RU2798327C1

RU2798327C1 - Соединение в качестве регулятора калиевых каналов, его получение и применение

Info

Publication number: RU2798327C1
Application number: RU2022112447A
Authority: RU
Inventors: Бо Лян; Ган Лю; Хуаньмин Чэнь
Original assignee: Шанхай Чжимэн Биофарма, Инк.
Priority date: 2021-10-27
Filing date: 2021-12-20
Publication date: 2023-06-21

Abstract

Изобретение относится к области биомедицины, в частности к соединению формулы А или его фармацевтически приемлемой соли, которое может найти применение для получения лекарственного средства, обладающего агонистической активностью в отношении калиевых ионных каналов KCNQ2. Изобретение относится также к способу получения соединения формулы А, его применению для лечения или профилактики заболевания, расстройства или состояния, выбранного из группы, включающей эпилепсию, судороги, воспалительную боль, невропатическую боль, мигрень, депрессию, инсульт и дегенеративное заболевание нервной системы, и включающей его фармацевтической композиции. 4 н. и 5 з.п. ф-лы, 2 табл., 3 пр.

Description

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Изобретение относится к области биомедицины, в частности к соединению в качестве регулятора калиевых каналов, его получению и применению.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Калиевый канал Kv7 представляет собой тип потенциал-зависимого ионно-калиевого канала с низким порогом активации, медленной активацией и отсутствием активации. Калиевый канал Kv7 включает пять членов семейства (от Kv7.1 до Kv7.5), все из которых имеют одинаковую топологию, а именно функциональный канал, состоящий из четырех субъединиц, и каждая субъединица содержит шесть трансмембранных фрагментов (от S1 до S6). Среди которых S4 представляет собой область, чувствительную к напряжению, которая играет важную роль в восприятии изменений мембранного потенциала и контроле конформационных изменений; SS-S6 – это основные компоненты области апертуры канала, а также основная комбинация и область действия открывателей калиевых каналов. Калиевый канал Kv7.1 представляет собой ненейронный путь, который распространяется во внешней периферической ткани, экспрессируется на сердце, опосредуя I_ks (медленное отложенное выпрямление тока) миокарда, и его мутация может приводить к синдрому удлиненного интервала QT. Калиевый канал Kv7.2–Kv7.5 является основой нейронального М-тока, широко распространен в нервной системе и обладает разнообразной физиологической активностью. Мутации генов калиевых каналов Kv7.2 и Kv7.3 могут приводить к различным паттернам эпилепсии, таким как доброкачественные семейные неонатальные судороги (BFNC), что полностью демонстрирует роль М-тока в регуляции возбудимости нейронов. Калиевый канал Kv7.4 сильно экспрессируется в наружных волосковых клетках улитки и слуховом ядре ствола мозга, и его мутация может вызывать наследственную глухоту. Калиевые каналы Kv7.5 в высокой степени экспрессируются на клетки скелетных мышц и головного мозга, и их мутация может вызывать ретинопатию. Многие заболевания, такие как эпилепсия, тревожность, глухота и т.д. обладают общей чертой, такой как высокая возбудимость мембран, а калиевые каналы Kv7 являются молекулярной основой М-тока, который можно открыть, чувствуя изменения мембранного потенциала, так что ингибиторный калиевый ток активируется, тем самым контролируя возбудимость мембраны, благодаря чему калиевые каналы Kv7 имеют большое значение при болях и психических заболеваниях, проявляющихся высокой возбудимостью нервов.

Ретигабин — препарат для лечения эпилепсии. Он был зарегистрирован для продажи в Великобритании, Германии и Дании. Исследования подтвердили, что роль ретигабина связана с потенциал-зависимыми калиевыми ионными каналами (KCNQ), где его основной механизм действия заключается в регулировании токов калия М-типа путем воздействия на каналы KCNQ2/3.

