본 발명은 카카오 콩 또는 콩껍질 분획물을 함유하는 원발성 접촉피부염 및 소화기계 염증 치료제를 그 특징으로 한다.
이와 같은 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 카카오 콩 또는 콩껍질 분획물이 세균이 분비하는 내독소 및 여러 피부염증 유발 물질들에 의해 발생되는 염증들에 대해 뛰어난 억제 효능을 가짐을 확인함으로써, 상기 분획물을 함유하는 원발성 접촉피부염 및 소화기계 염증 치료제에 관한 것이다.
따라서, 본 발명은 상기 카카오 콩 또는 콩껍질 분획물을 유효성분으로 함유하는 의약품 또는 식품첨가제를 포함한다.
본 발명에 따른 카카오 콩으로부터 코코아 버터를 제거하고 남은 분획물(카카오 메스) 또는 카카오 콩껍질 1 중량부에 50% 아세톤 수용액, 50% 에탄올 수용액 또는 50% 메탄올 수용액[Duksan, Korea] 4 ∼ 10 중량부를 첨가하여 40 ∼ 70 ℃의 온도로 4 ∼ 6시간 동안 환류하면서 교반 추출한 다음, 추출물을 원심분리하여 얻은 상징액을 모으고 남은 잔사를 반복 추출한 후, 상기 추출물을 여과, 건조시켜 카카오 콩 또는 콩껍질 추출물을 얻는다. 이 추출물을 스티렌계 다공성 수지에 흡착시킨 후, 20% 에탄올 수용액으로 분획한 후, 다시 60% 에탄올 수용액을 첨가하여 용매 분획물을 얻는다.
상기 분획물을 쥐에게 경구 투여하였을 경우, 소화기계 염증을 유발하기 위하여 세균의 내독소인 LPS를 복강 내에 주사함으로써 발생되는 쥐의 치사율을 현저히 낮추며, 또한 원발성 접촉피부염을 유발하는 물질인 TPA, 디스라놀, 크로톤오일에 의해 발생되는 염증을 현저히 억제시킨다.
한편, 본 발명은 카카오 콩 또는 콩껍질 분획물을 유효성분으로 하는 의약품 또는 식품 첨가제를 포함하는 바, 상기 추출물 의약물 또는 식품첨가제로의 제조방법은 공지방법을 따른다.
의약물으로 제조시에는 카카오 콩 또는 콩껍질 분획물 그 자체로도 사용할 수 있지만, 약학적으로 허용되는 담체(carrier), 부형제(forming agent), 희석제(diluent) 등과 혼합하여 분말, 과립, 캡슐 또는 주사제 등으로도 제조가 가능하다. 또한, 본 발명에 따른 카카오 콩은 예로부터 식용으로 사용되어온 것으로 분획물의 투여용량에 특별한 제약은 없고, 체내 흡수도, 체중, 환자의 연령, 성별, 건강상태 식이, 투여시간, 투여 방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다. 일반적으로 카카오 콩 또는 콩껍질 분획물은 체중 1 ㎏당 0.1 내지 10 ㎎ 정도를 투여하는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명의 유효성분을 포함하는 약제는 유효량 범위를 고려하여 제조하도록 하며, 이렇게 제형화된 단위투여형 제제는 필요에 따라 약제의 투여를 감시하거나 관찰하는 전문가의 판단과 개인의 요구에 따라 전문화된 투약법을 사용하거나 일정시간 간격으로 수회 투여할 수 있다.
한편, 식품첨가제로 제조시에는 음료, 껌, 과자류 등의 식품소재에 본 발명의 카카오 콩 또는 콩껍질 분획물을 포함시켜 제조할 수 있다.
이상에서 설명한 카카오 콩 또는 콩껍질 분획물을 유효성분으로 함유하는 의약품 및 식품첨가제는 염증 예방 및 억제효과에 탁월하다.
