medicamento
se presenta en una forma adaptada a la administración oral. Una
realización más preferida se refiere al uso de un compuesto para la
elaboración de un medicamento donde la sustancia grasa del vehículo
farmacológicamente aceptable es aceite de oliva.
Cualquiera de los compuestos de la presente
invención es liposoluble, es decir, es capaz de disolverse en una
solución que tenga una sustancia grasa. El término "sustancia
grasa" tal como se entiende en la presente invención es una
sustancia formada mayoritariamente por ácidos grasos. La sustancia
grasa se selecciona, por ejemplo, pero sin limitarse, de grasa de
origen animal, grasa de origen vegetal o grasa de origen
artificial.
Otra realización preferida de la presente
invención se refiere al uso del compuesto descrito anteriormente
donde el medicamento comprende además otra sustancia activa. Esta
sustancia activa debe permitir la actividad de cualquiera de los
compuestos de la invención, es decir, debe ser compatible.
Otra realización preferida se refiere al uso del
compuesto descrito anteriormente donde el medicamento se administra
en dos tomas de 100 mg de compuesto por kilogramo (Kg) de peso
corporal, por vía oral. Según una realización más preferida, la
primera toma se administra a partir de entre el momento en el que se
produce la reperfusión y 60 minutos después del inicio de la
reperfusión. Una realización aún más preferida se refiere al uso
donde el medicamento se administra a partir de entre 15 y 45 minutos
después del inicio de la reperfusión.
Según otra realización preferida las dos tomas
se administran con una diferencia de tiempo de entre 4 y 8 horas. Es
decir, si la primera toma se realiza a los 30 minutos desde el
inicio de la reperfusión, la segunda toma se realizará entre las 4
horas y 30 minutos desde el inicio de la reperfusión y las 8 horas y
30 minutos desde el inicio de la reperfusión.
La administración del medicamento se lleva a
cabo en un animal. Preferiblemente el animal es un mamífero.
Preferiblemente el mamífero es un humano. El término "toma" tal
como se entiende en la presente invención es cada una de las veces
que se administra el medicamento por vía oral. La dosis de cada una
de las tomas es de 100 mg de cualquiera de los compuestos de la
presente invención por kilogramo (Kg) de de peso corporal. El
medicamento se administra en dos tomas que se realizan después del
inicio de la reperfusión post-isquémica, a partir de
entre 15 y 45 minutos después del inicio. Las dos tomas se
administran separadas por un intervalo de tiempo de entre 4 y 8
horas.
A lo largo de la descripción y las
reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no
pretenden excluir otras características técnicas, aditivos,
componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos,
ventajas y características de la invención se desprenderán en parte
de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Las
siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración,
y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
Con la intención de complementar la descripción
que se ha llevado a cabo, así como de ayudar a un mejor
entendimiento de las características de la invención, de acuerdo con
algunos ejemplos realizados, se muestran aquí, con carácter
ilustrativo y no limitante, las siguientes figuras:
Fig. 1. Muestra el volumen de infarto después
de la isquemia transitoria y permanente. ** p<0.01
A: En el eje de ordenadas, se representa el
volumen de infarto (I) en mm^{3} en función del tipo de
isquemia.
B: En el eje de ordenadas se representa la
puntuación obtenida en el test neurológico en función del tipo de
isquemia. En la isquemia permanente se analizan 5 individuos. En la
isquemia transitoria se analizan 18 individuos.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig. 2. Muestra el efecto de la
administración del agente antioxidante CR-6 (dos
dosis a las 2 y 8 h después de la oclusión de la ACM).
Volumen infartado (p\leq0.05) (A): (I).
Valoración neurológica (p\leq0.05)(2B) (N). Medidas del volumen
infartado en córtex (C): (IC). Medidas del volumen infartado en
subcórtex (D): (IS). Volumen infartado después de la isquemia
permanente (E): (I). Valoración neurológica (F): (N). En A, B, C y D
se analizan 16 individuos a los que se les ha administrado sólo el
vehículo y 14 individuos a los que se les ha administrado
CR-6 junto con el vehículo. En E y F se analizan 5
individuos control y 4 individuos a los que se les ha administrado
CR-6 junto con el vehículo.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig. 3. Muestra el efecto de una dosis única
de CR-6 sobre el volumen de infarto y sobre el
déficit neurológico.
A. Efecto de una dosis única de
CR-6 sobre el volumen de infarto. En el eje de
ordenadas se representa el volumen infartado (I) en mm^{3}. En el
eje de abcisas se representan los valores medios del volumen
infartado de 18 individuos a los que se les ha administrado el
vehículo, 16 individuos a los que se les ha administrado
CR-6 y 8 individuos a los que se les administró
CR-6 únicamente 30 minutos después de la
reperfusión.