Ретигабин (РТГ) является первым препаратом, открывающим калиевые каналы Kv7, применяемым для лечения парциальной эпилепсии у взрослых, который был выпущен на рынок в 2011 году. Помимо противоэпилептического действия, РТГ также может применяться для лечения тревожных состояний, невралгии, нейродегенеративных заболеваний и др. РТГ может эффективно уменьшать или предотвращать приступы при различных моделях эпилепсии. РТГ оказывает эффективное противоэпилептическое действие как на тонические судороги, вызванные моделью максимального электрошокового судорожного припадка (МЭШ), так и на клонические судороги, индуцированные пентилентетразолом (ПТЗ). Кроме того, РТГ также может предотвращать судороги, вызванные N-метил-D-аспартатом (НМДА), пенициллином, пикротоксином, каиновой кислотой (КК) и т.д. Модель воспламенения подходит для скрининга различных противоэпилептических препаратов, и влияние РТГ на эту модель сильнее, чем на другие модели. Из-за расширенного влияния РТГ на все виды калиевых каналов Kv7 и других каналов, его низкая селективность делает его потенциально нежелательным. Во многих литературных источниках сообщается, что РТГ демонстрирует высокую частоту случаев возникновения нежелательных явлений, связанных с центральной нервной системой, которые могут привести к головокружению, утомляемости, афазии, нарушениям речи, нарушениям равновесия и другим нежелательным реакциям, включая камни в почках, задержку мочи и другие заболевания почек и мочевыделительной системы, заболевания, связанные с сердцем, такие как внезапная остановка сердца, преходящая неустойчивая желудочковая тахикардия, а также могут вызывать обесцвечивание сетчатки, сине-фиолетовую пигментацию кожи, ногтей и тому подобное.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Целью настоящего изобретения является создание соединения формулы А, способа его получения и применения в качестве регулятора калиевых каналов.

Первый аспект настоящего изобретения касается получения соединения, представляемого формулой А, или его фармацевтически приемлемой соли:

формула A.

Второй аспект настоящего изобретения касается способа получения соединения или его фармацевтически приемлемой соли согласно первому аспекту настоящего изобретения, включающего следующие стадии:

1) вступление

в реакцию с

для получения

;

2) вступление

в реакцию с

для получения соединения, представляемого формулой А.

В другом предпочтительном варианте на стадии 1) молярное отношение

к

составляет 1:1–1,2, предпочтительно 1:1,1.

В другом предпочтительном варианте на стадии 2) молярное отношение

к

составляет 0,8–1,1, предпочтительно 0,8–1,0.

В другом предпочтительном варианте способ включает следующие стадии:

Третий аспект настоящего изобретения касается использования соединения или его фармацевтически приемлемой соли согласно первому аспекту настоящего изобретения для получения лекарственного средства для лечения или профилактики заболевания, расстройства или состояния, вызванного за счет регуляции калиевых ионных каналов.

Четвертый аспект настоящего изобретения касается использования соединения или его фармацевтически приемлемой соли согласно первому аспекту настоящего изобретения для получения лекарственного средства для лечения или профилактики заболевания, расстройства или состояния, вызванного за счет регуляции калиевого ионного канала KCNQ2.

Пятый аспект настоящего изобретения касается использования соединения или его фармацевтически приемлемой соли согласно первому аспекту настоящего изобретения для получения лекарственного средства для лечения или профилактики заболевания, расстройства или состояния, вызванного за счет регуляции калиевого ионного канала KCNQ2/3.

Шестой аспект настоящего изобретения касается использования соединения или его фармацевтически приемлемой соли согласно первому аспекту настоящего изобретения для получения лекарственного средства для лечения или профилактики заболевания, расстройства или состояния, вызванного за счет регуляции калиевого ионного канала KCNQ3.

Седьмой аспект настоящего изобретения касается использования соединения или его фармацевтически приемлемой соли согласно первому аспекту настоящего изобретения для получения лекарственного средства для лечения или профилактики заболевания, расстройства или состояния, вызванного за счет регуляции калиевого ионного канала KCNQ3/5.

Восьмой аспект настоящего изобретения касается использования соединения или его фармацевтически приемлемой соли согласно первому аспекту настоящего изобретения для получения лекарственного средства для лечения или профилактики заболевания, расстройства или состояния, вызванного за счет регуляции калиевого ионного канала KCNQ4.

В другом предпочтительном варианте заболевание, расстройство или состояние представляет собой заболевание центральной нервной системы.

В еще одном предпочтительном варианте заболевание центральной нервной системы выбрано из группы, включающей эпилепсию, судороги, воспалительную боль, нейропатическую боль, мигрень, депрессию, тревожное расстройство, инсульт, болезнь Альцгеймера, нейродегенеративное заболевание, злоупотребление кокаином, никотиновую абстиненцию, алкогольную абстиненцию и шум в ушах.

