KR100545930B1 - 첼리도닌 또는 그 유도체를 포함하는 약제학적 조성물 - Google Patents

첼리도닌 또는 그 유도체를 포함하는 약제학적 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 약제학적으로 허용 가능한 담체와 함께 첼리도닌 또는 그 유도체를 함유하는 조성물에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 조성물은 사람 심방에 주로 발현하는 hKv1.5통로를 선택적으로 차단하는데 우수한 효과를 나타내어 K+통로 차단제 및 부정맥 치료제로 이용할 수 있다.

Description

첼리도닌 또는 그 유도체를 포함하는 약제학적 조성물 {Pharmaceutical compositions comprising chelidonine or derivatives thereof}
본 발명은 첼리도닌 또는 그 유도체와 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
부정맥이란, 다양한 원인에 의해 국소부위 심근의 전기/생화학적 특성이 변하여 심장의 비정상적 전기충동 형성 또는 전기충동의 전파(propagation) 장애가 일어나 심장의 비정상적인 리듬으로 심장의 펌프 기능에 이상이 나타나는 질환이다(www.americanheart.org/heart and stroke).
심장은 각 부위별로 활동전위 모양 및 기간이 다른데, 이는 각 부위의 이온통로의 종류 및 발현정도가 다르기 때문이라고 알려져 있으며 (Sanguinetti 및 Keating. Role of delayed rectifier potassium channels in cardiac repolarization and arrhythmias. News Physiol Sci 1997, 12:152-157), 모든 항부정맥제들은 심근의 이온 이동에 영향을 미쳐 항부정맥 효과를 나타내기 때문에 그 작용하는 이온의 종류에 따라 분류하기도 한다. 즉, 1급(나트륨통로 차단제), 2급(아드레날린성 베타수용체 차단제), 3급(칼륨통로차단제), 4급(칼슘통로 차단제) 및 기타이다(Katz AM. Selectivity and toxicity of antiarrhythmic drugs: molecular interactions with ion channels. Am J Med 1998, 104:179-195). 그러나 지금까지 개발된 항부정맥제들은 심장이외의 장기에 다양한 부작용을 나타내기 때문에 사용하는데 많은 문제점이 지적되고 있다. 최근 조직 선택성이 개선된 약물들이 개발되어 심장 이외의 장기에 대한 부작용은 급격히 감소되었으나, 심장에 대한 부작용은 항부정맥 효과를 나타내는 기전과 같은 기전으로부터 발생되기에 제거하기가 대단히 어려운 것으로 알려져 있다(Roden DM. Mechanism and management of proarrhythmia. Am J Cardiol 1998, 82:49I-57I), 가장 흔한 심장에 대한 부작용은 심근 수축기능감소, 서맥, 심장박동 페이싱장치 및 세동제거장치의 효율변동, 및 새로운 부정맥 발생 또는 부정맥 발생빈도를 증가시키는 (proarrhythmia) 것이다(Roden DM. Mechanism and management of proarrhythmia. Am J Cardiol 1998, 82:49I-57I).
심장박동수 조절에 있어서 활동전위 기간은 중요하며, 이를 이용한 항부정맥제들이 이미 개발되었으나 그 부작용 때문에 임상적 사용에 제한을 받고 있다. 부작용이 없는 이상적인 항부정맥제란, 비정상적으로 흥분성을 나타내는 심근세포(또는 심장박동수가 비정상적인 세포)에만 작용하거나, 심장 내에서도 부정맥 발생원인 조직(즉 심방, 심실, 퍼킨제섬유 등)에만 작용하는 약물이여야 하지만, 이러한 조건을 충족시키는 약물은 현재 개발되지 못했다. 부작용이 없거나 적은 새로운 항부정맥제를 개발하기 위해서는 항부정맥제의 작용부위 즉 이온통로에 대한 분자생물학적 수준의 새로운 이해가 뒤따라야 한다. 예를 들어, 심장부위별 이온통로의 발현이 다르고 각 이온통로의 약물에 대한 반응이 이온통로의 개폐여부에 의존적이 라면 새로운 약물 개발의 표적이 될 수 있을 것이다. 따라서, 분자생물학적 클로닝 기법과 전기생리학적 기법을 병용한다면 새로운 이상적인 항부정맥제를 효과적으로 개발할 수 있을 것이다.
한편, 활동전위 기간은 여러 K+통로에 의해 조절되며, 심장 각 부위별로 발현하는 K+통로의 여러 유전자가 알려져 있다.
심장에서 가장 다양한 이온 통로인 K+통로 전류는 크게 내향성 전류(IK1, inward rectifying current; IKAch, acetylcholine-activated current ; IKATP, ATP-sensitive K+ channel 등)와 막전압 의존성(voltage-gated)K+(Kv) 전류로 분류되는데, 대체로 내향성 K+ 전류는 안정막 전압조절에 관여하고 Kv 전류는 활동전위기간을 조절한다.
심근의 Kv 전류는 전기생리학적 특성에 따라 Ito, IKp, IKr, Ikur , Iks 등으로 분류된다. 첫째, Ito 전류는 ' 일과성 외향 K+ 전류(transient outward K+ current)' 로, 탈분극직후 빠르게 활성화되었다가 빠르게 비활성화 되며, 활동전위의 제 1기에 중요하다 둘째, IKP 전류는 ' 고원 K+ 전류(plateau K+ current)' 로 탈분극 되었을 때만 활성화되며, 중간 정도의 활성화속도를 가지며 거의 비활성화가 일어나지 않는 일종의 지연성 외향 K+ 전류이다. 셋째, IKR 전류는 ' 급속 활성화 지연성-외향 K+ 전류(rapidly activating delayed rectifier K+ current)' 로서 활동전위의 제 2기에 중요하다. 넷째, IKUR 전류는 ' 초급속 활성화 지연성-외향 K+ 전류(ultra-rapidly activating delayed rectifier K+ current)' 로서 이 또한 활동전위의 제 2기에 중요하다. 마지막으로, IKS 전류는 ' 완속-활성화 지연성 외향 K+ 전류(slow-activating delayed rectifier K+ current)' 로, 완전히 활성화되는데 몇 초가 걸리며 활동전위의 제 3기의 최종 재분극에 중요하다(Roden and George. The cardiac ion channel: relevance to management of arrhythmias. Annu Rev Med 1999, 47:138-148). 이러한 Kv 통로들은 세포의 재분극에 기여하여 활동전위기간을 조절할 수 있다. 임상적으로, 심실근에서 발생되는 부정맥들은 손상조직부위의 재분극 장애로 초래된다고 알려져 있기에, 부정맥치료의 중요한 표적으로 Kv 통로를 삼고 있다. 실제로, 퀴니딘, 베라파밀, 니페디핀, 소타롤, 아미오다론, 프레카니드, 크로피리움 등의 항부정맥제가 이러한 Kv 통로에 작용한다고 알려져 있다(Katz AM. Selectivity and toxicity of antiarrhythmic drugs: molecular interactions with ion channels. Am J Med 1998, 104:179-195). 그러나 이런 약물들은 이온통로 선택성이 결여되어 많은 부작용을 초래한다고 알려져 있기 때문에 이온 통로 선택성이 있는 새로운 약물개발이 필요하다.
초파리에서 세이커(Shaker) 유전자가 클로닝된 이래, 현재 보고된 포유동물의 Kv 통로의 cDNA는 9종류 이상의 아족(Kvl-Kv9)으로 분류된다.