B: En el eje de ordenadas se representa la
puntuación obtenida en el test neurológico con una dosis única del
vehículo (6 individuos) o de CR-6 con el vehículo (8
individuos).
\vskip1.000000\baselineskip
Fig. 4. Muestra la influencia de la
administración de CR-6 en los niveles de
GSH.
A: En el eje de ordenadas se representa la
concentración de GSH cortical (nmol/mg de proteína) en el córtex.
CR-6 previene la caída de GSH en el córtex después
de que los individuos sufran una isquemia.
B: En el eje de ordenadas se representa la
concentración de GSH (nmol/mg de proteína) en el núcleo estriado.
Hay dos regiones cerebrales afectadas por la isquemia: la corteza (o
córtex) y el estriado. CR-6 previene la caída de GSH
en el córtex después de que los individuos sufran una isquemia.
C: En el eje de ordenadas se representa el
volumen de infarto (I) en mm^{3} frente a la concentración de GSH
tanto para individuos a los que se administra el vehículo como a los
que se administra CR-6 más el vehículo.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig. 5. Muestra la expresión neuronal de
Cox-2 después de la isquemia y el efecto de
CR-6. Magnifcación x200.
Fig. 6. Muestra el resultado de la isquemia
en función de si hubo (SI) o no (NO) hiperemia.
A: En el eje de ordenadas se representa el
infarto de volumen (Log mm^{3}) frente al flujo sanguíneo en la
reperfusión (Log del porcentaje de incremento respecto del flujo
sanguíneo basal) en el eje de abcisas.
B: En el eje de ordenadas se representa el
porcentaje de flujo en la reperfusión de 5 individuos sin hiperemia
(NO) y de 13 individuos con hiperemia (SI), todos ellos
administrados con el vehículo.
C: En el eje de ordenadas se representa el
volumen de infarto en los grupos que se han comentado para la figura
B.
D: En el eje de ordenadas se representa la
puntación de la valoración neurológica en los grupos que se han
comentado anteriormente.
E: En el eje de ordenadas se representa el
volumen de infarto cortical en los grupos que se han comentado
anteriormente.
F: En el eje de ordenadas se representa el
volumen de infarto subcortical en los grupos que se han comentado
anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig. 7. Muestra el efecto de
CR-6 y vehículo (aceite de oliva) en animales
hiperémicos (SI) y no hiperémicos (NO).
Los términos SI y NO siempre hacen referencia a
si hubo o no hiperemia. Por ejemplo, vehículo-SI =
administrado con vehículo, con hiperemia;
vehículo-NO = administrado con vehículo, sin
hiperemia.
En los ejes de abcisas se representan los
valores medios de determinados parámetros en los siguientes grupos
de individuos: 5 individuos a los que se les administra el vehículo
y que no desarrollan hiperemia, 13 individuos a los que se les
administra el vehículo y que sí desarrollan hiperemia, 7 individuos
a los que se les administra CR-6 y que no
desarrollan hiperemia, y 7 individuos a los que se les administra
CR-6 y que sí desarrollan hiperemia. Los parámetros
que se representan en cada uno de los ejes de ordenadas son:
porcentaje de flujo sanguíneo respecto del flujo basal en la
reperfusión (A), porcentaje de flujo sanguíneo respecto del flujo
basal durante la oclusión de la arteria cerebral media, MCA (B),
volumen de infarto (C), valoración neurológica (D), medidas del
volumen infartado en córtex (E) y medidas del volumen infartado en
subcórtex (F).
\vskip1.000000\baselineskip
Fig. 8. Muestra cómo la hiperemia (SI) se
asocia a rotura de BHE y cómo CR-6 atenúa dicho
efecto.
En el eje de ordenadas se representa la
concentración de Evans Blue (Azul de Evans) en el grupo de
individuos a los que no se administra ni vehículo ni
CR-6 y a los que sí que se les administra vehículo o
CR-6 (junto con su vehículo).
\vskip1.000000\baselineskip
Fig. 9. Muestra el número de neutrófilos por
área de tejido isquémico en función de si los animales desarrollaron
hiperemia y del tratamiento recibido.