Девятый аспект настоящего изобретения касается получения фармацевтической композиции, включающей один или несколько фармацевтически приемлемых носителей или терапевтически эффективное количество одного или нескольких соединений или их фармацевтически приемлемых солей согласно первому аспекту настоящего изобретения.

Десятый аспект настоящего изобретения касается способа профилактики или лечения заболевания, расстройства или состояния, на которое влияет регуляция калиевых ионных каналов, включающего стадию введения субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества соединения или его фармацевтически приемлемой соли согласно первому аспекту настоящего изобретения или фармацевтической композиции согласно девятому аспекту настоящего изобретения.

Следует понимать, что в настоящем изобретении любой из технических признаков, конкретно описанный выше или ниже (в частности, в приведенных примерах), может быть объединен друг с другом для создания новых или предпочтительных технических решений, которые не будут избыточно подробно описаны в данном документе по отдельности.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

После долгосрочных и комплексных исследований авторы настоящего изобретения неожиданно получили соединение, представленное формулой А, с превосходной активностью в отношении открытия калиевых каналов, максимальной агонистической активностью по отношению к калиевым ионным каналам, фармакокинетикой (например, показателями мозгового кровообращения и т.д.), эффективностью и безопасностью in vivo, а также новой структурой за счет структурной оптимизации. На этой основе изобретатели завершили настоящее изобретение.

ТЕРМИНЫ

В настоящем изобретении, если не указано иное, используемые термины имеют общее значение, хорошо известное специалистам в данной области.

Соединение

Соединение, представляемое формулой А, или его фармацевтически приемлемая соль:

формула A

Используемый здесь термин «фармацевтически приемлемая соль» относится к соли, образованной соединением по настоящему изобретению с кислотой или основанием, подходящим для применения в качестве лекарственного препарата. Фармацевтически приемлемые соли включают неорганические и органические соли. Предпочтительным классом солей являются соли соединений по изобретению, образованные кислотами. Пригодные кислоты для образования солей включают, но не ограничиваются ими, неорганические кислоты, такие как хлористоводородная кислота, бромистоводородная кислота, фтористоводородная кислота, серная кислота, азотная кислота, фосфорная кислота, органические кислоты, такие как муравьиная кислота, уксусная кислота, трифторуксусная кислота, пропионовая кислота, щавелевая кислота, малоновая кислота, янтарная кислота, фумаровая кислота, малеиновая кислота, молочная кислота, яблочная кислота, винная кислота, лимонная кислота, пикриновая кислота, бензойная кислота, метилсульфоновая кислота, этансульфокислота, п-толуолсульфокислота, бензолсульфокислота, нафталинсульфокислота, а также аминокислоты, такие как пролин, фенилаланин, аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота.

Другим предпочтительным классом солей являются соли соединений по изобретению, образованные с основаниями, такие как соли щелочных металлов (такие как соли натрия или калия), соли щелочноземельных металлов (такие как соли магния или кальция), соли аммония (например, низшие алканол-аммониевые соли и другие фармацевтически приемлемые соли аминов), такие как метиламиновая соль, этиламиновая соль, пропиламиновая соль, диметиламиновая соль, триметиламиновая соль, диэтиламиновая соль, триэтиламиновая соль, трет-бутиламиновая соль, этилендиаминовая соль, гидроксиэтиламиновая соль, дигидроксиэтиламиновая соль, трисгидроксиэтиламиновая соль и соль амина, образованная из морфолина, пиперазина и лизина соответственно.

Способ получения

Способ получения соединения формулы А по настоящему изобретению более конкретно описан ниже, но эти конкретные способы не налагают никаких ограничений. Соединения по настоящему изобретению также могут быть беспрепятственно получены путем необязательного комбинирования различных способов синтеза, приведенных в описании или известных в данной области техники, и такие комбинации легко могут быть получены специалистами в области, к которой относится настоящее изобретение.

Как правило, процесс получения соединений по настоящему изобретению выглядит следующим образом, при этом используемые исходные материалы и реактивы являются коммерчески доступными, если не указано иное.

