KR100425029B1 - 두충 및 이소플라본이 함유된 건강식품 조성물 - Google Patents

두충 및 이소플라본이 함유된 건강식품 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 두충 및 이소플라본를 함유하는 건강식품 조성물에 관한 것으로, 칼슘, 비타민 D3, 비타민 K1로 구성된 성분에 이소플라본 및 두충을 함께 첨가하여 제조된 건강식품 조성물은 체중의 변화없이 골흡수 억제에 의해 골의 밀도가 증가되어 골다공증 예방 및 개선에 효과가 있으며, 식품으로 안정적으로 사용될 수 있는 성분으로만 구성되어 장기간 복용시 발생되는 부작용을 최소화할 수 있는 뛰어난 효과가 있다.

Description

두충 및 이소플라본이 함유된 건강식품 조성물{Health foods composition including Eucommia ulmoides Oliver and Isoflavone}
본 발명은 두충 및 이소플라본을 함유하는 건강식품 조성물에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 칼슘, 비타민 K1그리고 비타민 D3로 구성되는 성분에 두충 및 이소플라본을 함께 첨가하여 골다공증 예방 및 개선에 상승효과를 가지는 건강식품 조성물에 관한 것으로서, 이는 폐경등의 원인에 의하여 유발되는 골다공증을 부작용 없이 예방하고 개선하는데 효과적으로 사용될 수 있다.
뼈는 손상되었거나 오래된 뼈를 새로운 뼈로 대체하는 골의 재형성과정을 통해 건강한 상태로 유지된다. 골의 재형성과정은 조골세포(osteoblast)와파골세포(osteoclast)에 의해 이루어진다. 조골세포는 새로운 뼈를 생성하는 골형성(bone formation) 과정에, 파골세포는 낡은 뼈를 파괴하는 골흡수(bone resorption)에 관여한다. 그러나 폐경(menopause)에 의해 여성호르몬의 결핍이 나타나면 이런 골의 재형성과정에 관여하는 조골세포(osteoblast)와 파골세포(osteoclast)에 직접, 간접적으로 영향을 미쳐 골손실을 유발한다. 즉 폐경 후 골의 재형성이 활발해지고 골흡수 정도가 골생성 정도보다 많아져 골손실(bone loss)을 유발하게된다.(Robert H. Christenson "Biochemical markers of bone metabolism : An overview.", Clinical Biochemistry, 30(8), pp.573-593, 1997 )
골다공증은 골대사 질환 중 가장 흔한 질환으로, 골형성과 골흡수의 불균형에 의하여 단위 용적 내에 골량(bone mass)의 감소 및 미세 골구조(microarchtectural bone tissue)의 약화로 골이 구조적으로 약해짐으로서 작은 충격에도 쉽게 골적 및 형태학적인 변형이 초래되는 질환을 말한다.(Consensus Development Conference V, "Diagnosis, prophylaxis, and treatment of osteoporosis." Am J Med, 90, pp.646-650, 1993.(1994)) 그 원인으로는 내분비학, 영양학, 물리학, 유전학 분야의 인자들이 관여하고 있는 것으로 알려져 있으며(Riggs B. L and Melton L. J : N. Eng. J. Med, 314, pp.1676, 1982, 용석중, 임승길, 허갑범, 박병문, 김남현 : 대한의학협회지, 31, pp1350, 1988) 특히 에스트로겐(estrogen) 결핍, 비타민 D 결핍, 부갑상선 호르몬 과잉, 칼슘의 섭취부족이나 장에서의 흡수 능력 저하 등의 직접적인 원인이 있다.
