KR20000005259A - 코코아 추출 화합물과 그 제조방법 및 사용방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 폴리페놀류 또는 프로시아니딘류, 특히 식 A_n인 폴리머 화합물 및 약학적으로 허용 가능한 A_n의 염 또는 유도체(산화물도 포함)와 같은 코코아 추출물, 화합물, 그들의 조합물 및 그 조성물, 상기 추출물, 화합물 및 조성물을 이용하는 방법 뿐 아니라 그들의 제조방법을 개시하고 특허청구한다. 여기서 A는 하기 식을 갖는 모노머이다:

식>

여기에서, n은 최소한 하나의 말단 모노머 유니트 A와 복수개의 추가적인 모노머 유니트가 존재할 수 있도록 2 내지 18인 정수;

R은 3-(α)-OH, 3-(β)-OH, 3-(α)-O-당(糖) 또는 3-(β)-O-당;

인접 모노머 사이는 4, 6 또는 8 위치에서 결합;

4 위치는 알파 또는 베타 입체이성질;

X, Y 및 Z는 모노머 A, 수소 및 당로 이루어지는 군에서 선택, 단 최소한 하나의 말단 모노머에 있어서 그에 추가되는 모노머 유니트는 4위치에서 결합하고 Y=Z=수소;

당은 어떤 부위에서라도, 예컨데 에스터 본드를 통해, 페놀릭 부분으로 선택적으로 치환.

Description

코코아 추출 화합물과 그 제조방법 및 사용방법

관련 출원

1996. 9. 6. 출원된 US 출원번호 제08/709,406호, 1996. 4. 2. 출원된 US 출원번호 제08/631,661호, 1994. 10. 3. 출원된 US 출원번호 08/317,226호(현재 US 특허 제5,554,645호로 특허됨) 및 PCT/US96/04497가 관련출원으로 계속중이며, 본 명세서에 참고문헌으로 포함되어 있다.

발명의 분야

본 발명은 코코아 추출물 및 폴리페놀 특기 프로시아니딘류가 풍부한 폴리페놀류와 같은 코코아 추출물로부터 얻어지는 화합물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 추출물 및 화합물의 제조방법과 사용방법 및 예컨데 항종양제, 항산화제, DNA 토포아이소머라제 II 억제제, 시클로-옥시게나제 및/또는 리포옥시게나제 조절제, NO(질산화물) 또는 NO-합성효소 조절제, 비-스테로이드성 항염제, 아폽토시스(apoptisis) 조절제, 혈소판 응집 조절제, 혈액 또는 생체 글루코스 조절제, 항균제 및 산화성 DNA 손상 억제제 등 이들의 사용방법에 관한 것이다

본 명세서에서 문헌들은 필요한 부분에서 그때 그때 인용되거나, 상세한 설명 끝의 인용부에서 인용된다. 이들 문헌들은 본 발명분야에 관한 것이며; 여기서 인용되는 각 문헌들은 참고문헌으로서 본 명세서에 포함된다.

발명의 배경

폴리페놀류는 그 일부가 먹이사슬에 연결되는 폭넓은 범위의 식물에 존재하는 매우 다양한 화합물 군이다(페라이라 등, 1992). 어떤 경우 이들은 음식물에서 중요한 화합물 부류가 되기도 한다. 비록 폴리페놀류의 일부가 nonnutrative인 것으로 인식되지만 이들 화합물이 건강에 유용한 효과를 나타낼 수 있기 때문에 이에 대한 관심이 증대되고 있다.

예를 들면, 쿼세틴(quercetin; 플라보노이드의 일종)은 동물실험에서 항종양 작용을 하는 것으로 밝혀졌다(데쉬너 등, 1991; 카토 등, 1983). (+)-카테킨과 (-)-에피카테킨(플라반-3-올)은 백혈병 바이러스의 역전사효소 작용을 억제하는 것으로 나타났다(추 등, 1992). 노보탄닌(가수분해 가능한 탄닌 올리고머의 일종)은 항종양 작용을 한다(오쿠다 등, 1992) 통계보고에 의하면 일본의 녹차 생산지에서는 위암에 의한 사망이 현저하게 낮다. 에피갈로카테킨 갈레이드는 마우스의 피부종양을 억제하는 녹차에서 약학적으로 확성인 물질인 것으로 보고되었다(오쿠다 등, 1992). 엘라직산은 여러 동물종양 모델에서 항암 작용을 나타내었다(부카타 등, 1992). 또한 최근 프로안토시아니딘 올리고머를 항돌연변이제로 사용하는 키코만社의 발명이 특허되었다. 음식에서 페놀릭 화합물의 영역과 실험동물 모델에서 페놀릭 화합물의 종양발달 조절에 관한 것이 202차 미 화학회에서 최근 발표되었다(호 등, 1992; 황 등, 1992).

그러나 어떤 선행문헌에서도 코코아 추출물 또는 코코아 추출물로부터의 화합물, 이들의 제조방법, 이들을 예컨데 항종양제, 항산화제, DNA 토포아이소머라제 II 억제제, 시클로-옥시게나제 및/또는 리포옥시게나제 조절제, NO(질산화물) 또는 NO-합성효소 조절제, 비-스테로이드성 항염제, 아폽토시스 조절제, 혈소판 응집 조절제, 혈액 또는 생체 글루코스 조절제, 항균제 및 산화성 DNA 손상 억제제 등의 용도로 사용하는 것에 대하여 어떤 교시나 암시를 찾아볼 수 없다.

발명의 목적 및 요약

비발효 코코아 원두는 상당한 수중의 폴리페놀을 함유하고 있기 때문에 본 발명자들은 코코아에서 이들 화합물을 추출하고 활성을 스크리닝함으로써 코코아에 함유된 화합물 처럼, 코코아 추출물도 유사한 활성이 나타날 것이며 코코아 추출물을 이용할 수 있을 것으로 생각하였다. NCI(미국 암 연구소)는 대규모 천연물 선발 프로그램의 일환으로 항암 작용을 하는 여러 테오브로마(Theobroma) 및 헤라니아(Herrania) 종을 스크리닝하였다. 몇몇 코코아 조직 추출물에서 저레벨의 활성이 있었고, 연구는 더 이상 수행되지 않았다. 따라서 항종양 또는 항암 분야에서 코코아 및 그 추출물은 유용한 것으로 간주되지 않았다; 즉, 항종양 또는 항암 분야의 선행기술은 이 분야의 연구자로 하여금 암 요법으로 코코아와 그 추출물을 적용할 수 없는 것으로 교시하고 있는 것이다.

향미제 개발 분야에서 코코아 폴리페놀류의 기여를 연구하기 위하여 많은 분석방법이 개발되었기 때문에(클래퍼튼 등, 1992) 본 발명자들은 항종양 또는 항암 분야의 지식 즉, NCI의 스크리닝 방법과는 달리 항암 스크리닝을 위하여 향미제 분야에서와 유사한 방법을 적용하기로 하였다. 그 결과 본 발명자들은 프로시아니딘류를 함유한 코코아 폴리페놀 추출물이 항암제, 항신생물제 또는 항종양제로서의 유용성이 있음을 발견하였다.

나아가, 본 발명자들은 프로시아니딘 함유 코코아 추출물 및 이로부터 얻어진 화합물이 항종양제, 항산화제, DNA 토포아이소머라제 II 억제제, 시클로-옥시게나제 및/또는 리포옥시게나제 조절제, NO(질산화물) 또는 NO-합성효소 조절제, 비-스테로이드성 항염제, 아폽토시스 조절제, 혈소판 응집 조절제, 혈액 또는 생체 글루코스 조절제, 항균제 및 산화성 DNA 손상 억제제 등의 용도가 있음을 증명하였다.

본 발명의 목적은 코코아 추출물 및/또는 그로부터의 화합물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 코코아 추출물 및/또는 그로부터의 화합물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 하기의 식을 갖는 모노머 A의 폴리머 화합물인 식 A_n및 약학적으로 허용 가능한 A_n의 염 또는 유도체(산화물도 포함)를 제공하는 것이다:

여기서 n은 최소한 하나의 말단 모노머 유니트 A와 복수개의 추가적인 모노머 유니트가 존재할 수 있도록 2 내지 18인 정수;

R은 3-(α)-OH, 3-(β)-OH, 3-(α)-O-당(糖) 또는 3-(β)-O-당;

인접 모노머 사이는 4, 6 또는 8 위치에서 결합;

X, Y 및 Z는 모노머 A, 수소 및 당로 이루어지는 군에서 선택, 단 최소한 하나의 말단 모노머에 있어서 그에 추가되는 모노머 유니트는 4위치에서 결합하고 Y=Z=수소;

당은 어떤 부위에서라도, 예컨데 에스터 본드를 통해, 페놀릭 부분(moiety)으로 선택적으로 치환.

본 발명의 또 다른 목적은 하기의 식을 갖는 모노머 A의 폴리머 화합물인 식 A_n및 약학적으로 허용 가능한 A_n의 염 또는 유도체(산화물도 포함)를 제공하는 것이다:

여기서 n은 2 내지 18, 예를 들면 3 내지 18인 정수;

R은 3-(α)-OH, 3-(β)-OH, 3-(α)-O-당 또는 3-(β)-O-당;

인접 모노머 사이는 (4→6) 또는 (4→8)에 의해 4 위치에서 결합;

X, Y 및 Z는 모노머 A, 수소 및 당로 이루어지는 군에서 선택, 단 X와 Y가 인접한 모노머라면 Z는 H 또는 당, X와 Z가 인접한 모노머라면 Y는 H 또는 당이며, 말단에 있는 두개의 모노머 중 최소한 하나에 있어서 그에 추가되는 모노머 유니트는 4위치에서 결합하고, 선택적으로 Y=Z=수소;

당은 어떤 부위에서라도, 예컨데 에스터 본드를 통해, 페놀릭 부분으로 선택적으로 치환.

본 발명의 또 다른 목적은 항산화 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 DNA 토포아이소머라제 II 활성의 억제를 증명하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 종양 또는 암의 치료방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 항암, 항종양, 항신생물(antineoplastic) 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 항균 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 시클로-옥시게나제 및/또는 리포옥시게나제 조절제 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 NO(질산화물) 또는 NO-합성효소 조절제 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 비-스테로이드성 항염제 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 혈액 또는 생체 글루코스 조절제 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 항종양, 항산화, 항균, 을 제공하는 것이다.

항종양제, 항산화제, 시클로-옥시게나제 및/또는 리포옥시게나제 조절제 또는 NO(질산화물) 또는 NO-합성효소 조절제, 비-스테로이드성 항염제 및/또는 혈액 또는 생체 글루코스 조절제 조성물을 사용한 환자의 치료방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 산화성 DNA 손상을 억제하는 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 혈소판 응집 조절을 위한 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 아폽토시스 조절을 위한 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 언급한 조성물들의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법들에 사용되거나 상기 조성물의 제조에 사용되는 키트를 제공하는 것이다.

놀랍게도 코코아 추출물 및 그로부터의 화합물이 항신생물, 항종양 또는 항암 작용, 항산화 조성, DNA 토포아이소머라제 II의 작용 억제, 항균제, 시클로-옥시게나제 및/또는 리포옥시게나제 조절제, NO 또는 NO-합성효소 조절제, 비-스테로이드성 항염제, 아폽토시스 조절제, 혈소판 응집 조절제, 혈액 또는 생체 글루코스 조절제 및 산화성 DNA 손상 억제제 등의 작용을 하는 것이 발견되었다.

따라서, 본 발명은 실질적으로 순수한 코코아 추출물 및 그로부터의 화합물을 제공한다. 상기 추출물 또는 화합물은 코코아 프로시아니딘이 다음 중에서 선택된 최소한 하나의 코코아 프로시아니딘의 폴리페놀류 처럼 코코아 프로시아니딘이 풍부한 폴리페놀류로 이루어져 있을 것이다; (-) 에피카테킨, (+) 카테킨, 프로시아니딘 B-2, 프로시아니딘 2 내지 18 올리고머, 예를 들면 3 내지 18 올리고머, 프로시아니딘 2 내지 12 또는 3 내지 12 올리고머, 바람직하게는 3 내지 12올리고머, 가장 바람직하게는 2 내지 5 또는 4 또는 12 올리고머, 프로시아니딘 B-5, 프로시아니딘 A-2 및 프로시아니딘 C-1.

본 발명은 또한 실질적으로 순수한 코코아 추출물, 그로부터의 화합물, 또는 프로시아니딘류가 풍부한 폴리페놀류 및 적당한 담체(예를 들면 약학적으로, 수의학적으로 또는 식품학 적으로 수용가능한 담체)로 이루어진 것과 같은 합성 코코아 폴리페놀류를 함유하는 항종양제, 항산화제, DNA 토포아이소머라제 II 억제제, 시클로-옥시게나제 및/또는 리포옥시게나제 조절제, NO(질산화물) 또는 NO-합성효소 조절제, 비-스테로이드성 항염제, 아폽토시스 조절제, 혈소판 응집 조절제, 혈액 또는 생체 글루코스 조절제, 항균제 및 산화성 DNA 손상 억제제 등을 제공한다. 상기 추출물 또는 그로부터의 화합물은 코코아 프로시아니딘류를 포함하고 있을 것이다. 상기 추출물 또는 그로부터의 화합물은 코코아 원두를 분말화, 탈지한 뒤 분말로부터 활성 화합물을 추출 및 정제하여 제조될 수 있다.

본 발명은 또한 항종양제, 항산화제, DNA 토포아이소머라제 II 억제제, 시클로-옥시게나제 및/또는 리포옥시게나제 조절제, NO(질산화물) 또는 NO-합성효소 조절제, 비-스테로이드성 항염제, 아폽토시스 조절제, 혈소판 응집 조절제, 혈액 또는 생체 글루코스 조절제, 항균제 및 산화성 DNA 손상 억제제 등으로 처방할 필요가 있는 환자에게 실질적으로 순수한 코코아 추출물, 그로부터의 화합물, 또는 프로시아니딘류가 풍부한 폴리페놀류 및 적당한 담체(예를 들면 약학적으로, 수의학적으로 또는 식품학 적으로 수용가능한 담체)로 이루어진 것과 같은 합성 코코아 폴리페놀류를 유효량 함유하는 조성물을 투여하는 것으로 구성되는 치료방법을 제공한다. 상기 코코아 추출물 또는 그로부터의 화합물은 코코아 프로시아니딘류일 수 있으며; 코코아 원두를 분말화, 탈지한 뒤 분말로부터 활성 화합물을 추출 및 정제하여 제조될 수 있다.