이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는바, 본 발명이 다음 실시예로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 카카오 콩으로부터 염증 억제 효능을 갖는 분획물의 제조
<1-1> 용매 추출에 의한 염증 억제 효능을 갖는 추출물의 제조
카카오 콩으로부터 코코아 버터를 제거하고 남은 분획물(카카오 메스) 1 중량부에 50% 아세톤[Duksan, Korea] 수용액 6 중량부를 첨가하여 60 ℃의 온도로 5시간 동안 환류하면서 교반 추출한 후, 이 추출물은 8,000 rpm, 4 ℃, 30분간 원심분리[Vision, Korea]하여 얻어진 상징액을 모으고, 남은 잔사는 동일한 방법으로 1회 반복하여 추출하였다. 이렇게 얻어진 추출물을 여과지(Whatmann 41)로 여과시킨 후, 냉동 건조하여 카카오 콩 추출물을 얻었다.
<1-2> 흡착 칼럼 크로마토그래피에 의한 염증 억제 효능을 갖는 분획물의 제조
상기 <1-1>에서 얻어진 추출물로부터 기존에 특허 출원한 방법을 참고로 하여[미국 특허 제 6159451호, 2000] 흡착 칼럼크로마토그래피에 의해 분획물을 제조하였다. 즉, 소수성 충진제인 XAD-4[Sigma, USA]나 HP-20[Mitsbish, Japan]에 흡착시킨 후 20% 에탄올로 세척하고, 남은 분획을 다시 60% 에탄올로 분획하였다.
실시예 2 : 카카오 콩껍질로부터 염증 효능을 갖는 분획물의 제조
<2-1> 용매 추출에 의한 카카오 콩껍질로부터 염증 억제 효능을 갖는 추출물의 제조
카카오 콩껍질 1 중량부에 50% 아세톤[Duksan, Korea] 수용액 6 중량부를 첨가하여 60 ℃의 온도로 5시간 동안 환류하면서 교반 추출한 후, 이 추출물은 8,000 rpm, 4 ℃, 30분간 원심분리[Vision, Korea]하여 얻어진 상징액을 모으고, 남은 잔사는 동일한 방법으로 1회 반복하여 추출하였다. 이렇게 얻어진 추출물을 여과지(Whatmann 41)로 여과시킨 후, 냉동 건조하여 카카오 콩껍질 추출물을 얻었다.
<2-2> 흡착 칼럼 크로마토그래피에 의한 염증 억제 효능을 갖는 분획물의 제조
상기 <2-1>에서 얻어진 추출물로부터 기존에 특허 출원한 방법을 참고로 하여[미국 특허 제6159451호, 2000] 흡착 칼럼크로마토그래피에 의해 분획물을 제조하였다. 즉, 소수성 충진제인 XAD-4[Sigma, USA]나 HP-20[Mitsbish, Japan]에 흡착시킨 후 20% 에탄올로 세척하고, 남은 분획을 다시 60% 에탄올로 분획하였다.
상기와 같이 얻어진 카카오 콩 또는 콩껍질 분획물의 항염증 효능을 평가하기 위한 다음과 같은 실험들을 실시하였다.
실시예 3: 세균의 내독소에 의해 발생되는 염증의 억제 활성
상기 실시예 1, 2에서 얻은 분획물들의 세균의 내독소에 의해 발생하는 염증에 대한 억제 활성은 다음 공지의 방법[Yang et al., J. Nutr., 128: 2334-2340, 1998]에 따라 실시하였다.
우선, 25 ∼ 30 g의 BALB/C 쥐를 한 군당 25 마리를 준비하여 실험 전에 12시간 절식시킨 후, 상기의 방법에 의해 얻어진 시료를 1 g/㎏ 농도로 쥐에 경구 투여시켰다. 반면에 대조군은 동량의 인산용액만을 경구투여시켰다. 30분 후에 자이라진 하이드로클로라이드(xylazine hydrochloride)로 마취시킨 후 다시 5분 후에 40 ㎎/㎏의 LPS를 복강내로 투여하였다. 30 시간까지 매 2시간마다 생존율을 측정하였다. 항염증 정도는 대조군에 대한 생존 수의 차이로 측정하였다.