골다공증은 만성적인 질환이므로 예방적인 차원에서 골다공증의 진단방법이 많이 개발되는 것이 필요하다. 기존의 골다공증의 진단방법으로는 골밀도를 측정하는 방법과 골대사 지표를 측정하는 방법으로 대별된다. 골밀도 측정방법은 종래는 단순 방사선검사로 뼈를 찍어 판독을 하였으나, 최근에는 초음파를 이용한 골밀도 측정기로 1%의 뼈농도가 손실되어도 이를 알아낼 수 있게 되었다. 그러나 골 밀도의 1회 측정만으로는 골의 변형을 알 수 없어 연속적으로 수년에 걸쳐 시간적인 간격을 두고 측정해야만 골량의 감소를 알 수 있는 단점이 있다. 미래의 골밀도를 예측하거나 골대사의 전환율(turnover rate)을 알기 위해서는 골대사 지표(bone biochemical markers)의 분석이 필요하다. 좋은 골대사지표의 조건으로는 뼈에 특이한 물질이어야 하며, 비 침해적으로 쉽게 검사할 수 있어야 한다. 골흡수 지표에는 하이드록시프롤린(Hydroxyproline) 및 뇨중의 칼슘, L(+)타르트레이트(tartrate)에 저항성이 있는 산 포스파타아제(acid phosphatase) 또는 피리디노린(Pyridinoline) 및 디옥시피리디노린(deoxypyridinoline)이 있으나, 뼈에 많이 있고, 파골세포에 의해 뼈에 있는 타입Ⅰ콜라겐(type I collage)이 분해될 때 혈중과 소변으로 다량 유리되는 피리디노린(Pyridinoline) 및 디옥시피리디노린(deoxypyridinoline)가 골대사를 나타내는데 좋은 지표로서 알려지고 있다.
골다공증의 치료는 일반적인 요법과 약물요법이 있다. 일반적인 요법에는 칼슘과 비타민 D의 섭취, 운동 및 생활습관의 변화를 요구하고 있으며, 약물요법에는 호르몬 보충요법, 알렌드로네이트(Alendronate), 칼시토닌(Calcitonin),라록시펜(Raloxifene), Na-F, 칼시트리올(Calcitriol), 비스포스포네이트 제제를 투여한다. 골다공증 치료는 장기적인 치료기간을 요구하여, 종래의 약물을 장기 복용하는 경우 요로 결석, 자궁내막암, 유방암등과 같은 부작용이 초래되어 인체에 부작용이 없는 새로운 골다공증 치료제를 개발하는 것이 필요하다. 따라서 부작용을 최소화하기 위하여 한약재 또는 천연물질에서 골다공증 치료제를 개발하려는 시도가 활발히 이루어져, 국내등록번호 제284657호에서 황기 추출물을 유효성분으로 하는 골다공증 치료제를 개시한 바있고, 국내등록번호 제278361호에서 감초추출물을 유효성분으로 하는 골다공증 치료제를 개시한 바있다. 그러나 상기 국내특허공보에 개시된 골다공증 치료제는 황기 또는 감초와 같은 천연재료에서 특정유효성분을 화학적으로 추출하여 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 하고 있다.
골다공증의 치료는 일반적인 요법과 약물요법이 있다. 일반적인 요법에는 칼슘과 비타민 D의 섭취, 운동 및 생활습관의 변화를 요구하고 있으며, 약물요법에는 호르몬 보충요법, 알렌드로네이트(Alendronate), 칼시토닌(Calcitonin), 라록시펜(Raloxifene), Na-F, 칼시트리올(Calcitriol), 비스포스포네이트 제제를 투여한다. 골다공증 치료는 장기적인 치료기간을 요구하여, 종래의 약물을 장기 복용하는 경우 요로 결석, 자궁내막암, 유방암등과 같은 부작용이 초래되어 인체에 부작용이 없는 새로운 골다공증 치료제를 개발하는 것이 필요하다. 따라서 부작용을 최소화하기 위하여 한약재 또는 천연물질에서 골다공증 치료제를 개발하려는 시도가 활발히 이루어져, 국내등록번호 제284657호에서 황기 추출물을 유효성분으로 하는 골다공증 치료제를 개시한 바있고, 국내등록번호 제278361호에서 감초에서 추출된 글라브롤이 유효성분으로 함유되는 것을 특징으로 하는 골다공증 예방 및 치료용 약제 조성물을 개시한 바있다. 그러나 상기 국내특허공보에 개시된 골다공증 치료제는 황기 또는 감초와 같은 천연재료에서 특정유효성분을 화학적으로 추출하여 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 하고 있다.
본 발명은 일반적으로 식품으로 사용할 수 있는 성분들은 치료약물에 비해 효과는 저하될 수 있으나 안정적이며, 골다공증을 예방 및 치료하기 위하여 약학적 요법과 병행되거나 단독으로 이용되는 식이요법을 개선할 목적으로, 한방 및 천연물을 중심으로 골다공증예방 및 치료효과를 나타내는 성분을 대상으로 이미 식품의약품안전청에서 식품으로 사용 가능한 성분들을 중심으로 선별하였다. 선별된 성분들은 칼슘, 비타민 K 그리고 비타민 D, 이소플라본, 두충이며, 이들의 골다공증 예방 및 개선의 효과를 극대화할 수 있도록 이들 성분들을 혼합하여 건강식품 조성물을 개발하였다.
