KR100463825B1 - 에나미네랄ａ 활성수의 제조방법 및 이를 이용한 골다공증예방 및 개선용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 고온에서 소성된 오징어뼈 및 홍조류 파쇄분말을 원료로 한 알카리성을 갖는 미네랄 활성수의 제조방법 및 이를 이용하여 골다공증예방에 효능을 갖는 조성물과 건강식품에 관한 것이다. 본 발명의 미네랄이 풍부한 알칼리성 수용액은 인간을 포함한 포유류 골흡수 및 골다공증과 같은 골질환 예방 및 개선에 효능이 있는 유용한 활성수로서 사용가능하다.

Description

에나미네랄Ａ 활성수의 제조방법 및 이를 이용한 골다공증 예방 및 개선용 조성물{ENA Mineral Bioactive Solution, Manufacturing Method thereof and Its Application for the Osteoporosis Prevention}

본 발명은 에나활성미네랄A 활성수의 제조방법 및 이를 응용한 골다공증 예방 및 개선에 유용한 활성수에 관한 것이다.

보다 자세하게는 무기질이 풍부한 오징어뼈 또는/및 홍조류를 주원료로 하여 제조한 미네랄 활성수 조성물 및 이를 이용한 건강식품에 관한 것이다.

산업사회가 고도화 및 전문화가 되면서 전통적으로 슬로우 푸드를 섭취하는 식생활에서 패스트푸드 식생활로 변화되고, 생활환경의 스트레스와 환경오염인자로 인하여 현대인에게 필수적인 미네랄 공급이 부족하며, 현대인에게 필수적으로 요구되는 칼슘이 원활하게 공급되지 못하고 있는 실정이다.

인체가 필요로 하는 무기질은 극미량이지만 세포성장 및 체조직의 유지에 도움을 주고 신체 활동을 조절해주는 등 중요한 역할을 한다. 특히 인체대사기전에 중요한 역할을 하는 칼슘은 골다공증예방에 필수적이나 인간 및 포유류에게서 필요한 적정량 공급이 부족하며, 섭취량은 증가하나 흡수율이 낮은 것이 문제점으로 대두되고 있다.

골다공증은 노년층, 폐경기 이후의 여성이나, 남성에게 있어서 반드시 공통적으로 겪는 골격계 질환으로서 아직까지 초기 진단 및 예방이 미흡한 현실이다. 골다공증은 주로 에스트로겐, 성장호르몬, 남성호르몬 등의 호르몬 결핍에 의해 발생하며, 갑상선 질환 등에 이어 2차적으로 발생하기도 한다. 골다공증은 조골세포 (osteoblast)에 의한 뼈의 생성량보다 파골세포(osteoclast)에 의한 뼈의 파괴량이 증가하여 골밀도가 감소하는 질환으로 별다른 증상 없이 진행되다가 작은 충격에도 골절이 쉽게 발생하게 된다. 폐경기 여성에 있어서는 급속한 골 밀도 감소가 일어나게 되고 그 이후에는 여성과 남성에서 모두 서서히 골 밀도 감소가 진행된다. 이러한 골다공증에 있어서 혈청중의 칼슘(Ca), 총 알카라인 포스파타제(total alkaline phosphatase)의 변화와 골형성에 관련된 호르몬(estradiol, osteocalcin) 및 골흡수에 관련된 호르몬(parathyroid hormone)의 농도 변화가 나타나고 또한, 골흡수 지표로 이용되는 콜라겐 가교제인 뇨 중의 피리디놀린(pyridinoline)의 배출이 증가하게 된다.

골다공증의 치료는 호르몬 보충요법으로 에스트로겐(estrogen) 투여가 이루어지고 있으며, 호르몬 보충요법을 폐경주변기 후반이나 폐경 초기에 시작하여야 최대의 효과를 얻을 수 있다고 보고 되어 있다(Stepan JJ, etc., (2003) Endocr Regul 37(4):225-238.; Chen L, etc., (2000) 20(4):283-286). 또한, 에스트로겐 투여의 금기증에 적용되는 골다공증치료약제로는 칼슘, bisphosphonate, calcitonin, raloxifene, vitamin D등이 있다.