상기 카카오 콩 및 콩껍질 분획물들은 모두 세균의 내독소이면서 염증유발 물질인 LPS에 의해 발생하는 쥐의 치사율에 대한 저해 효능을 실험한 결과를 도 1과 2에 나타냈다. 도 1, 2에 나타낸 바와 같이, 카카오 콩 및 콩껍질 분획물을 각각 1 g/㎏ 농도로 쥐에 경구 투여시 30 시간에서 각각 32%와 36%의 치사율 감소가 관찰되었다. 특히, 12 시간에서는 각각 44%과 48%의 높은 치사율 감소 효과를 나타내었다.
실시예 4: TPA에 의해 유발되는 염증의 억제 활성
상기 실시예 1, 2에서 얻은 분획물들의 TPA에 의해 발생하는 염증의 억제 활성은 다음 공지의 방법[Romay C., et al., Inflamm. Res. 47: 334-338, 1998]에 따라 실시하였다.
우선, 25 ∼ 30 g의 BALB/C 쥐를 한 군당 8 마리를 준비하여 실험 전에 12시간 절식시킨 후, 상기의 방법에 의해 얻어진 시료를 각각의 농도로 경구 투여시켰다. 30분 후에 자이라진 하이드로클로라이드로 마취시킨 후 다시 5분 후에 TPA를 귀당 25 ㎍ 씩 양쪽 귀에 도포하였다. 5시간 후에 오른쪽 및 왼쪽 귀를 6 mm 펀치로 잘라내어 무게를 측정하였다. 항염증 정도는 대조군에 대한 무게의 차이로 측정하였다. (도 3 내지 도 9는 평균값으로 나타냈으며, 통계적 유의성은 유의수준 * P < 0.05, ** P < 0.01 에서 two-tailed Dunnett's t-test를 따라서 ANOVA 법[Ott, R. L., An introduction to statistical methods and data analysis, 1997]에 의해 검정하였다.)
상기 카카오 콩 및 콩껍질 분획물들의 염증유발 물질인 TPA에 의해 발생하는 염증에 대한 저해 효능을 실험한 결과를 도 3과 4에 나타냈다. 도 3, 4에 나타낸 바와 같이, 카카오 콩 및 콩껍질 분획물들을 각각 0.5 g/㎏ 농도로 쥐에 경구투여시 62%와 64%의 염증 억제율을 나타내었으며, 1 g/㎏ 농도로 쥐에 경구 투여시 각각 72%과 68%의 염증 억제율을 나타냄으로써 유사한 저해 효능을 나타내었다.
실시예 5: 크로톤 오일에 의해 발생하는 염증의 억제 활성
상기 실시예 1, 2에서 얻은 분획물들의 크로톤 오일에 의해 발생하는 염증의 억제 활성은 다음 공지의 방법[Clementi G., et al., Life Sci. 57: 193-197, 1995; Heiman A. S., et al., Steroids 62: 491-499, 1997]에 따라 실시하였다.
상기의 방법과 유사하게, 시료들을 각각의 농도로 경구 투여시켰다. 30분 후에 자이라진 하이드로클로라이드로 마취시킨 후 다시 5분 후에 크로톤 오일을 귀당 20 ㎕ 씩 양쪽 귀에 도포하였다. 5시간 후에 오른쪽 및 왼쪽 귀를 6 mm 펀치로 잘라내어 무게를 측정하였다. 항염증 정도는 대조군에 대한 무게의 차이로 측정하였다.
상기 카카오 콩 및 콩껍질 분획물들의 염증유발 물질인 크로톤 오일에 의해 발생하는 염증에 대한 억제 효능을 실험한 결과를 도 5와 6에 나타냈다. 도 5, 6에 나타낸 바와 같이, 카카오 콩 및 콩껍질 분획물들을 각각 0.5 g/㎏ 농도로 쥐에 경구 투여시 67%와 53%의 염증 억제율을 나타내었으며, 1 g/㎏ 농도로 쥐에 경구 투여시 각각 77%과 71%의 염증 억제율을 나타냄으로써 유사한 억제 효능을 나타내었다. 도 5와 6에 나타낸 바와 같이, 카카오 콩 및 콩껍질 분획물들을 각각 1 g/㎏ 농도로 쥐에 경구 투여시 77%와 68%의 강한 염증 억제 활성을 나타내었다.