Фармацевтическая композиция и способ применения

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению содержит безопасное и эффективное количество соединения по настоящему изобретению или его фармакологически приемлемой соли и фармакологически приемлемое вспомогательное вещество или носитель. «Безопасное и эффективное количество» относится к такому количеству соединения, которого достаточно для существенного улучшения состояния без появления серьезных побочных эффектов. Обычно фармацевтическая композиция содержит от 1 до 2000 мг соединения по настоящему изобретению на дозу, более предпочтительно от 5 до 1000 мг соединения по настоящему изобретению на дозу. Предпочтительно «доза» представляет собой капсулу или таблетку.

«Фармацевтически приемлемый носитель» относится к одному или нескольким совместимым твердым или жидким наполнителям или гелеобразным веществам, которые пригодны для клинического применения и которые должны иметь достаточную чистоту и достаточно низкую токсичность. «Совместимость» означает, что каждый компонент в композиции можно смешивать с соединениями по настоящему изобретению и друг с другом без существенного снижения эффективности соединений. Некоторые примеры носителей, приемлемых с фармацевтической точки зрения, включают в себя целлюлозу и ее производные (такие как натрия карбоксиметилцеллюлоза, натрия этилцеллюлоза, целлюлозы ацетат и т.д.), желатин, тальк, твердые смазки (такие как стеариновая кислота, магния стеарат), кальция сульфат, растительные масла (такие как соевое масло, кунжутное масло, арахисовое масло, оливковое масло и т.д.), полиолы (такие как пропиленгликоль, глицерин, маннитол, сорбитол и т.д.), эмульгаторы (такие как Твин®), смачивающий агент (такой как натрия додецилсульфат), красители, ароматизаторы, стабилизаторы, антиоксиданты, консерванты, апирогенную воду и т.д.

Фармацевтическая композиция представляет собой раствор для инъекций, капсулу, таблетку, пилюлю, порошок или гранулу.

Способ применения соединения или фармацевтической композиции по настоящему изобретению конкретно не ограничен, и репрезентативные способы применения включают, но не ограничиваются ими, прием внутрь, внутриопухолевое, ректальное, парентеральное (внутривенное, внутримышечное или подкожное) и местное применение.

Твердые лекарственные формы для приема внутрь включают капсулы, таблетки, пилюли, порошки и гранулы. В этих твердых лекарственных формах действующее вещество смешивают не менее чем с одним обычным инертным вспомогательным веществом (или носителем), таким как натрия цитрат или дикальцийфосфат, или с любым из следующих компонентов: (а) наполнители или вещества для улучшения совместимости, например, крахмал, лактоза, сахароза, глюкоза, маннитол и кремниевая кислота; (b) связующие вещества, например, гидроксиметилцеллюлоза, альгинат, желатин, поливинилпирролидон, сахароза и аравийская камедь; (с) увлажнители, такие как глицерин; (d) разрыхлители, такие как агар, кальция карбонат, картофельный крахмал или крахмал тапиоки, альгиновая кислота, некоторые сложные силикаты и натрия карбонат; (e) агенты, замедляющие растворение, такие как парафин; (f) ускорители абсорбции, например, четвертичные аммониевые соединения; (g) смачивающие агенты, такие как цетиловый спирт и глицерилмоностеарат; (h) адсорбенты, например, каолин, а также (i) смазывающие вещества, такие как тальк, кальция стеарат, магния стеарат, твердый полиэтиленгликоль, натрия лаурилсульфат или их смесь. В капсулах, таблетках и пилюлях лекарственные формы могут также содержать буферные агенты.

Твердые лекарственные формы, такие как таблетки, драже, капсулы, пилюли и гранулы, могут быть приготовлены с покрытиями и оболочками, такими как кишечнорастворимые оболочки и другие материалы, известные в этой области. Они могут содержать агенты, придающие непрозрачность, и высвобождение активного соединения или соединения в таких композициях может происходить с задержкой в части пищеварительного тракта. Примерами заливочных компонентов, которые можно использовать, являются полимерные и восковые материалы. При необходимости активное соединение может быть также в микрокапсулированной форме с одним или несколькими из вышеупомянутых вспомогательных веществ.