En el eje de ordenadas se representa el valor
medio del nº de células MPO+ por área En las imágenes de microscopía
en las que se ha realizado una tinción para ver los neutrófilos
marcados por inmunohistoquímica con un anticuerpo
anti-mieloperoxidasa (MPO) se ha contado el número
de células positivas por área.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig. 10. Muestra la formación de ión
superóxido en la arteria cerebral media (MCA) en el grupo de ratas
tratadas sólo con el vehículo pero no en el grupo de ratas tratadas
con CR-6, según tinción con dihidroetidio
(DHE).
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación se ilustrará la invención
mediante unos ensayos ilustrativos y de carácter no limitante,
realizados por los inventores que describen el uso de prolactina
para la hepatoprotección y regeneración de células hepáticas.
\vskip1.000000\baselineskip
Fueron usadas ratas macho adultas
Sprague-Dawley (Harlan, Spain) de entre 300 y
350 gramos de peso. El trabajo con los animales se llevó a cabo de
acuerdo con la legislación local y con la aprobación del Comité
Ético de la Universidad de Barcelona y de acuerdo con la legislación
Europea vigente. Los animales se mantuvieron respetando el ciclo de
vigilia/sueño de 12 h, y controlando las condiciones ambientales de
temperatura y humedad, y se les dio agua y comida ad libitum.
La anestesia utilizada en las intervenciones quirúrgicas fue
isofluorano.
La isquemia cerebral focal fue inducida por
oclusión intraluminal de la arteria cerebral media (ACM) derecha
(Justicia et al., 2006 J. Cereb. Blood Flow Metab.,
26: 321-32). Un grupo de ratas fueron sometidas a 90
minutos de isquemia seguida de reperfusión, mientras que otro grupo
fue sometido a una isquemia permanente. Las ratas fueron
anestesiadas con isofluorano e intubadas por la tráquea bajo
ventilación controlada. Durante todo el procedimiento quirúrgico se
obtuvieron varias muestras sanguíneas para la determinación de gases
en sangre. La presión arterial fue monitorizada durante todo el
procedimiento y la temperatura corporal mantenida entre 36,5 y
37,5ºC. La arteria carótida común y externa fueron expuestas y la
arteria pterigopalatina fue ligada. Un filamento de nylon (4/0,
looksutures, Havard-Apparatus) de 21 mm se introdujo
a través de la arteria carótida externa hasta el nivel donde se
ramifica la ACM. Este filamento fue cautelosamente retirado en el
grupo sometido a la reperfusión tras 90 minutos de la oclusión, y la
ligadura de la ACM fue desecha permitiendo la reperfusión. En el
grupo sometido a una isquemia permanente el filamento intraluminal
se mantuvo en su sitio sin ser retirado. Las ratas se recuperaron de
la anestesia, y a las 8, 24 ó 48 horas después de la oclusión de la
ACM fueron profundamente anestesiadas con isofluorano y sacrificadas
por perfusión coronaria con bomba de infusión de 60 mL de salino
heparinizado (30 U/mL) a un volumen de infusión de 10 mL/min seguido
por 120 mL de salino para retirar la sangre de los tejidos
cerebrales.
La perfusión cortical fue medida con un sistema
de láser-Doppler (Perimed, Sweden) en las ratas
sometidas a la oclusión de ACM. El día anterior a la inducción de la
isquemia, las ratas se anestesiaron para la implantación de una guía
en la superficie del cráneo después de reducir 1mm el grosor del
hueso con una pequeña broca. La guía se fijó al cráneo con cemento
dental y 2 pequeños tornillos siguiendo las coordenadas: 2 mm
posterior y 3,5 mm lateral con relación a bregma, sobre el
hemisferio ipsilateral (derecho). Al día siguiente se introdujo una
sonda láser-Doppler a través de la guía y se empezó
el registro. Después de un registro estable, la isquemia fue
inducida. La perfusión fue continuamente monitorizada antes de la
isquemia, durante los 90 minutos de ésta y los primeros 15 minutos
de reperfusión. Algunos datos de la perfusión se usaron para la
exclusión de algunos animales del estudio como por ejemplo:
- 1)
- Las ratas que después de la introducción del filamento para la oclusión de MCA no recuperaron la perfusión hasta el 40% o más del nivel basal; éstos animales fueron excluidos del estudio ya que se consideró que la isquemia no había sido exitosa posiblemente debido a factores individuales de la anatomía cerebrovascular. El porcentaje de disminución del flujo sanguíneo necesario para causar infarto según nuestras condiciones experimentales fue del 40%, verificando que con una caída inferior las ratas no desarrollaron un infarto.
- 2)
- Las ratas que no mostraron una recuperación a la reperfusión por encima del 80% del nivel basal fueron excluidas del estudio ya que sólo mostraron una restauración parcial del flujo sanguíneo. Estos criterios de exclusión son independientes del tratamiento que se inició a los 30 minutos de la reperfusión, una vez que se obtuvieron datos del flujo sanguíneo.
