본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 생큐노라이드 A를 유효 성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 생큐노라이드 A를 유효 성분으로 포함하는 멜라노사이트 자극 호르몬 활성 저해용 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 상술한 당업계의 요구에 따라 멜라노사이트 자극 호르몬 활성 억제 효과를 갖는 물질을 개발하고자 노력하였으며, 자연 재료인 천궁 추출물이 이러한 멜라노사이트 자극 호르몬의 활성 억제 효과를 갖는 물질이며, 상기 천궁 추출물을 포함하는 화장료 조성물이 우수한 피부 미백 효과를 가짐을 확인한 바 있다 (대한민국 특허출원 제 2002-25213호).
또한, 본 발명자들은 상기 천궁 추출물로부터 상기한 활성을 나타내는 물질을 단리하고자 노력하여, 상기 천궁 추출물로부터 다양한 단일 물질을 분리하였으며, 이들 중에서 멜라노사이트 자극 호르몬 활성 저해 효과를 나타내는 물질을 스크리닝한 결과 생큐노라이드 A가 상기한 활성을 나타냄을 확인하였다. 이러한 멜라노사이트 자극 호르몬 활성 저해 효과는 기존에 알려지지 않은 생큐노라이드 A의 신규한 용도이다.
자연계에 존재하는 프탈라이드의 일종인 생큐노라이드 A (senkyunolide A; 3-butyl-6,7-dihydrophthalide)는 하기 화학식 1과 같은 구조를 갖는 물질이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 생큐노라이드 A는 자연 재료인 천궁으로부터 분리된 것이다. 상기 천궁은 미나리과에 속하는 다년생 초본으로서, 일천궁 (Cnidium officinale) 및 토천궁 (Ligusticum chuanxiong) 등이 사용될 수 있다.
상기 천궁은 다양한 종류의 프탈라이드를 포함하고 있다. 예컨대, 일천궁 (Cnidium rhizome)에서는 리구스틸라이드, 부틸리덴네프탈라이드, 생큐노라이드 A 및 생큐노라이드 H 등이 존재함이 확인되었으며 (Kobayashi S. et al. Antiproliferative effects of the traditional Chinese medicine shimotsu-to, its component cnidium rhizome and derived compounds on primary cultures of mouse aorta smooth muscle cells. Jpn J Pharmacol 60(4):397-401(1992)), 토천궁 (Ligusticum chuanxiong)에서는 3-부틸프탈라이드, 3-부틸리덴프탈라이드, 3-부틸리덴-4-히드록시프탈라이드, 네오크니딜라이드, Z-리구스틸라이드, E-리구스틸라이드, 생큐노라이드 A, 생큐노라이드 F, 생큐노라이드 H 및 생큐노라이드 I 등이 분리되었다 (Li HX. et al. Separation and identification of the phthalic anhydride derivatives of Liqusticum chuanxiong Hort by GC-MS, TLC, HPLC-DAD, and HPLC-MS. J Chromatogr Sci 40(3)156-61(2002)).
이러한 천궁으로부터 단리된 물질들 중에서 본 발명의 생큐노라이드 A는 멜라노사이트 자극 호르몬의 활성을 저해하는 신규한 용도가 있으며, 이로 인하여 티로시나아제의 생합성 자체를 억제함으로써 티로시나아제의 활성을 저해하여 미백 효과를 나타내는 종래의 미백제보다 우수한 피부 미백 효과를 나타낸다. 또한, 본 발명의 생큐노라이드 A는 천궁 추출물 자체보다 더 낮은 농도에서 상기한 활성을 나타내기 때문에 보다 우수한 미백 물질로 사용될 수 있다.
본 발명에서 이용되는 천궁은 다양한 기관, 조직 (예: 뿌리, 잎, 꽃, 줄기, 과실 및 종자 등) 등이 이용될 수 있으며, 가장 바람직하게는 천궁의 뿌리를 이용한다.
바람직하게는, 본 발명의 생큐노라이드 A는 천궁 추출물에서 분리된다. 상기 천궁 추출물은 다양한 추출 용매, 예를 들어, (a) 물, (b) 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올 (메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등), (c) 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, (d) 아세톤, (e) 에틸 아세테이트, (f) 클로로포름, (g) 1,3-부틸렌글리콜, (h) 부틸 아세테이트를 추출 용매로 하여 천궁으로부터 얻을 수 있다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 천궁 추출물은 함수 저급 알코올, 가장 바람직하게는 에탄올을 이용하여 얻어진 것이다. 한편, 본 발명의 추출물은 상기한 추출 용매 뿐만 아니라, 다른 추출 용매를 이용하여도 실질적으로 동일한 효과를 나타내는 천궁 추출물이 얻어질 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 것이다.
