CN111821288A - 用于制备治疗子宫肌瘤药物的活性成分及其应用 - Google Patents

用于制备治疗子宫肌瘤药物的活性成分及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明所提供的用于制备治疗子宫肌瘤药物的活性成分及其应用，使用本发明提供的活性成分进行大鼠子宫肌瘤模型治疗后，大鼠子宫各项指标均优于其它组，且与正常组相比无显著性差异；血清E2、P、IL‑6和TNF‑α含量与正常组相比无显著性差异；子宫肌瘤模型组织中ER‑α水平显著降低；且对血液中肝功能指标ALT、ALP、AST的含量有不同程度的影响，对肾功能指标CRE、UREA的含量影响较小，本发明提供的活性成分能够显著改善子宫肌瘤模型症状，为棉酚类药物在疾病治疗方面起到减毒增效的积极作用，同时为子宫肌瘤新药的开发与研究提供了科学理论基础。

Description

用于制备治疗子宫肌瘤药物的活性成分及其应用
技术领域
本发明涉及肿瘤药物的研发技术领域。具体地，本发明涉及用于治疗子宫肌瘤的相关药物制备技术领域。
背景技术
子宫肌瘤现被广泛地认为它是一种性激素依赖性的良性肿瘤，目前在子宫肌瘤疾病的治疗药物中，复方醋酸棉酚片是一种具有双醛萘类高分子非激素类药物，其药物分子可在短时间内作用于子宫内膜、子宫肌层及肌瘤中的雌、孕激素受体，起到抑制激素分泌的生物作用，从而使子宫内膜功能恢复正常，其不良反应轻少。复方醋酸棉酚片其主要成分为醋酸棉酚、氯化钾、维生素B1、维生素B6，其中醋酸棉酚是棉酚的外消旋体，包括左旋棉酚[(–)-棉酚]和右旋棉酚[(+)-棉酚]，随着研究的深入，发现(–)-棉酚和(+)-棉酚的活性及毒性作用均有差异。目前研究表明(–)-棉酚和(+)-棉酚的毒性和活性，基本认为(–)-棉酚活性强，毒性也强，但有部分实验认为(+)-棉酚毒性强。
目前对于(–)-棉酚和(+)-棉酚的毒性和活性研究较多，但是针对其应用于子宫肌瘤治疗没有报道。
发明内容
针对现有技术中尚无(–)-醋酸棉酚作为活性成分应用于制备子宫肌瘤治疗药物技术方案的现状，本发明旨在于在于提供(–)-醋酸棉酚作为活性成分应用于制备子宫肌瘤治疗药物，通过建立大鼠子宫肌瘤模型获得了显著的药效，对子宫肌瘤疾病具有显著的治疗作用，为(–)-棉酚类药物在疾病治疗方面起到减毒增效的积极作用，同时为(–)-棉酚新药的开发与研究提供了科学理论基础。
本发明通过以下技术方案实现：
本发明提供用于制备治疗子宫肌瘤药物的活性成分，所述的活性成份为(–)-醋酸棉酚。
进一步的，所述的活性成分(–)-醋酸棉酚，在用于制备治疗子宫肌瘤药物时复配维生素B1、B6和氯化钾进行使用。
所述的活性成分(–)-醋酸棉酚用于制备治疗子宫肌瘤药物的活性成分在子宫肌瘤治疗中的应用。
所述的活性成分(–)-醋酸棉酚用于制备治疗子宫肌瘤药物的活性成分在子宫肌瘤治疗药物中的应用。
所述的活性成分(–)-醋酸棉酚用于制备治疗子宫肌瘤药物的活性成分在制备雌激素异常相关病症治疗药物中的应用。
所述的活性成分(–)-醋酸棉酚用于制备治疗子宫肌瘤药物的活性成分在制备孕激素异常相关病症治疗药物中的应用。
通过实施本发明具体的发明内容，可以达到以下有益效果：
(1)本发明提供一种(–)-醋酸棉酚作为活性成分应用于制备子宫肌瘤治疗药物，通过建立大鼠子宫肌瘤模型来评价(–)-醋酸棉酚的药效，探讨(–)-醋酸棉酚对子宫肌瘤疾病的治疗作用，为(–)-醋酸棉酚类药物在疾病治疗方面起到减毒增效的积极作用，同时为(–)-醋酸棉酚新药的开发与研究提供了科学理论基础。
(2)本发明所提供的用于子宫肌瘤治疗的活性成分，使用本发明提供的活性成分进行大鼠子宫肌瘤模型治疗后，大鼠子宫各项指标均优于其它组，且与正常组相比无显著性差异；血清E2、P、IL-6和TNF-α含量与正常组相比无显著性差异；子宫肌瘤模型组织中ER-α水平显著降低；且对血液中肝功能指标ALT、ALP的含量有不同程度的影响，对肾功能指标AST、CRE、UREA的含量影响较小，本发明提供的活性成分能够显著改善子宫肌瘤模型症状，为棉酚类药物在疾病治疗方面起到减毒增效的积极作用，同时为子宫肌瘤新药的开发与研究提供了科学理论基础。
附图说明
图1所示为不同处理组大鼠体质量变化趋势图。
图1中所示normal为正常对照组、modest为模型对照组、positive为阳性药对照组组、(+)-GA高为(+)-醋酸棉酚高剂量组、(+)-GA中为(+)-醋酸棉酚中剂量组、(+)-GA低为(+)-醋酸棉酚低剂量组、(–)-GA高为(–)-醋酸棉酚高剂量组、(-)-GA中为(–)-醋酸棉酚高剂量组、(–)-GA低为(–)-醋酸棉酚高剂量组
图2所示为不处理组大鼠子宫形态图。
图2中所示model1为模型对照组1、model2为模型对照组2、model3为模型对照组3、normal1为正常对照组1、normal2为正常对照组2、positive为阳性药对照组、(+)-GA高为(+)-醋酸棉酚高剂量组、(+)-GA中为(+)-醋酸棉酚中剂量组、(+)-GA低为(+)-醋酸棉酚低剂量组、(–)-GA高为(-)-醋酸棉酚高剂量组、(–)-GA中为(-)-醋酸棉酚中剂量组、(–)-GA低为(–)-醋酸棉酚低剂量组。