비타민 D 및 칼슘은 뼈의 형성에 관여하여, 이들 성분의 부족이 골다공증의 원인이 되며, 일반적으로 골다공증 치료 및 예방에 사용되고 있는 성분이다.
비타민 K는 장벽세포에 존재하는 칼슘과 결합하는 단백질의 글루탐산잔기의 카르복실화에 관여하여 활성 비타민 D인 1,25-(OH)2-D와 함께 뼈의 형성에 관여한다. 과다 섭취하였을 때 빈혈, 황달이 나타나지만 체내에서 빨리 배설되므로 거의 독성을 보이지 않는다. 현재 국내에서 비타민 K1만이 식품의 첨가물로서 사용이 가능하다.
두충은 두충나무과(Eucommiaceae)에 속한 낙엽교목인 두충(Eucommia ulmoides Oliver)의 나무껍질을 건조한 것으로 봄부터 여름 사이에 코르크층을 깍아 버리고 나무껍질을 벗겨 햇볕에 말려 사용한다. 본초강목에는 "풍과 냉이 심해서 신장이 상하고 허리와 척추 부위에 통증이 심한데 두충 600g을 불에 볶아서 술 4L에 10일 동안 담가두었다가 매일 300ml씩 복용한다"고 기재되어 있어 강과 신을 보하고 근골을 강하게 하며 태를 안정되게 하는데 쓰여 왔다(황완균, 최수부, 김일혁, "가시오갈피 및 두충 혼합엑스의 생리활성",생약학회지 27(1), pp.65-74, 1996). 또 혈압을 낮추고 요통을 멈추게 하여 익모초 등과 함께 고혈압 치료에 대한 처방에 배합되어 사용되었으며 강장, 강정, 진통약으로 널리 사용되어 왔다(문관심, "약초의 성분과 이용", 일월서각 pp.177, 1999). 최근 두충의 약리학적 효과로 항노화작용, 항피로작용, 글루코기다제 인히비터(glucosidase inhibitor) 작용, 심장수축력 억제 작용, 혈관확장 작용, 항당뇨 작용, 진통 및 신경통, 단백질 합성 및 지질대사 촉진작용등이 보고되었다. 또한 두충은 식품의약품 안전청에서 식품원료로 제한을 받지 않고 사용할 수 있는 동, 식물로 분류가 되어있어(식품의약품 안전청 식품원료인정여부 동.식물 현황, 1999. 4월), 장기간 복용하여야 하는 골다공증 예방 및 치료용 건강식품에 매우 유용한 원료가 될 수 있을 것이다.
에스트로겐과 유사한 화학구조와 작용을 가지며 '식물성 에스트로겐(phyto-estrogen)'이라 불리는 이소플라본은 안전하게 인체 내에 흡수되기 때문에 최근 여성호르몬을 대체할 수 있는 확실한 성분으로 주목받고 있다. 천연물에 존재하는 이소플라본은 제니스타인(genistein), 다이드자인(daidzein), 포모노네틴formononetin), 바이오카닌 A(biochanin A), 제니스틴(genistin), 다이드진 daidzin)등이 있으며, 정도에 있어서 차이는 있지만 모두 약한 에스트로겐 활성을 가지고 있다. 대두의 항암작용은 최근 많은 주목을 받고 있는데, 이것은 대두에 있는 이소플라본(isoflavones), 단백분해효소 억제제, 피테이트(phytate), 식이성 섬유, 사포닌(saponins), 식물성 스테롤(sterols), 페놀성 물질등에 기인하는 것으로 여겨지고 있다. 아시아 사람보다 칼슘 섭취 량이 3-4배 많은 서양에서 골 밀도가 낮고 골절환자 발생율이 4-5배 높은 것은 콩과 같은 이소플라본(isoflavone) 함량의 많은 식을 섭취하는 것에 기인하는 것으로 알려져 있다.