또한 본 발명은 실질적으로 순수한 코코아 추출물, 그로부터의 화합물, 또는 프로시아니딘류가 풍부한 폴리페놀류 및 적당한 담체(예를 들면 약학적으로, 수의학적으로 또는 식품학 적으로 수용가능한 담체)로 이루어진 것과 같은 합성 코코아 폴리페놀류를 함유하는 항종양제, 항산화제, DNA 토포아이소머라제 II 억제제, 시클로-옥시게나제 및/또는 리포옥시게나제 조절제, NO(질산화물) 또는 NO-합성효소 조절제, 비-스테로이드성 항염제, 아폽토시스 조절제, 혈소판 응집 조절제, 혈액 또는 생체 글루코스 조절제, 항균제 및 산화성 DNA 손상 억제제 등으로 처방할 필요가 있는 환자의 치료를 위한 키트를 제공한다.

본 발명은 도 제38A 내지 제38P 및 도 제39A 내지 39AA에 도시된 화합물을 제공하며; 4→6 및 4→8 결합이 선호된다.

본 발명은 본 발명의 화합물로 구성된 식품보존 또는 제조용 조성물 및 상기 조성물을 식품에 첨가하여 식품을 제조 또는 보존하는 방법을 포함한다.

그리고, 본 발명은 본 발명의 화합물과 적당한 담체 또는 희석제로 구성된 DNA 토포아이소머라제 II 억제제 및 상기 조성물(억제제)를 투여하는 환자의 치료방법을 제공한다.

상기 언급된 코코아 추출물을 포함하는 구체예를 널리 고려하면서, 본 발명은 본 발명의 화합물이 코코아 추출물 대용으로 또는 코코아 추출물로서 사용되는 구체예도 포함한다. 따라서, 본 발명은 코코아 추출물 및 본 발명의 화합물에 관하여 상술한 것과 유사한 키트, 방법 및 조성물에 관한 것도 포함한다.

이러한 본 발명의 목적 및 구체예들은 개시되어 있거나, 하기의 상세한 설명으로부터 명백하게 될 것이다.

도면의 간단한 설명

하기 상세한 설명은 첨부된 도면을 참조하여 더욱 상세하게 이해될 것이다.

도 1은 조(粗) 코코아 프로시아니딘류 분획물의 대표적인 겔 투과 크로마토그램;

도 2 는 비발효 코코아에서 추출된 코코아 프로시아니딘류의 분리(용출 그래프)를 보여주는 대표적인 역상 HPLC 크로마토그램;

도 2B 는 비발효 코코아에서 추출된 코코아 프로시아니딘류의 분리를 보여주는 대표적인 정상(正相) HPLC 크로마토그램;

도 3은 대표적인 프로시아니딘 구조;

도 4A-4E는 항암 또는 항신생물 작용의 스크리닝에 사용된 5개 분획물의 대표적인 HPLC 크로마토그램;

도 5 및 도 6A-6D는 코코아 추출물과 암세포인 ACHN(도 5) 및 PC-3(도 6A-6D)의 투여량-반응 상관관계 도표(분획물 생존수 대비 투여량; ㎍/mL); M&M2 F4/92, M&MA+E U12P1, M&MB+E Y192P1, M&MC+E U12P2, M&MD+E U12P2;

도 7A-7H는 코코아 프로시아니딘 A, B, C, D, E, A+B, A+E 및 A+D 분획물과 PC-3 세포주와의 전형적인 투여량-반응 상관관계 도표(분획물 생존수 대비 투여량; ㎍/mL); MM-1 A 0212P3, MM-1 B 0162P1, MM-1 C 0122P3, MM-1 D 0122P3, MM-1 E 0292P8, MM-1 A/B 0292P6, MM-1 A/E 0292P6, MM-1 A/D 0292P6;

도 8A-8H는 코코아 프로시아니딘 A, B, C, D, E, A+B, B+E 및 D+E 분획물과 KB 나소파린길/헬라 세포주와의 전형적인 투여량-반응 상관관계 도표(분획물 생존수 대비 투여량; ㎍/mL); MM-1 A 092K2, MM-1 B 0212K5, MM-1 C 0162K3, MM-1 D 0212K5, MM-1 E 0292K5, MM-1 A/B 0292K3, MM-1 B/E 0292K4, MM-1 D/E 0292K5;

도 9A-9H는 코코아 프로시아니딘 A, B, C, D, E, B+D, A+E 및 D+E 분획물과 HCT-116 세포주와의 전형적인 투여량-반응 상관관계 도표(분획물 생존수 대비 투여량; ㎍/mL); MM-1 C 0192H5, MM-1 D 0192H5, MM-1 E 0192H5, MM-1 B&D 0262H2, MM-1 A/E 0262H3, MM-1 D&E 0262H1;

도 10A-10H는 코코아 프로시아니딘 A, B, C, D, E, C+D, D+E 및 A+E 분획물과 ACHN 신장 세포주와의 전형적인 투여량-반응 상관관계 도표(분획물 생존수 대비 투여량; ㎍/mL); MM-1 A 092A5, MM-1 B 092A5, MM-1 C 0192A7, MM-1 D 0192A7, MM-1 E 0192A7, MM-1 B&D 0302A6, MM-1 C&D 0302A6, MM-1 A&E 0262A6;

도 11A-11H는 코코아 프로시아니딘 A, B, C, D, E, A+E, B+E 및 C+E 분획물과 A549 폐 세포주와의 전형적인 투여량-반응 상관관계 도표(분획물 생존수 대비 투여량; ㎍/mL); MM-1 A 019258, MM-1 B 09256, MM-1 C 019259, MM-1 D 019258, MM-1 E 019258, MM-1 A/E 026254, MM-1 B&E 030255, MM-1 C&E N6255;

도 12A-12H는 코코아 프로시아니딘 A, B, C, D, E, B+C, C+D 및 D+E 분획물과 SK-5 흑색종 세포주와의 전형적인 투여량-반응 상관관계 도표(분획물 생존수 대비 투여량; ㎍/mL); MM-1 A 0212S4, MM-1 B 0212S4, MM-1 C 0212S4, MM-1 D 0212S4, MM-1 E N32S1, MM-1 B&C N32S2, MM-1 C&D N32S3, MM-1 D&E N32S3;

도 13A-13H는 코코아 프로시아니딘 A, B, C, D, E, B+C, C+E 및 D+E 분획물과 MCF-7 유방 세포주와의 전형적인 투여량-반응 상관관계 도표(분획물 생존수 대비 투여량; ㎍/mL); MM-1 A N22M4, MM-1 B N22M4, MM-1 C N22M4, MM-1 D N22M3, MM-1 E 0302M2, MM-1 B/C 0302M4, MM-1 C&E N22M3, MM-1 D&E N22M3;

도 14는 코코아 프로시아니딘(특히 분획물 C)과 CCRF-CEM T-세로 백혈병 세포주와의 전형적인 투여량-반응 상관관계 도표(세포/mL 대비 증식일수; 빈 원은 대조군, 검은 원은 분획물 D 125㎍, 빈 역삼각형은 분획물 D 250㎍, 검은 역삼각형은 분획물 D 500㎍);

도 15A는 분획물 D+E 처리된 MCF-7 p168 유방암 세포주에 대한 XTT와 크리스탈 바이올렛의 세포독성 실험의 비교(빈 원은 XYY, 검은 원은 크리스탈 바이올렛);

도 15B는 UIT-1 코코아 유전자형에서 추출한 조 폴리페놀류를 다양한 농도로 처리한 MDA MB231 유방세포주에서 얻은 전형적인 투여량-반응 곡선(540nm 흡광도 대비 일수; 빈 원은 대조군, 검은 원은 부형제, 빈 역삼각형은 250㎍/mL, 검은 역삼각형은 100㎍/mL, 빈 사각형은 10㎍/mL; 흡광도 2.0은 판 해독기(plate reader)의 최고 한계이며, 이때는 세포수가 정확하지 않을 수 있다);

도 15C는 UIT-1 코코아 유전자형에서 추출한 조 폴리페놀류를 다양한 농도로 처리한 PC-3 전립선암 세포주에서 얻은 전형적인 투여량-반응 곡선(540nm 흡광도 대비 일수; 빈 원은 대조군, 검은 원은 부형제, 빈 역삼각형은 250㎍/mL, 검은 역삼각형은 100㎍/mL, 빈 사각형은 10㎍/mL;

도 15D는 UIT-1 코코아 유전자형에서 추출한 조 폴리페놀류를 다양한 농도로 처리한 MCF-7 p168 유방암 세포주에서 얻은 전형적인 투여량-반응 곡선(540nm 흡광도 대비 일수; 빈 원은 대조군, 검은 원은 부형제, 빈 역삼각형은 250㎍/mL, 검은 역삼각형은 100㎍/mL, 빈 사각형은 10㎍/mL; 검은 사각형은 1㎍/mL; 흡광도 2.0은 판 해독기의 최고 한계이며, 이때는 세포수가 정확하지 않을 수 있다);

도 15E는 UIT-1 코코아 유전자형에서 추출한 조 폴리페놀류를 다양한 농도로 처리한 헬라 자궁암 세포주에서 얻은 전형적인 투여량-반응 곡선(540nm 흡광도 대비 일수; 빈 원은 대조군, 검은 원은 부형제, 빈 역삼각형은 250㎍/mL, 검은 역삼각형은 100㎍/mL, 빈 사각형은 10㎍/mL; 흡광도 2.0은 판 해독기의 최고 한계이며, 이때는 세포수가 정확하지 않을 수 있다);

도 15F는 코코아 폴리페놀 분획물으로 처리한 헬라 자궁암 세포주에 대한 세포독성 효과 도표(540nm 흡광도 대비 일수; 빈 원은 분획물 A-E 100㎍/mL, 검은 원은 분획물 A-C 100㎍/mL, 빈 역삼각형은 분획물 D&E 100㎍/mL; 흡광도 2.0은 판 해독기의 최고 한계이며, 이때는 세포수가 정확하지 않을 수 있다);

도 15G는 코코아 폴리페놀 분획물 100㎍/mL으로 처리한 SKBR-3 유방암 세포주에 대한 세포독성 효과 도표(540nm 흡광도 대비 일수; 빈 원은 분획물 A-E, 검은 원은 분획물 A-C, 빈 역삼각형은 분획물 D&E);

도 15H는 코코아 프로시아니딘 분획물 D+E와 헬라 세포간의 전형적인 투여량-반응 관계 도표(540nm 흡광도 대비 일수; 빈 원은 대조군, 검은 원은 100㎍/mL, 빈 역삼각형은 75㎍/mL, 검은 역삼각형은 50㎍/mL, 빈 사각형은 25㎍/mL, 검은 사각형은 10㎍/mL; 흡광도 2.0은 판 해독기의 최고 한계이며, 이때는 세포수가 정확하지 않을 수 있다);

도 15I는 코코아 프로시아니딘 분획물 D+E와 SKBR-3 세포간의 전형적인 투여량-반응 관계 도표(540nm 흡광도 대비 일수; 빈 원은 대조군, 검은 원은 100㎍/mL, 빈 역삼각형은 75㎍/mL, 검은 역삼각형은 50㎍/mL, 빈 사각형은 25㎍/mL, 검은 사각형은 10㎍/mL);

도 15J는 소프트-아가-클로닝 분석을 이용한, 코코아 프로시아니딘 분획물 D+E와 헬라 세포간의 전형적인 투여량-반응 관계 도표(막대 그래프; 콜로니 수 대비 대조군, 1, 10, 50 및 100㎍/mL);

도 15K는 8종의 코코아 유전자형에서 획득한 조 폴리페놀 추출물로 처리했을 때 헬라 세포의 증식 억제를 도시(% 대조군 대비 농도, ㎍/mL; 빈 원은 C-1, 검은 원은 C-2, 빈 역삼각형은 C-3, 검은 역삼각형은 C-4, 빈 사각형은 C-5, 검은 사각형은 C-6, 빈 삼각형은 C-7, 검은 삼각형은 C-8; C-1=UF-12: hort 종=Trintario 이며 사용된 것은 UF-12(브라질) 코코아 폴리페놀의 조 추출물(카페인/theobromine 제거된 것); C-2=NA-33: hort 종=Forastero 이며 사용된 것은 UF-12(브라질) 코코아 폴리페놀의 조 추출물(카페인/테오브로마인 제거된 것); C-3=EEG-48: hort 종=Forastero 이며 사용된 것은 EEG-48(브라질) 코코아 폴리페놀의 조 추출물(카페인/테오브로마인 제거된 것); C-4=불명: hort 종=Forastero이며 사용된 것은 불명(서아프리카)의 코코아 폴리페놀의 조 추출물(카페인/테오브로마인 제거된 것); C-5=UF-613: hort 종=Trintario 이며 사용된 것은 UF-613(브라질) 코코아 폴리페놀의 조 추출물(카페인/theobromin 제거된 것); C-6=ICS-100: hort 종=Trintario(니카라과 Criollo 원형)이며 사용된 것은 ICS-100(브라질) 코코아 폴리페놀의 조 추출물(카페인/테오브로마인 제거된 것); C-7=ICS-139: hort 종=Trintario(니카라과 Criollo 원형)이며 사용된 것은 ICS-139(브라질) 코코아 폴리페놀의 조 추출물(카페인/테오브로마인 제거된 것); C-8=UIT-1: hort 종=Trintario이며 사용된 것은 UIT-1(말레이지아) 코코아 폴리페놀의 조 추출물(카페인/테오브로마인 제거된 것);

도 15L은 발효된 코코아 원두 및 건조 코코아 원두에서 획득한 조 폴리페놀 추출물로 처리했을 때 헬라 세포의 증식 억제를 도시(발효 및 천일건조시의 각 단계; % 대조군 대비 농도, ㎍/mL; 빈 원은 실험 개시일의 분획물, 검은 원은 1일째의 분획물, 빈 역삼각형은 2일째의 분획물, 검은 역삼각형은 3일째의 분획물, 빈 사각형은 4일째의 분획물, 검은 사각형은 9일째의 분획물);

도 15M은 헬라 세포에 대한 효소-산화처리된 코코아 프로시아니딘의 효과를 도시(폴리페놀 산화효소로 처리된 조 코코아 폴리페놀의 투여량에 대한 반응성; % 대조군 대비 농도, ㎍/mL; 검은 사각형은 카페인 및 테오브로마인이 함유된 조 UIT-1, 빈 원은 카페인 및 테오브로마인이 제거된 조 UIT-1, 검은 원은 폴리페놀 산화효소로 처리된 조 UIT-1);

도 15N은 조 코코아 분획물 D+E에 대한 대표적인 반-정제 역상 HPLC 분리를 도시;

도 15O는 조 코코아 폴리페놀 추출물에 대한 대표적인 반-정제 정상 HPLC 분리를 도시;