图3为不处理组大鼠子宫HE染色(×200倍)图。
图3中所示a-b为正常组，c-d为模型组，e为阳性对照组，f-h为(–)-醋酸棉酚低、中、高剂量组，i-k为(+)-醋酸棉酚低、中、高剂量组。
图4为不处理组大鼠子宫组织ER-α免疫组化图(×200倍)。
图5为不处理组大鼠子宫组织PR免疫组化图(×200倍)。
图4-5中所示a为正常组，b为模型组，c为阳性对照组，d-f为(–)-醋酸棉酚低、中、高剂量组，g-i为(+)-醋酸棉酚低、中、高剂量组。
具体实施方式
下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。
本发明中试剂有：(–)-醋酸棉酚、(+)-醋酸棉酚(实验室自制)；生理盐水(批号：1803025，国药集团新疆制药有限公司)；苦味酸，分析纯(批号：20160531，台山市粤侨试剂塑料有限公司)。复方醋酸棉酚片(批号：181003，西安北方药业有限公司)，维生素B1(批号：20180918，国药集团新疆制药有限公司)，维生素B6(批号：20181220，国药集团新疆制药有限公司)，氯化钾缓释片(批号：19043401，上海海虹实业集团巢湖今辰药业有限公司)。苯甲酸雌二醇注射液(批号：190116，上海全宇生物科技动物药业有限公司)，黄体酮注射液(批号：20190116，江西省创欣药业集团有限公司)，生理盐水，水合氯醛，4％多聚甲醛(批号：20190523，Biosharp公司)，手术器械(张家港市锦丰红光医用手术器械厂)，硝酸(优级纯)，过氧化氢(分析纯)，K标准储备液(国家标准物质中心)，大鼠E2、PROG、IL-6、TNF-αELISA试剂盒(批号：201908，上海酶联生物科技有限公司)，苏木素、伊红染液(Biosharp公司)，大鼠雌激素受体α抗体(批号：BS-0253R，北京博奥森生物技术有限公司)、大鼠孕激素受体抗体(批号：BS-23376R，北京博奥森生物技术有限公司)，DAB显色试剂盒(批号：ZLI-9018，北京中山金桥生物科技有限公司)，封闭血清(批号：SL034，北京索莱宝科技有限公司)，免疫组化SP试剂盒(批号：SP-9001，北京中山金桥生物科技有限公司)，PBS缓冲液、枸橼酸抗原修复液(Biosharp公司)
本发明中仪器有：AF2004电子天平：上海舜宇恒平科学仪器有限公司、MultiskanMK3型全自动酶标仪：美国Thermo scientific公司，Multifuge X3R型低温离心机：美国Thermo scientific公司，BS-200型全自动生化仪：南京普爱设备股份有限公司，DMI4000B荧光倒置显微镜：莱卡公司，微波炉，EG1150型Leica包埋机：北京昊诺斯科技有限公司；CV5030型全自动封片机：北京昊诺斯科技有限公司；RM2135型LEICA手动切片机；电热恒温水浴锅：北京市光明医疗仪器有限公司；DFC390型三目显微镜：Laica公司，ICV-450型电热恒温培养箱：日本ASONE，CEM MARS6高通量密闭微波消解系统，PinAACLE 900火焰原子吸收光谱仪：珀金埃尔默企业管理(上海)有限公司，灌胃针；1mL注射器：鹰潭荣嘉集团医疗器械实业有限公司，批号：190301；一次性培养皿；手术器械：南昌华益医疗器械有限公司；DY15K型分析天平：上海箐清仪器有限公司。所述试剂、材料均可通过公共渠道购买，工艺中所采用的设备和仪器均为本领域常见的设备。本发明中选用的所有材料、试剂和仪器都为本领域熟知的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
SD健康大鼠120只，雌性，体质量(180±20)g，由新疆医科大学动物实验中心提供，许可证号：SCXK(新)2018-0003。动物饲养于新疆医科大学动物实验中心，动物实验室为SPF环境，室温20±2℃，相对湿度20％-40％。
实施例一：用于制备治疗子宫肌瘤药物的活性成分
本发明提供用于制备治疗子宫肌瘤药物的活性成分，所述的活性成份为(–)-醋酸棉酚。
进一步的，所述的活性成分(–)-醋酸棉酚，在用于制备治疗子宫肌瘤药物时复配维生素B1、B6和氯化钾进行使用。
所述的活性成分(–)-醋酸棉酚用于制备治疗子宫肌瘤药物的活性成分在子宫肌瘤治疗中的应用。
所述的活性成分(–)-醋酸棉酚用于制备治疗子宫肌瘤药物的活性成分在子宫肌瘤治疗药物中的应用。
所述的活性成分(–)-醋酸棉酚用于制备治疗子宫肌瘤药物的活性成分在制备雌激素异常相关病症治疗药物中的应用。
所述的活性成分(–)-醋酸棉酚用于制备治疗子宫肌瘤药物的活性成分在制备孕激素异常相关病症治疗药物中的应用。
实施例二：用于制备治疗子宫肌瘤药物的活性成分的急性毒性实验
1实验方法
1.1急性毒性预实验
取18只雌性小鼠随机分为3组，每组6只，分别为(–)-醋酸棉酚组、(+)-醋酸棉酚组和空白对照组，适应性喂养3d，(–)-醋酸棉酚和(+)-醋酸棉酚组的最大给药剂量为150mg/Kg，计算依据为复方醋酸棉酚片成人日常用药量的75倍，给药前12h禁食不禁水，灌胃1次，灌胃体积0.40mL/10g，空白对照组以等体积的生理盐水灌胃。给药后0.5、1、2、4h后观察小鼠毒性反应情况及行为活动有无异常，记录小鼠死亡情况，常规饲养7d后剖检，观察小鼠主要脏器有无损伤变化。