Жидкие лекарственные формы для приема внутрь включают фармацевтически приемлемые эмульсии, растворы, суспензии, сиропы или настойки. В дополнение к активному соединению жидкая лекарственная форма может содержать инертные разбавители, обычно используемые в этой области, такие как вода или другие растворители, сжижающие агенты и эмульгаторы, например, этанол, изопропанол, этилкарбонат, этилацетат, пропиленгликоль, 1,3-бутандиол, диметилформамид и масла, особенно хлопковое масло, арахисовое масло, масло зародышей кукурузы, оливковое масло, касторовое масло и кунжутное масло или смеси этих веществ.

Кроме этих инертных разбавителей, композиции могут содержать вспомогательные вещества, такие как смачиватели, эмульгаторы и суспендирующие вещества, подсластители, ароматизаторы и вкусовые добавки.

В дополнение к активному соединению суспензия может содержать суспендирующий агент, такой как этоксилированный изооктадеканол, полиоксиэтиленсорбит и дегидратированный эфир сорбитана, микрокристаллическую целлюлозу, алюминия метоксид и агар или их смесь и т.д.

Композиции для парентерального введения могут включать физиологически приемлемые стерильные водные или безводные растворы, дисперсии, суспензии или эмульсии и стерильные порошки, которые могут быть повторно растворены в стерильных растворах или дисперсиях для инъекций. Подходящие водные и неводные носители, разбавители, растворители или наполнители включают в себя воду, этанол, многоатомные спирты и их любые подходящие смеси.

Лекарственные формы соединений по изобретению для местного применения включают мази, порошки, пластыри, спреи и средства, применяемые при ингаляциях. Активную фармацевтическую субстанцию в стерильных условиях смешивают с физиологически приемлемым носителем и любыми консервантами, буферными растворами или пропеллентами, которые могут потребоваться при необходимости.

Соединения по настоящему изобретению можно принимать в виде монотерапии или в сочетании с другими фармацевтически приемлемыми соединениями.

Способ лечения по настоящему изобретению можно применять отдельно или в сочетании с другими средствами лечения или терапевтическими препаратами.

При использовании фармацевтической композиции безопасное и эффективное количество соединения по настоящему изобретению применяют для млекопитающего, нуждающегося в лечении (например, для человека). При этом дозировка во время приема представляет собой фармацевтически эффективную дозу, для людей с массой тела 60 кг суточная доза обычно составляет от 1~2000 мг, предпочтительно от 5~1000 мг. Конечно, конкретные дозы также должны учитывать такие факторы, как путь введения, состояние здоровья пациента и т.д., которые находятся в компетенции квалифицированного врача.

По сравнению с предшествующим уровнем техники основными преимуществами настоящего изобретения являются:

(1) соединение обладает лучшими фармакокинетическими свойствами, такими как лучшее соотношение мозг-кровь (cerebral blood ratio), период полувыведения, степень воздействия, метаболическая стабильность и другие свойства;

(2) соединение обладает лучшей активностью в отношении открытия ионных калиевых каналов, лучшей максимальной агонистической активностью по отношению к калиевым ионным каналам, лучшей селективностью к ионным каналам, лучшей эффективностью и безопасностью in vivo;

(3) ожидается, что соединение будет использоваться для лечения и/или профилактики заболеваний и состояний, на которые влияет активность калиевых ионных каналов.

Настоящее изобретение будет дополнительно проиллюстрировано ниже со ссылкой на конкретные примеры. Следует понимать, что эти примеры используются только для иллюстрации настоящего изобретения, а не для ограничения объема настоящего изобретения. Экспериментальные методы, которые не указывают конкретные условия в следующих примерах, обычно следуют обычным условиям (например, условиям, описанным в Sambrook et al., Molecular Cloning: Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)) или соответствуют условиям, предложенным производителем. Если не указано иное, процентные доли и части рассчитывают по массе.

Если не указано иное, вся профессиональная и научная терминология, используемая в тексте, имеет те же значения, которые известны специалистам в данной области. Кроме того, любые способы и материалы, аналогичные или идентичные приведенным выше, могут применяться к способам изобретения. Способ предпочтительного варианта осуществления, описанный в настоящем документе, и материал предназначены только для демонстрационных целей.

Материалы и реактивы, используемые для проведения экспериментов в следующих примерах, могут быть получены из коммерческих источников, если не указано иное.