한편, 칼시토닌(calcitonin)은 갑상선의 C-cell에서 생성되는 호르몬으로, 인체에서의 생리작용은 아직 분명하지 않으나, 아마도 짧은 기간동안 칼슘 항상성(homeostasis)의 미세한 조절에 관여하는 것으로 여겨지고 있으며, 약리적 용량에서 골흡수의 억제 효과가 나타난다. 특히, 칼시토닌은 골교체율이 항진(high turn over rate)된 골다공증시 효과가 더욱 크다고 보고 되어져 있다.

위와 같은 골다공증 치료 효과를 가지는 치료제로서 파골세포들의 생성과 활성을 저해하는 작용을 통해 골 손상을 억제하거나, 그 속도를 늦추는 기전을 통해서 효과를 나타내는 ‘포사맥스’와 ‘에비스타’가 시판되고 있으며, ‘포르테오’라고 하는 조골세포들의 생성과 활성을 촉진시켜 새로운 뼈의 형성을 돕는 새로운 계열의 골다공증 치료제도 이용되고 있다. 새로운 화학 약제로서 랄록시펜(ralroxifene)은 선택적 난포호르몬 수용체조절제(SERM;selective estrogen receptor modulator)로서 골과 심혈관계에는 에스트로겐 효능약으로 작용하고, 반면 유방과 자궁에는 에스트로겐 길항약으로 작용하는 이상적인 약제지만, 최근에는 약물대사시에 나타나는 이 약제의 독성이 보고 된 바 있다(Hirsimaki P, etc., (2002) Breast J. 8(2):92-96).

본 발명은 에나활성미네랄A 활성수 및 이의 제조방법을 제공하고, 이를 응용한 골다공증 예방 및 개선에 유용한 새로운 미네랄 활성수를 제공하고자 한다.

도 1은 이온 용액화 단계를 위한 제조장치

도 2는 전시험기간에 걸친 각 그룹 동물의 평균 체중 변화 비교한 그래프

도 3은 난소절제술 후 시험물질을 투여하고 4주, 8주, 그리고 12주 후에 동물을 부검할 때 측정한 각 그룹의 평균 체중 변화를 나타낸 그래프

도 4는 난소절제술 후 시험물질을 투여하고 4주, 8주, 그리고 12주 후에 동물을 부검한 후 혈청 중의 칼슘 농도 변화에 미치는 미네랄 활성수의 효과 비교

도 5는 난소절제술 후 시험물질을 투여하고 4주, 8주, 그리고 12주 후에 동물을 부검한 후 혈청 중의 인의 농도 변화에 미치는 미네랄 활성수의 효과 비교.

도 6은 난소절제술 후 시험물질을 투여하고 4주, 8주, 그리고 12주 후에 동물을 부검한 후 혈청 중의 에스트라디올의 농도 변화에 미치는 미네랄 활성수의 효과 비교.

도 7은 난소절제술 후 시험물질을 투여하고 4주, 8주, 그리고 12주 후에 동물을 부검한 후 혈청 중의 오스테오칼신의 농도 변화에 미치는 미네랄 활성수의 효과 비교.

도 8은 난소절제술 후 시험물질을 투여하고 4주, 8주, 그리고 12주 후에 동물을 부검한 후 혈청 중의 알카라인 포스파타제의 농도 변화에 미치는 미네랄 활성수의 효과 비교.

도 9는 난소절제술 후 시험물질을 투여하고 4주, 8주, 그리고 12주 후에 동물을 부검한 후 골흡수시 혈청 중으로 유리되는 피리디놀린의 농도 변화에 미치는 미네랄 활성수의 효과 비교.

도 10은 난소절제술 후 시험물질을 투여하고 4주, 8주, 그리고 12주 후에 동물을 부검한 후 해면뼈조직의 면적 변화에 미치는 미네랄 활성수의 효과 비교.

도 11은 난소절제술 후 시험물질인 미네랄 활성수를 투여하고 4주, 8주, 그리고 12주 후 콜라겐에 대한 특수 염색 방법인 아잔염색을 실시하여 뼈 콜라겐의 지표가 되는 해면뼈조직의 면적을 관찰하였다

도 12는 난소절제술 후 시험물질을 투여하고 4주, 8주, 그리고 12주 후에 동물을 부검한 후 골흡수시 증가하는 파골세포의 수적 변화에 미치는 미네랄 활성수의 효과 비교.