이중 Kvl 아족이 가장 다양한데, 지금까지 8종류(Kv1.1-Kv1.8) 이상이 알려져있다(Grissner S. Potassium channels still hot. TiPS 1997, 18:347-350). 현재 심장조직에서 클로닝된 Kv 통로유전자는 Kv1.1, Kv1.2, Kv1.4, Kv1.5, Kv2.1, Kv4.2, Kv4.3 등 7종류이다(Deal등. Molecular physiology of cardiac potassium channels. Physiol Rev 1996, 76:49-67). 이들 유전자 중 사람심장에 발현하는 중요 Kv 통로유전자는 hKv1.4, hKv1.5, Kv4.3 및 HERG 유전자이다. 이런 유전자들은 주로 심방과 심실에 모두 발현하나, hKv1.5유전자는 사람 심방에 주도적으로 발현되며, 사람 심방에서 특징적으로 기록되는 IKur과 전기생리학적 및 약리학적 특성이 같다고 알려져 있다(Fedid등. The 1997 Stevenson Award Lecture. Cardiac K+ channel gating: cloned delayed rectifier mechanisms and drug modulation. Can J Physiol Pharmacol 1998, 76:77-89). 따라서, hKv1.5통로의 선택적인 차단제를 개발한다면 심방성 부정맥치료제가 될 것이다.
본 발명자들은, 사람 심방에 주도적으로 발현하는 hKv1.5통로에 대한 선택적인 차단제를 개발하고자 연구한 결과, 첼리도닌 및 그 유도체가 hKv1.5통로 전류 및 사람 심방세포의 IKur전류를 억제하고, 심박수에 비례하여 그 효과가 증대됨을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명은 약제학적으로 허용 가능한 담체와 함께, 우수한 K+통로 차단작용 및 항부정맥 효과를 나타내는 첼리도닌 또는 그 유도체를 포함하는 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
발명의 개시
본 발명은 첼리도닌(Chelidonine) 또는 그 유도체와 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
[화학식 1]
Figure 112003041656751-pct00001
상기 식 중,
R1은 수소, 히드록시, 탄소수 1 내지 5의 저급알콕시, 벤질옥시, 탄소수 1 내지 5의 저급알킬카보닐옥시, 벤조일옥시, 탄소수 1 내지 5의 저급알킬설포닐옥시, 아릴설포닐옥시, 디페닐포스포닐옥시기, 및 -OCONH2로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R2가 수소 또는 메틸기이고;
R3, R4 및 R5는 각각 수소이거나;
또는, R1은 R2 또는 R4와 이중결합을 형성하거나;
또는, R2는 R3와 이중결합을 형성하거나;
또는, R5는 이웃하는 N과 이중결합을 형성한다.
보다 바람직하게는, 본 발명의 조성물은 화학식 1의 첼리도닌 또는 그 유도체를 포함하며:
이때,
R1은 수소, 히드록시, 메톡시, 벤질옥시, 아세톡시, 벤조일옥시, 메틸설포닐옥시, 4-메틸-벤젠설포닐옥시, 디페닐포스포닐옥시기, 및 -OCONH2로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R2가 수소 또는 메틸기이고;
R3, R4 및 R5는 각각 수소이거나;
또는, R1은 R2 또는 R4와 이중결합을 형성하거나;
또는, R2는 R3와 이중결합을 형성하거나;
또는, R5는 이웃하는 N과 이중결합을 형성한다.
특히 바람직하게는, 본 발명의 조성물은 하기 화합물들:
[5bR-(5bα , 6β, 12bα)]-5b, 6, 7, 12b, 13, 14-헥사히드로-13-메틸[1,3]벤조디옥솔로[5,6c]-1,3-디옥솔로[4,5-i]페난트리딘-6-올;
[5bR-(5bα , 6β , 12bα)]-5b, 6, 7, 12b, 13, 14-헥사히드로-6-메톡시-13-메틸[1,3]-벤조디옥솔로[5,6c]-1,3-디옥솔로[4,5-i]페난트리딘;
[5bR-(5bα , 6β , 12bα)]-5b, 6, 7, 12b, 13, 14-헥사히드로-6-벤질옥시-13-메틸[1,3]벤조디옥솔로[5,6c]-1,3-디옥솔로[4,5-i]페난트리딘;
{[5bR-(5bα , 6β , 12bα)]-5b, 6, 7, 12b, 13, 14-헥사히드로-13-메틸[1,3]벤조디옥솔로[5,6c]-1,3-디옥솔로[4,5-i]페난트리딘-6-일}-아세테이트;
{[5bR-(5bα , 6β , 12bα )]-5b, 6, 7, 12b, 13, 14-헥사히드로-13-메틸[1,3]벤조디옥솔로[5,6c]-1,3-디옥솔로[4,5-i]페난트리딘-6-일}-벤조에이트;
(12bR)-13,14-디히드로-13-메틸[1,3]벤조디옥솔로[5,6c]-1,3-디옥솔로[4,5-i]페난트리딘;
(12bR)-7, 12b, 13, 14-테트라히드로-13-메틸[1,3]-벤조디옥솔로[5,6c]-1,3-디옥솔로[4,5-i]페난트리딘;
[5bR-(5bα , 6β , 12bα)]-5b, 6, 7, 12b, 13, 14-헥사히드로-13-메틸[1,3]벤조디옥솔로[5,6c]-1,3-디옥솔로[4,5-i]페난트리딘;
{[5bR-(5bα , 6β , 12bα)]-5b, 6, 7, 12b, 13, 14-헥사히드로-13-메틸[1,3]벤조디옥솔로[5,6c]-1,3-디옥솔로[4,5-i]페난트리딘-6-일}-디페닐포스페이트;
{[5bR-(5bα , 6β , 12bα )]-5b, 6, 7, 12b, 13, 14-헥사히드로-13-메틸[1,3]벤조디옥솔로[5,6c]-1,3-디옥솔로[4,5-i]페난트리딘-6-일}-메탄설포네이트;
{[5bR-(5bα , 6β , 12bα)]-5b, 6, 7, 12b, 13, 14-헥사히드로-13-메틸[1,3]벤조디옥솔로[5,6c]-1,3-디옥솔로[4,5-i]페난트리딘-6-일}-4-메틸벤젠설포네이트;
{[5bR-(5bα , 6β , 12bα)]-5b, 6, 7, 12b, 13, 14-헥사히드로-13-메틸[1,3]벤조디옥솔로[5,6c]-1,3-디옥솔로[4,5-i]페난트리딘-6-일}-카바메이트;
[5bR-(5bα , 6β , 12bα)]-5b, 6, 7, 12b, 13, 14-헥사히드로-5b, 13-디메틸[1,3]-벤조디옥솔로[5,6c]-1,3-디옥솔로[4,5-i]페난트리딘-6-올; 및
13-메틸[1,3]벤조디옥솔로[5,6c]-1,3-디옥솔로[4,5-i]페난트리디늄으로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물을 포함하는 것이 바람직하다.
하기 표 1은, 상기 기재 화합물들에 대한 각각의 화학식을 나타낸 것이다.
Figure 112003041656751-pct00002
Figure 112003041656751-pct00003
본 발명의 유효성분인 화합물 1의 첼리도닌은 식물에 존재하는 물질로, 인체 에 안전하고 독성이 적으며 항경련작용, 중추 도파민 효능 억제작용, 진통작용, 해열작용, 항암작용, 니트릭옥시드 억제작용, 티눈 및 사마귀 억제작용이 있는 것으로 알려졌다.