도 16은 합성 항산화제 BHA 및 BHT와 비교한 코코아 프로시아니딘 추출물 및 분획물에 대한 전형적인 란시맷(Rancimat) 산화 곡선(임의의 유니트 대비 시간;점선 및 교차(+)는 BHA 및 BHT; *는 D-E; x는 조추출물; 빈 사각형은 A-C; 빈 마름모는 대조군);

도 17은 키네토플라스트(kinetoplast; 運動核) DNA 연쇄사슬의 분리(decatenation)를 촉매하는 토포아이소머라제 II에 대한 코코아 프로시아니딘 분획물의 억제를 보여주는 전형적인 아가로스 겔(레인 1은 표지로서 (M) 모노머-길이 키네토플라스트 DNA 고리를 0.5㎍ 함유; 레인 2 및 20은 코코아 프로시아니딘 부재하의 4% DMSO에서 토포아이소머라제로 처리된 키네토플라스트 DNA를 함유. (대조군-C); 레인 3 및 4는 코코아 프로시아니딘 분획물 A 0.5 및 5.0㎍ 존재하에서 토포아이소머라제로 처리된 키네토플라스트 DNA를 함유; 레인 5 및 6은 코코아 프로시아니딘 분획물 B 0.5 및 5.0㎍ 존재하에서 토포아이소머라제로 처리된 키네토플라스트 DNA를 함유; 레인 7, 8, 9, 13, 14 및 15는 코코아 프로시아니딘 분획물 D 0.05, 0.5 및 5.0㎍ 존재하에서 토포아이소머라제로 처리된 키네토플라스트 DNA의 복제물; 레인 10, 11, 12, 16, 17 및 18은 코코아 프로시아니딘 분획물 E 0.05, 0.5 및 5.0㎍ 존재하에서 토포아이소머라제로 처리된 키네토플라스트 DNA의 복제물; 레인 19는 코코아 프로시아니딘 분획물 E 5.0㎍ 존재하에서 토포아이소머라제로 처리된 키네토플라스트 DNA의 복제물);

도 18은 DNA 복구능이 있는 세포주와 없는 세포주에 대한 코코아 프로시아니딘 분획물 D의 투여량-반응 상관관계도(분획물 생존수 대비 투여량; ㎍/mL; 좌측 xrs-6 DNA 복구불능 세포주, MM-1 D D282X1; 우측 BR1 DNA 복구능 세포주, MM-1 D D282B1);

EH 19는 코코아 분획물 D+E로 처리될 때 MCF-7 p168 모(母) 세포주와 비교한 아드리아마이신 내성 MCF-7 세포의 투여량-반응 곡선(% 대조군 대비 농도, ㎍/mL; 빈 원은 MCF-7 p168; 검은 원은 MCF-7 ADR);

도 20A 및 B는 반-제품 정상 HPLC로 얻은 12개의 분획물을 100㎍/mL 및 25㎍/mL 레벨으로 처리했을 때 헬라 및 SKBR-3 세포에 대한 투여량-반응 효과도(막대 그래프, % 대조군 대비 대조군 및 분획물 1-12);

도 21은 코코아 추출물로부터 농축(풍부화), 정제된 조 펜타머의 정상 HPLC 분리;

도 22A, B 및 C는 각각 프로시아니딘이 풍부한 펜타머, 분획물 A-C 및 분획물 D-E의 MALDI-TOF/MS의 도시;

도 23A는 수식(修飾) 반-제품 HPLC로 정제된 프로시아니딘 올리고머의 용출 프로필;

도 23B는 수식(修飾) 반-제품 HPLC로 정제된 프로시아니딘 트라이머의 용출 프로필;

도 24A-D는 각각 에피카테킨 구조에 기초하여 모두 (4-8) 결합한 펜타며의 에너지 최소화 구조;

도 25A는 벤질메르캅텐으로 티올분해(thiolysis)시 에피카테킨의 상대적 형광;

도 25B는 벤질메르캅텐으로 티올분해시 카테킨의 상대적 형광;

도 25C는 벤질메르캅텐으로 티올분해시 (B2 및 B5) 다이머의 상대적 형광;

도 26A는 티올분해시 다이머의 상대적 형광;

도 26B는 연속하여 티올분해 및 탈황시 B5 다이머의 상대적 형광;

도 27A는 펜타머로 처리시 처리기간 동안 MDA MB 231 누드 마우스 모델의 상대적인 종양의 부피;

도 27B는 펜타머로 처리된 MDA MB 231 누드 마우스 모델의 상대적인 생존곡선;

도 28은 무할로겐-분석적 분리에 의한 코코아 추출물로부터의 프로시아니딘의 아세톤 추출물의 용출 프로필;

도 29는 프로시아닌을 정상 HPLC에서 분리할 때 고정상(固定相; stationary phase)의 공극 크기의 효과를 도시;

도 30A는 코코아 원두의 발효동안의 기질 사용을 도시;

도 30B는 코코아 원두의 발효동안의 대사 생산을 도시;

도 30C는 코코아 원두의 발효동안의 플레이트 수를 도시;

도 30D는 코코아 원두의 발효액 중의 각 성분의 상대적 농도를 도시;

도 31은 NO-관련 페닐에프린으로 사전 수축된 래트(rat) 대동맥의 아세틸콜린-유도 확장을 도시;

도 32는 여러 실험 혼합물로부터의 혈당 내성(tolerance) 프로필;

도 33A 및 B는 COX-1 및 COX-2 활성에 대한 인도메타신(indomethacin)의 효과를 도시;

도 34A 및 B는 중합도 및 IC₅₀대비 COX-1/COX-2(μM)의 상관성을 도시;

도 35는 μM로 표시한 COX-1 및 COX-2 활성에 대한 화합물의 효과 사이의 상관성을 도시;

도 36A-V는 COX-1/COX-2와 프로시아니딘을 함유하는 샘플의 IC₅₀값(μM)을 도시;

도 37은 코코아에서 프로시아닌을 분리하기 위한 정제의 개요를 도시;

도 38A-P는 펜타머의 바람직한 구조를 도시;

도 39A-AA는 펜타머의 입체이성질체 라이브러리를 도시;

도 40A 및 B는 각각 UV 및 형광으로 검출된 프로시아니딘의 정상 HPLC 분리를 위한 70분 간의 농도구배를 도시;

도 41A 및 B는 각각 UV 및 형광으로 검출된 프로시아니딘의 정상 HPLC 분리를 위한 30분 간의 농도구배를 도시;

도 42는 프로시아니딘을 분리하는 정상 HPLC의 준비를 도시;

도 43A-G는 각각 프로시아니딘의 다이머, 프리머, 테트라머, 펜타머, 헥사머, 헵타머 및 옥타머의 CD(circular dichroism; 원형 2색성) 스펙트럼을 도시;

도 44A는 에피카테킨의 구조 및¹H/¹³C NMR 데이터를 도시;

도 44B-F는 에피카테킨의 APT, COSY, XHCORR,¹H 및¹³C NMR 스펙트럼을 도시;

도 45A는 카테킨의 구조 및¹H/¹³C NMR 데이터를 도시;

도 45B-E는 카테킨의¹H, APT, XHCORR, 및 COSY NMR 스펙트럼을 도시;

도 46A는 B2 다이머의 구조 및¹H/¹³C NMR 데이터를 도시;

도 46B-G는 B2 다이머의¹³C, APT,¹H, HMQC, COSY 및 HOHAHA NMR 스펙트럼을 도시;

도 47A는 B5 다이머의 구조 및¹H/¹³C NMR 데이터를 도시;

도 47B-G는 B5 다이머의¹H,¹³C, APT, COSY, HMQC 및 HOHAHA NMR 스펙트럼을 도시;

도 48A-D는 에피카테킨/카테킨 트라이머의¹H, COSY, HMQC 및 HOHAHA NMR 스펙트럼을 도시;

도 49A-D는 에피카테킨 트라이머의¹H, COSY, HMQC 및 HOHAHA NMR 스펙트럼을 도시;

도 50A 및 B는 혈압에 대한 코코아 프로시아니딘 분획물 A 및 C의 효과를 도시; 분획물 A는 투여 후 1분 이내에 혈압 레벨은 21.43%로 감소하였으며, 15분 후에 정상으로 회복된 반면, 분획물 C는 투여 후 1분 이내에 혈압 레벨은 50.5%로 감소하였으며, 5분 후에 정상으로 회복됨;

도 51은 마취된 기니아 피그의 동맥혈압에 대한 코코아 프로시아니딘 분획물의 효과를 도시;

도 52는 마취된 기니아 피그에서 코코아 프로시아니딘 분획물 C에 의한 동맥혈압의 변화에 대한 L-NMMA의 효과를 도시;

도 53은 HUVEC의 NO 생성에 대한 브라디키닌(bradykinin)의 효과를 도시;

도 54는 HUVEC의 마크로파지 NO 생성에 대한 코코아 프로시아니딘 분획물의 효과를 도시;

도 55는 마크로파지 NO 생성에 대한 코코아 프로시아니딘 분획물의 효과를 도시;

도 56은 LPS 및 감마-인터페론으로 유도되는 마크로파지 NO 생성에 대한 코코아 프로시아니딘 분획물의 효과를 도시;

도 57은 미셀-동전기적-모세관(micellar electrokinetic capillary) 크로마토그래피에 의한 코코아 프로시아니딘 올리고머의 분리를 도시;

도 58A-F는 각각 Cu⁺²-, Zn⁺²-, Fe⁺²-, Fe⁺³-, Ca⁺²- 및 Mg⁺²-이온이 결합한 트라이머의 MALDI-TOF 메스 스펙트럼을 도시;

도 59는 코코아 프로시아니딘 올리고머(테트라머 내지 옥타데카머)의 MALDI-TOF 메스 스펙트럼을 도시;

도 60은 코코아 프로시아니딘 올리고머와 백혈병 바이러스를 생산하는 고양이 FeA 임파구성(lymphablastoid) 세포주 사이의 투여량-반응 관계를 도시;

도 61은 코코아 프로시아니딘 올리고머와 백혈병 바이러스를 생산하는 고양이 CRFK 정상 신장 세포주 사이의 투여량-반응 관계를 도시;

도 62는 코코아 프로시아니딘 올리고머와 백혈병 바이러스를 생산하는 개 MDCK 정상 신장 세포주 사이의 투여량-반응 관계를 도시;

도 63은 코코아 프로시아니딘 올리고머와 백혈병 바이러스를 생산하는 개 GH 정상 신장 세포주 사이의 투여량-반응 관계를 도시;

도 64는 헥사머 가수분해에 대한 시간-온도 효과를 도시;

도 65는 트라이머 가수분해에 대한 시간-온도 효과를 도시.

상세한 설명

본 발명의 화합물

상술한 바와 같이 코코아 추출물 또는 그로부터 유도된 화합물들이 항암, 항종양, 항신생물 또는 항산화 작용을 나타내고, DNA 토포아이소머라제 II 및 산화성 DNA 손상을 막으며, 항균, 시클로-옥시게나제 및/또는 리포옥시게나제 조절, NO(질산화물) 또는 NO-합성효소 조절, 아폽토시스 조절, 혈소판 응집 조절, 혈액 또는 생체 글루코스 조절활성을 가지며 비-스테로이드성 항염제로서도 약리활성이 있음이 밝혀졌다.

추출물, 또는 그로부터 유도된 화합물 또는 화합물의 조합물은 일반적으로 코코아 원두를 분쇄하여 분말화, 분말을 탈지하고 탈지 분말에서 활성 화합물을 추출 및 정제하여 얻으진다. 상기 분말은 코코아 원두를 동결건조하고 건조된 원두를 펄핑(pulping), 디펄핑(depulping) 및 디헐링(dehulling)하고 디헐링된 원두를 분쇄함으로써 제조될 수 있다. 활성 화합물은 용매추출법으로 추출될 수 있다. 활성물질을 함유하는 추출물은 예를 들면 겔 투과 크로마토그래피 또는 HPLC법 또는 이들의 조합물에 의해 실질적으로 순수하게 정제될 수 있다.

코코아에서 유도된 본 발명의 화합물의 분리 및 정제에 관련하여 테오브로마(Theobroma), 헤라니아(Herrania) 속(屬)의 어떤 종(種) 또는 이들의 이종(異種)간 및 동종(同種)간의 잡종의 어느 것이라도 적용될 수 있다. 이러한 측면에서, 슐츠의 "Synopsis of Herrania" (J. Arnold Arboretum, Vol. 39, pp. 217-278, plus plates I to XVII, 1985), 커트리가사스의 "Cocoa and Its Allies, A Taxonomic Revision of the Genus Theobroma" (Bulletin fo the USNM, Vol. 35, part 6, pp. 379-613, plus plstes 1 to 11, Smithsonian Institution, 1964) 및 아디슨 등의 "Obsorvation on the Species of the Genus Theobroma Which Occurs in the Amazon"(Bol. Tech. Inst. Agronomico de Nortes, 25(3), 1951) 등이 인용문헌으로 된다.

또한 실시예 25는 종래 전혀 관심의 대상이 되지 않았던 테오브로마, 헤라니아 속(屬)의 어떤 종(種) 또는 이들의 이종(異種)간 및 동종(同種)간의 잡종에서 발견된 본 발명의 화합물을 기재한다; 그리고 실시예 25는 또한 코코아 발효조건을 조절함으로써 코코아로부터 얻을 수 있는 본 발명의 화합물의 수량을 조절하는 방법을 기술한다.

실질적으로 순수한 프로시아니딘의 분리에 이용되는 정제방법의 개요가 도 37에 도시된다. 상기 정제방법의 단계 1, 2는 실시예 1, 2에; 단계 3, 4는 실시예 3, 13, 23에; 단계 5는 실시예 4, 14에; 단계 6은 실시예 4, 14, 16에 각각 기술된다. 당 분야의 전문가라면 도 37에 도시된 정제방법의 개요로부터 도는 본 발명의 주제나 범위를 벗어나지 않고 또한 과도한 실험 없이 도 37에 도시된 정제방법의 개요를 변형시킴으로써 상기 활성 화합물을 얻을 수 있을 것이다.

활성을 가진 추출물, 그로부터 유도된 화합물 및 화합물의 조합물은 어떤 특별한 이론에 기댈 것 없이 프로시아니딘류 등과 같은 코코아 폴리페놀류인 것으로 동정되었다. 이들 코코아 프로시아니딘류는 뛰어난 항암, 항종양, 항신생물 활성; 항산화 활성; DNA 토포아이소머라제 II 및 산화성 DNA 손상 방지; 항균 활성; 시클로-옥시게나제 및/또는 리포옥시게나제, NO 또는 NO-합성효소, 아폽토시스, 혈소판 응집, 혈액 또는 생체 글루코스 조절능력 등을 가지며비-스테로이드성 항염제로서도 약리활성도 가지고 있다.