본 발명은 골다공증의 예방 및 개성에 효과가 있는 것으로 알려진 칼슘, 비타민 K1,비타민 D3로 구성된 조성물에 이소플라본, 두충을 각각 또는 함께 혼합하여 제조된 건강식품 조성물이 난소를 절제함으로써 골다공증을 인위적으로 유도한 흰쥐동물모델의 골다공증에 대한 개선효과를 조사함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 골다공증 예방 및 치료를 목적으로 상용화되고 있는 칼슘, 비타민 K1,비타민 D3로 구성된 조성물에, 식품원료 및 식품첨가제로 안정하게 사용될 수 있는 두충, 이소플라본을 첨가하여 제조된 건강식품 조성물을 제공함에 있다.
상기 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 골다공증 예방 및 치료에 상용화되고 있는 칼슘, 비타민 K1,비타민 D3로 구성된 조성물에 두충 및 이소플라본을 각각 또는 함께 혼합하여 난소를 절제함으로써 골다공증을 인위적으로 유도한 흰쥐동물에 각각 사료로 급이하여 체중, 뇨중의 피리디노린 및 데옥시피리디노린을 측정하고, 해면골의 면적을 측정하여, 뇨중의 피리디노린 및 데옥시피리디노린이 감소하고 해면골의 면적이 증가되는 것을 확인함으로써 달성하였다.
도 1은 경골의 표본 이미지를 도시한 것이다.
도 2는 경골의 골조직 이미지를 도시한 것이다.
본 발명은 칼슘, 비타민 K1,비타민 D3로 구성된 조성물에 이소플라본 및 두충을 함께 첨가하여 골다공증 예방 및 개선효과가 상승된 건강식품 조성물을 제조하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 의한 식품 조성물에 배합되는 성분들은 모두 식품 첨가제용 제품이거나, 천연 추출물이다.
본 발명의 식품 조성물이 골다공증 예방 및 치료에 효과가 있는지의 여부는 삼육실험동물연구소(오산, 경기도)로부터 구입한 스프라그-다울리(Sprague-Dauley)종 암컷 흰쥐로 동물실험을 하여 검증하였다.
이하, 본 발명을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들에만 한정하는 것은 아니다.
실시예 1 : 두충 및 이소플라본을 함유하는 골다공증 예방 및 치료용 식품 조성물의 제조
본 발명에 사용된 두충은 약재시장에서 두충의 건조된 수피를 구입하여 사용하였다. 구입한 두충 500g을 3mm 정도의 두께로 절단한 후 물 450ml에 식염 15g을 넣고 진탕한 후 5시간 정도 방치하여 두충이 내부까지 완전히 스며들게 한 후 볶아서 완전히 건조시킨다. 볶은 두충 50g을 증류수 1.5L로 126℃에서 2시간 동한 미광메카트로닉스 한약추출기(ME5000SUPER)를 사용하여 가압 추출한 후 100ml로 농축하여 사용하였다.
이소플라본은 대두추출물을 정제한 이소플라본 추출물을 사용하였다. 이는 (주) 태평양생화학사업본부(경기, 안산)에서 제공하는 것으로, 총 이소플라본 함량이 30% 이상 함유되어 있다. 이들중 제니스틴(genistin), 제인스테인(geinstein)이 15-20%, 다이드진(daidzin), 다이드제인(daidzein)이 11-15%를 각각 차지하며, 어그리콘(aglycone) 함량이 이소플라본 함량을 100%환산했을 때 21%이상을 차지한다.
비타민 K1는 (주) 인성케미칼에서 공급하는 비타민 K1이며, 총 비타민 K1함량이 5%인 식품 첨가용 제품을 사용하였다.
비타민 D3는 화일약품에서 공급하는 비타민 D3(cholecalciferol)이며, 100000 IU/g인 식품첨가에 사용되는 분말형태의 제품을 사용하였다.
칼슘은 화일약품에서 공급하는 유청칼슘이며, 칼슘함량 26.4%인 식품첨가에사용되는 분말형태의 제품을 사용하였다.
본 발명에 의한 건강식품 조성물은 칼슘, 비타민 D3및 비타민 K1로 구성된 조성물, 두충 추출물, 이소플라본 추출물의 중량비가 4 : 20 ∼30 : 0.5 ∼ 1 로 혼합하여 제조하는 것이 바람직하다.