Пример 1: получение соединения А

Стадия 1. Соединение 2

Соединение 1 (2,0 г, 10,0 ммоль, 1,0 экв.) растворяли в этилацетате (100 мл) и 2-(1-метилциклопропил)уксусной кислоте (регистрационный номер CAS: 71199-15-0, 1,26 г, 11,0 ммоль, 1,1 экв.), добавляли пиридин (7,9 г, 99,96 ммоль, 10,0 экв.) и T₃P (50 %, 31,8 г, 49,97 ммоль, 5,0 экв.), температуру повышали до 50°C, и перемешивали смесь в течение 16 часов. После охлаждения до 25°C смесь разбавляли водой и экстрагировали этилацетатом (3 х 100 мл). Объединенную органическую фазу промывали насыщенным раствором натрия хлорида и сушили над безводным натрия сульфатом. Остаток, полученный после концентрирования, очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (петролейный эфир : этилацетат = 10:1) с получением соединения 2 (2,5 г, 84%) в виде твердого вещества белого цвета.

ВЭЖХ-МС: [M+H]⁺ = 296,0

Стадия 2. Соединение А

Соединение 3 (224 мг, 0,61 ммоль, 1,2 экв.) растворяли в толуоле (5 мл) и последовательно добавляли соединение 2 (150 мг, 0,51 ммоль, 1,0 экв.), калия трет-бутоксид (172 мг, 1,53 ммоль, 3,0 экв.), 2-дициклогексилфосфино-2'-(N,N-диметиламино)бифенил (Dave-phos) (40 мг, 0,10 ммоль, 0,2 экв.) и Pd₂(dba)₃ (47 мг, 0,051 ммоль, 0,1 экв.), смесь нагревали до 80°C и перемешивали в течение 16 часов в атмосфере азота. Реакционный раствор охлаждали до 25°C, затем разбавляли этилацетатом (30 мл), поочередно промывали водой и насыщенным раствором натрия хлорида, органическую фазу сушили над безводным натрия сульфатом, а остаток, полученный после концентрирования, очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (петролейный эфир : этилацетат = 2:1) с получением соединения А (52,3 мг, 28%).

ВЭЖХ-МС: [M+H]⁺ = 367,2

¹H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d ₆) δ 8,80 (синглет, 1H), 7,27–7,24 (мультиплет, 1H), 7,02–6,99 (мультиплет, 2H), 6,71 (синглет, 2H), 4,31 (синглет, 2H), 3,48 (триплет, J = 6,0 Гц, 2H), 2,90 (триплет, J = 6,0 Гц, 2H), 2,17 (синглет, 2H), 2,10 (дублет, 6H), 1,14 (синглет, 3H), 0,55–0,52 (мультиплет, 2H), 0,32–0,29 (мультиплет, 2H).

Пример 2: испытание на агонистическую активность в отношении открывателя калиевых каналов (испытание FDSS/µCELL)

1. Методика проведения эксперимента

1.1. Экспериментальные процедуры

Получение клеток: клетки CHO-KCNQ2 выращивали в колбе для культивирования вместимостью 175 см². Когда клетки вырастали до плотности 60~80%, питательную среду удаляли, промывали один раз 7 мл фосфатно-солевого буферного раствора (ФСБ), затем добавляли 3 мл 0,25% раствора трипсина для гидролиза. После завершения гидролиза добавляли 7 мл питательной среды (90% минимально обогащенной среды, модифицированной по способу Дульбекко (DMEM)/F12 + 10% ФСБ + 500 мкг/мл G418) для нейтрализации, затем центрифугировали в течение 3 минут со скоростью вращения 800 об/мин, выкачивали супернатант, после чего добавляли 5 мл питательной среды для ресуспендирования, после которого выполняли подсчет клеток.

Выращивание клеток: по результатам подсчета клеток доводили плотность до 3 × 10⁴ клеток/лунка. После выдержки при комнатной температуре в течение 30 минут клетки помещали в CO₂-инкубатор с температурой 37°C и инкубировали в течение ночи (16–18 часов). Плотность клеток достигала приблизительно 80%.

Инкубация с флуоресцентным красителем: среду для культивирования клеток удаляли, добавляли загрузочный буферный раствор в объеме 80 мкл/лунку и инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 60 минут.

Инкубация соединения: удаляли буферный раствор, добавляли приготовленный раствор соединения в объеме 80 мкл/лунка, инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 20 минут.