도 13은 난소절제술 후 시험물질인 미네랄 활성수를 투여하고 4주 후 골흡수시 증가하는 파골세포의 활성 정도를 관찰

도 14는 난소절제술 후 시험물질인 미네랄 활성수를 투여하고 8주 후 골흡수시 증가하는 파골세포의 활성 정도를 관찰

도 15는 난소절제술 후 시험물질인 미네랄 활성수를 투여하고 12주 후 골흡수시 증가하는 파골세포의 활성 정도를 관찰

도 16은 미네랄 활성수의 투여가 난소절제술을 실시한 동물의 실질장기에 미치는 영향

본 발명은 에나활성미네랄A 활성수의 제조방법 및 이를 응용한 골다공증 예방 및 개선에 유용한 조성물에 관한 것이다. 좀더 상세하게는 무기질이 풍부한 오징어 뼈 또는/및 홍조류를 주원료로 하여 제조한 에나활성미네랄A 활성수 조성물 및 이를 이용한 건강식품에 관한 것이다.

본 발명은 천연식용해조류인 김, 우뭇가사리, 꼬시레기, 국수나물, 보라털, 지누아리, 돌가사리, 비단풀, 홍조녹말, 오징어 뼈를 주성분으로 하여 정제하여 천연미네랄을 보급하는 알칼리 수용액을 제조한다.

본 발명은

1) 오징어뼈 및 홍조류를 씻은 후 분쇄하는 단계;

2) 분쇄물을 가열소성하여 무기질 미네랄을 제조하는 단계;

3) 무기질 미네랄을 실온으로 냉각한 후 미세 분말화 하는 단계;

4) 미세분말을 물에 이온 용액화 하는 단계;

5) 미세분말을 침전하여 필터링함으로써 알카리성 수용액을 수득하는 단계;를 포함한다.

상기 홍조류(紅藻類)는 100% 식물성 식용해조로서 엽록소 외에 홍조소를 함유하여 홍색, 자색을 띠는 식물 무리를 일컫는다. 몸은 대게 다세포로 실 모양이나 잎 모양으로 주로 바다에 살며, 김, 우뭇가사리, 풀가사리 등이 이에 속한다. 또한 오징어 뼈는 오적골이라 하여 오징어의 중심부에 있는 흰색의 뼈를 건조시켜 사용한다.

본 발명에서 상기 홍조류와 오징어 뼈를 이용한 무기질 미네랄의 제조방법은 깨끗이 씻은 후 잘 건조하여 1000 내지 2000℃에서 1시간 동안 가열소성 하는 것이바람직하며, 소성에 의해 세균이나 불순물이 완전 연소되어 제거되면 무기질인 미네랄만 남게 되는데 이를 실온에서 완전히 냉각시킨 후 분쇄기를 이용하여 미세분말화한다.

다음으로 소성된 오징어 뼈, 소성된 홍조류를 이용하여 미세분말화된 미네랄을 물에 용해시킨다.

상기 소성된 미네랄을 용해시킨 물을 이온용액화 하는데 80 내지 100 ℃에서 양수기 펌프를 이용하여 10기압 이상의 압력으로 낙차를 이용하여 부서지는 방식으로 1시간 이상 계속하는 것이 좋다. 양수기의 펌프 압력은 최소 10k 이상이어야 효과적이다. 이렇게 하여 이온화된 이온용액은 침전 후 여과시키는데 15시간 내지 35시간 동안 그대로 두어 미네랄 슬러지가 아래로 자연 침전 되면 상등액인 맑은 액만 침전휠타를 이용하여 여과시키면 알칼리성을 띄는 미네랄 활성수가 제조된다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하겠는바, 본 발명은 하기의 실시예에만 국한되는 것은 아니다. 이하에서 %는 별도로 정의하지 않는 한 중량%를 의미한다.