1.2最大给药量实验
取36只雌性小鼠随机分为3组，每组12只，分别为(–)-醋酸棉酚组[(–)-GA]，(+)-醋酸棉酚组[(+)-GA]和空白对照组[Control]，适应性喂养3d，(–)-醋酸棉酚组和(+)-醋酸棉酚组以最大剂量150mg/Kg灌胃，给药前12h禁食不禁水，灌胃体积0.40mL/10g，一天内给药两次，每次间隔8h，期间禁食不禁水，空白对照组以等体积的生理盐水灌胃，给药后观察小鼠毒性反应情况及行为活动有无异常，逐日观察记录小鼠外观、饮食饮水、粪便和运动情况，隔天记录小鼠体重量。常规饲养14d后剖检，肉眼观察小鼠主要脏器有无眼观病理变化，称取心、肝、脾、肾组织质量并计算脏器系数/％＝(m组织/m体重)×100。
1.3统计学方法
数据以“均数±标准差”表示，采用SPSS 19.0软件进行统计分析，以独立样本t检验分析进行组间数据比较。
2结果与分析
2.1急性毒性预实验结果
给药0.5h后(–)-醋酸棉酚组和空白对照组小鼠各死亡一只，剖检后发现肺部有大量血块，其余小鼠均有活动减少、头颈部皮毛稀松的现象，4h后恢复正常饮食饮水，2d后行为活动均恢复正常。连续观察7d内剩余小鼠无死亡现象，行为正常且无其他毒性反应，主要脏器无明显损伤，无法测出半数致死LD50，故进行最大给药量实验。
2.2最大给药量实验结果
每次给药0.5h后各组小鼠活动减少、精神状态欠佳、头颈部皮毛稀松，给药结束2h后小鼠少量进食并开始活动，未出现死亡；观察14d内，各组小鼠行为无异常、饮食饮水均正常、体重自然增加、未出现明显毒性反应症状，主要脏器无明显损伤。采用SPSS19.0统计软件进行统计学分析，给药组小鼠与空白对照组小鼠体重均增长，且各给药组小鼠体重在给药前、给药后2d、6d、10d、14d与无明显差异(P>0.05)，结果见表1；各实验组脏器系数与对照组无显著性差异(P>0.05)，结果见表2。
表1：小鼠体质量变化结果(
Figure BDA0002509955340000081
n＝12)
组别 给药前(g) 给药后2d(g) 给药后6d(g) 给药后10d(g) 给药后14d(g)
Control 21.25±1.46 23.40±1.49 28.02±1.57 32.56±2.30 36.50±2.58
(－)-GA 21.20±1.91 23.06±2.11 27.42±2.88 32.28±2.95 35.81±3.41
(+)-GA 21.93±1.23 24.05±1.35 28.67±1.49 32.25±1.96 35.99±2.27
表2：小鼠脏器系数结果(
Figure BDA0002509955340000082
n＝12)
组别 心(％) 肝(％) 脾(％) 肾(％)
Control 0.58±0.11 4.79±0.85 0.40±0.11 0.63±0.09
(-)-GA 0.54±0.13 5.07±0.43 0.33±0.09 0.62±0.12
(+)-GA 0.55±0.14 4.74±0.32 0.32±0.14 0.55±0.15
通过以上实验结果表明，最大剂量给药并未出现死亡情况，无法计算LD50值。通过对给药组及对照组的分析比较，对体重及各脏器系数的影响并未出现统计学差异(P>0.05)。在预实验中观察到(–)-醋酸棉酚组和空白对照组小鼠死亡小鼠的肺部有大量血块，为灌胃技术操作不当导致，与药物本身无关，并且多数小鼠的心、脾、肺、肾等脏器通过肉眼观察并未出现损伤及变形等病变，且给药组灌胃后小鼠均在第3d恢复正常状态。本实验采用急性毒性实验可为其进一步研究提供理论依据及剂量选择等有关信息。
实施例三：
1.实验动物分组与造模
取性成熟雌性未孕SD大鼠117只(由于考虑到大鼠性周期对雌孕激素的影响，选择同一周龄的大鼠进行造模)，适应性饲养7d后，随机分为8组，包括：模型对照组、阳性药组(复方醋酸棉酚片)、(–)-醋酸棉酚高、中、低剂量组、(+)-醋酸棉酚高、中、低剂量组，腹腔注射苯甲酸雌二烯醇0.5mg/Kg，每日1次，同时每周加注1次黄体酮注射液4mg/kg，腹腔注射，连续5周；第6周改为同时注射两种激素，剂量同上，另取性成熟雌性未孕SD大鼠13只腹腔注射1mL/100g生理盐水，每日1次，连续6周做空白对照组。造模结束后各组随机抽取1只大鼠，对子宫肌瘤模型指标进行检测，预判模型是否成功。
2.子宫肌瘤模型大鼠给药
造模结束后对各组大鼠进行药物干预：正常对照组和病理模型组每日灌胃同等体积生理盐水，阳性药组给药剂量为20mg/Kg(相当于成人日用剂量体重比例的20倍)，以饮用水为溶剂制成混悬液，每天一次，灌胃体积lmL/100g。(–)-醋酸棉酚和(+)-醋酸棉酚组的药物为复方制剂，主药为(-)-醋酸棉酚或(+)-醋酸棉酚，辅料为维生素B1、B6和氯化钾，(以阳性药复方醋酸棉酚片为参照：醋酸棉酚25mg、维生素B110mg、维生素B610mg、氯化钾250mg)，以主药的剂量为标准，低、中、高剂量组给药浓度分别为25mg/Kg、50mg/Kg、100mg/Kg，按表3分别加入相应剂量的辅料，以饮用水为溶剂制成混悬液，每天一次，灌胃体积lmL/100g，连续给药4周。