Сбор данных флуоресценции: для записи сигнала флуоресценции в режиме реального времени использовали прибор FDSS/µCELL с длиной волны возбуждения 480 нм и длиной волны излучения 540 нм, регистрацию проводили 1 раз в секунду, в течение 10 секунд после исходного уровня, начинали добавление стимулирующего буферного раствора в объеме 20 мкл/лунка, после чего продолжали регистрацию данных до завершения 180 секунд.

1.2. Приготовление раствора

загрузочный буферный раствор: 10 мл/пластинка, способ получения приведен ниже:

Компонент	Объем
Концентрат PowerLoadTM, 100X (ингредиент C)	100 мкл
Реактив FluxORTM, восстановленный в ДМСО (стадия 1.2)	10 мкл
Вода деионизированная	8,8 мл
Испытуемый буферный раствор FluxOR™, 10X (компонент B)	1 мл
Пробенецид, восстановленный в воде деионизированной (стадия 1.1)	100 мкл
Общий объем	10 мл

Испытуемый образец буферного раствора: 100 мл/пластинка, способ получения приведен ниже:

Компонент	Объем
Вода деионизированная	8,9 мл
Испытуемый буферный раствор FluxOR™, 10X (компонент B)	1 мл
Пробенецид, восстановленный в воде деионизированной (стадия 1.1)	100 мкл
Общий объем	10 мл

Стимулирующий буферный раствор: 5 мл/пластинка, способ получения приведен ниже:

Компонент	Объем
Компонент	+K⁺	-K⁺
Вода деионизированная	2,5 мл	3,5 мл
Буферный раствор FluxOR™, не содержащий хлор, 5X (ингредиент E)	1 мл	1 мл
Концентрат K₂SO₄ (125 мМ раствор K₂SO₄ (концентрированный), ингредиент F)	1 мл	/
Концентрат Tl₂SO₄ (концентрат 50 мМ раствора Tl₂SO₄, компонент G)	0,5 мл	0,5 мл
Общий объем	5 мл	5 мл

Вышеупомянутый буферный раствор входит в коммерчески доступный набор FluxOR для анализа ионных калиевых каналов.

1.3. Получение соединения

Готовили 20 мМ исходный раствор соединения ДМСО, 10 мкл 20 мМ исходного раствора соединения помещали в 20 мкл раствора ДМСО, выполняли последовательное 3-кратное разведение до получения 8 промежуточных концентраций, затем среднюю концентрацию соединения переносили в испытуемый буферный раствор, выполняли 200-кратное разведение, чтобы получить конечную испытуемую концентрацию, отбирали 80 мкл и добавляли на испытуемый планшет.

Самая высокая тестируемая концентрация составляла 100 мкМ, друг за другом следовали 100 мкМ, 33,33 мкМ, 11,11 мкМ, 3,70 мкМ, 1,23 мкМ, 0,41 мкМ, 0,137 мкМ и 0,045 мкМ (всего 8 концентраций). Раствор каждой концентрации помещали в 3 лунки.

Содержание ДМСО при конечной концентрации испытуемого образца не превышало 0,5%. Данная концентрация ДМСО не влияла на калиевый канал KCNQ2.

1.4. Анализ данных

Экспериментальные данные были проанализированы с помощью программного обеспечения Excel 2007 и GraphPad Prism 5.0, и для расчета эффекта агонизма было получено расчетное соотношение 180 секунд. Эффект агонизма соединения рассчитывали по следующей формуле:

Процентное значение агонизма =	Отношение флуоресцентных сигналов с добавлением соединения - отношение флуоресцентных сигналов без добавления соединения	x 100%
	Отношение флуоресцентных сигналов без добавления соединения

1.5. Контроль качества

Окружающая среда: температура ~25°C

Реактив: набор для детектирования FluxOR^TM (Invitrogen, номер по каталогу: F0017)

Экспериментальные данные в протоколе должны соответствовать следующим критериям: Z’-фактор: > 0,5

2. Полученные результаты: см. таблицу 1 для получения подробной информации.

Таблица 1

Соединение	Максимальная агонистическая активность (%)
A	43,06
B	9,67

Ссылки на вышеупомянутые методики анализа: ZhaobingGao et al., Journal of Biological Chemistry. 2010, 285(36): 28322-28332.