본 발명은 다음식의 화합물을 제공한다:

여기서 n은 첫번째 모노머 유니트 A와 복수개의 다른 모노머 유니트가 존재할 수 있도록 2 내지 18, 예를 들면 3 내지 12인 정수;

R은 3-(α)-OH, 3-(β)-OH, 3-(α)-O-당 또는 3-(β)-O-당;

4 위치는 알파 또는 베타 입체이성질;

첫 번째 모노머 유니트에 있어서 그에 결합하는 다른 모노머 유니트는 4 위치이고 Y=Z=수소인 조건하에서 X, Y 및 Z는 모노머 유니트 사이의 결합 위치를 나타내며; X, Y 및 Z가 모노머 유니트 사이의 결합 위치가 아닐 때 X, Y 및 Z는 수소이거나, Y, Z는 당이고 X는 수소이거나, 또는 X는 알파 또는 베타 당이고 Y, Z는 수소, 또는 그들의 조합물이다. 상기 화합물에서 n은 5 내지 12일 수 있으며, 바람직하기로는 5일 수 있다. 상기 당은 글루코스, 갈락토스, 자일로스, 람노스 및 아라비노스로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. R, X, Y 및 Z 중의 어느 하나의 당 또는 이들 모두의 당은 에스터 본드를 통해, 페놀릭 부분으로 선택적으로 치환될 수 있다.

따라서 본 발명은 다음 식의 화합물을 제공할 수 있다:

여기서 n은 다음과 같은 첫 번째 모노머 유니트 A 및 복수개의 또 다른 A 모노머 유니트가 존재하도록, 2 내지 18인 정수, 예를 들면 3 내지 12, 유익하게는 5 내지 12, 바람직하게는 5;

R은 3-(α)-OH, 3-(β)-OH, 3-(α)-O-당 또는 3-(β)-O-당;

4 위치는 알파 또는 베타 입체이성질;

첫 번째 모노머 유니트에 있어서 그에 결합하는 다른 모노머 유니트는 4 위치이고 Y=Z=수소인 조건하에서 X, Y 및 Z는 모노머 유니트 사이의 결합 위치를 나타내며; X, Y 및 Z가 모노머 유니트 사이의 결합 위치가 아닐 때 X, Y 및 Z는 수소이거나, Y, Z는 당이고 X는 수소이거나, 또는 X는 알파 또는 베타 당이고 Y, Z는 수소, 또는 그들의 조합물;

상기 당은 에스터 본드를 통해, 페놀릭 부분으로 선택적으로 치환될 수 있다.

따라서 본 발명은 A가 다음 식인 모노머인 식 A_n폴리머 화합물 및 약학적으로 허용 가능한 A_n의 염 또는 유도체(산화물도 포함)을 제공한다:

여기서 n은 최소한 하나의 말단 모노머 유니트 A와 복수개의 추가적인 모노머 유니트가 존재할 수 있도록 2 내지 18인 정수;

R은 3-(α)-OH, 3-(β)-OH, 3-(α)-O-당 또는 3-(β)-O-당;

인접 모노머 사이는 4, 6 또는 8 위치에서 결합;

X, Y 및 Z는 모노머 A, 수소 및 당로 이루어지는 군에서 선택, 단 최소한 하나의 말단 모노머에 있어서 그에 추가되는 모노머 유니트(즉, 말단 모노머 유니트에 인접한 모노머 유니트의 결합)는 4위치에서 결합하고, 선택적으로 Y=Z=수소;

당은 어떤 부위에서라도, 예컨데 에스터 본드를 통해, 페놀릭 부분으로 선택적으로 치환.

바람직한 실시예에서 n은 3 내지 18, 2 내지 12 예컨데 5 내지 12가 될 수 있으며; 유리하게는 n은 5이다. 상기 당은 글루코스, 갈락토스, 자일로스, 람노스 및 아라비노스로 이루어진 군에서 선택된다. R, X, Y 및 Z 중의 어느 하나의 당 또는 이들 모두의 당은 에스터 본드를 통해, 페놀릭 부분으로 선택적으로 치환될 수 있다. 페놀릭 부분은 카페인산, 코우마린산, 페룰린산, 갈린산, 하이드로벤조산 및 시나핀산으로 이루어진 군에서 선택된다.

또한 본 발명은 A가 다음 식인 모노머인 식 A_n폴리머 화합물 및 약학적으로 허용 가능한 A_n의 염 또는 유도체(산화물도 포함)을 제공한다:

여기서 n은 2 내지 18인 정수, 예를 들면 3 내지 18, 유익하게는 3 내지 12 예를들면 5 내지 12, 바람직하게는 5;

R은 3-(α)-OH, 3-(β)-OH, 3-(α)-O-당 또는 3-(β)-O-당;

인접 모노머 사이는 (4→6) 또는 (4→8)에 의해 4 위치에서 결합;

X와 Y가 인접한 모노머일 때 Z는 H 또는 당이며, X와 Z가 인접한 모노머일 때 Y는 H 또는 당인 조건과; 두 개의 말단 모노머 중 하나 이상에 있어서 인접한 모노머는 4 위치에서 결합하는 조건;하에서 X, Y 및 Z는 H, 당 또는 인접한 모노머이며, 선택적으로 Y=Z=수소;

4 위치의 결합은 알파 또는 베타 입체이성질;

당은 에스터 본드를 통해, 페놀릭 부분으로 선택적으로 치환.

"최소한 하나의 말단 모노머 유니트 A"라는 표현과 관련하여, 본 발명은 두 개의 말단 모노머 유니트를 가지며, 두 개의 말단 모노머 유니트 A는 같거나 다를 수 있음을 알게 될 것이다. 또한 "최소한 하나의 말단 모노머 유니트 A"라는 표현은 말단 모노머 유니트 A가 "첫번째 모노머 유니트"로 지칭되는 실시예를 포함하며, 이때 "첫번째 모노머 유니트"란 그 모노머에 다른 모노머 유니트가 추가로 결합하여 식 A_n인 폴리머 화합물을 이루게 되는 모노머를 말하는 것이라는는 사실도 알게 될 것이다. 나아가 두 개의 말단 모노머 중 하나 이상에 있어서 인접한 모노머는 4 위치에서 결합하며, 선택적으로 Y=Z=수소이다.

"그들의 조합물"이라는 용에에 관하여, 예를 들면 하나 이상의 본 발명 화합물로 이루어진 조성물로 처방될 필요가 있는 대상에 투여되는 것 처럼, 하나 이상의 본 발명 화합물이 동시에 사용될 수도 있다는 것을 이해하게 될 것이다.

본 발명의 화합물 또는 그들의 조합물은 상술한 코코아 추출물이 갖는 유용성을 나타내며; 본 명세서 전반에 걸쳐 "코코아 추출물"이란 용어는 본 발명의 화합물 또는 그들의 조합물이라 표현될 수도 있으므로 본 발명의 화합물 또는 그들의 조합물은 코코아 추출물과 동일한 의미가 될 수 있음을 알게 될 것이다.

여기에서 사용된 "올리고머"란 용어는 n이 2 내지 18인 상술한 화학식중 어느 화합물 또는 그들의 조합물을 말단다. n이 2이면 "다이머"; n이 3이면 "트라이머"; n이 4이면 "테트라머"; n이 5이면 "펜타머"이며; n이 18인 "옥타데카머"도 올리고머라 칭할 수도 있다.

본 발명의 화합물 또는 그들의 조합물은 예를 들면 테오브로마, 헤라니아 속의 어느 종 또는 이들의 이종 또는 동종간의 잡종과 같이 천연 원료로부터 분리될 수 있거나; 본 발명의 화합물 또는 그들의 조합물은 예를 들면 실질적으로 순수하도록 정제될 수 있으며; 예를 들면 명백히 동질적인 것으로정제될 수 있다. 순수도는 상대적인 개념이며, 많은 실시예들이 본 발명의 화합물 또는 그들의 조합물의 분리·정제를 설명하고 있기 때문에 당 분야의 전문가라면 제시된 방법에 다라 실질적으로 순수한 본 발명의 화합물 또는 그들의 조합물을 획득하거나 그들을 실질적으로 동질적인 것으로 정제할 수 있다(예를 들면 크로마토그래히 피크를 분리, 구분하여 정제). 실시예(예컨데 실시예 37)를 고려하면, 실질적으로 순수한 화합물 또는 그들의 조합물은 최소한 약 40%(예컨데 최소한 약 50%)의 순도, 유익하게는 최소한 약 60%(예컨데 최소한 약 70%)의 순도, 더욱 유익하게는 최소한 75-80%의 순도, 바람직하게는 최소한 약 90%의 순도, 더욱 바람직하게는 90% 이상(예컨데 최소한 90-95% )의 순도, 또는 그 이상 즉, 95%(예컨데 95-98%)의 순도이다.

나아가 여기서 사용된 올리고머를 구성하는 모노머 유니트로는 (+)-카테킨(약자로 C)과 (-)-에피카테킨(약자로 EC)이 있다. 인접 모노머간은 4위치에서 6위치로 또는 4위치에서 8위치로 연결되며; 한 모노머의 4위치와 인접 모노머 유니트의 6 또는 8위치의 결합은 (4→6) 또는 (4→8)로 표시된다. 한 모노머의 4위치와 인접 모노머 유니트의 6 및 8위치 사이에서는 4종류의 구조화학적(sterochemical) 결합이 가능하며; 모노머 유니트 사이의 구조화학적 결합은 각각 (4α→6), (4β→6), (4α→8) 또는 (4β→8)로 표시된다. C가 다른 C나 EC에 결합된 경우 그 결합은 (4α→6) 또는 (4α→8)로 나타낸다. EC가 다른 C나 EC에 결합된 경우 그 결합은 (4β→6) 또는 (4β→8)로 나타낸다.

상기에서 언급한 활성을 나타내는 화합물로서 다이머는 EC-(4β→8)-EC와 EC-(4β→6)-EC가 있고, 이때 EC-(4β→8)-EC가 바람직하며; 트라이머는 [EC-(4β→8)]₂-EC, [EC-(4β→8)]₂-C와 [EC-(4β→6)]₂-EC가 있고, 이때 [EC-(4β→8)]₂-EC가 바람직하며; 테트라머는 [EC-(4β→8)]₃-EC, [EC-(4β→8)]₃-C와 [EC-(4β→8)]₃-C, [EC-(4β→8)]₂-EC-(4β→6)-C가 있고, 이때 [EC-(4β→8)]₃-EC가 바람직하고; 펜타머는 [EC-(4β→8)]₄-EC, [EC-(4β→8)]₃-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₃-EC-(4β→8)-C와 [EC-(4β→8)]₃-EC-(4β→6)-C가 있고, 이때 펜타머의 말단 모노머 유니트의 3-위치는 선택적으로 갈레이트(gallate) 또는 β-D-글루코스으로 치환되며, [EC-(4β→8)]₄-EC가 바람직하다.

또한 상술한 활성을 나타내는 화합물은 헥사머부너 도데카머까지를 포함하며, 이들의 예는 다음과 같다:

헥사머로서, 다른 EC 또는 C에 결합된 EC의 경우 (4β→8) 또는 (4β→6)결합을, 다른 C 또는 EC에 결합된 C의 경우 (4α→8) 또는 (4α→6)결합을 가진 하나의 모노머(C 또는 EC)에; 상기 기재된 펜타머 화합물이 (4β→8)결합으로 연결된 것, 예컨데 [EC-(4β→8)]₅-EC, [EC-(4β→8)]₄-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₄-EC-(4β→8)-C와 [EC-(4β→8)]₄-EC-(4β→6)-C, 여기서 헥사머 말단 모노모 유니트의 3-위치는 선택적으로 갈레이트 또는 β-D-글루코스으로 치환되며, [EC-(4β→8)]₅-EC가 바람직하고;

헵타머로서, 다른 EC 또는 C에 결합된 EC의 경우 (4β→8) 또는 (4β→6)결합을, 다른 C 또는 EC에 결합된 C의 경우 (4α→8) 또는 (4α→6)결합을 가진 두 모노머(C 및/또는 EC)의 임의의 조합물에; 상기 기재된 펜타머 화합물이 (4β→8)결합으로 연결된 것, 예컨데 [EC-(4β→8)]₆-EC, [EC-(4β→8)]₅-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₅-EC-(4β→8)-C와 [EC-(4β→8)]₅-EC-(4β→6)-C, 여기서 헵타머 말단 모노모 유니트의 3-위치는 선택적으로 갈레이트 또는 β-D-글루코스으로 치환되며, [EC-(4β→8)]₆-EC가 바람직하고;

옥타머로서, 다른 EC 또는 C에 결합된 EC의 경우 (4β→8) 또는 (4β→6)결합을, 다른 C 또는 EC에 결합된 C의 경우 (4α→8) 또는 (4α→6)결합을 가진 세개 모노머(C 및/또는 EC)의 임의의 조합물에; 상기 기재된 펜타머 화합물이 (4β→8)결합으로 연결된 것, 예컨데 [EC-(4β→8)]₇-EC, [EC-(4β→8)]₆-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₆-EC-(4β→8)-C와 [EC-(4β→8)]₆-EC-(4β→6)-C, 여기서 옥타머 말단 모노모 유니트의 3-위치는 선택적으로 갈레이트 또는 β-D-글루코스으로 치환되며, [EC-(4β→8)]₇-EC가 바람직하고;

노나머로서, 다른 EC 또는 C에 결합된 EC의 경우 (4β→8) 또는 (4β→6)결합을, 다른 C 또는 EC에 결합된 C의 경우 (4α→8) 또는 (4α→6)결합을 가진 네개 모노머(C 및/또는 EC)의 임의의 조합물에; 상기 기재된 펜타머 화합물이 (4β→8)결합으로 연결된 것, 예컨데 [EC-(4β→8)]₈-EC, [EC-(4β→8)]₇-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₇-EC-(4β→8)-C와 [EC-(4β→8)]₇-EC-(4β→6)-C, 여기서 옥타머 말단 모노모 유니트의 3-위치는 선택적으로 갈레이트 또는 β-D-글루코스으로 치환되며, [EC-(4β→8)]₈-EC가 바람직하고;

데카머로서, 다른 EC 또는 C에 결합된 EC의 경우 (4β→8) 또는 (4β→6)결합을, 다른 C 또는 EC에 결합된 C의 경우 (4α→8) 또는 (4α→6)결합을 가진 다섯개 모노머(C 및/또는 EC)의 임의의 조합물에; 상기 기재된 펜타머 화합물이 (4β→8)결합으로 연결된 것, 예컨데 [EC-(4β→8)]₉-EC, [EC-(4β→8)]₈-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₈-EC-(4β→8)-C와 [EC-(4β→8)]₈-EC-(4β→6)-C, 여기서 옥타머 말단 모노모 유니트의 3-위치는 선택적으로 갈레이트 또는 β-D-글루코스으로 치환되며, [EC-(4β→8)]₉-EC가 바람직하고;

운데카머로서, 다른 EC 또는 C에 결합된 EC의 경우 (4β→8) 또는 (4β→6)결합을, 다른 C 또는 EC에 결합된 C의 경우 (4α→8) 또는 (4α→6)결합을 가진 여섯개 모노머(C 및/또는 EC)의 임의의 조합물에; 상기 기재된 펜타머 화합물이 (4β→8)결합으로 연결된 것, 예컨데 [EC-(4β→8)]₁₀-EC, [EC-(4β→8)]₉-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₉-EC-(4β→8)-C와 [EC-(4β→8)]₉-EC-(4β→6)-C, 여기서 옥타머 말단 모노모 유니트의 3-위치는 선택적으로 갈레이트 또는 β-D-글루코스으로 치환되며, [EC-(4β→8)]₁₀-EC가 바람직하고;

도데카머로서, 다른 EC 또는 C에 결합된 EC의 경우 (4β→8) 또는 (4β→6)결합을, 다른 C 또는 EC에 결합된 C의 경우 (4α→8) 또는 (4α→6)결합을 가진 일곱개 모노머(C 및/또는 EC)의 임의의 조합물에; 상기 기재된 펜타머 화합물이 (4β→8)결합으로 연결된 것, 예컨데 [EC-(4β→8)]₁₁-EC, [EC-(4β→8)]₁₀-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₁₀-EC-(4β→8)-C와 [EC-(4β→8)]₁₀-EC-(4β→6)-C, 여기서 옥타머 말단 모노모 유니트의 3-위치는 선택적으로 갈레이트 또는 β-D-글루코스으로 치환되며, [EC-(4β→8)]₁₁-EC가 바람직하다.