실시예 6: 디스라놀에 의해 발생하는 염증의 억제 활성
상기 실시예 1, 2에서 얻은 분획물들의 디스라놀에 의해 발생하는 엽증의 억제 활성은 다음 공지의 방법[Viluksela M., et al., Arch. Dermatol. Res. 283: 262-268, 1991; Blazso G., et al., Prostaglandins 50: 161-168, 1995]에 따라 실시하였다.
상기의 방법과 유사하게, 시료들을 각각의 농도로 경구 투여시켰다. 30분 후에 자이라진 하이드로클로라이드로 마취시킨 후 다시 5분 후에 디스라놀을 귀당 50 ㎍씩 양쪽 귀에 도포하였다. 5시간 후에 오른쪽 및 왼쪽 귀를 6 mm 펀치로 잘라내어 무게를 측정하였다. 항염증 정도는 대조군에 대한 무게의 차이로 측정한다.
상기 카카오 콩 및 콩껍질 분획물들의 염증유발 물질인 디스라놀에 의해 발생하는 염증에 대한 억제 효능을 실험한 결과를 도 7과 8에 나타냈다. 도 7과 8에 나타낸 바와 같이, 카카오 콩 및 콩껍질 분획물들을 각각 1 g/㎏ 농도로 쥐에 경구 투여시 82%과 78%의 강한 염증 억제 활성을 나타내었고, 또한 0.5 g/㎏ 농도에서 각각 51%과 59%의 염증 억제율을 나타내었다.
이상과 같이, 상기 카카오 콩 및 콩껍질 분획물들을 경구 투여시 TPA, 크로톤 오일, 디스라놀에 의해 유발되는 염증의 강한 저해 활성을 나타냈다. 또한, 처리한 시료의 농도가 점차 증가할수록 염증이 억제되는 것을 관찰함으로써, 염증들이 경구 투여한 카카오 콩 및 콩껍질 분획물들의 농도에 의존적인 것을 알 수 있었다.
상기의 실험 결과, 카카오 콩 및 콩껍질의 분획물들을 쥐에게 경구 투여하였을 때 강력한 염증 억제 효능을 나타내었다.
실시예 7: 정제의 제조
유효성분 10 g
락토스 70 g
결정성 셀룰로오스 15 g
마그네슘 스테아레이트 5 g
총 량 100 g
상기에서 나열된 성분들을 잘게 부숴 혼합한 후 직타법(direct tableting method)에 의해 정제를 제조하였다. 각 정제의 총량은 100 ㎎이고, 그 중 유효성분의 함량은 10 ㎎이다.
실시예 8: 분말제의 제조
유효성분 10 g
옥수수 전분 50 g
카르복시 셀룰로오스 40 g
총 량 100 g
상기에서 나열된 성분들을 잘게 부숴 혼합하여 분말을 제조하였다. 경질 캡슐에 분말 100 ㎎을 넣어 캡슐제를 제조하였다.
실시예 9: 독성 시험
본 발명의 카카오 콩 또는 콩껍질 분획물에 대하여 독성실험을 다음과 같이 수행하였다. 구체적으로 상기 분획물을 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide, 이하 DMSO)에 용해하고 물로 희석한 후 이를 마우스(군당 10마리)에 각각 1 g/㎏을 투여한 다음 7일간 관찰하였으나 사망하는 쥐는 없었다.
실시예 10
껌 베이스 20 중량%, 설탕 76.9 중량%, 향료 1 중량% 및 물 2 중량%와 상기 실시예에서 얻은 카카오 콩 또는 콩껍질 분획물 0.1 중량%를 배합하여 통상의 방법으로 츄잉껌을 제조하였다.