한편, 본 발명의 생큐노라이드 A는 상기 천궁 추출물로부터 공지의 방법에 의하여 분리 및 정제될 수 있다. 예컨대, 상기 생큐노라이드 A는 다양한 크로마토그래피, 예컨대, 기체 크로마토그래피 (GC), 고속 기체 크로마토그래피 (HSGC), 액체 크로마토그래피 (LC), 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 및 박층 크로마토그래피 (TLC) 등의 방법에 의하여 분리 및 정제될 수 있다.
또한, 본 발명의 생큐노라이드 A는 상기 천궁 추출물에서 분리된 것 이외에 화학적으로 합성된 것도 사용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 화장료 조성물에서 유효 성분으로서의 생큐노라이드 A의 함량은 상기 화장료 조성물의 총 중량에 대하여 0.00001-20 중량%이며, 보다 바람직하게는 0.0001-10 중량%이다. 만일, 함량이 0.00001 중량% 미만인 경우에는 그 효과가 나타나기 어렵고, 20 중량%를 초과하는 경우에는 피부 자극을 유발할 가능성이 높으며 제형의 안정화에도 영향을 미칠 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서의 생큐노라이드 A 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.
본 발명의 미백용 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 수렴 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 재료
천궁의 뿌리는 대한민국 서울 소재 경동시장에서 구입하여 추출물 제조 및 유효 성분 물질의 단리에 사용하였다.
실시예 1: 생큐노라이드 A의 분리 및 정제
건조된 천궁의 뿌리의 분말 3 ㎏을 에탄올 18 ℓ에 3-5일간 침적시키고 이것을 와트만 여과지 No. 5를 이용하여 여과한 후 냉각 콘덴서가 장치되어 있는 회전 감압 증발기로 완전히 건조하였다. 건조된 분말을 에틸아세테이트 및 물이 함유된 혼합액에 분획한 후 에틸아세테이트 층에 있는 것을 다시 회전 감압 증발시켰다. 이렇게 하여 얻어진 물질을 오픈 실리카 컬럼 (노르말 헥산:에틸아세테이트 = 3:1)을 이용하여 TLC에서 Rf값이 0.5 인 분액들을 얻고 이를 감압 증류하여 30.1 g을 수득하였다. 여기서 Rf의 0.5의 값은 프렙-TLC를 이용하여 활성을 갖는 물질의 Rf의 값을 미리 실험을 통해 얻은 결과이다. 상기 감압 증류하여 수득된 물질을 정제하기 위하여 프렙-LC (Prep-LC)를 이용하여 화합물을 분리한 후 감압 증류한 뒤 진공 펌프를 이용하여 잔류 용매를 제거하여 3.1 g의 생큐노라이드 A를 수득하였다: Exact Mass: 192.12; ms (m/z(%)) 192(17.19), 163(1.91), 135(3.57), 107(100); 1HNMR 6.21(dt), 5.91(dt), 4.93(dd) 2.47-1.39(m), 0.9(t); IR 2932, 2872, 1747, 1241 ㎝-1; UV (207, 278 ㎚).
실험예 1:
생큐노라이드 A의 멜라노사이트 자극 호르몬 활성 억제에 의한 멜라닌 생성 억제 효과
상기 실시예 1에서 분리된 생큐노라이드 A의 멜라노사이트 자극 호르몬 활성 억제에 의한 멜라닌 생성 억제 효과를 다음과 같이 실험하였다.
멜라노사이트 세포는 마우스 유래 B-16 멜라노마 세포주 (ATCC CRL 6323) 를 구입하여 사용하였다. 멜라노마 세포주를 포도당 4.5 g/ℓ, 10% 혈청 및 1% 항생제가 함유된 DMEM 배지에 접종하여 50 ㎖ T-플라스크에 37℃에서 배양하였다. 5% CO2 조건 하에서 24시간 배양한 후 0.02% EDTA가 함유된 0.05% 트립신을 처리하여 세포를 분리한 후 ø100 plate에 5 ×104 cells/plate가 되게 처리하여 배양하였다. 배양 후 24시간 경과 후 각 플레이트에 멜라노사이트 자극 호르몬 (α-MSH, Sigma, 미합중국)을 100 μM 첨가한 후 상기 생큐노라이드 A를 각각 5, 10, 20 및 50 ㎍/㎖ 첨가하였다. 배양 5일 경과 후 각 플레이트에 있는 각각의 세포를 수득하여 멜라닌의 양을 정량하였다. 멜라닌의 정량은 먼저 5% 트리클로로아세테이트 (TCA)를 처리하여 교반하고 원심분리하여 침전된 멜라닌을 살린 포스페이트 완충용액으로 세척하였다. 침전된 멜라닌에 1N NaOH를 처리하여 용해시킨 후 475 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 멜라닌 농도는 합성 멜라닌 (Sigma, 미합중국)의 표준 농도 곡선으로부터 결정하고 각각 추출물의 멜라닌 생성 억제율을 구하였다. 상기 실험의 결과는 하기 표 1에 나타나 있다.