表3：(–)-醋酸棉酚、(+)-醋酸棉酚复方药物剂量配比表
Figure BDA0002509955340000091
Figure BDA0002509955340000101
3.实验动物取材与处理
灌胃结束后剖检，以10％水合氯醛为麻醉药(0.35mL/100g)腹腔注射麻醉，各组大鼠腹主动脉取血，离心血清(3500r/min，10min)，保存于-80℃冰箱备用。分离大鼠活体子宫，肉眼观察各组大鼠子宫形态及色泽，拍照，大鼠子宫称量并计算子宫系数，游标卡尺测量大鼠子宫宫体最大直径及左右宫角长度并记录；肉眼观察大鼠实质性脏器有无眼观病理变化，取子宫脏器用生理盐水洗净称重，计算子宫系数/％＝(m子宫/m体重)×100，心、肝、脾、肾等脏器组织分装，一部分组织经4％多聚甲醛固定液固定后用于组织切片的制作，一部分组织于-80℃冻存用于核磁代谢组学检测。
4.结果与分析
4.1大鼠一般行为学观察
造模前大鼠生活状态良好，皮毛光亮，开始以雌激素负荷进行造模后，模型组大鼠普遍出现脱毛现象，随着造模时间的延长，大鼠背部皮毛易脱落，抓取时尤为明显，随着造模期间激素负荷增加，模型组大鼠皮毛暗淡且凌乱，少数大鼠背部及头颈部出现严重脱毛现象，并且脱毛面积较大；造模期间大鼠摄食量正常却有出现排泄物增多、腹泻等现象，大鼠神态不佳并伴有嗜睡、蜷卧、精神萎靡等现象，性情暴躁易怒，少数大鼠腹腔注射部位有硬结产生；正常组大鼠与造模前相比无明显变化，摄食摄水正常，皮毛光亮无脱毛现象，未出现与造模组大鼠相似的变化。
造模结束后开始给药治疗，各给药组大鼠脱毛情况开始好转，体质量呈现增长趋势，大鼠摄食和排泄情况正常，腹泻情况减少，精神状态逐渐好转的同时性情也恢复温和，不再暴躁易怒。模型组仍存在皮毛暗淡、脱毛和排泄物增多的现象，虽然精神状态逐渐恢复，但是性情依旧暴躁易怒，无好转现象。
4.2各组大鼠体质量变化结果
造模期间，各造模组大鼠体质量与正常组相比增长缓慢，并且在第4周时各组大鼠体质量进行性减轻，增长趋势不明显，模型组大鼠意外死亡1只；从第7周开始给药治疗，各给药组大鼠体质量逐渐增加，与正常组大鼠体质量均呈现上升趋势。详见附图1。
4.3大鼠子宫相关指标的影响
经统计学分析，结果表明：与正常组相比，模型对照组大鼠的子宫重量、子宫系数、分角长度、最大直径、宫体最大直径均有增加，且有显著性差异(P＜0.05)，其中子宫系数和分角最大直径差异极显著(P＜0.01)，可表明大鼠子宫肌瘤模型造模成功；经药物治疗后，(–)-醋酸棉酚中、高剂量组和(+)-醋酸棉酚中、高剂量组的大鼠子宫系数与模型组相比差异极显著(P＜0.01)，与正常组相比无显著性差异(P＞0.05)；(–)-醋酸棉酚高剂量组的分角长度与模型组相比有显著性差异(P＜0.05)，与模型组相比，(–)-醋酸棉酚中、高剂量组和(+)-醋酸棉酚中、高剂量组的大鼠子宫分角最大直径和宫体最大直径均有降低，且差异极显著(P＜0.01)，与正常组相比无显著性差异(P＞0.05)。结果表明，(–)-醋酸棉酚和(+)-醋酸棉酚的中、高剂量组可改善子宫肌瘤的症状，详见表4。
表4：各组大鼠子宫各项指标的比较
Figure BDA0002509955340000111
Figure BDA0002509955340000112
Figure BDA0002509955340000121
注：与正常组相比，*P＜0.05，**P＜0.01，与模型组相比，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。
4.4大鼠子宫形态学观察
正常组大鼠子宫呈“Y”字形，左右分角长度一致、直径均匀，左右分角纤细并且形状规则，质地均匀，没有结节和囊肿；模型组大鼠子宫颜色暗淡，肉眼可见明显的结节和囊肿，左右分角长度不一致、直径粗细不均匀，形状畸形，有的短粗，宫体肿胀，内有积液充盈。给药组中(–)-醋酸棉酚和(+)-醋酸棉酚的低剂量组大鼠子宫分角仍有肿胀，直径不均匀的现象，与模型对照组相比形态略有改善；中、高剂量组大鼠子宫分角内结节明显减少，分角直径质地较均匀，子宫体形态规则。将等剂量组的(–)-醋酸棉酚与(+)-醋酸棉酚相比，大鼠子宫形态更规则，分角更纤细均匀。检测结果如附图2所示。
实施例四：
基于上述实施例三中的实验方案，对各组大鼠血清中激素水平和炎症因子含量进行测定。具体测定方法及测定结果如下：
1、酶联免疫吸附法测定大鼠血清中激素水平、细胞因子的含量
实验原理：采用双抗夹心法测定血清样本中大鼠各指标水平。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往被包被的微孔中依次加入抗体，再与HRP标记的检测抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加入底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化为蓝色。用酶标仪在450nm波长下测定吸光值，通过标准曲线计算样品中指标含量。