본 발명의 상세한 설명으로부터, 상기 언급된 것들은 예시적이며 본 발명의 화합물의 몇 가지를 무제한적으로 설명하기 위해 제공된 것이며, 본 발명에 의해 가능한 본 발명의 화합물의 범위를 제한하는 것이 아니라는 사실을 이해하게 될 것이다.

실시예 3A, 3B, 4, 14, 23, 24, 30 및 34는 본 발명의 화합물을 분리하는 방법을 기술한다. 실시예 13, 14A-D 및 16은 본 발명의 화합물을 정제하는 방법을 기술한다. 실시예 5, 15, 18, 19, 10 및 29는 본 발명의 화합물을 동정(identification)하는 방법을 기술한다. 도 38A-P 및 39A-AA는 본 발명의 대표적인 펜타머의 구조화학적 라이브러리를 도시한다. 실시예 17은 본 발명의 화합물의 분자모델 방법을 기술한다. 실시예 36은 코코아에 n이 13 내지 18인 고중합 올리고머의 존재에 대한 증거를 제공한다.

나아가 본 발명이 바람직하게는 코코아 프로시아니딘류를 포함하는 코코아 추출물에 관하여 기술되어 있지만, 이 개시로부터 숙달된 유기화학자라면 이들 활성 화합물을 합성방법을 통해 획득 및/또는 제조할 수 있음을 인정하고 구상할 수 있을 것이다. 따라서 본 발명은 합성 코코아 폴리페놀류 또는 프로시아니딘류 또는 이들의 유도체 및/또는 글리코시드, 갈레이트, 에스테르 등(이것에 제한되는 것은 아님)을 포함하는 이들의 합성 전구물질을 포함한다. 즉, 본 발명의 화합물은 코코아 또는 테오브로마 또는 헤라니아 속의 종으로부터 뿐 아니라 합성법으로서도 제조될 수 있고; 글리코시드, 갈레이트, 에스테르 등 본 발명 화합물의 유도체 및 합성 전구물질은 본 발명의 화합물에 해당된다. 유도체들은 또는 상기 식에서 당 또는 갈레이트 부분이 말단 모노머의 Y 또는 Z위치에 존재하거나, 치환된 당 또는 갈레이트 부분이 말단 모노머의 Y 또는 Z위치에 존재하는 화합물을 포함한다.

예를 들면, 실시예 8의 방법 C는 어떤 암세포주에 대한 세포독성을 개선시키기 위하여 본 발명 화합물 또는 이들 조합물을 코코아 효소로 산화시키는 것을 기술한다(도 15M 참조). 본 발명은, 반응속도적, 열동력학적 요소들을 고려한다면, 본 발명 화합물을 효소적으로 수식(修飾)(예, 화학적으로 중요한 부분의 절단 또는 부가)하는 능력, 예를 들면 폴리페놀 산화효소, 퍼옥시다제, 카탈라제 조합물 및/또는 가수분해효소, 에스터라제, 환원효소, 트란스퍼라제 등과 이들의 조합물을 사용한 효소적 처리를 포함한다.

본 발명 화합물의 합성에 관련하여, 숙련자는 과도한 실험없이 본 명세서의 개시에 기초하여 , 예컨데 모노머 뿐 아니라 폴리머 화합물을 주의 깊게 역합성 분석한다면, 또 다른 합성방법을 기획할 수 있게 될 것이다. 예를 들면 본 발명화합물의 페놀적 특성이 주어지면, 숙련자는 유기금속 첨가법, 페놀 커플링 및 광화학 반응을 조합물하여 다양한 선택적 보호/비보호 방법을 활용할 수 있다. 예를 들면 유기합성 화학분야에서 널리 알려진 표준 반응과 함께 수렴적, 선형적 또는 생물모방적 접근, 또는 이들의 조합물하는 방법처럼 과도한 실험 없이 본 발명 화합물을 합성법으로 제조할 수 있다. 이러한 측면에서 W. 카루터스의 "Some Mordern Methods of Organic Synthesis" (3판, 켐브리지 대학 출판, 1986), J. 마치의 "Adbanced Organic Chemistry" (3판, 존윌리&썬, 1985), 반 렌스버그 등의 (Zyma SA) EP 0096 007 및 하기 '인용부'상의 문헌 등을 참조할 수 있으며, 이들은 본 명세서에서 인용문헌으로 포함된다.

본 발명 화합물의 이용성

본 발명 화합물에 관련하여, 본 발명 화합물인 다음과 같은 다양한 병증의 치료에 대한 폭넓은 적용성을 갖는 등 놀랄만한 특징적 활성을 가짐이 발견되었다.

COX/LOX-연관된 이용성

가장 많은 심장혈관계 질병인 아테롬성 동맥경화증은 심장마비, 심장발작 및 순환계 문제의 주원인이다. 아테롬성 동맥경화증는 많은 세포 종류과 생화학적 반응 및 부분적 요소 등이 관여된 복잡한 질병이다. 이 질병, 질병의 상태 및 병의 진행 등에는, 저밀도 리포프로틴(LDL) 산화, 시이클로-옥시게나제(COX)/리폭시나제(LOX) 생화학 및 질산화물(NO) 생화학의 상호 의존적인 결과에 따라 구분되는 여러 측면이 있다.

임상연구에 의하면 LDL의 혈장농도가 증가하면 아테롬 발생이 빨라진다는 것이 명백히 알려졌다. 아테롬성 동맥경화 부위에 침적된 콜레스테롤은 주로 LDL을 포함하는 혈장 리포프로틴이다. LDL의 산화는 아테롬 형성의 개시에 결정이며, 수퍼옥사이드 음이온 라디칼(O₂·-)의 생성증가와 관련있다. O₂·- 또는 다른 반응성 물질(예, ·OH, 0N00·-, 지질 퍼옥시 라디칼, 구리이온, 및 금속을 베이스로 한 단백질)에 의한 LDL의 산화는 수용체를 매개로 한 세포의 세포흡입작용(endocytosis)에 대한 LDL의 친화도를 감소시킨다. 산화된 LDL은 마크로파지에 의해 빠르게 흡입되며, 마크로파지는 발병 초기의 아테롬성 동맥경화 부위에서 발견되는 "거품 세포(foam cell)"와 매우 유사한 세포로 변형된다.

산화 리포프로틴은 또한 LDL 입자내의 지질 하이드로퍼옥사이드가 형성됨으로써 혈관을 손상시킨다. 혈관의 손상은 불포화 LDL 지질의 연쇄 라디칼 산화반응을 촉발시키고, 따라서 마크로파지 흡입(incorporation)에 대한 산화 LDL을 더욱 생성하게 된다.

이러한 과정을 통해 산화 LDL로 가득찬 거품세포가 집중적으로 축적되면 초기 "지방층(fatty streak)" 손상이 발생하며, 이 손상은 결국 심장질환( 또는 관상동맥증; coronary)을 유발하는 아테롬성 동맥경화의 복잡한 손상으로 발전한다.

진 막스가 일반화하여 검토(사이언스, Vol. 265, p. 320, 1994. 7. 15.)한 바와 같이, 미국에서는 일년에 33만명의 환자가 심각한 아테롬성 플라크(아테롬성 동맥경화)에 의해 폐색된 혈관(예, 심장동맥)을 확장하는 심장 및/또는 말초혈관 안지오플라스티(angioplasty) 수술로 혈류를 정상화시키고 있다. 환자들 대부분에 있어서 이 수술은 의도한 효과를 나타낸다. 그러나 환자의 약 33%(어쩌면 그 이상)에서는 처치된 동맥이 빠르게 폐색되는 레스테노시스(restenosis)가 발달한다. 이 환자들은 안지오플라스티 수술 전보다 좋아지지 않고, 심지어는 더욱 악화되기도 한다. 혈관벽에서 평활근세포(smooth muscle cells; SMC)의 과도한 증식은 레스테노시스를 유발한다. 손상된 SMC에서의 산화 LDL의 증가된 축척은 레스테노시스와 유사한 아테롬성 동맥경화-유사성 과정을 유발할 수도 있다. 이에 관한 조우 등의 "Association Between Prior Cytomegalovirus Infection And The Risk Of Restenosis After Coronary Aterectomy"(뉴 잉글랜드 저널 오브 메디신, 335:624-630, 1996. 8. 29.) 및 그곳에 인용된 문헌들이 모두 본 명세서에 인용문헌으로 포함된다. 따라서 아테롬성 동맥경화와 관련하여 본 발명의 유용성은 레스테노시스에 적용할 수 있다.

시클로-옥시게나제(COX;프로스타글란딩 엔도퍼옥사이드 신타제)에 대한 본 발명 화합물의 억제작용과 관련하여, COX는 많은 생리학적 과정에 관여하는 프로스타글란딘 및 다른 아라키돈산 대사물(즉, 에이코사노이드)의 생성에 중심적인 효소임이 알려졌다. COX-1이 많은 조직에서 발현되는 구성효소(constitutive enzyme)인데 반하여, 이것의 이소형(isoform)인 COX-2는 다양한 사이토키닌, 호르몬 및 종양 프로모터에 의해 유도된다. COX-1은 혈소판 응집에 관여하며, 따라서 아테롬성 동맥경화의 진행에 관여하는 크롬복산(thromboxane) A2를 생산한다. 이것을 막는 것이 심장혈관계 질병을 예방하는 기초원리가 된다.

COX-1과 COX-2의 활성은 아스피린과 다른 비스테로이드성 항염제(NSAID)에 의해 억제되며, NSAID의 위에 대한 부작용은 COX-1과 관련된 것으로 생각된다. 나아가, 정기적으로 NSAID를 복용하는 환자는 이러한 약을 복용하지 않는 환자에 비하여 수축성 콜로렉트 암(colorectal cancer)에 대한 위험이 40-50% 낮으며; COX-2 mRNA 레벨이 인간 콜로렉트 선암(腺癌)의 86%로 크게 증가된다는 사실이 알려졌다.

COX-2가 발현되는 세표계의 중요한 특징중의 하나는 아폽토시스(apoptosis)의 조절(즉, 진행된 세포를 죽임)에 참여하는 유전자들의 발현이 강화되었다는 점이다. 몇몇 NSAID는 세포의 괴사 증가 및 닭의 배(胚) 섬유아세포에서의 아폽토시시의 유도를 증가와 관련있는 것으로 알려졌다.

세포성 리폭시게나제는 또한 불포화 지방의 퍼옥시화를 통한 LDL의 산화적 수식에 관여한다. 지방 퍼옥시 라디칼의 생성은 마크로파지 흡입(incorporation)에 대한 산화 LDL을 더욱 생성하면서 불포화 LDL 지질의 연쇄 라디칼 산화반응을 촉발시킨다.

본 발명 화합물은 COX/LOX이 관계된 질병의 치료에 유용성이 있다는 것이 밝혀졌다. 실시예 28에서, COX는 공지의 NSAID인 인도메타신과 비슷한 농도의 본 발명 화합물에 의해 억제되었다.

COX의 억제에서, 본 발명 화합물은 n이 2 내지 18인 올리고머이다. 바람직한 실시예에서, 본 발명의 화합물은 n이 2 내지 10, 더욱 바람직하게는 2 내지 5인 올리고머이다.

상술한 COX/LOX에 대한 활성억제를 나타내는 본 발명 화합물의 예는 상술한 다이머, 트라이머, 테트라머 및 펜타머이다.

따라서 COX-2에 대한 본 발명 화합물의 중요한 억제 잠재력 및 대장암 세포주를 발현시키는 것으로 추정되는 COX-2에 대한 세포독성 효과와 더불어, 본 발명 화합물은 암으로 진행되는 단계에 대한 억제제와 같은 아폽토 활성(apoptotic activity) 뿐 아니라 광범위한 예방작용을 갖는 NASID 종류와 같은 활성을 보유한다(실시예 8, 도 9D-H 등 참조).

나아가 COX의 촉매에 의해 아라키돈산이 프로스타글란딘 H₂로 변환하는 것에서의 두 번째 산물인 프로스타글란딘류는 염증, 통증, 열, 치명적인 진전, 진통 및 혈소판 응집에 관여한다. 따라서 본 발명의 화합물은, 예컨데 심장혈관계 질병과 발작에 대해 NSAID와 같은 조건에서 효과적이다(실질적으로, 트롬복산 A₂의 생성을 억제하게 되는 혈소판 COX-1의 억제는 심장혈관계 질병에 대한 아스피린의 예방효과의 기초가 된다).

염증은 손상에 대한 살아있는 조직의 반응이다. 이것은 복잡한 일련의 효소반응, 조절물질의 분비, 체액의 유출, 세포이동, 조직의 붕괴 및 회복으로 이루어진다. 염증은 COX와 LOX 효소의 기질인 아라키돈산을 방출하는 프로스타글란딘 H₂에 의해 활성화된다. COX는 아라키돈산을 급성 부종에서 만성 관절염에 이르기 까지 염증 상황에서 발견되는 주요 에이코사노이드인 프로스타글란딘 PGE₂로 바꾼다. MSAID에 의한 이것의 억제는 치료의 핵심이다.