[실시예 1]

에나활성미네랄A 활성수의 제조

깨끗이 씻어서 건조시킨 오징어 뼈와 홍조류를 각각 분쇄하여 분말로 제조한 후 1100℃에서 1시간 동안 가열소성하였다. 소성된 오징어 뼈와 홍조류를 실온에서완전히 냉각시킨 후 분쇄기를 이용하여 미세한 분말로 제조하였다. 상기 홍조류는 김, 우뭇가사리, 꼬시레기, 국수나물, 보라털, 지누아리, 돌가사리, 비단풀 및 홍조녹말을 동일량으로 혼합하여 사용하였다.

물 500ℓ에 소성된 오징어 뼈 미세분말을 1.5㎏, 소성된 홍조류 미세분말 4㎏을 넣어 교반하여 용해시켰다. 이 용액을 90℃에서 양수기 펌프를 이용하여 10기압의 압력으로 낙차를 주어 입자가 부서지는 방식으로 2시간 동안 분쇄하여 이온용액을 제조하고, 이온용액을 24시간 동안 정치시킨 후 반응기 내 상층의 맑은 액을 침전휠타를 이용하여 여과하여 미네랄 활성수를 제조하였다.

제조한 미네랄 활성수의 성분을 분석한 결과를 표 1에 나타내었다.

표 1. 에나활성미네랄A 활성수의 성분분석

상기 표 1에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 이온용액은 pH가 12.85로 알칼리 용액이며, 특히 칼슘 성분의 함량이 높고, 인체에 유익한 다양한 금속이온을 다량 포함하고 있는 것을 알 수 있다.

[실시예 2]

오징어 뼈를 깨끗하게 씻은 후 건조하여 분쇄한 후 실시예 1과 동일하게 실시하여 제조하였으며, 소성된 오징어 뼈 미세분말 5.5kg를 물 500ℓ에 용해시킨 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 실시하여 미네랄 활성수를 제조하였다. 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

표 2. 오징어 뼈 성분분석

상기 표 2에서 보듯이 칼슘의 농도가 매우 높고 다양한 인체에 유익한 금속이온을 함유하고 있으며 pH가 12.2로서 알카리 임을 알 수 있다.

[실시예 3]

상기 실시예 1에서 제조한 알칼리 미네랄 활성수를 이용하여 동물실험을 실시하였다.

실험에 사용된 동물로는 위스타(Wistar)계통의 특정병원체부재(SPF) 랫트를 (주)오리엔트로부터 공급받아 사용하였다. 위스타 랫트(Wistar rat)의 사육은 온도 22± 3℃, 상대습도 50± 10%, 조명시간 12시간(08:00 점등~20:00소등)으로 설정된 자동 온습도 조절 장치가 설치된 폴리카보네이트제 사육상자(240W × 390L × 175 Hmm)에 5마리씩 수용하여 순화 및 사육하였다. 사료는 실험동물용 고형사료(PMI Nutrition International, 505 North 4th Street Richmond, In 47374, USA)를 방사선조사(13.2 kGy) 멸균하여 자유 섭취시켰으며, 물은 상수도수를 물병을 이용하여 자유섭취 시켰다.

실시예 1에 의해 제조된 미네랄 활성수 24L를 냉장보관하면서 실험적으로 유도한 골다공증 동물모델에 0.5%, 5%, 10%의 농도로 12주간 음용수로 공급한 후 혈청중의 골다공증 진단 지표들의 변화와 대퇴골의 조직병리학적 검사를 통한 골다공증 예방효과에 대한 실험을 실시하였다. 대조실험으로는 일반 음용 상수도(Tap water)를 이용하였다.

위스타 랫트(Wistar rat) 중 체중이 200 내지 230g인 암컷을 선별하여 각 군당 24마리씩 사용하였다. 각 개체별로 폴리카보네이트 사육상자에 수용하였다. 랫트를 Rompun® (0.04cc/100g)과 ketamine (0.14cc/100g)로 마취시킨 다음 복부를제모하고 소독액으로 철저하게 소독하고 난소절제술을 실시였다.