실험예 1 : 본 발명에 의한 식품 조성물을 투여에 따른 실험동물의 체중변화 측정
체중 180-200g의 스프라그-다울리(Sprague-Dauley)종 암컷 흰쥐를 삼육실험동물연구소(오산, 경기도)로부터 구입하여, 아주대학교병원 동물실험실에서 키웠으며, 이곳의 온도는 23±1℃ ,습도는 40∼60%, 명암주기는 12시간 조건으로 24주간 사육하였다. 상기 흰쥐를 케타민 1ml/kg(체중) 복강 투여하여 마취하였다. 마취후 등쪽부위의 털을 전기면도기로 제거하고 70% 알코올로 소독하였다. 먼저 흰쥐의 등쪽 하단 부위 척추선을 따라 약 3cm 가량의 피부조직을 메스를 이용하여 가르고 난소가 위치하는 복막 양쪽을 1.5cm 가른 후 난소를 절개하였다. 난소절제군은 왼쪽 난소부터 절제하였고, 정상군은 난소를 절제하지 않고 봉합하였다. 수술 1일 후 항생제를 투여하였으며, 이후 약4주간 회복기를 가졌다.
정상군 및 난소절제군을 각각 7마리씩 나누었으며 난소절제군은 대조군, A 군, B 군, C 군, D 군으로 구분하였다. 정상군 및 난소절제 대조군에는 일반사료를, 난소절제 A, B, C, D 군은 조합물 사료를 공급하였다. 일반사료는 삼양사료 주식회사에서 제공하는 분말형태의 사료를 사용하였고, 조합물 사료는 표 1과 같이 일반사료에 본 발명에 의한 건강식품 조성물을 첨가하여 제조하였다.
본 발명에 의한 건강식품 조성물의 배합비
대조군 A B C D
칼슘 0 % 0.4 % 0.4 % 0.4 % 0.4 %
비타민 D3 0 % 0.005 % 0.005 % 0.005 % 0.005 %
비타민 K1 0 % 0.0018 % 0.0018 % 0.0018 % 0.0018 %
두충추출물 0 % 0 % 2.5 % 0 % 2.5 %
이소플라본 추출물 0 % 0 % 0 % 0.083 % 0.083 %
1일 사료 섭취량은 흰쥐가 3일 동안 섭취하는 사료를 정량하여 결정하였는데, 흰쥐의 체중 1 kg당 60 g 씩 매일 공급하였다. 7개월간 투여하여 체중의 변화를 측정하여 표 2에 나타내었다.
실험결과는 평균 표준편차(mean standard deviation)로 나타내었고 학생들의 t-검정(student's t-test)을 이용하여 통계처리 후 신뢰구간(p value)이 0.05보다 작은 경우 유의성이 있는 것으로 판정하였다. 통계처리계산은 SAS를 이용하여 수행하였다.
본 발명에 의한 건강식품 조성물의 급여에 따른 체중의 변화
그룹 30 일 실험동물의 수 235 일 실험동물의 수
정상군 260.8 ±21.3a) 6 303.3 ±30.1 3
대조군l 262.9 ±22.3 7 330.0 ±38.4 7
A 255.7 ±23.0 7 340.0 ±56.3 6
B 262.9 ±22.7 7 335.0 ±57.6 6
C 257.5 ±25.2 7 350.0 ±46.7 6
D 260.7 ±22.3 7 302.1 ±42.5 7
체중의 변화에 있어서 난소적출후 30일째 와 235일째의 측정치는 정상군이 260.8 ±21.3, 303.3 ±30.1을 나타내었고, 대조군은 262.9 ±22.3, 330.0 ±38.4로 증가함을 나타내었으나 유의성을 나타내지 않았다. 조성물 투여군에 있어서, A군은 255.7 ±23.0, 340.0 ±56.3이었고, B군은 262.9 ±22.7, 335.0 ±57.6 이었고, C군은 257.5 ±25.2, 350.0 ±46.7 D군은 260.7 ±22.3, 302.1 ±42.5을 나타내었으며, 대조군에 비하여 유의성을 나타내지 않았다. 조성물 투여군중 D군은 평균 체중이 다른 투여군 보다 특히 낮으며, 정상군의 체중 증가량과 비슷함을 보인다. 이는 이소플라본과 두충의 상호작용에 의한 체중감량 효과로 사료된다.