생큐노라이드 A의 농도 (㎍/㎖) |
멜라닌 생성율 (%) |
0*
|
100.0 |
0**
|
175.8 |
5**
|
160.6 |
10**
|
121.3 |
20**
|
105.5 |
50**
|
98.7 |
*멜라노사이트 자극 호르몬 무처리
**멜라노사이트 자극 호르몬 100 μM 처리 |
상기 표 1에 나타난 바와 같이, 본 발명의 생큐노라이드 A는 멜라노사이트 자극 호르몬이 처리된 멜라노사이트 세포에서의 멜라닌 생성율을 농도 의존적으로 감소시키며, 50 ㎍/㎖ 이상이 처리되었을 경우에는 멜라노사이트 자극 호르몬이 처리되지 않은 멜라노사이트 세포에 있어서의 멜라닌 생성율 (100.0%) 보다 더 낮은 멜라닌 생성율을 나타내었다. 따라서, 본 발명의 생큐노라이드 A는 멜라노사이트 자극 호르몬의 활성을 우수하게 저해하여 멜라닌 생성을 억제하는 효과를 나타냄을 알 수 있다.
실험예 2: 생큐노라이드 A의 티로시나아제 생성 억제 여부 확인
상기 실험예 1과 동일한 방법으로 멜라노사이트 세포를 배양하여 생큐노라이드 A를 플레이트에 각각 5, 10, 20 및 50 ㎍/㎖ 첨가하였다. 그런 다음 배양 3일 경과 후 세포를 수획하였다. 수획된 세포는 소듐 포스페이트 완충용액을 이용하여 2회 세척한 후 0.1% 트리톤 X-100을 처리한 후 초음파 파쇄기를 이용하여 30초간 반응시켰다. 이 반응액을 고속 원심분리기를 이용 (12,000rpm, 30분, 4℃)하여 세포 데브리스와 상등액을 분리하였다. 분리된 상등액은 전기 영동법을 이용하여 단백질을 분리하고 여기에 0.2% 도파 (dopa) 용액이 들어있는 반응액에서 약 8시간 반응시킨 후 각 젤에서의 티로시나아제 생성량을 확인하였다. 상기 실험의 결과는 하기 표 2에 나타나 있다.
생큐노라이드 A의 농도 (㎍/㎖) |
티로시나아제 밴드 강도 |
0*
|
100 |
0**
|
205 |
5**
|
185 |
10**
|
153 |
20**
|
132 |
50**
|
101 |
*멜라노사이트 자극 호르몬 무처리
**멜라노사이트 자극 호르몬 100 μM 처리 |
상기 표 2에 나타난 바와 같이, 본 발명의 생큐노라이드 A는 멜라노사이트 자극 호르몬이 처리된 멜라노사이트 세포에서의 티로시나아제 생성을 농도 의존적으로 감소시키며, 50 ㎍/㎖ 이상이 처리되었을 경우에는 멜라노사이트 자극 호르몬이 처리되지 않은 멜라노사이트 세포에 있어서의 티로시나아제 밴드 강도와 거의 동일한 정도의 밴드 강도를 나타내었다. 따라서, 본 발명의 생큐노라이드 A는 멜라노사이트 자극 호르몬의 활성을 저해하여 티로시나아제의 생합성 자체를 억제함으로써, 기존의 미백제의 티로시나아제 활성 저해 효과에 의한 멜라닌 생성 억제보다 더 우수한 멜라닌 생성 억제 효과를 나타냄을 알 수 있다.
이하, 본 발명의 제형예로서 유연 화장수, 수렴 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스 및 팩을 예시하고 있으나, 본 발명의 조성물을 포함하는 화장료의 제형은 이에 제한되는 것은 아니다.
제형예
제형예 1: 유연 화장수
생큐노라이드 A를 포함한 유연 화장수의 제형예는 하기 표 3과 같다.
성분 |
함량 (중량%) |
생큐노라이드 A글리세린1.3-부틸렌글리콜PEG 150알란토인DL-판테놀EDTA-2Na벤조페논-9소듐 히아루로네이트에탄올옥틱도데세스-16폴리솔베이트 20방부제, 향, 색소증류수 |
1.05.03.01.00.10.30.020.045.010.00.20.2미량잔량 |
합계 |
100 |
제형예 2: 수렴 화장수
생큐노라이드 A를 포함한 수렴 화장수의 제형예는 하기 표 4와 같다.