관절염은 대부분 연결조직에서 나타나는 질병이고 병리경과인 류마티즘 질병의 일종이다. 이 질병에 의해 영향받는 기본적인 부위는 활액(滑液)막, 연골, 뼈, 건(腱), 인대 및 간질(間質)조직을 포함하는 연결조직이다. 임시적인 연결조직 증상은 염좌(捻挫), 접찔림, 건 염증 및 건막(腱膜; tendon sheath)의 변형을 포함한다. 가장 심각한 형태의 관절염은 류마티즘성 관절염, 골염, 통풍(通風) 및 전신낭창 홍진(紅疹; erythematosus)이다.

류마티즘성 질병 외에도, 다른 질병들에도 특징적으로 염증이 나타난다. 치은염과 치주염에는 류마티즘성 질병과 유사한 병리학적인 증상이 따른다. 장염 질병은 장의 특발성(特發性) 만성 염증 상태, 위계양성 대장염 및 크론병이라 불린다. 척추염은 척추 연결의 만성 염증이다. 비만과 관련한 골관절염의 발병률도 높다.

따라서 본 발명의 화합물은 염증, 통증, 열, 치명적인 진전, 진통 및 혈소판 응집이 관련된 증상의 치료에 유용성을 갖는다.

본 발명 화합물에 의한 COX의 억제는 프로스타글란딘(예, PGD₂, PGE₂) 형성을 억제할 수도 있다. 따라서 본 발명은 프로스타글란딘 PGD₂, PGE₂에 관계된 증상의 치료에 유용하다.

관련성이 없는 유용물

산화질소(NO)는 아테롬발생증의 진행과정에서 결정적으로 수반되는 혈소판 응집, 단구 유착과 주화성 및 혈관 평활근 조직의 증식을 억제하는 것으로 알려져 있다. 아테롬성 동맥경화증 조직내에서의 산화질소(NO)의 양은 산소 자유라디칼과의 반응으로 인하여 감소된다는 견해가 증거로서 뒷받침되고 있다. 이러한 반응으로 인한 NO의 손실은 혈관벽에 대한 혈소판과 염증세포의 유착을 증진시키게 되어 이완작용의 산화질소 메카니즘을 더욱 손상시키게 된다. 이러한 방식으로, NO의 손실은 아테롬발생증의 진행을 촉진하게 되어 진행성 질병 상태가 되게 한다.

고혈압증은 졸증, 심장발작, 심기능부전증, 불규칙한 심박 및 신부전증을 포함한 심장맥관 질환의 주요원인이 된다. 고혈압증은 신체를 순환하는 혈관내의 혈압이 표준치 보다 높은 상태이다. 지속된 시간동안 수축기 혈압이 150㎜Hg를 초과하거나 또는 확장기 혈압이 90㎜Hg를 초과할 때, 신체가 손상이 된다. 예를들면, 지나치게 높은 수축기 혈압은 혈관을 파열시킬 수 있다. 뇌에서 혈관이 파열되면 뇌졸증이 된다. 또한, 이는 아테롬성 동맥경화증을 유발할 수 있는 혈관의 두꺼워짐 현상 및 좁아짐 현상의 원인이 될 수 있다. 또한 혈액이 방출될 때 높아진 확장기 혈압을 극복하기 위해서 더욱 격렬하게 활동하기 때문에 높아진 혈압은 심근을 확대시킬 수 있다. 결국, 이러한 심근확장은 불규칙한 심박 또는 심기능 부전증을 일으킬 수 있다. 고혈압증은 증상이 전혀 없고 혈압이 체크될때만 발견될 수 있기 때문에 "침묵의 살인자"라고 불리우고 있다.

혈압의 조절은 하나의 메카니즘이, 약어로서 eNOS인, 산화질소 신타제(NOS)의 구성성분 Ca⁺²/카모듈린 종속형태의 발현을 수반하는 복잡한 것이다. 이 효소에 의해서 합성된 NO는 혈관내의 근육이 이완되도록 하여(확장법) 혈압을 낮추게 된다. 억제자에 의하거나 또는 아테롬성 동맥경화증과 같은 병리학적 상태에서 합성이 방해를 받기 때문에 eNOS에 의해 합성되는 표준레벨의 NO가 합성되지 않을 경우, 혈관근육은 적절한 정도로 이완되지 않는다. 그로 인한 혈관 수축은 혈압을 상승시키게 되며, 고혈압증의 원인이 될 수 있다.

혈관 내피세포는 eNOS를 포함한다. eNOS에 의해 합성되는 NO는 여러방향으로 확산되며, 기초가 되는 혈관 평활근에 도달될 때, NO는 구아닐일 시클라제의 헴(heme) 그룹에 결합하여 cGMP 증가의 원인이 된다. cGMP의 증가는 세포내의 유리된 Ca⁺²증가의 원인이 된다. 시클릭 GMP는 Ca⁺²수송인자들을 인산화시키는 프로테인 키나제를 활성화시킬 수도 있으며, 이는 근육세포의 세포내 구조에서 Ca⁺²이 격리되는 원인이 된다. 근육 수축은 Ca⁺²을 필요로 하기 때문에, Ca⁺²의 농도가 감소될 때 근육 수축력은 감소된다. 근육의 이완은 혈관이 확장되게 하며, 이는 혈압을 낮추게 된다. 따라서, eNOS의 억제는 혈압상승의 원인이 된다.

NOS 억제제의 투여에 의하거나 또는 가능하게는 아테롬성 동맥경화증과 같은 병리학적인 상태에서 합성이 방해받기 때문에 표준 레벨의 NO가 합성되지 않을 때, 혈관 근육은 적절한 정도로 이완되지 않는다. 그로 인한 혈관 수축은 혈압을 상승시키게 되며, 이는 고혈압의 원인이 될 수 있다. 고혈압 환자들에 있어서 eNOS의 활성도를 증가시키는 치료방법을 발견하는데 상당한 관심이 모아지고 있지만 실제적인 치료방법은 보고되지 않았다. 니트로글리세린 또는 이소소르비드 디니트레이트와 같은 NO를 배출할 수 있는 약리학적 약품은 혈압강하 치료의 대들보 역할을 한다.

본 발명의 화합물들이 LDL의 산화를 억제시키지만, 더욱 광범위한 이들 화합물의 효능은 NO에 의해서 아테롬성 동맥경화증에 미치는 다차원적인 영향이다. 본 발명의 화합물에 의한 NO의 조절은 고혈압의 조절, 과콜레스테린혈증에 영향을 미치는 NO의 하락, 혈소판 응집 및 단구 유착의 억제, 아테롬성 동맥경화증의 진행에 수반되는 모든 작용을 포함한 유리한 영향들이 나타나게 된다. 면역계에서의 NO의 역할은 혈관내에서의 기능과는 상이하다. 대식세포는 구성성분이라기 보다는 iNOS로서 불리우는, 유도가능한 NOS 형태를 포함한다. iNOS의 전사는 시토키닌으로 불리우는 많은 생물반응 변형제들에 의해서 양성(positively) 및 음성( negatively)으로 조절된다. 가장 중요한 유발자(inducer)들은 감마-인터페론, 종양괴사인자, 인터로킨-1, 인터로킨-2 및 그램 음성 박테리아의 세포벽 성분인 리포폴리사카라이드(LPS)이다. 자극받은 대식세포들은 리보뉴클레오티드를 DNA 합성에 필요한 디옥시리보뉴클레오티드로 전환시키는 효소인 리보뉴클리아제 리덕타제를 억제시키기에 충분한 NO를 생성하게 된다. DNA 합성의 억제는 iNOS를 포함하는 대식세포 및 기타 다른 조직들이 종양세포 또는 감염성 박테리아를 빠르게 분열시키는 성장을 억제시킬 수 있는 중요한 방법이 될 수도 있다.

NO의 영향 및 감염성 박테리아에 대해서는 부적절한 저장, 처리 및 오염으로 인한 영양물 관련 질병 뿐만 아니라, 신체접촉 및 상처, 개인의 체질, 직업 및 환경을 반영하는 감염과정에서 미생물이 중요한 역할을 하게 된다.

본 발명의 화합물, 이의 조합물 및 상기 성분들을 포함하는 조성물은 NO 농도의 조절과 관련된 질환의 치료에 유용하다. 실시예 9는 본 발명의 화합물의 (자유 라디칼의 억제제로서) 산화방지제 활성도를 예시하였다. NO가 자유라디칼로 제공되고 본 발명의 화합물이 강한 산화방지제로 제공될 때, 생체외 실험모델과 생체내 실험모델로의 본 발명의 화합물 투여로 NO 레벨의 감소를 유발시킬지는 의심스러웠다. NO의 감소는 저혈압이라기 보다는 고혈압의 결과를 가져오게 한다. 예상과는 반대로, 본 발명의 화합물은 생체외 실험모델로부터 NO의 증가를 유도해내며, 생체내 조사를 통하여 저혈압의 영향을 제시하였다(실시예 31 및 실시예 32). 이들 결과는 예상되지 않은 것이었으며, 전혀 기대되지 않은 것이었다.

실시예 27은, 혈관 확장 효과를 수반하는, 본 발명의 화합물 및 글루코스를 포함하는 용액을 마신 후 곧 나타나는 홍반(안면 조홍)을 예시하였다.

실시예 31은 생체내 동물모델에서 본 발명의 화합물에 의해서 유도되는 저혈압 효과를 예시하였으며, 이는 고혈압 치료에 있어서의 본 발명의 화합물의 효능을 설명하는 것이다. 이 실시예에서, 본 발명의 화합물, 이의 조합물 및 상기 성분들을 포함하는 조성물은 올리고머들을 포함하며, 여기에서 n은 2∼18이며, 바람직하게는 n은 2∼10 이다.

실시예 32는 생체외 모델에서 본 발명의 화합물에 의해서 생성되는 NO의 조절을 예시하였다. 이 실시예에서, 본 발명의 화합물, 이의 조합물 및 상기 성분들을 포함하는 조성물은 올리고머들을 포함하며, 여기에서 n은 2∼18이며, 바람직하게는 n은 2∼10이다.

또한, 실시예 35에서는 MALDI/TOF/MS에 의해서 검출되는 Cu⁺²-, Fe⁺²- 및 Fe⁺³- 올리고머 착물(complex)의 형성에 관한 증거를 제공하였다. 이들 결과는 본 발명의 화합물이 구리이온 및/또는 철이온과 함께 착물을 형성하여 LDL 산화에 미치는 이들의 영향을 최소화할 수 있다.

더욱이, 본 발명의 화합물은 감염치료용 및 영양물 손상방지용으로 유용한 항균성 활성도를 갖는다. 실시예 22 및 30은 임상적인 중요성과 영양물 중요성을 갖는 여러 가지의 대표적인 마이크로비오타(microbiota)에 대한 본 발명의 화합물의 항균성 활성도를 다음과 같이 예시하였다.

미생물	유 형	임상/영양물 관련
헬리코박테리아피로리(pylori)	그램 음성	위염, 궤양, 위암
바실러스종	그램 양성	식중독, 창상감염,소의 유방염, 패혈증
살모넬라종	그램 음성	식중독, 설사
황색 포도상구균	그램 양성	절(癤), 옹(癰), 창상감염,패혈증, 유선 농양
대장균	그램 음성	유아 설사, 요도감염
슈도모나스종	그램 음성	요도감염, 창상감염,"swimmer's ear"
맥주 효모균	효모	식중독
아세토 박테리아파스퇴리아누스(pasteurianus)	그램 음성	식중독

실시예 33은 대식세포의 NO 생성에 미치는 본 발명의 화합물의 효과를 예시하였다. 이 실시예에서, 얻어진 결과는 본 발명의 화합물이 리포폴리사카라이드(LPS) 또는 시토키닌에 의한 자극에 무관한 경우와 이에 의존하는 경우에 단구/대식세포의 NO 생성을 유도한다는 사실을 입증하는 것이다. NO를 생성하는 대식세포들은 감염성 박테리아의 성장을 억제할 수 있다.

항균성 활성도를 유도하는 본 발명의 화합물은 올리고머이며, 여기에서 n은 2∼18이며, 바람직하게는 n은 2, 4, 5, 6, 8 및 10 이다.

상기에서 인용된 NO에 대한 항균성 활성도를 유도하는 화합물들의 예로는 전술된 다이머, 테트라머, 펜타머, 헥사머, 옥타머 및 데카머가 있다.

항암(anti-cancer) 유용물

암은 세 그룹으로 분류된다 : 암종(carcinomas), 육종(sarcomas) 및 임파종(lymphomas). 암종은 피부, 다양한 장기(organs)의 내막, 선(glands) 및 조직에서 발생하는 악성 종양이다. 육종은 뼈, 근육 또는 결합조직에서 발생되는 악성종양이다. 제3의 그룹은 장기를 형성하는 혈액세포내에서 모두 발생하기 때문에 백혈병 및 임파종을 포함한다. 암의 주요 유형은 전립선암, 유방암, 폐암, 결장직장암, 방광암, 비-호지킨 임파종, 자궁암, 피부의 흑색종, 신장암, 백혈병, 난소암 및 췌장암이다.

암은 DNA를 손상시키는 유전인자, 이온화 방사선, 오염물질, 라돈 및 자유라디칼과 같은 여러 인자들에 의해서는 세포의 DNA가 변성되는 결과로서 발생된다. 돌연변이를 갖는 세포들은 정돈된 세포분열 과정에서 결함을 나타내게 된다. 이들 세포는 아폽토시스(apoptosis)(예정된 세포괴사)를 경험하지 못하며, 악성 종양의 초기를 표시하거나 또는 더 많은 돌연변이들이 악성종양이 되도록 계속 분열된다.

매우 상이한 암들에게 공통적인 세가지 주요 특징들이 있다.

(1) 무한정으로 증식하는 능력 ; (2) 주변 조직으로서 종양의 침투 ; 및 (3) 전이과정이 있다.

일정한 유형의 암은 특징적인 방식으로 전이된다. 예를들면 갑상선암, 폐암, 유방암, 신장암 및 전립선암은 뼈로 자주 전이한다. 통상적으로 폐암은 뇌에 퍼지게 되며, 부신암 및 결장직장암은 간으로 자주 전이된다. 백혈병은 초기에 일반화된 질병으로 여겨졌으며, 이러한 질병은 신체의 골수에서 발견된다. 놀랍게도, 본 발명의 화합물은 전술한 다양한 암의 치료에 유용한 것으로 발견되었다. 실시예 6, 7, 8 및 15는 본 발명의 화합물이 인간의 HeLa(cervical), 전립선암, 유방암, 신장암, T-세포 백혈병 및 결장암 세포주(cell lines)에 대해서 항암 활성을 유도한다는 것을 예시하였다. 실시예 12(도 20)는 실질적으로 HPLC로 정제되는 올리고머성(다이머-도데카머) 프로시아니딘으로 처리되는 HeLa 및 SKBR-3 유방암 세포주에 미치는 투여량 반응효과를 예시하였으며, 이들 암 세포주에 대한 세포 독소는 효능을 전혀 나타내지 않는 저급 올리고머를 포함하는 펜타머 프로시아니딘부터 도데카머 프로시아니딘까지에 따라 좌우되었다.