실험예 2 : 본 발명에 의한 조성물의 투여에 따른 실험동물 뇨의 피리디노린 및 데옥시피리디놀린 함량 측정
뇨중의 피리디노린(pyridinoline) 및 디옥시피리디노린(deoxypyridinoline)을 측정하기 위해, 상기 실험예 1의 실험방법과 동일하게 실험동물군을 준비하고, 상기 실험예와 동일하게 건강식품 조성물을 사료에 혼합하여 실험동물에게 급여하였다.
사료 및 조성물 투여 후 120일 및 150일 째 되는 날에 물과 사료를 자유로이 섭취하게 하면서, 1마리씩 꺼내어 4시간 간격으로 뇨를 채취하여, 3일간 수집하였다. 수집된 뇨는 -20 ℃ 냉동고에 보관하면서 뇨중의 크레아틴, 피리디노린 및 디옥시피디노린을 측정하였다.
1)뇨중의 크레아틴 측정
뇨의 피리디노린 및 디옥시피리디노린을 보정하기 위하여, 뇨중의 크레아틴(creatinine)을 측정한다. 크레아틴 측정을 위해 크레아틴 키트 creatinine kit) (영동제약)을 사용하였다. 뇨는 1/50배 희석하여 측정하였고, 키트에 들어있는 피크릭산(picric acid)는 1/2배 희석하여 사용하였다. 스탠다드 Standard)는 크레아틴(creatinine) 10mg/dL (884 uM)을 사용하였고, 0, 2.5, 5, 7.5, 10mg/mL를 제조하여 교정 커브(calibration curve)를 작성하였다. 분광광도계 Shimadzu, UV-1201)의 파장은 515nm에서 측정하여 흡광도를 측정하였다. 뇨의 크레아틴은 mM로 나타내었다.
2)뇨중의 피리디노린 및 디옥시피리디노린의 HPLC 분석
피리디노린(pyridinoline) 및 디옥시피리디노린(deoxypyridinoline)은 IanT. Jameset al(1996)가 보고한 방법을 수정하여 분석하였다.(Ian T. James, Amanda J. Walne, and David Perrett., "Automated solid-phase extraction with hi호-performance liquid chromatography analysis of Pyridinium crosslinks".,Analytical biochemistry., 240, pp.29-36, 1996)
즉, 뇨중의 피리디노린(pyridinoline) 및 디옥시피리디노린 deoxypyridinoline)은 측정하기 위하여 뇨와 농축 HCl(35%)을 각각 1.5ml, 0.5ml 3:1)를 혼합하여 최종 HCl농도 약 3M이 되게 하여, 10ml 스크류-탐 바이알(screw-top vials)에 넣어 120℃ 에서 20시간동안 가수 분해하였다. 가수분해된 뇨 2ml를 취하여 10분간 마이트로 원심분리(microcentrifuge, 13000g)에서 원심분리하였다. 상등액 1ml를 취하여 25mM 디소디윰 테트라보레이트(disodium tetraborate) (pH 9.3)를 사용하여 1/10로 희석하여, 고체상 추출(solid phase extraction, SPE)을 하였다. SPE에 사용된 카트리지(cartridge)는 IST에서 공급하는 1ml 아이솔루트 컨펌(Isolute Confirm) HCX SPE 카트리지를 사용하였다. SPE 실험은 5mM 소디윰 포메이트(sodium formate, pH 2.75) 2ml를 유속 0.5ml/min으로 카트리지를 컨디션닝(conditioning)하는 것으로 시작한다. 컨디션닝(conditioning)후 희석한 가수분해된 뇨 7.5ml를 유속 0.5ml/min으로 카트리지에 통과시킨다. 5mM 소디윰 포메이트 0.5ml로 세척하여(유속 0.5ml/min)하여 염을 제거하였다. 5mM 소디윰 포메이트 : MeOH이 6:4로 혼합된 용액 6ml를 유속 3ml/min으로 통과 시키켜 불순물을 제거하고, 5mM 소디윰 포메이트 2ml로 유속 3ml/min에서 세척한다. 이후 질소로 30초간 건조하고, 최종 HFBA(heptafluorobutyric acid)로 pH 5로 적정한 100mM 소디윰 포메이트 400ul를 사용하여 피리디노린 및 디옥시피리디노린을 선택적으로 용리시키고, 용리된 용액을 1M HFBA 40ul가 들어있는 튜브에 포집한다.