또한, 본 발명의 조성물에 포함되는 첼리도닌 유도체 중 화합물 8, 9, 11 및 12는 신규한 물질이며, 이를 제외한 화합물들은 하기와 같이 이미 문헌에 개시된 바 있는 공지물질이다:
화합물 1
- Simanek, V. Benzophenanthridine alkaloids. In: The Alkaloids. Academic Press. 1985, Vol. 4, 185-240;
화합물 2
- Nowicky, Wassili. Carcinostatic agents and their use. Patent 1,191,837, 1985, 8, 13, Canada;
화합물 3
- Grynkiewicz, Grzegorz; Chojecka-Koryn, Ewa, Gadzikowska, Maria; Chodkowska, Anna, Jagiello-Wojtowicz, Ewa, Synthesis and biological activity of O-acyl and O-alkyl chelidonine derivatives. Eur J Med Chem 2001, 36:951-960;
화합물 4
- Grynkiewicz, Grzegorz; Chojecka-Koryn, Ewa, Gadzikowska, Maria; Chodkowska, Anna, Jagiello-Wojtowicz, Ewa, Synthesis and biological activity of O-acyl and O-alkyl chelidonine derivatives. Eur J Med Chem 2001, 36:951-960;
화합물 5
- Grynkiewicz, Grzegorz; Chojecka-Koryn, Ewa, Gadzikowska, Maria; Chodkowska, Anna, Jagiello-Wojtowicz, Ewa, Synthesis and biological activity of O-acyl and O-alkyl chelidonine derivatioves. Eur J Med Chem 2001, 36:951-960;
화합물 6
- Hanaoka, Miyoji; Yoshida, Shuji; Annen, Masami; Mukai, Chisato., A novel and biomimetic synthesis of (±)-chelamine, (±)-chelidonine, sanguinarine, and dihydrosanguinarine from coptisine via a common intermediate. Chem Lett 1986, 5:739-742;
화합물 7
- Snatzke, Guenther; Hrbek, Jaroslav, Jr. ; Hruben, Ladislav; Horeau, Alain; Santavy, Frantisek, Circular dichroism. XLII. Isolation and chemistry of the alkaloids from some plants of the genus Papaver. L. III. Absolute configuration and chiroptical properties of chelidonine and tetrahydroberberine alkaloids. Tetrahedron 1970, 26(21):5013-5028;
화합물 10
- Grynkiewicz, Grzegorz; Chojecka-Koryn, Ewa, Gadzikowska, Maria; Chodkowska, Anna, Jagiello-Wojtowicz, Ewa, Synthesis and biological activity of O-acyl and O-alkyl chelidonine derivatives. Eur J Med Chem 2001, 36:951-960;
화합물 13
Takao, Narao A. Alkaloids of Papaveraceae. VI. Alkaloids of Corydalis incisa. 5. The structure of corynoline, Chem Pharm Bull 1963, 11(10):1306-1312;
화합물 14
Lenfield, J. Karoutil, M. Marsalek, E. Slavik, J. Preininger V. and Simanek. V. J Med Plant Res 1981, 43:161-165.
그러나, 이들 첼리도닌계 화합물이 K+통로 차단작용 및 항부정맥 효과가 있다는 사실은 어떠한 문헌에도 기재되거나 암시된 적이 없다.
본 발명의 첼리도닌 또는 그 유도체는 하기의 방법들에 의해 제조하거나 시중에서 구입하여 사용할 수 있다.
배리, 디케이 등(The benzophenanthridine alkaloids. J. Nat Prod 1984, 47:1-43)의 방법에 따라, 애기똥풀(Chelidonium majus var. asiaticum)을 메탄올로 추출한 후, 핵산, 디클로로메탄, 부탄올 및 물로 계통분획하고 활성분획인 핵산분획을 실리카겔 컬럼크로마토그래피 (디클로로메탄:에틸아세테이트:메탄올)로 정제하여, 첼리도닌 또는 그 유도체를 얻을 수 있다.
또한, 타케오 등(Chiroptische eigenschaften und absolue konfiguration von (+)-14-epicorynolin,(+)-corynolin, (+))-chelidonine und verwandten verbindungen. Arch Pharm(Weinheim) 1984, 317:223-237) 및 부다바리 등(The Merck Index, 8th ed. Merck ＆ Co., 1989, 2038-2039)의 방법에 따라, 첼리도닌에 RCl(R은 알킬기, 페닐기, 또는 할로겐 또는 저급알킬기로 치환된 페닐기를 나타낸다), RCOCl(R은 알킬기, 페닐기, 또는 할로겐 또는 저급알킬기로 치환된 페닐기를 나타낸다) 및 클로로설포닐 이소시아네이트를 반응시켜 첼리도닌 또는 그 유도체를 얻을 수 있다.
본 발명의 몇몇 화합물들은 하기 반응식 1~5의 합성과정으로 합성될 수 있다. 그러나, 이는 단지 예시를 들기 위한 것으로서, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
Figure 112003041656751-pct00004
첼리도닌을 데스-마틴 페리오디난(Dess-Martin Periodinane) 산화제로 처리 함으로써 이급 알콜을 탈수반응 및 산화반응 시켜 화합물 6을 얻는다.
Figure 112003041656751-pct00005
첼리도닌을 트리에틸아민 존재 하에서 메탄설포닐 클로라이드로 처리하여 대응하는 메실레이트 화합물 10을 얻고, 이어 포타슘 t-부톡사이드로 제거반응을 행하여 화합물 7을 얻는다. 이어 화합물 7에 존재하는 이중결합을 팔라듐 촉매하에 수소로 환원시켜 화합물 6과 8의 혼합물을 얻는다.
Figure 112003041656751-pct00006
첼리도닌을 1,5-디아자바이씨클로[4,3,0]논-5-인 염기 존재하 디페닐포스포릴 아자이드로 처리하여 대응하는 인산에스테르 화합물 9를 얻는다. 이 반응에서 출발물질이 회수 된다.
Figure 112003041656751-pct00007
첼리도닌을 트리에틸아민 염기 존재하에서 파라-톨루엔설포닐 클로라이드로 처리하여 대응하는 설폰에스테르 화합물 11을 얻는다.
Figure 112003041656751-pct00008
첼리도닌을 소디움 카보네이트 염기 존재하 클로로설포닐 이소시아네이트로 처리한 후 가수분해하여, 대응하는 카바메이트 화합물 12를 얻는다. 이 반응에서 출발물질이 회수되었다.
본 발명에 따른 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용가능한 담체로는, 부형제, 결합제, 활택제, 붕괴제, 피복제, 유화제, 현탁제, 용제, 안정화제, 흡수조제, 주사용수, 등장화제 등을 예시할 수 있으며, 본 발명에 따른 조성물은 이들 화합물들로부터 선택된 1종 이상의 성분을 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 경구 또는 주사제 제제로써 제형화될 수 있으며, 경구 제제의 제형이 보다 바람직하다. 경구 제제로는, 과립제, 정제, 캅셀제, 액제 등을 예시할 수 있다.
본 발명의 조성물의 투여량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 첼리도닌 중량기준으로, 통상 10∼5000 mg/일이 바람직하고, 보다 바람직하게는 50∼1000 mg/일이다.
첼리도닌의 독성은 생쥐에서 정맥주사시 34.6± 2.44 mg/kg이고, 그 유도체 중 상구이나린의 독성은 생쥐에서 정맥주사시 15.9 mg/kg, 피하주사시 102.0 mg/kg이다.
본 발명의 조성물은 K+통로 차단제 및 항부정맥제로 사용될 수 있으며, 쥐, 개, 토끼, 고양이, 닭 등의 온혈동물 치료에도 사용이 가능하다.
도 1a는 hKv1.5통로 유전자가 발현된 Ltk-세포에서 막전압을 -80 mV에서 +50 mV로 자극시 기록된 K+전류에 대한 첼리도닌(화합물 1)의 효과를 나타낸 도이다.
도 1b는 hKv1.5통로 유전자가 발현된 Ltk-세포에서 막전압을 -80 mV에서 +50 mV로 자극시 기록된 K+전류에 대한 상구이나린(화합물 14)의 효과를 나타낸 도이다.