①加样：标准品加样：在标准品孔内各加不同浓度的标准品50μL，样品孔加样：分别设空白孔(空白对照空不加样品及酶标试剂，其余操作均相同)与待测样品孔，在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μL，然后再加待测样品10μL，样品最终稀释5倍。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。②加酶：每孔加入HPR酶标试剂100μL，空白孔除外。③温育：用封模板封板后至37℃温育60分钟。④洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静至30秒后弃去，重复5次，拍干。⑤显色：每孔先加入显色剂A50μL，再加入显色剂B50μL，轻轻振荡混匀，37℃避光显色15分钟。⑥终止：每孔加入终止液50μL，终止反应，此时蓝色立即转黄色。⑦测定：以空白孔调零，450nm波长依序测定各孔吸光度，测定在加入终止液后15分钟以内进行。大鼠血清P、IL-6、TNF-α含量的测定方法同上。测定结果如表5所示。
表5：对大鼠血清中激素水平、细胞因子含量的影响(
Figure BDA0002509955340000131
n＝10)
组别 E<sub>2</sub>(pmol/L) P(ng/mL) IL-6(pg/mL) TNF-α(pg/mL)
Normal 39.18±3.33 8.71±0.45 112.51±2.01 168.64±2.39
Model 56.56±3.43<sup>**</sup> 13.37±0.47<sup>**</sup> 148.36±8.55<sup>**</sup> 265.15±6.96<sup>**</sup>
Positive 46.22±3.62<sup>**▲▲</sup> 10.11±1.26<sup>**▲▲</sup> 130.65±8.40<sup>**▲</sup> 201.70±4.31<sup>▲▲</sup>
(－)-GA低 44.95±4.65<sup>**▲▲</sup> 10.32±0.91<sup>**▲▲</sup> 130.77±4.19<sup>**▲</sup> 225.61±4.36<sup>*▲▲#</sup>
(－)-GA中 42.85±4.49<sup>*▲▲</sup> 9.88±0.86<sup>**▲▲</sup> 123.90±8.54<sup>**▲▲</sup> 209.05±7.67<sup>▲▲#</sup>
(－)-GA高 40.52±2.88<sup>▲▲#</sup> 9.28±0.85<sup>*▲▲</sup> 119.88±3.23<sup>▲▲</sup> 185.61±5.03<sup>▲▲#</sup>
(+)-GA低 47.53±2.04<sup>**▲▲</sup> 10.74±1.36<sup>**▲▲</sup> 134.24±4.05<sup>**▲</sup> 243.02±4.29<sup>**▲▲</sup>
(+)-GA中 46.36±3.69<sup>**▲▲</sup> 10.40±1.06<sup>**▲▲</sup> 133.29±5.01<sup>**▲</sup> 226.39±8.27<sup>*▲▲</sup>
(+)-GA高 44.06±3.12<sup>**▲▲</sup> 10.03±0.47<sup>**▲▲</sup> 129.29±7.39<sup>**▲▲</sup> 219.96±5.38<sup>*▲▲</sup>
注：与正常组相比，*P＜0.05，**P＜0.01，与模型组相比，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01，与等剂量的(+)-醋酸棉酚相比，#P＜0.05。
ELISA法检测血清中激素水平结果显示，与正常对照组相比，模型组血清中E2和P的含量均较高，有显著性差异(P＜0.01)，给药后各组血清E2、P的含量均有降低，与模型组相比有显著性差异(P＜0.01)，其剂量越高效果越好，呈浓度依赖性，(–)-醋酸棉酚的降低作用优于(+)-醋酸棉酚。其中(–)-醋酸棉酚高剂量组的血清E2含量与正常组相比无显著性差异(P＞0.05)，并且与(+)-醋酸棉酚高剂量组相比有显著性差异(P＜0.05)，(–)-醋酸棉酚高剂量组的血清P含量与正常组相比有显著性差异(P＜0.05)，而其余各组与正常组相比差异更显著(P＜0.01)，结果表明(–)-醋酸棉酚和(+)-醋酸棉酚均可降低子宫肌瘤大鼠血清中激素水平含量，并且(–)-醋酸棉酚的治疗效果更好。
ELISA法检测血清中细胞结果显示，与正常对照组相比，模型组血清中IL-6和TNF-α的含量均较高，有显著性差异(P＜0.01)，给药后各组血清中IL-6和TNF-α的含量有降低，与模型组相比有显著性差异(P＜0.05)，其剂量越高效果越好，呈浓度依赖性，(–)-醋酸棉酚的降低作用优于(+)-醋酸棉酚。其中(–)-醋酸棉酚高剂量组的血清IL-6含量与正常组相比无显著性差异(P＞0.05)，并且与模型组相比，(–)-醋酸棉酚中、高剂量组和(+)-醋酸棉酚高剂量组血清IL-6含量的差异更加显著(P＜0.01)，表明(–)-醋酸棉酚和(+)-醋酸棉酚的高剂量组对血清IL-6含量降低效果较高，而(–)-醋酸棉酚的作用优于(+)-醋酸棉酚。对于血清中TNF-α的含量，(–)-醋酸棉酚中、高剂量组与正常组相比无显著性差异(P＞0.05)，(–)-醋酸棉酚低、中、高剂量组与(+)-醋酸棉酚各剂量组相比具有显著性差异(P＜0.05)，可表明(–)-醋酸棉酚和(+)-醋酸棉酚均可降低子宫肌瘤大鼠血清中TNF-α含量，并且(–)-醋酸棉酚的治疗效果更好。