상기와 같이 전처리된 용액은 HPLC를 사용하여 분석하였다. 검출기는 형광검출기(FL2000, SPECTRA SYSTEM, USA)를 사용하였고 방출 파장은 296nm에서 여기파장은 400nm을 사용하였다. 컬럼은 역상(C18, 250x4.6mm, 5u micron, Phenomenex, USA)을 사용하였다. 펌프는 스펙트라시스템(SPECTRAsystem) P4000을 사용하였고, 유속은 1ml/min에서 분석하였다. 이동상은 30mM 헵타프루오로부티릭산 (heptafluorobutyric acid, HFBA)와 아세토니트릴(acetonitrile)을 83:17(v/v)에서 70:30(v/v)으로 30분간 점차적으로 변화를 주는 조건에서 분석하였다.
피리디노린 및 디옥시피리디노린의 스탠다드는 각각 731nM 피리디노린, 342nM 디옥시피리디노린이 들어있는 크로스링크 스탠다드(INstruchemie b.v, Netherland)를 희석하여 사용하였다.
상기와 같은 방법에 의하여 측정된 결과는 표3과 같고, 실험결과의 통계분석 방법은 실험예 1과 동일하다.
본 발명에 의한 조성물의 급여에 의한 뇨의 피리디노린 및 디옥시피리디노린의 함량
그룹 실험동물의 수 피리디노린 (nM/mM 크레아틴) 디옥시피리디노린 (nM/mM 크레아틴)
정상군 3 18.9±4.6a) 6.6±2.7
대조군 5 22.7±9.7 7.8±2.2
A 6 18.0±6.2 7.2±3.2
B 6 15.9±4.1 5.7±1.7
C 5 15.8±1.7 5.5±1.7
D 7 8.4±3.8 2.0±3.2
정상군과 대조군의 차이는 거의 없었으나, D군의 피리디노린, 디옥시피리디노린 함량이 각각 8.4 nM/mM(creatinine)±3.8, 2.0nM/mM(creatinine)±3.2 이므로 대조군의 22.7nM/mM(creatinine)±9.7, 7.8nM/mM(creatinine)±2.2 보다 감소하였다.
A군, B군, C군은 대조군에 비해 감소하였으나 유의성을 나타내지 않았다. A군의 피리디노린, 디옥시피리디노린 함량이 각각 18.0nM/mM(creatinine)±6.2, 7.2nM/mM(creatinine)±3.2이므로 D군에 비해 각각의 함량이 많은 것으로 나타났다.
비타민 K, 비타민 D 및 칼슘은 골다공증 예방 및 치료에 효과가 있는 것으로 알려져 있으나, 본 실험에서는 유의한 감소효과를 얻지 못하였다. 또한 비타민 K, 비타민 D 및 칼슘에 두충 또는 이소플라본을 각각 혼합한 것도 유의적인 감소효과를 얻지 못하였다. 이는 대조군에서 저 칼슘식이를 하지 않아 골흡수 작용이 극대화되지 않은 것이 원인으로 사료된다. 그러나 비타민 K, 비타민 D 및 칼슘에 이소플라본과 두충을 함께 투여한 D군에서는 대조군보다 피리디노린 및 디옥시피리디노린이 다량 감소하였다. 이는 칼슘, 비타민D, 비타민K의 혼합물에 이소플라본 및 두충을 함께 투여하면 파골세포에 의한 골흡수를 억제하는데 있어 상승작용이 있는 것을 의미한다.
실험예 3 : 본 발명에 의한 조성물의 급여에 따른 해면골 면적의 측정
골흡수 지표에 대한 효과를 눈으로 확인하기 위해 뼈의 골밀도를 간접적으로 측정하는 방법인 해면골의 면적을 측정하기 위하여 상기 실험예 1의 방법과 동일하게 실험동물을 준비한다. 사료 및 조성물 투여 후 약 7개월 째, 에테르로 마취시킨 후 자궁탈구(cervical dislocation)로 도살하였다. 복부를 절개하여 우측의 대퇴골 및 경골, 좌측의 경골을 취하였다. 우측의 대퇴골 및 경골은 드라이 아이스에 급속 냉동시킨 후 냉동창고에 보관하였고, 좌측 경골은 골조직 검사를 위하여 4% 포르말린 용액에 보관하였다.