도 1c는 hKv1.5통로 유전자가 발현된 Ltk-세포에서 막전압을 -80mV에서 +50 mV로 자극시 기록된 K+전류에 대한 아세틸첼리도닌(화합물 4)의 효과를 나타낸 도이다.
도 1d는 hKv1.5통로 유전자가 발현된 Ltk-세포에서 막전압을 -80 mV에서 +50 mV로 자극시 기록된 K+전류에 대한 벤조일첼리도닌(화합물 5)의 효과를 나타낸 도이다.
도 1e는 hKv1.5통로 유전자가 발현된 Ltk-세포에서 막전압을 -80 mV에서 +50 mV로 자극시 마지막에 기록된 안정전류에 대한 화합물 1의 첼리도닌(○), 화합물 4의 아세틸첼리포닌(▲), 화합물 5의 벤조일첼리도닌(■) 및 화합물 14의 상구이나린(●)의 용량반응곡선을 나타낸 도이다.
도 2는 hKv1.5통로 유전자가 발현된 Ltk-세포에서 첼리도닌(화합물 1, 10 μM)에 의한 hKv1.5통로억제의 막전압 의존성을 나타낸 도이다.
도 3은 hKv1.5통로 유전자가 발현된 Ltk-세포에서 첼리도닌(화합물 1, 10 μM)에 의한 hKv1.5통로억제의 통로상태 의존성을 나타낸 도이다.
도 4a는 사람 심방세포에서 막전압을 -80 mV에서 +50mV로 자극시 기록된 K+통로 전류에 대한 첼리도닌(화합물 1)의 효과를 나타낸 도이다.
도 4b는 사람 심방세포에서 막전압을 -80 mV에서 +50mV로 자극시 기록된 K+통로 전류에 대한 첼리도닌(화합물 1)의 효과를 탈분극 자극말기에 측정한 안정전류를 통계처리한 도이다.
도 5a는 토끼심방조직에서 첼리도닌 투여전 대조군의 자극 빈도수에 따른 활동전위모양 변동을 나타낸 도이다.
도 5b는 토끼심방조직에서 첼리도닌(화합물 1, 1 μM) 투여후 자극 빈도수에 따른 활동전위모양 변동을 나타낸 도이다.
도 5c는 토끼심방조직에서 자극빈도수에 따른 90% 재분극시의 활동전위기간 (APD90)에 미치는 화합물 1의 첼리도닌(○), 화합물 4의 아세틸첼리도닌(▲), 화합물 5의 벤조일첼리도닌(■) 및 화합물 14의 상구이나린(●)의 평균효과를 나타낸 도이다.
발명의 최선의 실시예
본 발명은 다음의 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명되나, 본 발명이 이들 실시예 의해 제한되지는 않는다.
실시예 1. (12bR)-13,14-디히드로-13-메틸[1,3]벤조디옥솔로[5,6c]-1,3-디옥솔로[4,5-i]페난트리딘(화합물 6)의 제조
:(12bR)-13,14-dihydro-13-methyl[1,3]benzodioxolo[5,6c]-1,3-dioxolo[4,5-i]phenanthridine
무수 메틸렌 디클로라이드(0.2 ㎖)에 데스마틴 페리오디난(25 mg, 0.059 mmol)을 녹이고 10분간 실온에서 교반하였다. 이에 첼리도닌(20 mg, 0.054 mmol)을 무수 메틸렌 디클로라이드(0.1 ㎖)에 녹인후 서서히 점적하였다. 반응액을 30분간 교반한 후 디에틸이서(0.9 ㎖)를 넣고 반응액을 포화 탄산칼륨 수용액(0.56 ㎖)와 치오황산나트륨 오수화물(0.1 g) 혼합액에 넣고 15분간 교반하였다. 상기 반응액을 에틸아세테이트로 추출, 세척, 건조 후에 컬럼 크로마토그래피(헥산:에틸아세테이트=10:1)를 행하여 6.6 mg(37%)의 목적 화합물(화합물 6)을 얻었으며, 9 mg(45%)의 첼리도닌을 회수하였다.
Rf=0.24 (헥산:에틸아세테이트=10:1)
1H-NMR (500MHz, CDCl3) : δ 7.71 (d, 1H, J=9.0Hz), 7.60 (d, 1H, J=14Hz), 7.50 (d, 1H, J=8.5Hz), 7.32 (d, 1H, J=8.0Hz), 7.27 (s, 1H), 6.87(d, 1H, J=8.5Hz), 6.07 (s, 2H), 6.06 (s, 2H), 4.21 (s, 2H), 2.64 (s, 3H).
실시예 2. (12bR)-7, 12b, 13, 14-테트라히드로-13-메틸[1,3]-벤조디옥솔로[5,6c]-1,3-디옥솔로[4,5-i]페난트리딘(화합물 7)의 제조
:(12bR)-7, 12b, 13, 14-tetrahydro-13-methyl[1,3]-benzodioxolo[5,6c]-1,3-dioxolo[4,5-i]phenanthridine
무수 메탄올(0.3㎖)에 화합물 10(20 mg, 0.046mmol)을 녹이고 10분간 실온에서 교반하였다. 이에 포타슘 t-부톡사이드(15 mg, 0.138 mmol)을 넣고 13시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응액을 에틸아세테이트로 추출, 세척, 건조후에 컬럼 크로마토그래피(헥산:에틸아세테이트=4:1)를 행하여 10mg(64%)의 목적 화합물(화합물 7)을 얻었다.
Rf=0.22 (헥산:에틸아세테이트=4:1)
1H-NMR(500MHz, CDCl3) : δ 7.16 (d, 1H, J=6.0Hz), 7.16 (d, 1H, J=8.0Hz), 6.74 (d, 1H, J=8.0Hz), 6.60 (s, 1H), 6.50-6.48 (m, 1H), 5.97 (d, 2H, J=10Hz), 5.93 (d, 2H, J=10Hz), 4.56-4.53 (m, 1H), 4.43 (d, 2H, J=16.5Hz), 3.92 (d, 2H, J=16.5Hz), 3.59-3.41 (m, 2H), 1.99 (s, 3H).
실시예 3: [5bR-(5bα , 6β , 12bα )]-5b, 6, 7, 12b, 13, 14-헥사히드로-13-메틸[1,3]벤조디옥솔로[5,6c]-1,3-디옥솔로[4,5-i]페난트리딘(화합물 8) 의 제조
: [5bR-(5bα , 6β , 12bα)]-5b, 6, 7, 12b, 13, 14-hexahydro-13-methyl[1,3]-benzodioxolo[5,6c]-1,3-dioxolo[4,5-i]phenanthridine
무수 메탄올(0.3 ㎖)에 화합물 7(10 mg, 0.030 mmol)을 녹이고 10% 팔라듐(1 mg)을 넣고 실온에서 10분간 교반하였다. 반응액에 수소를 주입하면서 1시간 동안 교반한 후 셀라이트 패드하에 반응액을 여과한 후 감압, 농축하고 컬럼 크로마토그래피(헥산:에틸아세테이트=6:1)를 행하여 2 mg(20%)의 목적 화합물 8 및 1.8 mg(18%)의 화합물 6을 얻었다.
Rf=0.27 (헥산:에틸아세테이트=6:1)
1H-NMR(500MHz, CDCl3) : δ 6.93(s, 1H), 6.75(d, 1H, J=8.5Hz), 6.72(d, 1H, J=8.5Hz), 6.56 (s, 1H), 5.94 (d, 2H, J=15Hz), 5.92 (d, 2H, J=3Hz), 3.94 (d, 1H, J=16.5Hz), 3.61 (d, 1H, J=4.0Hz), 3.48 (d, 1H, J=16Hz), 3.07-3.04 (m, 1H), 2.79-2.67 (m, 2H), 2.40 (s, 3H), 1.91-1.88 (m, 1H).