CR-6 fue sintetizado
químicamente como previamente se refirió (Casas et al., 1992.
J. Agric. Food Chem., 40: 585-90).
CR-6 fue disuelto en aceite de oliva comestible y
comercializado (Carbonell, España) y se administró oralmente a las
ratas a una dosis de 1 mL (100 mg/Kg) usando un medidor de comida.
El mismo aceite fue usado como vehículo. Cada animal fue tratado dos
veces a las 2 h y 8 h del comienzo de la isquemia, ó sólo a las 2 h.
Las ratas recibieron un código que no revelaba el tipo de
tratamiento asignado a cada animal.
Para la determinación del volumen de infarto,
las ratas fueron anestesiadas con isofluorano y sacrificadas por
decapitación a las 24 h. El cerebro se retiró y se cortó en
secciones coronales de 2 mm de grosor, que fueron teñidos con una
solución al 1% de cloruro de
2,3,5-triphenyltetrazolio (TTC) durante 10 minutos a
37ºC. Los cortes se sumergieron toda la noche en una solución al 4%
de paraformaldehído en tampón fosfato y después se lavaron y se
guardaron en tampón fosfato 0,1 M a un pH de 7.4. Las mitocondrias
de los tejidos isquémicos no reaccionaron a la tinción con TTC,
mientras que se adquirieron color rojo en los tejidos sanos. En las
imágenes de las secciones, se midieron las zonas blancas o claras de
cada sección, rectificando la zona del edema producido en la zona
cerebral infartada por el ratio entre las áreas contralateral e
ipsilateral. Las áreas fueron integradas para calcular el volumen
infartado.
Un simple test neurológico en una escala de 0 a
9 puntos (0 = no déficit y 9 = la deficiencia más alta) se realizó
como se indicaba previamente (Justicia et al., 2006. J
Cereb. Blood Flow Metab., 26: 321-32) antes de
la muerte de los animales. Se siguieron 4 test para la
evaluación:
- 1)
- Actividad espontánea (movimiento/exploración = 0; movimiento sin exploración = 1; no movimiento ó sólo cuando se le tira de la cola = 2).
- 2)
- Rotación hacia la izquierda (si no hace nada = 0; si hay elevación de la cola o la rata se estira o se arrastra (push & pull) = 1; espontáneamente = 2; rotación sin desplazamiento (spinning top) = 3.
- 3)
- Resistencia a la extensión de la pata izquierda (si no se puede realizar la extensión = 0; si se puede realizar extensión = 1; si no hay resistencia a la extensión = 3).
- 4)
- Reflejo a la caída (simétrico = 0; asimétrico = 1; pata delantera contralateral retraída = 3)
Para el análisis de la permeabilidad de la
barrera hematoencefálica (BBB, siglas del término en inglés), se
inyectaron 4 mL/Kg (por Kg de peso corporal) de solución de Evans
Blue al 2% en solución salina a través de la vena femoral 4 h
después la inducción de la reperfusión. 2 h más tarde, las ratas
fueron anestesiadas y se realizó perfusión transcardíaca para
eliminar la sangre del tejido. El cerebro se cortó en secciones
coronales y en cortes de 2 mm de grosor y dos de las secciones
(coordenadas de Bregma) fueron usadas para la extracción de Evans
Blue, mientras una tercera sección fue guardada para la
extracción de RNA. El córtex ipsilateral y contralateral y el
estriado se diseccionaron, se pesaron y se sumergieron en una
solución al 50% de ácido tricloroacético (TCA) (1.3 mL por gramo de
tejido). El tejido se homogenizó por medio de un polytron y
se centrifugó a 12000 x g durante 20 minutos. El sobrenadante se
mezcló con etanol (1:3). La intensidad de fluorescencia fue medida
en un fluorímetro a 680 nm usando una alícuota de 110 \mul de
muestra.
La concentración de Evans Blue (ng/mL) se
calculó usando una curva estándar con las concentraciones conocidas
de este colorante.
24 horas después de provocar la isquemia, las
ratas fueron anestesiadas y perfundidas a través del corazón usando
una bomba de infusión a una frecuencia de 10 mL/min con 60 mL de
solución salina heparinizada a la concentración de (30 U/mL) seguido
de 120 mL de solución salina para extraer toda la sangre del cuerpo.