이론에 의해서 제한되는 것은 전혀 바라지 않지만, 전술한 효과들을 설명하는 최소의 구조적인 모티브인 것으로 여겨진다. 또한 실시예 37은 고양이 임파아구암 세포주에 대한 고급 올리고머(펜타머-데카머)의 동일한 세포독성 효과를 예시하였다. 또한, 세포독소는 표준의 개 세포주 및 고양이 세포주에 대한 고급 올리고머의 세포독성 효과로서 관찰되었다(도 58∼도 61).

실시예 8(도 9D-H)에서, 본 발명의 화합물은 인간의 결장암 세포주(HCT 116)을 발현하는 가정의(putative) COX-2에 대한 세포독소를 유도하는 것으로 나타났다.

실시예 9는 본 발명의 화합물에 의한 항산화제 활성을 예시하였다. 본 발명의 화합물은 DNA 가닥의 파열, DNA-단백질 교차결합 및 뉴클레오티드의 자유라디칼 산화를 억제시켜서 돌연변이의 발생을 감소 및/또는 방해하게 된다.

실시예 10은 본 발명의 화합물을 토포이소머라제 Ⅱ 억제제로서 예시하였으며, 이는 독소루비신과 같은 화학적 치료제의 타겟이 된다.

실시예 21은 누드 마우스(nude mouse) 모델(마우스의 평균 무게는 약 25g)에서의 인간의 유방암 세포주(MDA-MB-231/LCC6)에 대한 항-종양 활성을 유도하는 실질적으로 순수한 펜타머의 생체내 효과를 예시하였다. 예상밖의 동물 독성 때문에 고 투여량(5㎎)의 펜타머에 의한 반복적인 생체내 실험은 전적으로 성공적이지는 못하였다. 통상적으로, 이러한 독성은 본 발명의 화합물의 혈관확장 효과와 관련될 수 있는 것으로 여겨진다.

실시예 33은 대식세포의 NO생성에 미치는 본 발명의 화합물의 영향을 예시하였다. NO를 생성하는 대식세포들은 빠르게 분열하는 종양세포들의 성장을 억제시킬 수 있다.

또한, 본 발명은 아폽토시스에 의한 세포증식의 억제를 유도하는 본 발명의 화합물의 용도를 포함한다.

항암 활성을 위해서, 본 발명의 화합물은 올리고머이며, 여기에서 n은 2∼18이며, 예를들면 3∼12와 같이 3∼18이며, 바람직하게는 n은 5∼12이며, 가장바람직하게는 n은 5 이다.

상기에서 인용된 암에 대한 억제 활성을 유도하는 화합물은 전술된 바와 같이 펜타머 내지 도데카머를 포함한다.

조제 및 방법

따라서, 집합적으로 본 발명의 화합물, 이의 조합물 및 이 성분들을 포함하는 조성물은 다양한 양상의 아테롬성 동맥경화증, 심장혈관질환, 암, 혈압 조절 및/또는 고혈압, 염증 질환, 감염성 병원체 및 식중독에 대한 광범위한 활성을 나타내고 있다.

그러므로, 본 발명의 화합물, 이의 조합물 및 이 성분들을 포함하는 조성물은, 트롬복산(thromboxane) A₂의 형성을 억제시켜 혈소판 응집에 영향을 미치므로써 혈전증의 위험을 감소시키는 COX 억제제이다. 또한, COX의 억제작용은 혈관벽에 대한 혈소판과 염증 세포의 유착을 저하시키게 되어 NO의 이완 메카니즘을 개선시키게 된다. 공지된 NSAID, 인도메타킨과 유사한 농도에서의 COX의 억제작용과 결부된, 이들 결과는 항혈전증 효능을 나타낸다.

더욱이, 본 발명의 화합물, 이의 조합물 및 이 성분들을 포함하는 조성물은, 초산화물 라디칼 음이온 및 리폭시게나제 중재 지질 퍼옥시라디칼의 레벨을 감소시키므로써 LDL의 산화를 억제하는 항산화제이다. 이 단계에서의 LDL 산화의 억제는 대식세포 활성을 느리게 하며, 아테롬성 동맥경화증의 추가 진행을 막기 위해서 포말세포(foam cell)의 형성을 방해하게 된다. 또한 LDL 산화의 억제는 레스테노시스(restenosis)의 진행을 느리게 할 수 있다. 따라서, 본 발명의 화합물 또는 이의 조합물 또는 본 발명의 화합물 또는 이의 조합물을 포함하는 조성물은 아테롬성 동맥경화증 및/또는 레스테노시스의 예방 및/또는 치료에 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 화합물은 환자의 레스테노시스를 예방하거나 치료하기 위한 혈관형성술 또는 이와 유사한 과정 전 또는 후에 투여될 수 있다.

레스테노시스 및/또는 아테롬성 동맥경화증의 치료 또는 예방을 위해서, 본 발명의 화합물이나 또는 본 발명의 화합물 또는 화합물들을 포함하는 조성물은 단독으로 또는 다른 치료제와 함께, 공지된 개시내용 및 지식으로부터, 숙련된 개업의사가 처방하는 바 대로 투여될 수 있으며, 예를들면 레스테노시스 및/또는 아테롬성 동맥경화증의 초기 증상 또는 징후의 시점에서, 지나친 실험이 전혀 요구됨이 없이 혈관형성술과 함께 또는 혈관형성술 후에 또는 숙련된 개업의사의 처방한 바 대로의 혈관 형성술 후에 즉시 투여하며 ; 본 발명의 화합물 또는 화합물들 또는 이의 조합물의 단독 투여 또는 다른 처리제와의 투여는 예를들면, 월 1회, 격월, 연 2회, 연 1회 또는 다른 식이요법으로 지나친 실험이 전혀 요구됨이 없이 필요한 시간동안 개업의사의 처방대로 지속될 수도있다.

또한, 본 발명의 화합물, 이의 조합물 및 이 성분들을 포함하는 조성물은 생체내에서 저혈압 효과를 나타내며, 생체내에서 NO를 유도하는 것으로 나타났다. 이들 결과는 고혈압의 치료 및 과콜레스테린혈증을 수반하는 임상상태에 실제적으로 적용되며, 여기에서 NO 레벨은 현저하게 감소된다.

본 발명의 화합물, 이의 조합물 및 이 성분을 포함하는 조성물의 조제는 약제학, 식품과학, 의학, 수의학 분야에서 공지된 표준기술에 따라, 활성화합물이 즉시 방출되거나 느리게 방출되는 액체, 현탁액, 정제, 캡슐, 주사용액 또는 좌약 형태로 제조될 수 있다.

또한, 담체는 폴리머 지연 방출 시스템(polymeric delayed release system)일 수도 있다. 합성 폴리머는 방출이 조절되는 조성물의 조제에 특히 유용하다. 이러한 초기 예는 소위 나노(nano) 입자들을 형성하기 위해 1마이크론 이하의 직경을 갖는 구형으로 메틸메타크릴레이트를 폴리머화시키는 것이다(Kreuter, J. Microcapsules and Nanoparticles in Medicine and pharmacology, M. Donbrow(Ed). CRC Press, P. 125-148).

약제용 및 더욱 최근에는 항원용으로 자주 선택되는 담체는 폴리(d, 1-락티드-코-글리코리드)(PLGA) 이다. 이는 독성을 전혀 나타내지 않는 에로디블 수터(erodible sutures), 골격 플레이트(bone plates) 및 다른 일시적인 보철에 있어 오랜 역사를 갖는 의료용도를 갖는다. 광범위한 약제들은 PLGA 마이크로캡슐로 조제되어 왔다. 데이터는 PLGA의 적용에 따라 누적된다(Eldridge, J.H., et al. Current Topics in Microbiology and Immunology, 1989, 146 : 59∼66.). 직경이 1∼10 마이크론인 PLGA 중심체는 구강투여될 때 효과를 나타낼 수 있다. PLGA 마이크로캡슐화 과정은 유중수(water-in-oil) 에멀젼의 상분리를 이용한다. 본 발명의 화합물 또는 화합물들은 수용액으로 제조되며, PLGA는 메틸렌 클로라이드 및 에틸아세테이트와 같은 적합한 유기용매에 용해된다. 이들 혼합 불가능한 두 용액은 빠른 속도의 교반에 의해서 공-에멀젼화(co-emulsified) 된다. 폴리머에 대한 비-용매가 첨가되어, 수성의 작은 물방울 주위에 있는 폴리머를 침전시켜서 미발달된 마이크로캡슐을 형성하게 된다. 마이크로캡슐들을 수집한 다음, 여러 가지의 약품(폴리비닐알코올(PVA), 젤라틴, 알기네이트, 메틸셀룰로스)중의 하나로 안정화시킨 다음, 진공건조법 또는 용매추출법으로 용매를 제거해 낸다.

부가적으로, 느린-방출형 조제물의 제조에 대한 내용은, 여기에서 참고문헌으로 통합된, 미합중국 특허 제5,024,843호, 제5,091,190호, 제5,082,668호 및 제4,612,008호 및 제4,327,725호에 개시되어 있다.

부가적으로, 관심 있는 코코아 유전자형(genotypes)의 확인과 관련된 선택적인 가공방법은 보존 레벨의 본 발명의 화합물을 운반하기 위한 수단으로서 뿐만 아니라, 전술한 질병의 치료가 요구되는 환자에게 활성 화합물을 운반하는 부형제로서 아이덴터티 표준(SOI) 및 비표준(non-SOI) 쵸콜렛 생성물을 제조하는데 이용될 수 있다.

이점에 관해서는, 여기에서 참고문헌으로서 통합된, 1996년 9월 6일자로 공동 특허출원중인 미합중국 특허출원번호 08/709,406호에 개시되어 있다. USSN 08/709,406호에, 연장된 시간 동안 강한 열처리에 노출시키지 않고 코코아 원두를 가공하는 선택 및/또는 지방의 용매추출법 사용을 허용하면서, 분리된 원두의 볶음 또는 액체 밀링 장비를 필요로 하지 않는 가공단계들의 유일한 컴비네이션을 이용하여 코코아 원두로부터 보존 레벨의 폴리페놀을 갖는 코코아 고형물 및/또는 코코아 버터를 생산하는 방법이 개시되어 있다. 이러한 방법의 잇점은 전통적인 코코아 가공에서 발견되는 것과는 대조적으로 증진된 폴리페놀의 보존에 있으며, 가공 후의 얻어지는 폴리페놀의 함량에 대한 미가공된 원두에서 발견되는 폴리페놀의 초기 함량의 비율은 2 이하이다.

본 발명의 화합물은 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 갖는 조제형태로 하나 이상의 전술한 화합물을 포함하며, 항암(anti-cancer), 항종양(anti-tumor) 또는 항신생물(anti-neoplastic)활성, 항산화활성을 갖는 본 발명의 화합물은 DNA 토포이소머라제 Ⅱ 효소를 억제시키며, DNA에 대한 산화적 손상을 억제시키며, 단구/대식세포의 NO 생성을 유도하며, 항균성의 시클로-옥시게나제 및/또는 리포옥시게나제, NO 또는 NO-신타제, 아폽토시스, 혈소판 응집 및 혈액 또는 생체내 글루코스 조절 활성을 가지고, 비-스테로이드계 항감염성 인자로서의 효능을 갖는다.

본 발명의 다른 구체예는, 적어도 하나의 부가적인 항신생물제, 혈압저하제, 항감염제, 항균제, 항산화제 및 조혈제 뿐만 아니라, 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제와 함께, 본 발명의 화합물 또는 이의 조합물을 포함하는 조성물을 포함한다.

이러한 조성물은 요구되는 투여량 및 의학, 영양학 또는 수의학에서 잘 공지되어 있는 기술에 의해서 고려되는 데이터인 예를들면 연령, 성별, 체중, 유전적인 조건 및 환자의 실제 상태, 투여경로, 특정 올리고머의 상대농도 독성(LD₅₀)에 따라서 환자에게 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물은 다른 항신생물제, 항종양제 또는 항암제, 항산화제, DNA 토포이소머라제 Ⅱ 효소억제제, DNA의 산화손상 억제제 또는 시클로-옥시게나제 및/또는 리포옥시게나제, 아폽토시스, 혈소판 응집, 혈액 또는 생체내 글루코스 또는 NO 또는 NO-신타제 조절제, 비-스테로이드계 항감염제와 함께 및/또는 항신생물제, 항종양제, 항암제, 항산화제, DNA 토포이소머라제 Ⅱ 효소억제제, DNA 산화손상억제제, 시클로-옥시게나제 및/또는 리포옥시게나제, 아폽토시스, 혈소판 응집 조절제, 혈액 또는 생체내 글루코스 또는 NO 또는 NO-신타제 조절제 및/또는 비-스테로이드계 항감염제의 나쁜효과를 줄이거나 경감시키는 약제와 함께, 연령, 성별, 체중, 유전상태, 환자의 실제조건 및 투여경로를 고려하면서 공동-투여되거나 연속투여된다.

사람 또는 가축에 적용되는 본 발명의 조성물의 예로는, 씹을 수 있는 고체 또는 음료 조제물 뿐만 아니라, 예를들면 캡슐, 정제, 알약 등과 같은 고체 또는 액체 조제물과 같은 식용 조성물을 포함하며, 이는 본 발명이 식용자원(예를들면, 코코아 또는 쵸콜렛향이 나는 고체 또는 액체조성물)으로부터 얻어지는 것이므로 매우 적합할 수 있으며 : 본 발명은 예를들면 현탁액, 시럽 또는 엘릭시르와 같은 입, 코, 항문, 질 등을 통해 투여 가능한 액체 조성물을 포함하고(코코아 또는 쵸콜렛 향이 나는 조성물 포함) ; 무균 현탁액 또는 에멀젼과 같은 비경구 투여용, 피하투여용, 피내 투여용, 근육내 투여용 또는 정맥내 투여용(예를들면 주사가능한 투여) 조제물을 포함한다. 그러나 조성물중의 활성성분은 단백질과 복합물을 형성하여 혈류에 투여될 때 혈액 단백질의 침전으로 인한 응혈이 일어날 수도 있으며, 이는 당업자들이 참작해야할 사항이다. 이러한 조성물에서의 활성 코코아 추출물은 살균수, 생리 염수, 글루코스, DMSO, 에탄올 등과 같은 적합한 담체, 희석제 또는 부형제와 혼합될 수 있다. 본 발명의 활성 코코아 추출물은 예를들면 등장 염수, 글루코스 또는 DMSO 완충제와 같이 냉동건조된 재조제용 형태로 제공될 수 있다. 어떤 등장 염류 용액에서는 침전이 관찰된다 : 그리고 이러한 침전물 형성은 본 발명의 화합물을 분리해내는 방법, 예를들면 "염석(salting out)" 방법으로서 이용될 수 있다.