메스를 이용하여 복부의 정중선을 따라 길이 1cm 정도로 절개 후 자궁인대(ligamentum uteri)를 견인해서 양측의 난소를 노출시킨 후 자궁간막(mesometrium)과 난소(ovary)사이를 결찰한 후 양측의 난소를 완전히 제거하였다. 근육과 피부를 각각 봉합한 후 수술부위를 철저히 소독하여 감염을 예방하였으며, 수술 다음 날 체중을 측정하여 군 분리를 실시하였다. 4개의 그룹으로 군 분리 한 후 전 시험 기간 동안 음수를 통해서 시험물질을 자유 공급시켰으며, 시험물질 투여 후 4, 8, 그리고 12주에 동물을 희생시켰다.

표 3. 동물실험을 위한 그룹별 투여 조건

이하는 동물 실험 결과를 설명한다.

랫트의 체중변화 관찰

암컷 랫트에 난소절제술로 유도한 골다공증 동물모델에서 전 시험기간 동안 1주일에 한번씩 체중을 측정함으로써 체중변화를 관찰하고 또한, 동물의 일반 증상을 관찰하여 도 2 및 도 3에 나타내었다. 난소절제술 후 전 시험 그룹에 있어서 체중 증가를 관찰 할 수 있었으나, 부형제대조군과 비교하여 시험물질인 미네랄 활성수를 0.5%, 5%, 그리고 10% 농도로 투여한 투여군에서 통계학적으로 유의성 있는 체중 변화는 관찰되지 않았으며, 동물의 일반증상 관찰에 있어서도 전 시험기간 동안 아무런 이상증상도 관찰되지 않았다.

혈청지표에 미치는 영향 관찰

실험적으로 암컷 랫트에 난소절제술을 실시한 후 유도한 골다공증 동물모델에서 period killing으로 희생된 동물에 대해 골다공증에 있어서 혈청 지표로 이용되는 에스트라디올(estradiol), 오스테오칼신(osteocalcin), 칼슘(calcium), 인(phosphorus), 알카라인 포스파타제(alkaline phosphatase)의 농도를 관찰함으로써 시험물질의 효능을 검정하였다. 혈액 시료를 원심분리(3000g, 15분)를 통해서 혈청을 분리한 후 에스트라디올(estradiol)과 오스테오칼신(osteocalcin)은 방사선면역측정법(radioimmunoassay) (Bayer, USA)법으로 측정하였고, 칼슘(calcium)은 OCPC End point (Bayer, USA)법으로 측정하고, 그리고 인의 농도는 상업화된 키트 (Bio System S.A., Buenos Aires Argentina)로 인몰리브덴산염(phosphomolybdate complex)이 형성되는 것을 분광광도법으로 측정하였다. 혈청 총 알카리성 포스파타제(serum total alkaline phosphatase)의 활성은 Coloric metric assay (Bayer, Germany)법으로 측정하였다. 각각 성분별로 도 4 내지 8에 나타내었다.

1) 칼슘(calcium)

도 4에서 볼 수 있듯이 전 시험기간 동안 시험물질인 미네랄 활성수를 0.5%, 5%, 그리고 10% 농도 투여군에 있어서 부형제 대조군과 비교하여 통계학적으로 유의성 있는 혈청 칼슘 농도 변화는 관찰되지 않았다. 미네랄 활성수의 투여는 혈중 칼슘의 농도에는 아무런 영향을 주지 않는 물질로 판단된다.

2) 인(phosphorus)

도 5에서 볼 수 있듯이 전 시험기간 동안 시험물질인 미네랄 활성수를 0.5%, 5%, 그리고 10% 농도 투여군에 있어서 부형제 대조군과 비교하여 통계학적으로 유의성 있는 혈청 인 농도 변화는 관찰되지 않았다. 미네랄 활성수의 투여는 혈중 인의 농도에는 아무런 영향을 주지 않는 물질로 판단된다.

3) 에스트라디올(Estradiol)

도 6에서 볼 수 있듯이 시험물질인 미네랄 활성수를 0.5%, 5%, 그리고 10% 농도 투여군에 있어서 부형제 대조군과 비교하여 시험물질 투여 후 12주에 5%와 10% 투여군에서 통계학적으로 유의성(p<0.05)있는 혈청 estradiol 농도의 증가를 관찰할 수 있었다. 이러한 상승된 혈중 에스트라디올은 천연성분의 시험물질에서유래된 것으로 판단되며, 난소절제술에 의해 호르몬 결핍으로 유도된 골다공증 동물 모델에 있어서 골흡수가 일어나는 것을 예방할 것으로 사료된다.