실시예 4. {[5bR-(5bα , 6β , 12bα)]-5b, 6, 7, 12b, 13, 14-헥사히드로-13-메틸[1,3]벤조디옥솔로[5,6c]-1,3-디옥솔로[4,5-i]페난트리딘-6-일}-디페닐포스페이트(화합물 9)의 제조
: {[5bR-(5bα , 6β , 12bα)]-5b, 6, 7, 12b, 13, 14-hexahydro-13-methyl[1,3]benzodioxolo[5,6c]-1,3-dioxolo[4,5-i]phenanthridine-6-yl}-diphenylphosphate
무수 클로로포름(0.4 ㎖)에 첼리도닌(30 mg, 0.081 mmol)을 녹이고 1,5-디아자바이씨클로[4,3,0]논-5-인(30 ㎕, 0.243 mmol)을 넣고 실온에서 30분간 교반하였다. 이에 디페닐포스포릴아자이드(27 ㎕, 0.122 mmol)을 넣고 12시간 교반한 후 에틸아세테이트로 반응액을 추출, 세척, 건조후에 컬럼 크로마토그래피(헥산:에틸아세테이트=2:1)를 행하여 20 mg(42%)의 목적 화합물(화합물 9)을 얻었고 11 mg(37%)의 첼리도닌을 회수하였다.
Rf=0.31 (헥산:에틸아세테이트=2:1)
1H-NMR (500MHz, CDCl3) : δ 7.41-7.35 (m, 5H), 7.31-7.19 (m, 7H), 6.59 (d, 1H, J=8.5Hz), 6.37 (s, 1H), 5.90 (s, 2H), 5.88 (d, 2H, J=23Hz), 5.11-5.05(m, 1H), 4.10 (d, 2H, J=5.0Hz), 3.70 (d, 2H, J=17.5Hz), 3.66 (bs, 1H), 3.44 (d, 2H, J=17Hz), 2.99 (1H, dd, J=11, 15Hz), 2.87 (1H, dd, J=5, 15.5Hz), 2.53 (s, 3H).
실시예 5. {[5bR-(5bα , 6β , 12bα)]-5b, 6, 7, 12b, 13, 14-헥사히드로-13-메틸[1,3]벤조디옥솔로[5,6c]-1,3-디옥솔로[4,5-i]페난트리딘-6-일}-메탄설포네이트(화합물 10)의 제조
: {[5bR-(5bα , 6β , 12bα)]-5b, 6, 7, 12b, 13, 14-hexahydro-13- methyl[1,3]-benzodioxolo[5,6c]-1,3-dioxolo[4,5-i]phenanthridine-6-yl}-methanesulfonate
무수 메틸렌디클로라이드(0.5 ㎖)에 첼리도닌(18 mg, 0.048 mmol)을 녹인 후 0℃ 에서 10분간 교반하였다. 이에 무수 트리에틸아민(8 ㎕, 0.058 mmol)과 메탄설포닐클로라이드(6 ㎕, 0.073 mmol)을 넣고 실온에서 6시간 동안 교반한 후 에틸아세테이트로 추출, 세척, 건조후에 컬럼 크로마토그래피(헥산:에틸아세테이트=2:1)를 행하여 16mg(77%)의 목적 화합물(화합물 10)을 얻었다.
Rf=0.39 (헥산:에틸아세테이트=2:1)
1H-NMR(500MHz, CDCl3) : δ 7.21(d, 1H, J=8.0Hz), 7.18(s, 1H), 6.69 (d, 1H, J=8.5Hz), 6.42(s, 1H), 5.90(d, 2H, J=5.0Hz), 5.88(d, 2H, J=15.5Hz), 5.18-5.16 (m, 1H), 4.13-4.11 (m, 1H), 3.75 (s, 1H), 3.73 (d, 2H, J=12Hz), 3.45 (d, 2H, J=17Hz), 3.14-3.08 (m, 1H) , 3.05 (s, 3H) , 2.94 (1H, dd, J=5.0, 15Hz), 2.54 (s, 3H).
실시예 6. {[5bR-(5bα , 6β , 12bα)]-5b, 6, 7, 12b, 13, 14-헥사히드로-13-메틸[1,3]벤조디옥솔로[5,6c]-1,3-디옥솔로[4,5-i]페난트리딘-6-일}-4-메틸벤젠설포네이트(화합물 11)의 제조
: {[5bR-(5bα , 6β , 12bα)]-5b, 6, 7, 12b, 13, 14-hexahydro-13-methyl [1,3]-benzodioxolo[5,6c]-1,3-dioxolo[4,5-i]phenanthridine-6-yl}-4- methylbenzenesulfonate
무수 메틸렌디클로라이드(0.3 ㎖)에 첼리도닌(10 mg, 0.027 mmol)을 녹인 후 0℃ 에서 10분간 교반하였다. 이에 무수 트리에틸아민(5 ㎕, 0.032mmol)과 파라톨루인설포닐 클로라이드(8 ㎕, 0.040 mmol)을 넣고 실온에서 12시간 동안 교반한 후 에틸아세테이트로 추출, 세척, 건조 후에 컬럼 크로마토그래피(헥산:에틸아세테이트=2:1)를 행하여 8.6 mg(63%)의 목적 화합물(화합물 11)을 얻었다.
Rf=0.36 (헥산:에틸아세테이트=2:1)
1H-NMR (500MHz, CDCl3) : δ 7.86 (d, 2H, J=8.5Hz), 7.37 (d, 2H, J=8.5Hz), 7.30-7.26 (m, 1H), 7.20 (s, 1H), 6.66 (d, 2H, J=8.0Hz), 6.33 (s, 1H), 5.89 (d, 2H, J=3.5Hz), 5.87 (d, 2H, J=18Hz), 4.96-4.92 (m, 1H), 4.03(d, 1H, J=5.0Hz), 3.67 (d, 2H, J=17.5Hz), 3.60 (bs, 1H), 3.42 (d, 2H, J=17.5Hz), 2.98 (1H, dd, J=11.5, 15Hz), 2.68 (1H, dd, J=5.0, 15.5Hz), 2.51(s, 3H), 2.47 (s, 3H).
실시예 7. {[5bR-(5bα , 6β , 12bα )]-5b, 6, 7, 12b, 13, 14-헥사히드로-13-메틸[1,3]벤조디옥솔로[5,6c]-1,3-디옥솔로[4,5-i]페난트리딘-6-일}-카바메이트(화합물 12)의 제조
: {[5bR-(5bα , 6β , 12bα)]-5b, 6, 7, 12b, 13, 14-hexahydro-13-methyl [1,3]benzodioxolo[5,6c]-1,3-dioxolo[4,5-i]phenanthridine-6-yl}-carbamate
무수 메틸렌디클로라이드(0.4 ㎖)에 소디움카보네이트(10 mg, 0.097mmol)와 클로로설포닐 이소시아네이트(6 ㎕, 0.065 mmol)을 넣고 -78℃ 에서 10분간 교반하고, 첼리도닌(20 mg, 0.054 mmol)을 무수 메틸렌디클로라이드(0.14 ㎖)에 녹여 상기 혼합용액에 서서히 점적하였다. 반응액을 1시간동안 교반하고, 온도를 서서히 0℃ 로 올린 후 반응액을 물로 종결시키고 3N 수산화나트륨 수용액으로 pH를 알카리화한 후 에틸아세테이트로 추출, 세척, 건조 후에 컬럼 크로마토그래피(헥산:에틸아세테이트=1:1)를 행하여 5.4 mg(20%)의 목적 화합물(화합물 12)을 얻었고 4 mg(40%)의 첼리도닌을 회수하였다.