실시예 11
설탕 60 중량%, 물엿 39.8 중량% 및 향료 0.1 중량%와 상기 실시예에서 얻은 카카오 콩 또는 콩껍질 분획물 0.1 중량%를 배합하여 통상의 방법으로 캔디를 제조하였다.
실시예 12
박력 1급 25.59 중량%, 중력 1급 22.22 중량%, 정백당 4.80 중량%, 식염 0.73 중량%, 포도당 0.78 중량%, 팜쇼트닝 11.78 중량%, 암모 1.54 중량%,중조0.17 중량%, 중아황산나트륨 0.16 중량%, 쌀가루 1.45 중량%, 비타민 B₁0.0001 중량%, 비타민 B₂ 0.0001 중량%, 밀크향 0.04 중량%, 물 20.6998 중량%, 전지분유 1.16 중량% 대용분유 0.29 중량%, 제일인산칼슘 0.03 중량%, 살포염 0.29 중량% 및 분무유 7.27 중량%와 상기 실시예에서 얻은 카카오 콩 또는 콩껍질 분획물 1중량%를 배합하여 통상의 방법으로 비스켓을 제조하였다.
실시예 13
꿀 0.26 중량%, 치옥토산아미드 0.0002 중량%, 니코틴산아미드 0.0004 중량%, 염산리보플라빈나트륨 0.0001 중량%, 염산피리독신 0.0001 중량%, 이노시톨 0.001 중량%, 오르트산 0.002 중량% 및 물 98.7362 중량%와 상기 실시예에서 얻은 카카오 콩 또는 콩껍질 분획물 1 중량%를 배합하여 통상의 방법으로 음료를 제조하였다.
실시예 14
돈육 65.18 중량%, 계육 25 중량%, 전분 3.5 중량%, 대두단백 1.7 중량%, 식염 1.62 중량%, 포도당 0.5 중량% 및 글리세린 1.5 중량%와 상기 실시예에서 얻은 카카오 콩 또는 콩껍질 분획물 1 중량%를 배합하여 통상의 방법으로 소세지를 제조하였다.
실시예 15
스피루리나 55 중량%, 구아검효소 분해물 10 중량%, 비타민 B₁염산염 0.01중량%, 비타민 B6 염산염 0.01 중량%, DL-메티오닌 0.23 중량%, 스테아린산 마그네슘 0.7 중량%, 유당 22.2 중량% 및 옥수수전분 1.85 중량%와 상기 실시예에서 얻은 카카오 콩 또는 콩껍질 분획물 10 중량%를 배합하여 통상의 방법으로 정제형 건강보조식품을 제조하였다
실시예 16
키토올리고당 11.26 중량%, 마늘분말 0.2 중량%, 은행잎추출물 분말 0.2 중량%, 베타카로틴(30% 현탄액) 0.9 중량%, 알파토코페롤 1.2 중량%, 레시틴 1.2 중량%, 정제팜유 4.5 중량%, 황납 1.6 중량%, 대두유 18.994 중량%, 젤라틴 37.83 중량%, 글리세린 16.51 중량%, 에틸바닐린 0.09 중량% 이산화티타늄 0.076 중량% 및 식용색소 0.44 중량%와 상기 실시예에서 얻은 카카오 콩 또는 콩껍질 분획물 5 중량%를 배합하여 통상의 방법으로 캡슐형 건강보조식품을 제조하였다.
비교예
이 분획의 활성을 일반적으로 잘 알려진 항염증 물질인 녹차의 EGCG(epigallocatechingallate)와 비교하기 위하여 상기 실시예 4와 동일한 방법으로 실험하였다. 도 9에서 보듯이, 카카오 콩 및 콩껍질의 분획물은 순수한 항염증 물질인 EGCG와 비교했을 때 매우 우수한 효능을 나타내었다.
결국, 본 발명에서 사용한 방법에 의한 카카오 콩 및 콩껍질 분획물은 동물 실험에서 강한 항염증 활성을 갖는 것을 알 수 있었다.