4) 오스테오칼신(Osteocalcin)

도 7에서 볼 수 있듯이 시험물질인 미네랄 활성수를 0.5%, 5%, 그리고 10% 농도 투여군에 있어서 부형제 대조군과 비교하여 시험물질 투여 후 12주에 5% (p<0.05)와 10% (p<0.001) 투여군에서 통계학적으로 유의성 있는 혈청 오스테오칼신농도의 감소를 관찰할 수 있었다. 4주와 8주에 있어서도 부형제 대조군에 비해서 미네랄 활성수 투여군에서 혈청 오스테오칼신의 농도가 낮은 경향을 나타내는 것으로 관찰되었다. 골형성 지표인 오스테오칼신에 대해서 미네랄 활성수는 초기에는 큰 영향을 미치지 않지만, 장기간에 걸친 시험물질의 투여는 오스테오칼신의 농도를 낮춤으로서 골형성을 원래 수준으로 감소시키는 것으로 판단된다.

5) 알카라인 포스파타제(Alkaline phosphatase)

도 8에서 볼 수 있듯이 전 시험기간 동안 시험물질인 미네랄 활성수를 0.5%, 5%, 그리고 10% 농도 투여군에 있어서 부형제 대조군과 비교하여 통계학적으로 유의성 있는 혈청 알카라인 포스파타제 농도의 변화는 관찰되지 않았다.

혈청 피리디놀린(pyridinoline)에 미치는 영향 관찰

골다공증시 뼈의 콜라겐(collagen)의 감소로 type Ⅰ collagen crosslinkingmolecule인 피리디놀린 (PYD)는 순환혈액과 뇨로 유리된다. 이러한 뼈 특이 표시인자인 PYD를 측정함으로써 골다공증의 진행을 관찰할 수 있다. PYD의 측정에 있어서 기존의 HPLC나 면역학적 분석법(immunoassay)을 이용한 뇨로 유리된 PYD의 측정 방법은 감도와 특이성이 낮은 단점이 있었으나, 본 실험에서는 혈청중의 PYD를 ELISA (enzyme-linked immunoassay) 방법을 적용해서 뇨 중에서 측정하는 것 보다 40배나 낮은 농도의 PYD까지 측정함으로써 초기 골다공증 진단에 있어서 유용한 혈청학적 지표로 이용하였다. 이 결과를 도 9에 나타내었다.

시험물질인 미네랄 활성수의 골흡수시 혈청중으로 유리되는 type Ⅰ collagen crosslinking molecule인 피리디놀린 (PYD)에 미치는 영향을 관찰한 결과 표 9에서 보듯이 시험물질 투여 후 4주와 12주에서는 10% 농도의 시험물질 투여군에서 부형제 대조군과 비교하여 통계학적으로 유의성 (p<0.01) 있는 혈청 PYD 농도의 감소를 관찰할 수 있었으며, 시험물질 투여 후 8주에 있어서는 5%와 10% 농도의 시험물질 투여군에서 혈청 PYD 농도의 유의성 (p<0.05) 있는 감소가 관찰되었다.

골 및 기타 장기에 미치는 영향 관찰

실험적으로 유도한 골다공증 동물모델에서 대퇴골의 조직병리학적 관찰을 위해서 period killing에서 희생된 각 각의 동물로부터 대퇴골을 적출하여 포름산(formic acid)를 이용한 탈회과정과 10% 중성 포르말린을 이용한 조직고정 과정을 거쳐서 제작된 조직 표본에 대해 골다공증 진행에 따른 대퇴골의 콜라겐 변화를 관찰하기 위해서 콜라겐에 대한 특수 염색인 아잔염색(Azan staining)을 실시해 골다공증의 지표가 되는 해면뼈조직(trabecular bone)의 면적을 이미지 분석(image analysis)프로그램 (Visus image analysis, Foresthill Products, Foresthill, CA)을 이용해 분석하고, 헤마톡실린 에오신염색(hematoxylin-eosin staining) 을 실시해 골흡수에 관련된 세포인 파골세포의 수를 확인하였다.