성분 |
함량 (중량%) |
생큐노라이드 A글리세린1.3-부틸렌글리콜알란토인DL-판테놀EDTA-2Na벤조페논-9소듐 히아루로네이트에탄올폴리솔베이트 20위치하젤 추출물구연산방부제, 향, 색소증류수 |
1.02.02.00.20.20.020.043.015.00.32.0미량미량잔량 |
합계 |
100 |
제형예 3: 영양 화장수
생큐노라이드 A를 포함한 영양 화장수의 제형예는 하기 표 5와 같다.
성분 |
함량 (중량%) |
생큐노라이드 A글리세릴 스테아레이트 SE스테아릴 알코올라놀린폴리솔베이트 60소르비탄 스테아레이트경화식물유광물유스쿠알란트리옥타노인디메치콘초산토코페롤카르복시비닐폴리머글리세린1,3-부틸렌글리콜소듐히아루로네이트트리 에탄올아민방부제, 향, 색소증류수 |
1.51.51.51.51.30.51.05.03.02.00.80.50.125.03.05.00.12미량잔량 |
합계 |
100 |
제형예 4: 영양 크림
생큐노라이드 A를 포함한 영양 크림의 제형예는 하기 표 6과 같다.
성 분 |
함량 (중량%) |
생큐노라이드 A친유형 모노스테아린산글리세린세테아릴 알코올스테아린산밀납폴리솔베이트 60소르비탄 스테아레이트경화식물유스쿠알란광물유트리옥타노인디메치콘소듐마그네슘실리케이트글리세린베타인트리에타올아민소듐히아루로네이트방부제, 향, 색소증류수 |
5.02.02.21.51.01.50.61.03.05.05.01.00.15.03.01.04.0미량잔량 |
합계 |
100 |
제형예 5: 마사지 크림
생큐노라이드 A를 포함한 마시지 크림의 제형예는 하기 표 7과 같다.
성분 |
함량 (중량%) |
생큐노라이드 A친유형 모노스케아린산 글리세린스테아릴 알코올스테아린산폴리솔베이트 60소르비탄 스테아레이트이소스테아릴 이소스테레이트스쿠알란광물유디메치콘히드록시에칠셀룰로오스글리세린트리에타올아민방부제, 향, 색소증류수 |
1.01.51.51.01.50.65.05.035.00.50.126.00.7미량잔량 |
합계 |
100 |
제형예 6: 에센스
생큐노라이드 A를 포함한 에센스의 제형예는 하기 표 8과 같다.
성분 |
함량 (중량%) |
생큐노라이드 A글리세린베타인PEG 1500알란토인DL-판테놀EDTA-2Na벤조페논 - 9히드록시에칠 셀룰로오스소듐히아루로네이트카르복시비닐폴리머트리에탄올아민옥틸도데칸올옥틸도데세스 -16에탄올방부제, 향, 색소증류수 |
1.510.05.02.00.10.30.020.040.18.00.20.180.30.46.0미량잔량 |
합계 |
100 |
제형예 7: 팩
생큐노라이드 A를 포함한 팩의 제형예는 하기 표 9와 같다.
성분 |
함량 (중량%) |
생큐노라이드 A폴리비닐 알코올셀룰로오스 검글리세린PEG 1500사이크로데스트린DL-판테놀알란토인글리시리진산모노암모늄니코틴아미드에탄올PEG 40 경화피마자유향, 색소, 방부제증류수 |
1.0 15.00.153.02.00.150.40.10.30.56.00.3미량잔량 |
합계 |
100 |
실험예 3: 본 발명의 화장료 조성물의 미백 효과 평가
본 발명의 화장료 조성물의 미백 효과를 실제 사용 테스트를 통하여 평가하였다. 상기 제형예 4의 생큐노라이드 A를 1.5%를 함유하고 있는 영양 크림 및 제형예 4의 생큐노라이드 A를 정제수로 대체한 크림 (비교예)을 사용하여 각각의 미백 효과를 평가하였다.
30-40세 여성 20명을 자외선 조사기를 이용하여 피부의 색소 침착을 야기시켰다. 이들을 무작위로 2개 군으로 나누어 제형예 4 및 비교예의 영양 크림을 매일 아침 저녁 2회씩 세안 후 적당량을 팔의 상박에 2개월간 연속적으로 바르게 하였다. 미백 효과는 상박에서의 개선 효과를 육안으로 관찰하여 평가하였다. 그 결과는 하기 표 10에 나타내었다.
|
유효 |
약간 유효 |
무효 |
유효율(%) |
처방예 4 |
41 |
6 |
3 |
94.0 |
비교예 |
5 |
12 |
33 |
34.0 |
상기 표 10에 나타난 바와 같이, 본 발명의 화장료 조성물은 비교예의 조성물에 비하여 높은 피부 미백 효과를 나타냄을 알 수 있다. 또한, 본 발명품을 피부에 도포한 대부분의 피검자들에게서 피부 자극을 관찰할 수 없었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.