El tejido cerebral se extrajo y se diseccionó separando el córtex y
el estriado ipsilateral y contralateral y fue rápidamente congelado
y almacenado a -80ºC hasta su análisis. La concentración de GSH fue
estimada según la siguiente fórmula: GSH = GSH - (2xGSSG).
La expresión de la proteína
ciclooxigenasa-2 (Cox-2) se estudió
por inmunoquímica como previamente se describe (Planas et
al., 2002. J. Cereb. Blood Flow Metab., 22:
918-925) a las 24 h post-isquemia.
Se sumergieron 2 mm de una sección coronal de cerebro en 4% de
paraformaldehído en tampón fosfato a pH 7.4 durante toda la noche y
después se lavaron en el mismo tampón. La inmunohistoquímica de
Cox-2 se realizó en secciones flotantes obtenidas en
el vibratomo. Se obtuvieron secciones de 50 \mum de grosor y se
sometieron a inmunotinción usando anticuerpos monoclonales contra
Cox-2 (Cayman) diluido 1:200. La inmunohistoquímica
contra la mieloperoxidasa (MPO) (Pharmingen) se realizó en secciones
de parafina que se obtuvieron después de incluir 2 mm de cerebro en
parafina y de obtener cortes de 5 \mum de grosor en el microtomo.
Se usaron anticuerpos monoclonales de ratón contra MPO a una
dilución de 1:500. Después del anticuerpo primario, las secciones
fueron incubadas con anticuerpos secundarios biotinilados seguidos
por el procedimiento de ABC (Serotec). La reacción de revelado se
llevó a cabo con diaminobencidina como se describe en (Planas et
al., 2002. J. Cereb. Blood Flow Metab., 22:
918-925). El número de células por área se contó en
tres áreas de cada sección.
La ACM ipsilateral al hemisferio isquémico se
aisló de algunos animales después de 24 h
post-isquemia. Los segmentos de la arteria se
colocaron en solución KHS (de las siglas en inglés de
Krebs-Henseleit solution) conteniendo
sacarosa al 30% durante la noche y se transfirieron a un criomolde
(Bayer Química Farmacéutica, Barcelona, Spain) relleno de medio de
inclusión (Tissue Tek OCT embedding medium, Sakura Finetek
Europe, The Netherlands) durante 20 minutos, y después se congelaron
en nitrógeno líquido y se guardaron a -70°C. El colorante
fluorescente dihidroetidio (DHE) se utilizó para evaluar la
producción de O2^{-} in situ, tal como se ha descrito
previamente (Jimenez-Altayó et al.,
2006. J. Pharmacol. Exp. Ther., 316: 42-52; Martinez-Revelles et al., 2008. Pharmacol. Exp. Ther., 325: 363-369).
2006. J. Pharmacol. Exp. Ther., 316: 42-52; Martinez-Revelles et al., 2008. Pharmacol. Exp. Ther., 325: 363-369).
La comparación entre los dos grupos se hizo con
la realización del t-test ó del test no paramétrico
de Mann-Whitney, dependiendo de si los valores
pasaron o no pasaron el test de normalidad (D'Agostino &
Pearson omnibus normally test). Las comparaciones entre más de
dos grupos se hicieron con one-way ANOVA
seguida del análisis post-hoc de Bonferroni's
para valores que se ajustaban a la normalidad, o con el test de
Kruskal-Wallis seguido del Dunn's Multiple
Comparison Test. Se consideraron significativos aquellos valores
p\leq0.05. El análisis estadístico se realizó con GraphPad
Prism software.
\vskip1.000000\baselineskip
La oclusión de la ACM en rata
Sprague-Dawley puede inducir varios grados de
lesión tisular y consecuencias funcionales. El volumen infartado
(media\pmdesviación estándar) fue menor (p\leq0.01) después de
una isquemia transitoria (140.2\pm64.4 mm^{3}) que en la
isquemia permanente (265.6\pm69.2 mm^{3}) (Fig. 1B). Sin
embargo, el déficit neurológico sólo mostró una insignificante
tendencia a incrementar después de isquemia permanente comparado con
la transitoria (p=0.1) (Fig. 1C). Esta observación sugiere que, en
relación a la extensión del tejido lesionado, el déficit funcional
fue comparativamente peor después de la isquemia transitoria que de
la permanente.