한편, 시험물질에 대한 장기간의 노출에 대한 각 장기의 영향을 관찰하기 위해서 폐, 심장, 간장, 비장, 췌장, 신장, 갑상선, 부신 등의 실질장기를 동물을 희생시킬 때 대퇴골과 같이 적출한 후 10% 중성 포르말린에 고정 과정을 거쳐서 일반적인 조직처리 과정에 따라 헤마톡실린 에오신염색을 실시해서 관찰하였다.

그 결과를 도 10 내지 16에 나타내었다.

1) 해면뼈조직(Trabecular bone)의 면적

조직 중 콜라겐에 대한 특수 염색인 아잔염색을 통하여 난소절제술을 실시한 후 시험물질인 미네랄 활성수에 의한 뼈 콜라겐에 미치는 영향을 살펴보았다. 도 10 및 도 11에서 보듯이 난소절제술에 의해 부형제 대조군에서는 호르몬 결핍에 따른 골다공증이 진행되어 뼈 콜라겐 양의 감소로 시험기간이 진행됨에 따라 점차 해면뼈조직의 면적이 감소하는 것을 관찰할 수 있었다. 난소절제술 후 4주 동안의 시험물질 투여에 의해서는 통계학적으로 유의성 있는 변화를 관찰할 수 없었지만, 부형제 대조군과 비교하여 시험물질을 0.5%, 5%, 그리고 10% 농도로 투여한 그룹에서 뼈 콜라겐의 형성의 지표가 되는 해면 뼈조직의 면적이 다소 높은 경향인 것을 관찰할 수 있었다. 시험물질 투여 8주 후에는 전 시험그룹이 모두 다 4주와 비교하여뼈 콜라겐이 줄어든 것을 관찰할 수 있었지만, 8주 그룹의 비교에 있어서는 5% (p<0.05)와 10%(p<0.001) 투여 그룹에서 부형제 대조군과 비교하여 통계학적으로 유의성 있는 해면뼈조직 면적의 증가를 관찰할 수 있었다. 한편, 12주 투여군에서는 4주 및 8주와 비교하여 부형제 대조군과 0.5% 농도의 시험물질 공급군에서는 뼈 콜라겐 양이 감소한 것을 관찰할 수 있었고, 12주 그룹에서는 8주 그룹에서와 마찬가지로 5% (p<0.01)와 10% (p<0.01) 농도의 시험물질 투여 군에서 해면뼈조직 면적의 유의한 증가를 관찰할 수 있었다.

2) 파골세포(Osteoclast)의 수적 변화

골흡수의 지표로 사용되는 세포인 파골세포의 수적 변화를 관찰한 결과 도 12 내지 도 15에서 보듯이 전 시험기간 동안 통계학적으로 유의성 있는 변화를 관찰할 수 있었다. 난소절제술을 실시한 후 4주 동안 시험물질인 미네랄 활성수를 투여한 후 대퇴골의 골간(diaphysis)부분에서 파골세포의 수적 변화를 관찰 결과 10% 농도의 시험물질 투여군에서 통계학적으로 유의성 (p<0.01) 있는 감소를 관찰할 수 있었으며, 8주 투여 후 관찰할 결과에서는 모든 농도의 시험물질 투여군에서 부형제 대조군과 비교하였을 때 유의성 있는 파골세포의 감소를 관찰하였다. 한편, 12주 투여 그룹에 있어서는 대조군의 경우 파골세포의 수가 8주와 비교하여 비슷한 수준으로 높게 나타나는 비해, 시험물질 투여군에 있어서는 모든 농도의 시험물질 투여군에서 파골세포의 수가 부형제 대조군과 비교하여 유의성 (p<0.01) 있게 감소한 것을 관찰할 수 있었다.

3) 실질장기에 미치는 영향 관찰

시험물질인 미네랄 활성수의 골의 미치는 영향뿐만 아니라, 장기간 음수 공급에 의한 실질 장기에 미치는 영향을 관찰한 결과 폐, 심장, 간, 비장, 췌장 및 신장, 부신과 갑상선에 대해서 부형제 대조군과 비교하여 아무런 영향도 미치지 않는 것을 알 수 있었다. 이는 도 16에 나타내었다.