Rf=0.31 (헥산:에틸아세테이트=1:1)
1H-NMR(500MHz, CDCl3) : δ7.26(d, 1H, J=8.5Hz), 7.21(s, 1H), 6.71(d, 1H, J=8.5Hz) , 6.45 (s, 1H), 5.92 (d, 2H, J=5.5Hz), 5.90 (d, 2H, J=14.5Hz), 5.11-5.07 (m, 1H), 4.78 (bs, 2H), 4.15 (bs, 1H), 3.83 (bs, 1H), 3.75-3.80(m, 1H), 3.50-3.43 (m, 1H), 3.09-3.08 (m, 1H), 3.02 (dd, 1H, J=5.0, 15Hz), 2.59 (s, 3H).
실험예 1: 첼리도닌 및 그 유도체들의 hKv1.5통로 전류에 미치는 영향
1) 선택적 이온통로 발현 세포주(cell line)의 제조
심장에 발현하는 K+통로 유전자를 각각 선택적으로 하나씩만 발현하는 세포주를, 논문(Yang, et al., Inhibition of cardiac potassium currents by the vesnarinone analog OPC-18790: comparison with quinidine and dofetilide. J Pharmacol Exp Ther 1997, 280:1170-1175; Kwak, et al., Phosphorylation is required for alteration of Kv1.5 K+ channel function by the Kvbeta 1.3 subunit. J Biol Chem 1999, 274:25355-25361)에 기대된 방법을 사용하여 제작하였다. 즉, 덱사메타손(dexamethasone)에 의해 유도되는 마우스 유암 바이러스 프로모터(murine mammary tumor virus promotor)를 갖고 있는 pMSVneo에 hKv1.5 및 HERG를 끼워 넣어 마우스 Ltk-세포(mouse Ltk-cell)에 리포펙타민(lipofectamine)으로 감염시킨 후, 24 시간 후 G418 0.5 ㎍/㎖을 함유한 DMEM 배지에 단일 콜로니(colony)를 형성할 때까지 2주간 세포를 배양하였다. 개개의 콜로니를 분리하여 G418 0.25 ㎍/㎖를 함유한 배지에 배양하여 노던(northern)블롯 및 홀-셀 전압고정(whole-cell voltage clamp) 방법으로 각 이온통로 발현수준을 검토하여 다음 실험에 사용하였다. 이렇게 선택된 세포주는 G418 0.25 ㎍/㎖를 함유한 배지에서 실험에 사용할 때까지 배양하였다. 안정 세포주(stable cell line)가 아닌 일시 유전자발현(transient transfection)용 세포들은 DMEM 배지에서 배양하였다.
2) 전류기록
사람 심방세포 및 세포주에서 전류는 막전압고정(gigaohm-seal patch clamp) 방법 중 홀-셀(whole cell) 방법으로 기록하는데(Kwak, et al., Phosphorylation is required for alteration of Kv1.5 K+ channel function by the Kvbeta 1.3 subunit. J Biol Chem 1999, 274:25355-25361), 전기적인 신호를 패취 고정(patch clamp) 증폭기(Axon Instruments, Axopatch-1D, Foster, USA)로 증폭 후, 전류의 신호를 신호변환기(Digidata 1200, Axon Instruments)로 디지털신호로 변환하여 컴퓨터에 저장하였다. 그리고, 전류기록에 사용한 미세전극(Kimax-51, 1.5-1.8 x 100mm)은 2-단계 미세전극 제조기(2-stage pipette puller: Narishige, PP-83)로 뽑아서 미세전극 말단을 열처리하여 사용하는데, 이때 저항이 1-2 MΩ정도되는 피펫을 사용하였다. 한편, 홀 셀 모드(whole cell mode)의 미세전극 내 용액은 100 mM KCl, 10mM HEPES, 5 mM K4BAPTA, 5 mM K2ATP 및 1 mM MgCl2 (pH 7.2)을 함유하고, 세포외용액은 130 mM NaCl, 4mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES 및 10 mM 글루코스(pH 7.35)를 함유하였다.
상기에서 제조한 세포주(Ltk-cell)에, 세포막 전압을 -80 mV로 고정하고 +50 mV로 250 ms 동안 탈분극 자극을 가한 후 -50 mV로 재분극하면서 전류를 기록하였다. 각 화합물의 용량-의존적 hKv1.5통로 전류 억제효과는 화합물이 존재하지 않을 때의 +50 mV로 탈분극 자극 말기에 측정된 안정전류에 대한 상대적 크기로 표시하여 비교하였다.
도 1a 내지 도 1d는 Ltk-세포에 발현시킨 hKv1.5통로 전류에 대한 첼리도닌(화합물 1), 상구이나린(화합물 14), 아세틸첼리도닌(화합물 4), 및 벤조일첼리도닌(화합물 5) 각각의 용량에 따른 효과를 나타낸다. 도 1e는 탈분극 자극의 마지막에 기록된 안정전류와 각 화합물들의 용량반응곡선을 나타낸 도이다. 각 화합물의 결과는 힐(Hill) 방정식으로 최적화하였다.
도 1a 내지 1e로부터, 상기 화합물들은 Ltk-세포에 발현시킨 hKv1.5통로 전 류를 농도-의존적으로 억제하며, 억제양상은 유도체에 따라 약간씩 차이가 있다는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 첼리도닌(화합물 1) 및 아세틸첼리도닌(화합물 4)은 열려진 이온통로를 우선적으로 차단하는 양상을 보였으나, 상구이나린(화합물 14)는 통로활성화 과정을 느리게 하였다. 벤조일첼리도닌(화합물 5)은 지속적 차단작용(tonic block)을 보였다.
상기 화합물들, 즉 화합물 1 ~ 14의 hKv1.5통로 전류 억제작용에 대한 IC50(50% 억제농도) 및 힐(Hill) 방정식을 사용하여 용량반응곡선으로부터 상기 화 합물들의 힐(Hill) 상수값을 산출하였다. 그 결과는 표 2에 나타난 바와 같다.
Figure 112003041656751-pct00009
Figure 112003041656751-pct00010
실험예 2: 첼리도닌에 의한 hKv1.5통로 전류억제의 막전압 의존성
이온 통로에 작용하는 많은 약물들의 막전압의존성 여부는 약물의 응용가치를 평가하는 데 중요하다.
도 1a 내지 도 1e에서 관찰한 억제효과를 전압-전류 관계곡선으로부터 각 막전압에서 약물이 존재하지 않을 때의 대조전류에 비해 첼리도닌(화합물 1) 10 μM 존재하에서의 전류의 상대적인 크기로 비교하여 도 2를 얻었다, 도 2는 각 막전압에서 약물이 존재하지 않는 대조전류에 대한 약물의 상대적 억제효과를 나타낸 것으로, - 80 mV로 막전압을 고정후 - 80 mV부터 +60 mV까지 막전압을 10 mV 간격으로 증가시켜 가면서 250 ms동안 자극시 마지막에 기록된 안정전류를 첼리도닌이 존재하지 않을 때의 대조전류에 비교하여 첼리도닌 존재 하에서의 전류크기를 상대적 전류로 환산하여, 각 막전압에 대하여 나타내었다. 점선은 hKv1.5통로 전류의 활성화 곡선을 표시한 것이고, 0 mV이상의 막전압에서의 막전압 의존성을 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, 첼리도닌(화합물 1)은 -30 mV에서 0mV사이에선 강한 막전압 의존성을 보이고 0 mV와 +60 mV사이에선 약한 막전압 의존성을 보였다. 즉, 0 mV와 +60 mV사이에서 우드헐(Woodhull) 방정식으로 계산시 δ -값이 0.16 ± 0.01 (n=7)이었다.