Соединение B представляет собой соединение, имеющее структуру

, раскрытую в патентах WO2008024398 и WO2011094186. При сравнении максимальной агонистической активности соединения A и соединения B можно увидеть, что после того, как трет-бутил соединения B заменяется на

, максимальная агонистическая активность соединения в отношении калиевого ионного канала KCNQ2 значительно увеличивается (~4,5 раз).

Пример 3: исследование способности соединений проходить через гематоэнцефалический барьер

1) Цель исследования: получение данных в отношении прохождения испытуемого соединения через гематоэнцефалический барьер

2) Суть эксперимента

Отбирали девять здоровых самцов мышей ICR (масса тела в диапазоне 18–22 г), распределяли их на 3 группы, включающие по 3 особи каждая. После голодания в течение ночи животным пероральным путем вводили испытуемое соединение соответственно. Кровь собирали путем пункции сердца в следующие временные точки: 1 час, 2 часа и 4 часа. В пробирку с антикоагулянтом ЭДТА-K₂ отбирали не менее 0,5 мл цельной крови. В течение получаса плазму центрифугировали (6000 оборотов, 8 минут, 4°С) и заморозили при -20°С для последующего использования. В то же время отбирали ткань мозга, промывали 0,9 % раствором натрия хлорида, который затем удаляли насухо с помощью впитывающей бумаги, ткань взвешивали и замораживали при -20°C для последующего использования.

Экспериментальные результаты: согласно полученным данным по концентрации препарата в крови для расчета фармакокинетических параметров после введения использовали некомпартментную модель программы WinNonlin® 7.0 (Pharsight, США).

Таблица 2 Соотношение мозг-кровь (концентрация препарата в тканях мозга и в крови), в каждой временной точке после однократного перорального введения самцам мышей ICR

	Соотношение мозг-кровь (1 ч)	Соотношение мозг-кровь (2 ч)	Соотношение мозг-кровь (4 ч)
Соединение А	4,47	3,31	4,24
Соединение B	0,7	0,8	0,1

Соотношение мозг-кровь является очень важным параметром для неврологических препаратов. Чем выше значение соотношения мозг-кровь, тем выше способность соединения проходить через гематоэнцефалический барьер. Из сравнения данных в таблице 2 видно, что соотношение мозг-кровь для соединения А по настоящему изобретению значительно выше, чем для соединения В, раскрытого в патентах WO2008024398 и WO2011094186 (более чем в 4 раза).

Все литературные источники, упомянутые в настоящем изобретении, включены в данный документ в виде ссылок, как если бы они были включены при помощи ссылки по отдельности. Кроме того, следует понимать, что после изучения вышеприведенного описания специалистами в данной области техники могут быть внесены многочисленные изменения и модификации, и такие эквиваленты также попадают в объем, определяемый прилагаемой формулой изобретения.

Claims

1. Соединение формулы А или его фармацевтически приемлемая соль:

формула A.

2. Способ получения соединения или его фармацевтически приемлемой соли по п. 1, включающий следующие стадии:

1) вступление

в реакцию с

для получения

;

2) вступление

в реакцию с

для получения соединения формулы А.

3. Применение соединения или его фармацевтически приемлемой соли по п. 1 для получения лекарственного средства, обладающего агонистической активностью в отношении калиевых ионных каналов KCNQ2, для лечения или профилактики заболевания, расстройства или состояния, выбранного из группы, включающей эпилепсию, судороги, воспалительную боль, невропатическую боль, мигрень, депрессию, инсульт и дегенеративное заболевание нервной системы.

4. Применение по п. 3, где заболевание, расстройство или состояние выбирают из группы, включающей эпилепсию и судороги.

5. Применение по п. 3, где заболевание, расстройство или состояние выбирают из группы, включающей воспалительную боль, невропатическую боль и мигрень.

6. Применение по п. 3, где заболевание, нарушение или состояние представляет собой депрессию.

7. Применение по п. 3, где заболевание, расстройство или состояние представляет собой инсульт.

8. Применение по п. 3, где заболевание, расстройство или состояние представляет собой дегенеративное заболевание нервной системы.

9. Фармацевтическая композиция, обладающая агонистической активностью в отношении калиевых ионных каналов KCNQ2, включающая один или более фармацевтически приемлемых носителей и терапевтически эффективное количество соединения или его фармацевтически приемлемой соли по п. 1.