La administración del agente antioxidante
CR-6 (dos dosis a las 2 y 8 h después de la oclusión
de la ACM redujo el volumen infartado (p\leq0.05) (Fig. 2A) y
mejoró la valoración neurológica (p\leq0.05) (Fig. 2B) después de
la isquemia transitoria. El CR-6 protegió al córtex
y al estriado (Fig. 2C, D). No obstante, este tratamiento con
CR-6 no tuvo efecto protector después de la isquemia
permanente (Fig. 2E, F). En el grupo del CR-6, el
volumen infartado fue significativamente más extenso (p\leq0.001)
después de la isquemia permanente (300.1\pm38.4 mm^{3}) que de
la isquemia transitoria, pero, de nuevo, la valoración neurológica
sólo demostró una insignificante tendencia a aumentar después de la
isquemia permanente vs a la transitoria (p=0.06).
Una administración única de CR-6
a las 2 h de la reperfusión no fue suficiente para inducir la
protección, puesto que no redujo el volumen infartado (Fig. 3A) ni
tampoco mejoró el déficit neurológico (Fig. 3B). Esto sugiere que
una acción prolongada del antioxidante puede ser necesaria para
neutralizar los efectos de la reperfusión.
La concentración del glutatión total (GSx) y del
oxidado (GSSG) se determinó en el córtex ipsilateral y contralateral
y en el estriado a las 24 h post-isquemia en las
ratas tratadas con vehículo ó CR-6 y la reducción
del contenido en glutatión reducido (GSH) se calculó con las medidas
previas (ver Métodos). A las 24 h después de la isquemia
transitoria, la concentración de GSH, estaba significativamente
reducida en el córtex ipsilateral (p\leq0.05) (Fig. 4A) y en el
estriado (p\leq0.001) (Fig. 4B) de las ratas isquémicas que
recibieron vehículo. Este efecto fue atenuado por
CR-6, ya que el contenido en GSH en este grupo no
fue significativamente diferente de los controles no isquémicos.
(Fig. 4A, B). Se encontró una relación negativa entre el contenido
en GSH y el volumen infartado (Fig. 4C), lo que sugirió que el grado
de consumo de GSH era un indicativo de la magnitud de la lesión
tisular después de la isquemia/perfusión.
La isquemia induce la expresión de la proteína
Cox-2 a las 24 h (Fig. 5) y este efecto fue
altamente atenuado por CR-6 (Fig. 5).
Cox-2 fue principalmente detectado en neuronas (Fig.
5) sugiriendo que el estrés oxidativo está involucrado en la
inducción de Cox-2 neuronal y que el efecto de
CR-6, también directa ó indirectamente alcanza las
neuronas.
El estudio de la perfusión cortical antes
(basal), durante y después de la isquemia, demostró que algunas
ratas muestran valores de flujo sanguíneo en la reperfusión muy
similar a los valores basales, mientras que otras ratas muestran
valores muy por encima de los basales. En el grupo vehículo (n=18),
se encontró una relación entre el grado de incremento del flujo
sanguíneo a la reperfusión y el volumen infartado, ya que el
logaritmo de estos valores está positivamente correlacionado
(p\leq0.002) (Fig. 6A). Esto indica que el aumento del flujo
sanguíneo en la reperfusión por encima de los niveles basales (i.e
hiperemia reactiva) se asocia a una mayor extensión del volumen
infartado. Sin embargo, no se encontró relación entre el desarrollo
de la hiperemia reactiva y la bajada del flujo sanguíneo durante la
isquemia, indicando que la magnitud de la hiperemia no depende del
grado de caída de flujo durante la isquemia. La hiperperfusión se
definió como un aumento de flujo superior al 20% del basal, por
encima de la cual se consideró que las ratas mostraban hiperemia
reactiva (para referirse a este término, en la presente invención
también se utiliza el término hiperperfusión) (Fig. 6B). La media
idesviación estándar (DE) de flujo sanguíneo durante la isquemia fue
similar en el grupo de ratas con hiperemia (44.1\pm17.5% del flujo
basal) que en el grupo sin ella (53.4\pm10.7% del flujo basal).
Entonces los volúmenes infartados fueron comparados en función de la
presencia o ausencia de hiperemia reactiva, de acuerdo con nuestra
definición. El volumen infartado (valor medio\pmSD) fue más
extenso (p<0.01) en el grupo de ratas que mostró hiperemia
(162.7\pm56.6) que en el grupo que no mostró hiperemia
(81.7\pm45.5 mm^{3}) (Fig. 6C). Además, la valoración
neurológica (valor medio\pmSD) fue peor (p\leq0.05) en el grupo
con hiperemia (5.4\pm1.5 puntos) que en el
no-hiperémico (3.6\pm1.3 puntos). (Fig. 6D). La
hiperemia se refiere a la hiperperfusión cortical ya que con la
sonda del láser Doppler se midió el flujo de sanguíneo
cortical. De acuerdo con esto, el infarto cortical (valor
medio\pmSD) fue más extenso (p<0.01) en el grupo hiperémico
(93.7\pm48.4 mm^{3}) que en el no hiperémico (17.6\pm16.0
mm^{3}) (Fig. 6E). En cambio, no se encontraron diferencias
significativas en el volumen infartado (valor medio\pmSD) entre el
estriado del grupo con hiperemia (67.4\pm17.8 mm^{3}) y el grupo
no hiperémico (56.5\pm28.4 mm^{3}) (Fig. 6F). Estos resultados
sugieren que la hiperemia cortical en la reperfusión tiene valor
predictivo de la exacerbación del daño cortical por reperfusión y
por lo tanto es un marcador de daño de la reperfusión.