实施例五：
基于上述实施例三中的实验方案，对各组大鼠子宫切片进行病理学分析及免疫组化法测定大鼠子宫组织中雌激素受体、孕激素受体水平。具体测定方法及测定结果如下：
1大鼠子宫切片病理学分析
1.1子宫组织固定与脱水包埋及组织HE染色
固好的子宫组织取材后置入包埋盒标记→自来水冲洗1h→脱水机按程序脱水处理→组织包埋→石蜡切片，切片厚度约为4μm，捞片温度40～45℃→置于烘箱里65℃烤片过夜。将切片从烘箱中取出立即放入脱蜡液中进行脱蜡和各级乙醇脱水，具体操作：二甲苯Ⅰ15min→二甲苯Ⅱ10min(当试验室温度低于10℃时，脱蜡时间应相对延长，确保脱蜡充分)→无水乙醇、90％乙醇Ⅰ、90％乙醇Ⅱ、80％乙醇各3min→自来水冲洗→苏木素染液5min→自来水冲洗→盐酸乙醇分化→自来水返蓝1min→伊红染液1min→自来水冲洗→脱水(80％乙醇、95％乙醇Ⅰ、95％乙醇Ⅱ、无水乙醇各5s)→透明(二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各5s)→中性树胶封片，晾干，显微镜下观察其病理变化。检测结果如附图3所示。
正常对照组子宫平滑肌层较薄，平滑肌细胞呈长梭形，排列整齐，未见炎症细胞浸润；模型组子宫平滑肌明显增厚，平滑肌细胞排列紊乱且不均匀，细胞体积变大，多数细胞核不规律增大呈椭圆形，肌纤维排列疏松，结缔组织增生和内膜腺体增多，有炎症细胞浸润，提示模型成功；各给药组子宫平滑肌层增生有不同程度改善，其中(–)-醋酸棉酚和(+)-醋酸棉酚高剂量组平滑肌细胞较排列均匀整齐，腺体减少，肌纤维排列整齐紧密，炎症细胞浸润较少，说明给药组对子宫肌瘤有一定的治疗作用。
2免疫组化结果与半定量分析
2.1免疫组化法测定大鼠子宫组织中雌激素受体、孕激素受体水平
二步法免疫组化检测步骤：①将石蜡切片置于65℃烘箱中提前烘烤2h，脱蜡时取出立即放入脱蜡液中。②脱蜡、水化：脱蜡液Ⅰ15min→脱蜡液Ⅱ15min→无水乙醇5s→95％乙醇Ⅰ5s→95％乙醇Ⅱ5s→80％乙醇5s，用蒸馏水、0.01M PBS(pH 7.4)缓冲液分别冲洗3次，每次5min；③去除内源性过氧化物酶：将切片放置盛有3％H2O2溶液的修复盒中，室温下孵育10min，再用蒸馏水、PBS缓冲液分别冲洗3次，每次5min；④抗原修复：将切片放置在盛有0.01M枸橼酸缓冲液(pH 6.0)的修复盒中，在微波炉中修复10min，修复温度为92～95℃，待自然冷却至室温后用PBS缓冲液冲洗3次，每次5min；⑤血清封闭：滴加10％正常山羊血清，室温孵育30min，倾去余液，勿洗，滴加经适当稀释过的一抗(雌激素受体α抗体、孕激素受体抗体)，在4℃冰箱里孵育过夜，第二天取出后室温下复温1h，用PBS缓冲液冲洗3次，每次5min；⑥滴加生物素标记二抗，在室温下孵育1h，用PBS缓冲液洗3次，每次5min；滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液室温孵育15min，用PBS溶液洗3次，每次5min；⑦DAB显色：现配DAB显色液室温显色，在显微镜下控制显色时间，大约4min，用自来水终止显色反应；⑧复染：用苏木素复染3min，蒸馏水冲洗后用盐酸乙醇分化，用PBS缓冲液反蓝3min。⑨常规乙醇脱水、透明：80％乙醇5s→95％乙醇Ⅰ5s→95％乙醇Ⅱ5s→无水乙醇5s→二甲苯Ⅰ5s→二甲苯Ⅱ5s，干燥后中性树胶封片，显微镜下拍照和观察。检测结果如附图4、附图5所示。
每张免疫组化染色切片在200倍镜下观察子宫组织中ER-α和PR的表达情况，ER-α和PR阳性表达时细胞核呈现棕黄色；空白对照组的ER-α、PR阳性细胞表达较弱，细胞核呈未见明显黄染或淡黄色；模型组的ER-α、PR阳性细胞表达最强，可见深棕色或棕黑色，分布较集中，颗粒密集，阳性信号强；给药组中，各组大鼠子宫ER-α、PR阳性细胞染色浅于模型组，阳性信号和阳性细胞表达均呈现降低趋势，其中阳性药组、(–)-醋酸棉酚和(+)-醋酸棉酚高剂量组大鼠子宫平滑肌组织阳性细胞表达情况较其他几组明显较低，阳性细胞染色为浅黄色，阳性细胞颗粒分布较分散，阳性细胞表达较弱。
2.2ER-α和PR表达半定量分析结果
参照Fromowitz综合计数法进行分析：ER-α和PR阳性表达呈现棕黄色颗粒，平滑肌细胞胞浆或胞核有棕褐色颗粒，无着色或背景色为阴性表达，按照阳性细胞着色强度进行评分：0分：无着色或背景色；淡黄色弱着色：1分；介于弱与强着色之间的棕黄色：2分，褐色强着色：3分；显微镜下阳性细胞所占比例计数评分：阴性表达：视野中阳性细胞覆盖率低于5％，计0分；弱阳性表达：视野中阳性细胞覆盖率5％～25％，计1分；阳性表达：视野中阳性细胞覆盖率25％～50％，计2分；强阳性表达：视野中阳性细胞覆盖率50％～75％，计3分。每张免疫组化切片在阳性染色的高密度区域选择6处清晰视野，依次对着色程度和阳性细胞所占比例进行评分，2个评分结果之和为最终评分。测定结果如表6、表7所示。