얻어진 자료에 대해 다중 비교 검정법을 실시하였다. 평균치에 대하여는 Battlett 검정으로 homogeneity를 검사하여 균질성이 있는 경우에 부형제 대조군과 투여군간에 차이가 있는지를 검사하기 위하여 다중비교법인 Dunnett's t-test를 실시하였다. Battlett 검정 결과 균질성이 인정되지 않으면 순위화한 데이터를 이용한 비모수적 방법인 Kruskal-Wallis's H test를 실시하고, p<0.05인 경우 Dunnett's test를 이용하여 군간의 유의차를 조사하였다. 이러한 분석은 통계프로그램인 GraphPad InStat(version 3.05, GraphPad Software Inc.)를 이용하여 실시하였다. 검정의 위험율은 5% 및 1%로 정하였다.

본 발명에 따른 미네랄 활성수를 장기간 투여시에 혈청중의 에스트라디올의 농도 증가와 오스테오칼신의 농도를 감소시키는 작용을 하고, 대퇴골에 대해서는 해면뼈조직의 면적을 증가시키고 파골세포의 수를 감소시키는 작용으로 골다공증의 예방효과가 있으며, 기타 장기에는 아무런 독성을 나타내지 않는 효과가 있다.

Claims (11)

1) 오징어뼈 및 홍조류에서 선택되는 어느 하나 이상을 씻은 후 분쇄하는 단계;

2) 분쇄물을 가열소성하여 무기질 미네랄을 제조하는 단계;

3) 무기질 미네랄을 실온으로 냉각한 후 미세 분말화 하는 단계;

4) 미세분말을 물에 이온용액화 하는 단계;

5) 미세분말을 침전하여 필터링함으로써 알카리성 수용액을 수득하는 단계;를 포함하는 에나활성미네랄A 활성수의 제조방법.

청구항 제 1항에 있어서,

상기 무기질 미네랄 제조단계는 1000 내지 2000℃에서 가열소성하는 것을 특징으로 하는 에나활성미네랄A 활성수의 제조방법.

청구항 제 1항에 있어서,

이온용액화는 80 내지 100℃에서 양수기 펌프를 이용하여 10기압이상의 압력으로 낙차를 이용하여 부서지는 방식으로 하는 것을 특징으로 하는 에나활성미네랄A 활성수의 제조방법.

제 3항에 있어서,

이온용액화를 1시간 이상 계속하는 것을 특징으로 하는 에나활성미네랄A 활성수의 제조방법.

제 1항에 있어서,

상기 단계 5)에서 침전은 15시간 내지 35시간동안 침전 후 필터링하는 것을 특징으로 하는 에나활성미네랄A 활성수의 제조방법.

제 1항 내지 제5항에서 선택되는 어느 한 항에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 에나활성미네랄A 활성수.

제 6항에 있어서,

에나활성미네랄A 활성수는 골다공증 예방효과를 가지는 것을 특징으로 하는 미네랄 활성수.

1) 오징어뼈 및 홍조류중에서 선택되는 어느하나 이상을 잘 씻은 후 분쇄하는 단계;

2) 분쇄물을 1000 내지 2000℃에서 가열소성성하여 무기질 미네랄을 제조하는 단계;

3) 무기질 미네랄을 실온으로 냉각한 후 미세 분말화 하는 단계;

4) 미세분말을 80 내지 100℃ 물에 투입한 후 양수기 펌프를 이용하여 10기압이상의 압력으로 낙차를 이용하여 부서지는 방식으로 이온용액화 하는 단계;

5) 미세분말을 침전하여 필터링함으로써 알카리성 수용액을 수득하는 단계;를 포함하는 에나활성미네랄A 활성수의 제조방법.

제 8항에 있어서,

이온용액화를 1시간 이상 계속하는 것을 특징으로 하는 에나활성미네랄A 활성수의 제조방법.

제 9항에 있어서,

상기 단계 5)에서 침전은 15시간 내지 35시간동안 침전 후 필터링하는 것을 특징으로 하는 에나활성미네랄A 활성수의 제조방법.

제 8항 내지 제 11항에서 선택되는 어느 한 항에 의해 제조되는 골다공증 예방효과를 가지는 것을 특징으로 하는 에나활성미네랄A 활성수.