Tomando todos los animales juntos (n=33), la
incidencia de hiperemia fue del 62%. No obstante, la hiperemia no
fue equitativamente distribuida en los dos grupos. Así, la hiperemia
fue retrospectivamente encontrada en el 72% de las ratas asignadas
en el grupo vehículo (n=18) mientras que sólo fue del 50% en el
grupo del CR-6 (n=14) las que la habían
desarrollado. El aumento de la perfusión en los grupos hiperémicos
fue similar entre el grupo del CR-6 y el del
vehículo (Fig. 7A). Además, el grado de caída del flujo sanguíneo
durante la isquemia fue similar en todos los grupos (Fig. 7B). En el
grupo de animales que fueron tratados con CR-6, el
volumen infartado (valor medio\pmSD) fue similar tanto si
previamente habían desarrollado hiperemia (85.7\pm39.2 mm^{3})
como si no la habían desarrollado (73.8\pm40.6 mm^{3}) (Fig.
7C). Sin embargo, las ratas hiperémicas tratadas con
CR-6 mostraron una reducción del volumen infartado
(p\leq0.01) respecto a las ratas hiperémicas tratadas con vehículo
(Fig. 7C). En cambio el volumen de infarto fue similar en la ratas
no hiperémicas tratadas con CR-6 ó vehículo (Fig.
7C).
Resultados similares se encontraron para la
valoración neurológica, ya que las ratas hiperémicas tratadas con
CR-6 tenían un déficit neurológico menor que
aquellas que recibieron vehículo. Sin embargo no hubo grandes
diferencias en la valoración entre las ratas no hiperémicas tratadas
con CR-6 o con vehículo (Fig. 7D). La proteína
CR-6 protegió de una manera más efectiva el córtex
(i.e la región que desarrolló más lesión con la hiperemia) que el
estriado (Fig. 7E, F). Estos resultados mostraron que
CR-6 protegió de manera más efectiva a las ratas
hiperémicas que a las no hiperémicas, sugiriendo que éste
antioxidante ejerce más efecto en condiciones en las que aparecen
signos de lesión por reperfusión como se ha visto en el córtex en el
presente modelo experimental.
Los animales con hiperemia desarrollaron
alteraciones de la permeabilidad de la barrera hematoencefálica, BHE
(BBB, de las siglas en inglés), según se observó con extravasación
de Evans Blue (Fig. 8). La extravasación de Evans Blue
tendió a ser menor después de la administración de
CR-6. Las diferencias que se vieron con el grupo
vehículo no
fueron significativas. Los signos de la permeabilidad de la barrera hematoencefálica no se observaron en todas
fueron significativas. Los signos de la permeabilidad de la barrera hematoencefálica no se observaron en todas
\hbox{las ratas.}
La expresión de mieloperoxidasa (MPO) se examinó
para valorar la infiltración de neutrófilos al tejido lesionado. En
los animales hiperémicos se detectó un aumento en la infiltración de
neutrófilos comparado con los no hiperémicos. El número de células
MPO-positivas (MPO+) por área fue mayor en el grupo
vehículo que en el grupo CR-6. Se demuestra que los
individuos que no sufren hiperemia tienen menor número de células
MPO+ que los individuos que sí que han sufrido una hiperemia.
Se procedió con el aislamiento de la ACM de
ratas tratadas con CR-6 o con vehículo a las 24 h
post-isquemia. Comparado con las ratas operadas del
grupo control, la isquemia transitoria indujo la formación de
superóxido (que detectamos con la técnica de dihidroetidio; DHE) en
la ACM en el grupo vehículo (Fig. 10), mientras que el
CR-6 inhibió la formación de superóxido en la
ACM.