表6：大鼠子宫组织ER-α阳性细胞所占比例情况(n＝8)
Figure BDA0002509955340000171
表7：大鼠子宫组织ER-α表达评分情况(
Figure BDA0002509955340000181
n＝8)
组别 着色评分 细胞所占比例评分 总分
Normal 1.00±0.19 0.90±0.11 1.90±0.19
Model 2.70±0.11<sup>**</sup> 2.93±0.10<sup>**</sup> 5.63±0.17<sup>**</sup>
Positive 1.83±0.17<sup>▲▲</sup> 1.95±0.18<sup>▲▲</sup> 3.78±0.25<sup>▲▲</sup>
(－)-GA低 2.38±0.13<sup>▲▲</sup> 2.23±0.13<sup>▲▲</sup> 4.60±0.19<sup>▲▲</sup>
(－)-GA中 1.78±0.07<sup>▲▲#</sup> 2.00±0.15<sup>▲▲#</sup> 3.78±0.17<sup>▲▲#</sup>
(－)-GA高 1.38±0.13<sup>▲▲#</sup> 1.25±0.14<sup>▲▲#</sup> 2.63±0.17<sup>▲▲#</sup>
(+)-GA低 2.45±0.21<sup>▲▲</sup> 2.35±0.23<sup>▲▲</sup> 4.80±0.26<sup>▲▲</sup>
(+)-GA中 2.20±0.15<sup>▲▲</sup> 2.30±0.19<sup>▲▲</sup> 4.50±0.19<sup>▲▲</sup>
(+)-GA高 1.90±0.15<sup>▲▲</sup> 1.73±0.15<sup>▲▲</sup> 3.63±0.23<sup>▲▲</sup>
注：与正常组相比，*P＜0.05，**P＜0.01，与模型组相比，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01，与等剂量的(+)-醋酸棉酚相比，#P＜0.05。
对各组大鼠子宫组织中ER-α阳性表达结果来看，模型组和与正常组相比有显著性差异(P<0.01)，给药组与模型组相比有显著性差异(P<0.01)，说明各给药组能降低子宫肌瘤模型组织中ER-α水平，对子宫肌瘤有一定的治疗作用，其中(–)-醋酸棉酚中、高剂量组与(+)-醋酸棉酚中、高剂量组相比有显著性差异(P<0.01)，表明(–)-醋酸棉酚的抗子宫肌瘤增殖的活性更强，药效更好。
表8：大鼠子宫组织PR阳性细胞所占比例情况(n＝8)
Figure BDA0002509955340000182
Figure BDA0002509955340000191
表9：大鼠子宫组织PR表达评分情况(
Figure BDA0002509955340000192
n＝8)
组别 着色评分 细胞所占比例评分 总分
Normal 1.08±0.10 1.10±0.1 2.18±0.39
Model 2.85±0.14<sup>**</sup> 2.88±0.11<sup>**</sup> 5.73±0.25<sup>**</sup>
Positive 1.98±0.23<sup>▲▲</sup> 2.00±0.24<sup>▲▲</sup> 3.98±0.41<sup>▲▲</sup>
(－)-GA低 2.28±0.18<sup>▲▲</sup> 2.33±0.15<sup>▲▲</sup> 4.61±0.21<sup>▲▲</sup>
(－)-GA中 1.83±0.23<sup>▲▲#</sup> 2.03±0.17<sup>▲▲#</sup> 3.85±0.26<sup>▲▲#</sup>
(－)-GA高 1.43±0.13<sup>▲▲#</sup> 1.38±0.11<sup>▲▲#</sup> 2.80±0.11<sup>▲▲#</sup>
(+)-GA低 2.38±0.13<sup>▲▲</sup> 2.40±0.15<sup>▲▲</sup> 4.78±0.25<sup>▲▲</sup>
(+)-GA中 2.20±0.15<sup>▲▲</sup> 2.25±0.18<sup>▲▲</sup> 4.45±0.23<sup>▲▲</sup>
(+)-GA高 1.83±0.23<sup>▲▲</sup> 1.68±0.15<sup>▲▲</sup> 3.50±0.26<sup>▲▲</sup>
注：与正常组相比，*P＜0.05，**P＜0.01，与模型组相比，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01，与等剂量的(+)-醋酸棉酚相比，#P＜0.05。
对各组大鼠子宫组织中PR阳性表达结果来看，模型组和与正常组相比有显著性差异(P<0.01)，各给药组与模型组相比有显著性差异(P<0.01)，说明各给药组能降低子宫肌瘤模型组织中PR水平，对子宫肌瘤有一定的治疗作用，其中(–)-醋酸棉酚中、高剂量组与(+)-醋酸棉酚中、高剂量组相比有显著性差异(P<0.01)，表明(–)-醋酸棉酚的抗子宫肌瘤增殖的活性更强，药效更好，详见表8、9。