상기와 같이 추출된 경골의 중앙을 절개하여 골단(epiphysis)부분의 해면골(trabecular bone)을 관찰하였다. 해면골은 골대사작용이 가장 활발한 곳이어서, 외부효과에 의한 뼈의 골생성 및 골흡수 작용이 가장 빠르게 반응하여 나타나는 곳이다. 따라서 해면골의 면적을 측정함으로 골다공증을 진단할 수 있으며, 골다공증 유발억제 효과를 판단할 수 있는 지표로 사용된다.
골조직을 분석하기 위하여 우선 탈회 과정을 거친후 표준 방법에 따라 헤마토자린 에오신(Hematoxylin Eosin) 염색한 후 표본을 만들었다. 골조직 표본을 만드는 작업은 아주대학교병원 해부병리과에서 수행하였다. 표본을 3600dpi에서 스캔닝(UTA III, UMAX)하여 표본의 골조직 이미지(image)를 관찰하였다. 포토샵(Photoshop) 5.5를 이용하여 표본 이미지(도 1)에서 골조직 이미지(도 2)를 분리하였고, 분리된 골조직 이미지에서 해면골 면적을 측정하였다. 해면골 측정부위로는 골단부분(epyphysis)을 선정하였다. 이미지를 좌,우로 분리하여 성장판의 가장 높은 지점에서 0.2mm, 각각 해면골을 둘러싼 조직으로부터 0.2mm 떨어진곳을 직사각형 형태를 취하여 측정하였다. 해면골 및 전체면적 측정을 위하여 이미지 마스터 2D 소프트웨어(IMAGE MASTER 2D software)를 사용하였다. 측정부위의 전체 면적에서 해면골이 차지하는 면적을 %로 정량화하여 그 비교분석한 결과를 표 4에 나타내었다.
본 발명에 의한 조성물의 급여에 의한 해면골의 면적
그룹 해면골 면적(%) 실험동물의 수
대조군 22.2±2.8 5
A 24.4±2.6 5
B 31.5±6.1 4
C 25.7±8.1 5
D 35.0±2.8 3
해면골의 면적은 B군과 D군이 각각 31.5% ± 6.1, 35.0% ± 2.8로 대조군의22.2% ± 2.8에 비해 증가하였다. A군과 C군은 각각 24.4% ± 2.6, 25.7% ± 8.1로 control보다 증가하였으나 유의성을 나타내지 않았다.
D군의 해면골 면적은 대조군에 비해 약 1.5배 증가하였다. 골흡수지표 측정을 통해 알아본 바와 같이 이소플라본 및 두충의 공동작용에 의해 D군이 골흡수 억제에 의한 골다공증 유도 억제효과가 있을 것이라는 예상과 일치하였고, 경골의 전체 이미지에서 확인할 수 있다.(도 1 및 도2 참조)
이상, 상기 실시예와 실험예를 통하여 설명한 바와 같이 본 발명은 골다공증 예방 및 치료를 목적으로 상용화되고 있는 칼슘, 비타민 D3, 비타민 K로 구성된 조성물에 이소플라본 추출물 및 두충 추출물을 함께 첨가하여 제조된 건강식품 조성물은 각각을 첨가하여 제조된 건강식품 조성물보다 체중의 변화없이 골흡수 억제에 의해 골의 밀도가 증가되어, 폐경등의 원인에 의하여 유발되는 골다공증을 부작용 없이 예방하고 개선시키는 효과가 있으며, 식품으로 안정적으로 사용될 수 있는 성분으로만 구성되어 장기간 복용시 발생되는 부작용을 최소화할 수 있으므로, 골다공증 치료제의 보조제로서 매우 유용한 발명이다.

Claims (2)

  1. 칼슘, 비타민 D3, 비타민 K1, 두충 500g을 3 mm 두께로 세절하고, 물 450mL와 식염 15g을 첨가하여 진탕하고, 5시간 방치한 후 볶아서 건조시키고, 상기 볶은 두충 50g에 증류수 1.5L를 첨가하여 126℃에서 2시간 동안 한약추출기를 사용하여 가압 추출한 후 100mL로 농축한 두충 추출물 및 대두 추출물을 정제한 것으로 총 이소플라본 함량이 30% 이상인 이소플라본 추출물의 중량비가 0.4: 0.005: 0.0018: 2.5: 0.083 인 것을 특징으로 하는 골다공증 예방 및 개선에 효과가 있는 건강식품 조성물.
  2. 삭제
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