En base a todos estos hallazgos, se concluye que
la hiperemia reactiva a una temprana reperfusión es un signo de
lesión por reperfusión. Dado el beneficio de la supresión prolongada
del estrés oxidativo después de la reperfusión que hemos descrito
aquí, tenemos la hipótesis de que una isquemia transitoria puede
inducir alteraciones del flujo sanguíneo cerebral que se producen
durante varias horas después de la reperfusión y que pueden
contribuir significativamente a la lesión por reperfusión.
La hiperperfusión en la reperfusión
post-isquémica no es un fenómeno que ocurre sólo en
ratas, ya que algunos pacientes pueden desarrollar una
hiperperfusión después una trombólisis con rt-PA
(Kidwell et al. 2001. Los resultados que se muestran en la
presente invención muestran que sólo algunos individuos (ratas) que
desarrollan hiperperfusión son diana para el tratamiento con
antioxidantes, lo que significa que los efectos beneficiosos del
CR-6 en la afectación neurológica y el volumen
infartado sólo se dieron en esos animales, pero no en animales que
no desarrollaron hiperperfusión en la reperfusión ó en animales que
no presentaron reperfusión.
En conclusión, los presentes resultados muestran
que el antioxidante CR-6 es protector en la
isquemia/reperfusión en ratas, que esta protección es especifica
para un subgrupo de animales que desarrollaron hiperemia en el
momento de la reperfusión, que el daño cerebral fue mayor en esos
animales comparado con los animales que no mostraron hiperperfusión,
que el tratamiento con antioxidante se debe mantener durante varias
horas después de la reperfusión y que CR-6 confiere
beneficios en la interfase entre la sangre y el cerebro previniendo
la generación de estrés oxidativo y nitrosativo en los vasos
sanguíneos y previniendo el colapso o ruptura de la BHE.
Claims (15)
1. Uso de un compuesto de fórmula general I,
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
donde R_{1} y R_{4} son iguales
o diferentes y se seleccionan de entre H ó un alquilo
(C_{1}-C_{4});
R_{2} y R_{a} son iguales o diferentes y se
selecciona de entre H, OH, un alquilo
(C_{1}-C_{4}) o un alcoxilo
(O-(C_{1}-C_{4}));
R_{5} se selecciona de entre H y un grupo
alquilo (C_{1}-C_{4}) y
R_{6} es un grupo alquilo
(C_{1}-C_{10}),
para la elaboración de un medicamento destinado
al tratamiento de una lesión producida por una reperfusión
post-isquémica, donde el flujo sanguíneo al inicio
de la reperfusión es igual o superior a un 20% del valor basal.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Uso del compuesto según la reivindicación 1
donde R_{1} es H, R_{2} es un alcoxilo (O-(C_{1})), R_{3} es
un hidroxilo, R_{4} es H, R_{5} es un grupo alquilo
(C_{1}-C_{4}) y R_{6} es un grupo alquilo
(C_{1}-C_{4}).
3. Uso del compuesto según la reivindicación 2,
donde R_{5} y R_{6} son un grupo metilo.
4. Uso del compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, donde la reperfusión
post-isquémica es cerebral.
5. Uso del compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, donde el medicamento se presenta en una
forma adaptada a la administración oral o parenteral.
6. Uso del compuesto según la reivindicación 5,
donde el medicamento se presenta en una forma adaptada a la
administración oral.
7. Uso del compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, donde el medicamento incluye al menos un
excipiente farmacológicamente aceptable.
8. Uso del compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, donde el medicamento incluye al menos un
vehículo farmacológicamente aceptable.
9. Uso del compuesto según la reivindicación 8,
donde el vehículo farmacológicamente aceptable es una sustancia
grasa y el medicamento se presenta en una forma adaptada a la
administración oral.
10. Uso del compuesto según la reivindicación 9
donde la sustancia grasa es aceite de oliva.
11. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
1 a 10, donde el medicamento comprende además otra sustancia
activa.
12. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
1 a 11, donde el medicamento se administra en dos tomas de 100 mg de
compuesto por kilogramo de peso corporal, por vía oral.
13. Uso según la reivindicación 12, donde la
primera toma se administra a partir de entre el momento en el que se
produce la reperfusión y 60 minutos después del inicio de la
reperfusión.
14. Uso según la reivindicación 13, donde la
primera toma se administra a partir de entre 15 y 45 minutos después
del inicio de la reperfusión.
15. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
12 a 14, donde las dos tomas se administran con una diferencia de
tiempo de entre 4 y 8 horas.
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| ES200900756A ES2345378B1 (es) | 2009-03-20 | 2009-03-20 | Uso de un compuesto para la elaboracion de un medicamento destinado al tratamiento de una lesion producida por una reperfusion post-isquemica. |
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