실험예 3: 첼리도닌에 의한 hKv1.5통로 전류억제의 통로상태 의존성
첼리도닌의 hKv1.5통로 전류 억제효과가 이온통로의 어떤 상태에서 더 잘 작 용하는지 분석하여 도 3을 얻었다.
도 3은, 대조군 및 첼리도닌(화합물 1) 10 μM이 존재할 때, -80 mV로 막전압 에서 +50 mV로 탈분극시킨 후, -50 mV로 재분극시킬 때 발생되는 흔적전류(tail current)를 나타낸 것이다.
대조군에서는 이 흔적전류가 아주 빠르게 감소하는데 반해서, 첼리도닌 존재하에서는 초기 최대(peak) 전류는 감소하나 연속적인 전류의 감소가 대조군에 비해 아주 서서히 일어나 흔적전류의 " 교차현상" 이 관찰되었다. 이는 첼리도닌이 hKv1.5통로에 대해 열린통로 차단제(open channel blocker)로 작용함을 강력히 시사한다. 즉, 첼리도닌은 닫힌 상태보다는 열린 상태의 hKv1.5통로에 더 잘 결합하여 억제효과를 보였다.
실험예 4: 사람 심방세포의 K + 전류에 미치는 첼리도닌의 효과
사람 심방세포분리는 논문(Wang et al. Effects of flecainide, quinidine, and 4-aminopyridine on transient outward and ultrarapid delayed rectifier currents in human atrial myocytes. J Pharmacol Exp Ther 1995, 272:184-196)에 기재된 방법을 사용하였다. 즉, 대동맥-관상동맥 연결시술을 받는 환자의 심방조직의 일부를 환자의 동의하에 채취하여, Ca2+-제거 크랩스 헨셀레이트(Krebs Henseleit:KH) 용액에 넣어 조직을 잘게 자른 다음, 10 ㎖ Ca2+-제거 KH용액이 담긴 삼각플라스크에서 계속 저으면서 5분간 흔들어준 후 상층액을 제거하였다. 조직들을 10㎖ 효소함유(200U/㎖ 콜라젠 분해효소, 4 U/㎖ 단백질 분해효소) 용액에 재부 유시킨 후 45분간 배양한 다음, 상층액을 제거 후 다시 새로운 10 ㎖ 효소용액(삼각플라스크)에 재부유시키고, 매 15분 간격으로 분리된 세포의 숫자 및 질을 도립현미경으로 관찰하면서 최대의 수확을 얻을 때까지 배양하였다. 배양 후 조직을 저장액에 옮겨 피펫으로 세포를 분리 후 250 g에서 5분간 원심 후 침전물을 저장액[조성: 20mM KCl, 10 mM KH2PO4, 10 mM 글루코스(glucose), 70 mM 글루타민산(glutamic acid), 10 mM β -히드록시부틸산(B -hydroxybutyric acid), 10 mM 타우린(taurine), 10 mM EGTA, 0.1% 알부민(albumin), pH 7.4 KOH로 조절]에 재부유하여 전류기록에 사용할 때까지 보관하였다.
첼리도닌의 hKvl.5통로 전류 억제효과가, hKvl.5통로를 가장 많이 발현한다고 알려진 사람 심방세포의 K+ 통로 전류에 대해서도 같은 효과를 보이는지 검토하였다.
심방세포는, 부정맥이 없고 대동맥-관상동맥 연결시술을 받은 환자의 심방조직으로부터 분리하여 사용하였다. -80 mV로 막전압 고정 후 +50 mV로 탈분극 자극하고 -50 mV로 재분극 시키면서 전류를 기록하여 도 4a를 얻었다.
도 4b에서는 각 실험군에서 탈분극 자극 말기에 기록한 안정전류를 통계처리 하였다(n=7).
사람 심방세포에서 측정된 외향성 K+통로 전류는, 탈분극 자극시 아주 빠르게 열렸다 빠르게 비활성화되는 전류와 지속적으로 열리는 통로전류로 구성되어 있는데, 도 4a는 그 전형적인 전류를 보여주고 있다. 도 4a에 나타난 바와 같이, 첼 리도닌(화합물 1) 10 μM은 사람 심방세포의 K+ 통로전류의 최고치를 감소시키고 비활성화 과정을 약간 빠르게 하여 안정상태 전류를 감소시켰다. 즉, 첼리도닌 10 μM은 +50 mV의 탈분극 자극말기에 측정된 안정상태 전류를 대조군에 비해 41 ± 5% (n=7)만큼 억제시킴을 도4b로부터 알 수 있었다. 그러므로, hKv1.5를 발현하는 세포주에서 관찰한 첼리도닌의 효과가 실제 사람 심방세포에서도 동일하게 나타남을 확인하였다.
실험예 5: 토끼 심방세포의 활동전위에 미치는 첼리도닌 및 그 유도체 효과의 자극빈도수 의존성
심장조직에서 활동전위기록은 논문(Kwak, et al., a newly synthesized benzopyran derivative, activates the cardiac ATP-sensitive K+ channel. J Pharmacol Exp Ther 1995, 275:807-812)에 기재된 방법을 사용하였다. 즉, 2kg가량의 토끼를 두부 타격으로 치사 시킨 후 심장을 빠르게 적출하여 97% 산소와 3% 이산화탄소로 포화된 타이로드(Tyrode) 용액이 채워진 해부접시에서 필요부위를 분리해내어 수조에 고정하고, 37℃ 타이로드 용액으로 관류시켰다. 활동전위는 1∼5 Hz, 1ms 기간, 역치전압의 20 내지 30% 높은 자극을 가하여 유발하였다. 활동전위기록은 3M KCl이 채워진 유리전극(10-20 MΩ)의 신호를 증폭기(KS-700, WPI)로 증폭한 다음 오실로스코프(Dual beam storage 5113, Tektronix, Beaverton OR)와 생리기록계(RS 3400, Gould, Cleveland, OH)에 기록하였다. 활동전위기간 비교시, 주로 90% 활동전위기간(APD90)을 사용하였다. 이때, APD90은, 안정막전압으로부터 최대 탈분극까지의 높이를 100%로 정하고 최대 탈분극으로부터 90% 재분극이 일어났을 때의 활동전위 기간이다. 오실로스코프 화면에 기록된 영상들을 폴라로이드 필름에 찍었다.
토끼 심방세포의 활동전위에 대한 첼리도닌 효과의 자극빈도수 의존성여부를 검토하였다.
도 5a(대조군) 및 도 5b(투여군)는 첼리도닌(화합물 1) 투여전과 투여후의 자극빈도수에 따른 활동전위 모양변동을 나타낸 것이고, 도 5c는 화합물 1의 첼리도닌(○), 화합물 4의 아세틸첼리도닌(▲), 화합물 5의 벤조일첼리도닌(■) 및 화합물 14의 상구이나린(●)의 90% 재분극시 평균 활동전위기간을 나타낸 도이다. 상대적 활동전위기간은 각 자극빈도수에서 첼리도닌 투여 전의 APD90의 상대적 값으로 산출하였다. 자극빈도수를 1, 2, 3, 4 및 5Hz로 증가시, 첼리도닌(1 μM)은 대조군의 활동전위기간에 비해 각 자극빈도수에서, 13.0 ± 8.1%(n=5), 14.5 ± 7.9%(n=5), 16.5 ± 2.2%(n=5), 28.2 ± 0.4% (n=5) 및 33.3 ± 0.31% (n=5)만큼씩 증가시켰다. 더불어, 아세틸첼리도닌(화합물 4), 벤조일첼리도닌(화합물 5) 및 상구이나린(화합물 14)도 유사한 양상으로 활동전위기간을 증가시켰으나, 첼리도닌 보다는 약효가 약했다(도 5c참조).