实施例六：
基于上述实施例三中的实验方案，对各组大鼠血液生化指标和血清中钾离子含量进行测定。具体测定方法及测定结果如下：
1血液生化指标检测
将血清从-80℃冰箱中取出，4℃解冻，3500r/min离心5min，待测。全自动生化仪检测指标有：谷丙转氨酶(ALT)，碱性磷酸酶(ALP)，天冬氨酸转氨酶(AST)，肌酐(CRE)，尿素(UREA)。测定结果如表10所示。
表10：血液生化指标结果(
Figure BDA0002509955340000201
n＝8)
Figure BDA0002509955340000202
注：与正常组相比，*P＜0.05，**P＜0.01
测定正常对照组、各给药组大鼠血清中的5种生化指标，结果显示各给药组大鼠血清中ALT、ALP、AST、CRE、BUN含量与正常对照组相比均有升高。与正常对照组相比，各给药组血清中的ALT、ALP的含量均有显著性差异(P＜0.05)：血清ALT含量结果中，阳性药组、(–)-醋酸棉酚和(+)-醋酸棉酚的高剂量组差异极显著(P＜0.01)；血清ALP含量结果中，阳性药组、(–)-醋酸棉酚中、高剂量组和(+)-醋酸棉酚各剂量组结果极其显著(P＜0.01)；血清AST含量检测结果中，阳性对照组、(–)-醋酸棉酚、(+)-醋酸棉酚的中、高剂量组与正常对照组相比结果均有显著性差异(P＜0.05)，其中阳性对照组结果极其显著(P＜0.01)。血清CRE和BUN含量结果中，各给药组含量与正常组相比均有升高，无显著性差异(P＞0.05)。结果表明(–)-醋酸棉酚和(+)-醋酸棉酚对血液5种生化指标均有一定影响：对血液中ALT、ALP的含量影响较显著，对血液中AST、CRE、BUN的含量影响较小。
2血清中钾离子测定
样品前处理方法：分别吸取0.5mL血清样品于微波消解罐中，加入4mL HNO3溶液和2mL H2O2溶液，放置1h后置于微波消解仪中进行消解，微波消解程序：①温度110℃，持续5min；②温度130℃，持续5min；③160℃，持续10min。消解完毕后，将消解液用超纯水定容至25ml容量瓶中，作为待测样品溶液，同时制备试剂空白溶液。仪器工作参数：钾离子波长为769.9nm，狭缝为1.4nm，灯电流为2.0mA。标准曲线：精密吸取K元素标准储备液适量，用1％HNO3溶液配制成50、100、200、300、500、1000μg/L的系列标准混合溶液进行标准曲线线性测定，以钾离子浓度为横坐标，吸收度为纵坐标作回归方程，得钾标准曲线为Y＝22.627X+0.1337，r＝0.9993。检测结果如表11所示。
表11：血清中钾离子检测结果(
Figure BDA0002509955340000211
n＝8)
组别 K<sup>+</sup>(mg/L)
Normal 151.1±5.32
Positive 130.6±4.82<sup>*</sup>
(－)-GA低 132.4±4.60<sup>*</sup>
(－)-GA中 124.3±5.03<sup>**</sup>
(－)-GA高 113.3±4.39<sup>**</sup>
(+)-GA低 131.8±4.82<sup>*</sup>
(+)-GA中 127.3±4.50<sup>**</sup>
(+)-GA高 120.4±4.22<sup>**</sup>
根据表11检测结果所示，通过对正常组、各给药组血清中钾离子的检测，结果表明药物干预后各组大鼠血清中钾离子含量均有不同程度的降低：与正常对照组相比，阳性对照组、(–)-醋酸棉酚和(+)-醋酸棉酚均有显著性差异(P＜0.05)，其中阳性对照组、(–)-醋酸棉酚低剂量组、(+)-醋酸棉酚高剂量组差异极其显著(P＜0.01)。表明药物干预后，阳性对照组、(–)-醋酸棉酚和(+)-醋酸棉酚均会降低机体血液中的钾离子浓度。
如上所述，即可较好地实现本发明，上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种改变和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。

Claims (6)

1.用于制备治疗子宫肌瘤药物的活性成分，其特征在于，所述的活性成份为(-)-醋酸棉酚。
2.如权利要求1所述的用于制备治疗子宫肌瘤药物的活性成分，其特征在于，所述的活性成分(-)-醋酸棉酚，在用于治疗子宫肌瘤时复配维生素B1、B6和氯化钾进行使用。
3.权利要求1-2任意一项中的用于制备治疗子宫肌瘤药物的活性成分在子宫肌瘤治疗中的应用。
4.权利要求1-2任意一项中的用于制备治疗子宫肌瘤药物的活性成分在子宫肌瘤治疗药物中的应用。
5.权利要求1-2任意一项中的用于制备治疗子宫肌瘤药物的活性成分在制备雌激素异常相关病症治疗药物中的应用。
6.权利要求1-2任意一项中的用于制备治疗子宫肌瘤药物的活性成分在制备孕激素异常相关病症治疗药物中的应用。
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