도 5a 내지 5c로부터, 첼리도닌 및 그 여러 유도체들은 낮은 박동수에서는 그 효과가 거의 적고 빠른 박동수에서 그 효과가 더욱 증대함이 확인되었다. 이는 이상적인 항부정맥제가 갖추어야 할 조건 중의 하나이기에 첼리도닌 및 그 유도체 들은 이상적인 항부정맥제로서의 조건을 갖추고 있음이 판명되었다.
제조예 1: 정제
하기의 조성에 따라, 통상의 정제 제조방법으로 제제화하였다.
Figure 112003041656751-pct00011
제조예 2: 캡슐제
하기와 같은 방법에 따라, 다음과 같은 방법으로 캡슐제를 제조하였다. 첼리도닌을 체질하여 부형제와 혼합한 후, 젤라틴 캡슐중에 충전하여 캡슐을 제조하였다.
Figure 112003041656751-pct00012
제조예 3: 산제
하기의 성분을 통상의 산제의 제조방법으로 혼합하고, 봉지에 넣어 밀봉한 후 산제를 제조하였다.
Figure 112003041656751-pct00013
제조예 4: 주사제
하기의 성분을 통상의 주사제의 제조방법으로 2.0 ㎖의 용량의 앰플에 충전하고, 멸균시켜 주사제를 제조하였다.
Figure 112003041656751-pct00014
Figure 112003041656751-pct00015
본 발명에 따른 조성물은 인체에 안전하고 독성이 적으며, 사람심방에서 발현하는 K+통로를 선택적으로 차단하여 심장박동수가 빨라졌을 때 그 효과가 증대되고 낮은 박동수에서는 그 효과가 거의 없어 K+통로 차단제 및 부정맥 치료제로서 사용 가능하다.

Claims (12)

  1. 하기 화학식 1의 첼리도닌 또는 그 유도체와 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 항부정맥제:
    Figure 112005061036656-pct00016
    화학식 1
    상기식 중,
    R1은 수소, 히드록시, 탄소수 1 내지 5의 저급알콕시, 벤질옥시, 탄소수 1 내지 5의 저급알킬카보닐옥시, 벤조일옥시, 탄소수 1 내지 5의 저급알킬설포닐옥시, 아릴설포닐옥시, 디페닐포스포닐옥시기, 및 -OCONH2로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R2가 수소 또는 메틸기이고;
    R3, R4 및 R5는 각각 수소이거나;
    또는, R1은 R2 또는 R4와 이중결합을 형성하거나;
    또는, R2는 R3와 이중결합을 형성하거나;
    또는, R5는 이웃하는 N과 이중결합을 형성한다.
  2. 제 1항에 있어서,
    R1은 수소, 히드록시, 메톡시, 벤질옥시, 아세톡시, 벤조일옥시, 메틸설포닐옥시, 4-메틸-벤젠설포닐옥시, 디페닐포스포닐옥시기, 및 -OCONH2로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R2가 수소 또는 메틸기이고;
    R3, R4 및 R5는 각각 수소이거나;
    또는, R1은 R2 또는 R4와 이중결합을 형성하거나;
    또는, R2는 R3와 이중결합을 형성하거나;
    또는, R5는 이웃하는 N과 이중결합을 형성하는 항부정맥제.
  3. 제 1항에 있어서, 화학식 1의 첼리도닌 또는 그 유도체가 하기 화합물 군으로부터 선택된 것인 항부정맥제:
    [5bR-(5bα , 6β , 12bα)]-5b, 6, 7, 12b, 13, 14-헥사히드로-13-메틸[1,3]벤조디옥솔로[5,6c]-1,3-디옥솔로[4,5-i]페랄트리딘-6-올;
    [5bR-(5bα , 6β , 12bα )]-5b, 6, 7, 12b, 13, 14-헥사히드로-6-메톡시-13-메틸[1,3]-벤조디옥솔로[5,6c]-1,3-디옥솔로[4,5-i]페난트리딘 ;
    [5bR-(5bα , 6β , 12bα )]-5b, 6, 7, 12b, 13, 14-헥사히드로-6-벤질옥시-13-메틸[1,3]벤조디옥솔로[5,6c]-1,3-디옥솔로[4,5-i]페난트리딘;
    {[5bR-(5bα , 6β , 12bα )]-5b, 6, 7, 12b, 13, 14-헥사히드로-13-메틸[1,3]벤조디옥솔로[5,6c]-1,3-디옥솔로[4,5-i]페난트리딘-6-일}-아세테이트;
    {[5bR-(5bα , 6β , 12bα )]-5b, 6, 7, 12b, 13, 14-헥사히드로-13-메틸[1,3]벤조디옥솔로[5,6c]-1,3-디옥솔로[4,5-i]페난트리딘-6-일}-벤조에이트;
    (12bR)-12,14-디히드로-13-메틸[1,3]벤조디옥솔로[5,6c]-1,3-디옥솔로[4,5-i]페난트리딘;
    (12bR)-7, 12b, 13, 14-테트라히드로-13-메틸[1,3]-벤조디옥솔로[5,6c]-1,3-디옥솔로[4,5-i]페난트리딘;
    [5bR-(5bα , 6β , 12bα )]-5b, 6, 7, 12b, 13, 14-헥사히드로-13-메틸[1,3]벤조디옥솔로[5,6c]-1,3-디옥솔로[4,5-i]페난트리딘;
    {[5bR-(5bα , 6β , 12bα )]-5b, 6, 7, 12b, 13, 14-헥사히드로-13-메틸[1,3]벤조디옥솔로[5,6c]-1,3-디옥솔로[4,5-i]페랄트리딘-6-일}-디페닐포스페이트;
    {[5bR-(5bα , 6β , 12bα )]-5b, 6, 7, 12b, 13, 14-헥사히드로-13-메틸[1,3]벤조디옥솔로[5,6c]-1,3-디옥솔로[4,5-i]페난트리딘-6-일}-메탄설포네이트;
    {[5bR-(5bα , 6β , 12bα )]-5b, 6, 7, 12b, 13, 14-헥사히드로-13-메틸[1,3]벤조디옥솔로[5,6c]-1,3-디옥솔로[4,5-i]페난트리딘-6-일}-4-메틸벤젠설포네이트;
    {[5bR-(5bα , 6β , 12bα )]-5b, 6, 7, 12b, 13, 14-헥사히드로-13-메틸[1,3]벤조디옥솔로[5,6c]-1,3-디옥솔로[4,5-i]페난트리딘-6-일}-카바메이트;
    [5bR-(5bα , 6β , 12bα)]-5b, 6, 7, 12b, 13, 14-헥사히드로-5b, 13-디메틸[1,3]-벤조디옥솔로[5,6c]-1,3-디옥솔로[4,5-i ]페난트리딘-6-올; 및
    13-메틸[1,3]벤조디옥솔로[5,6c]-1,3-디옥솔로[4,5-i]페난트리디늄.
  4. 제 1항에 있어서, 약제학적으로 허용가능한 담체가 부형제, 결합제, 활택제, 붕괴제, 피복제, 유화제, 현탁제, 용제, 안정화제, 흡수조제, 주사용수, 등장화제로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 성분임을 특징으로하는 항부정맥제.
  5. 제 1항에 있어서, 경구 또는 주사제 제제의 형태로 제형화되는 것을 특징으로 하는 항부정맥제.
  6. 삭제
  7. 제 1항에 있어서, K+통로 차단 작용을 갖는 것을 특징으로 하는 항부정맥제.
  8. 제 7항에 있어서, hKv1.5통로 차단 작용을 갖는 것을 특징으로 하는 항부정맥제.
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
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