실시예 38은 약제 및 식품분야에 적용하기 위한 정제 조제물 형태의 본 발명의 화합물의 제조를 예시한 것이다. 또한, 실시예 39는 유사한 적용을 위한 캡슐 조제물 형태의 본 발명의 화합물의 제조를 예시한 것이다. 또한, 실시예 40은, 여기에서 참고문헌으로 통합된, 공동출원중인 미합중국 특허 08/709,406호에 개시된 방법에 의해서 얻어진 코코아 고형물 또는 본 발명의 화합물을 포함하는 비표준(non-SOI) 쵸콜렛 및 아이덴터티 표준(SOI)의 조제물을 예시하였다.

또한, 본 발명은 활성코코아 추출물이 제공되는 키트(kit)를 포함한다. 이 키트는 적합한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 분리용기를 포함할 수 있다. 또한, 키트는 공동-투여용 또는 연속-투여용 부가적인 항암제, 항종양제 또는 항신생물제, 항산화제, DNA 토포이소머라제 Ⅱ 효소억제제 또는 산화성 DNA 손상 억제제 또는 항균제 또는 시클로-옥시게나제 및/또는 리포옥시게나제, NO 또는 NO-신타제 비-스테로이드계 항감염제, 아폽토시스 및 혈소판 응집 조절제 또는 혈액 또는 생체내 글루코스 조절제 및/또는 항신생물제, 항종양제 또는 항암제, 항산화제, DNA 토포이소머라제 Ⅱ 효소 억제제 또는 항균제 또는 시클로-옥시게나제 및/또는 리포옥시게나제, NO 또는 NO-신타제, 아폽토시스, 혈소판 응집조절제 및 혈액 또는 생체내 글루코스 조절제 및/또는 비-스테로이드계 항감염제의 나쁜 효과를 줄이거나 경감시키는 약제를 포함할 수 있다. 첨가제(들)은 분리용기(들)형태 또는 활성 코코아 추출물과 혼합된 형태로 제공될 수 있다. 부가적으로, 키트는 성분들의 혼합 또는 조합 및/또는 투여방식에 관한 사용법을 포함할 수 있다.

유전자의 확인

본 발명의 다른 구체예는 본 발명의 화합물을 또는 이들 화합물로 된 조합물에 의한 인접세포접촉의 결과로서 발현되는 유전자들의 조절을 포함한다. 이와 같은 경우, 본 발명의 화합물은, 제한되는 것은 아니지만 아테롬성 동맥경화증, 고혈압증, 암, 심장혈관질환 및 염증을 포함하는 여러 질병들과 관련된, 본 발명의 화합물들 또는 이들 화합물로 된 조합물에 의해서 유도되거나 억제되는 유전자들의 확인방법을 포함한다. 상세하게는, "정상의" 비질병 상태에서 발현되는 것과 비교되는 상기한 질병들 상태에서 상이하게 발현되는 유전자들은 본 발명의 화합물들 또는 이들 화합물로 된 조합물과의 접촉 전 또는 후에 확인되고 설명된다.

앞서 언급된 바와 같이, 상기 질병 및 질병상태는 다양한 생체분자들과의 자유라디칼 상호작용에 부분적으로 근거를 둔다. 이들 질병의 주요주제는 많은 자유 라디칼 반응들이 반응성이 있는 산소를 수반하며, 이는 질병의 진행과정에서 수반되는 생리적 조건들을 차례로 유발시킨다는 데 있다. 예를들면, 반응성이 있는 산소는 핵인자(NF)-KB와 같은 전사인자의 조절에 관여하게 된다. NF-KB의 타겟 유전자들은 통합된 감염성 반응에 연결되는 유전자들을 포함한다. 이는 종양괴사인자(TNF)-α, 인터로킨(IL)-I, IL-6, IL-8, 유도성 NOS, 메이저 조직적합성 복합체(MHC) 부류 Ⅰ 항원등을 암호화하는 유전자들을 포함한다. 또한, 전사인자의 활성을 조절하는 유전자들은 산화성 스트레스(oxidative stress)에 의해서 차례로 유도될 수 있다. 산화성 스트레스는 라디칼 제거 시스템과 라디칼 발생 시스템이 불균형을 이루는 것이다. 이러한 조건의 여러 공지된 예들(Winyard and Blake, 1997)은 gadd153(성장억제 및 DNA 손상에 의해서 유도되는 유전자), NF-IL6과 결합하며, DNA에 결합할 수 없는 헤테로다이머를 형성하는 생성물을 포함한다. NF-IL6은 인터로킨 6 및 8을 암호화하는 유전자를 포함한 여러 유전자들의 발현을 조절한다. 산화성 스트레스 유도성 유전자들의 다른 예로는 성장억제상태에서 전사인자 p53의 효과를 조절하는 gadd45이다. p53은 아폽토시스를 진행시키기 위해서 세포분열을 정지시킬 수 있고 비정상적인 세포들(예를들면, 암)을 유발할 수 있는 p53 단백질을 암호화한다.

부분적으로 자유라디칼 메카니즘에 근거한 다양한 질병에 유용한 본 발명의 화합물들 또는 이들 화합물로 된 조합물의 예상밖의 불명백한 신규의 유용물에 대한 전체 파노플리(panoply)가 제공된다면, 본 발명은 특정 질병 또는 질병상태에 있는 동물의 생체외 및/또는 생체내 모델에서의 본 발명의 화합물에 의해 발현되는 유전자(들) 또는 유전자 생성물(들)에 대한 일시적인 효과들을 유전자 발현 분석법을 사용하여 측정하는 방법들을 포함한다. 이 분석법은, 제한되는 것은 아니지만, 시차 디스플레이, cDNA 라이브러리 서열화, 유전자 발현의 연속 분석(SAGE), 고밀도 올리고뉴클레오티드 배열로의 혼성화에 의한 발현 모니터링 및 프로토콜 또는 이의 조합(락하드 등, 1996)에 의거한 다양한 역전사 효소-폴리머화 연쇄반응(RT-PCR)을 포함한다.

유전자 평가방법과 결부되는 본 발명에서 예시되는 본 발명의 화합물들 또는 이들 화합물로 된 조합물의 광범위한 생리학적인 효과들은, 공지 또는 신규한 것이든지, 유도되거나 또는 억제되는지 간에, 유전자들 및 유전자 생성물들이 발견되게 한다. 예를들면, 본 발명은 RT-PCR을 사용한 림프구에서의 시토킨(예를들면, IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, IL-12 및 TNF-α)의 생체내 및 생체외 유도 및/또는 억제를 포함한다. 이와 유사하게는, 본 발명은 선택 유전자들의 유도 및/또는 억제를 확인하는 시차 디스플레이의 적용을 포함한다 ; 자극된 조건 및/또는 산화제로 자극된 조건(예를들면, TNF-α 또는 H₂O₂)하의 심장혈관분야(예를들면, 초산화물 디스머타제, 헴 옥시다제, COX1 및 2 및 다른 산화제 방어 유전자들). 암분야의 경우, 본 발명은 조절상태의 산화제로 스트레스 받은 세포들내에서 CuZn-초산화물 디스머타제, Mn-초산화물 디스머타제와 같은 유전자들 또는 유전자 생성물들의 유도 및/또는 억제를 확인하는 시차 디스플레이의 적용을 포함한다.

다음의 비제한적인 실시예들은 단지 예시적인 것에 불과하며, 본 발명을 한정시키는 것으로 판단해서는 안되고, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어남이 없이 많은 변형이 가능하다.

실시예

실시예 1 : 코코아 공급원 및 제조방법

코코아의 세가지 인정된 원예농업 품종을 나타내는 여러 테오브로마 카카오 유전자형(Enriquez, 1967 ; Engels, 1981)은 세계의 주요 코코아 생산지 세곳으로부터 얻어졌다. 본 실시예에 사용된 이들 유전자형은 표 1에 나타내었다. 수확한 코코아 포드(pods)가 열린 다음, 동결 건조시키기 위해서 과육이 있는 원두들을 제거해낸다. 동결건조한 덩어리로부터 과육을 수동으로 제거해 낸 다음, 원두들을 다음과 같이 분석하는데 사용하였다. 먼저, 미발효된 동결건조한 코코아 원두들을 수동으로 껍질을 벗긴 다음, TEKMAR 밀을 사용하여 미세한 분말 덩어리로 으깨었다. 결과로서 얻어진 덩어리를 용매로서 재증류시킨 헥산을 사용하여 속슬레 추출법으로 밤새도록 탈지시켰다. 주변온도의 진공상태에서 탈지시킨 덩어리로부터 잔류용매를 제거해 내었다.

표 1. 테오브로마 카카오 물질의 설명

유전자형	생산국	원예농업 품종
UIT-1	말레이지아	트리니타리오(Trinitario)
미상	아프리카 서부	포라스테로(Forastero)
ICS-100	브라질	트리니타리오(니카라구안 크리올로 원종)
ICS-39	브라질	트리니타리오(니카라구안 크리올로 원종)
UF-613	브라질	트리니타리오
EEG-48	브라질	포라스테로
UF-12	브라질	트리니타리오
NA-33	브라질	포라스테로

실시예 2 : 프로시아니딘 추출과정

A. 방법 1

자랄 및 콜린(1977)에 의해서 제시된 것을 변형한 방법을 사용하여, 실시예 1의 탈지시키고 미발효시킨 동결건조한 코코아 원두들로부터 프로시아니딘을 추출해 내었다. 70% 아세톤/탈이온수 2×400mL와 70% 메탄올/탈이온수 400mL를 포함하는 탈지된 코코아 덩어리의 배치 50그램으로부터 프로시아니딘을 추출해 내었다. 추출물을 모은 다음, 부분진공상태하에 고정되어 있는 회전식 증발기를 사용하여 45℃에서 증발법에 의해서 용매를 제거해내었다. 얻어진 수상을 탈이온수를 사용하여 1L로 희석시킨 다음 400mL CHCl₃를 사용하여 2회 추출하였다. 용매상을 버렸다. 수상을 500mL 에틸아세테이트로 4회 추출하였다. 결과로서 얻어진 에멀젼을 10℃에서 30분동안 2,000×g에서 작동되는 소르발 RC 285 원심분리법으로 연화시켰다. 합해진 에틸아세테이트 추출물에 100∼200mL의 탈이온수를 첨가하였다. 부분진공상태하에서 고정된 회전식 증발기를 사용하는 45℃에서의 증발법에 의해서 용매를 제거해 내었다. 얻어진 수상을 액체 N₂로 얼린 다음, LABCONCO 동결건조 시스템에 따라서 동결건조하였다. 상이한 코코아 유자자형으로부터 얻어진 조(crude) 프로시아니딘의 수율을 표 2에 나타내었다.

표 2 : 조프로시아니딘의 수율

유전자형	생산국	수율(g)
UIT-1	말레이지아	3.81
미상	아프리카 서부	2.55
ICS-100	브라질	3.42
ICS-39	브라질	3.45
UF-613	브라질	2.98
EEG-48	브라질	3.15
UF-12	브라질	1.21
NA-33	브라질	2.23

B. 방법 2

선택적으로, 70% 수성 아세톤을 사용하여, 실시예 1의 탈지시킨 미발효된 동결건조한 코코아 원두들로부터 프로시아니딘을 추출하였다. 탈지시킨 물질 10그램을 5분동안 100mL 용매를 사용하여 현탁시켰다. 슬러리를 4℃에서 3000×g으로 15분 동안 원심분리한 다음, 상청액을 유리솜에 통과시켰다. 여과액을 부분 진공상태에서 증류시킨 다음, 얻어진 수상을 액체 N₂에서 냉동시킨 다음, LABCONCO 동결건조시스템에 따라서 동결건조시켰다. 조프로시아니딘의 수율은 15∼20% 이었다.

특정 이론에 의해서 한정됨이 없이, 조프로시아니딘의 수율의 차이는 상이한 유전자형, 지리적 조건, 원예농업품종 및 제조방법에 따라서 다양한 것으로 여겨진다.

실시예 3 : 코코아 프로시아니딘의 부분정제

A. 겔 투과 크로마토그래피

실시예 2에서 얻어진 프로시아니딘을 세파덱스 LH-20(28×2.5㎝)상의 액체크로마토그래피에 의해서 부분 정제하였다. 탈이온수에서 메탄올로의 단계 변화도(gradient)에 의해서 분리단계를 수행하였다. 탈이온수중의 15% 메탄올로 시작한 초기 변화도 조성물은 매 30분마다 탈이온수중의 25% 메탄올, 탈이온수중의 35% 메탄올, 탈이온수중의 70% 메탄올 및 최종적으로는 100% 메탄올이 단계적으로 사용되었다. 크산틴 알카로이드의 용리전개에 따른 용출액(카페인 및 테오브로민)을 단일 분획물로서 수집하였다. 이 분획물은 크산틴 알카로이드 유리(freee) 서브(sub) 분획물을 산출하였으며, 이는 MM2A 내지 MM2E로 지정된 5가지의 서브(sub) 분획물을 산출하기 위하여 추가로 서브(sub) 분별증류시켰다. 부분 진공상태에서 고정된 회전식 증발기를 사용하는 45℃에서의 증발법에 의해서 각각의 서브 분획물로부터 용매를 제거해 내었다. 얻어진 수상을 액체 N₂에서 냉동시킨 다음, LABCONCO 동결건조시스템에 따라서 밤새도록 동결건조하였다. 분획화를 보여주는 대표적인 겔투과크로마토그램은 도 1에 도시되어 있다. 대략적으로, 이러한 방식에 의해서 100㎎의 물질을 서브 분획화시켰다.

크로마토그래피 조건 : 칼럼 ; 28×2.5㎝ 세파덱스 LH-20, 이동상 : 메탄올/물 단계 변화도, 15:85, 25:75, 35:65, 70:30, 100:0, 1/2시간 간격으로 단계적으로 진행, 유량 ; 1.5mL/분, 검출기 ; λ₁=254nm 및 λ₂=365nm에서 UV, 차트 스피드 : 0.5㎜/분, 칼럼 하중 ; 120㎎

B. 반-정제(semi-preparative) 고(high) 퍼포먼스 액체 크로마토그래피(HPLC)

방법 1. 역상(Reverse phase) 분리

실시예 2 및/또는 실시예 3A로부터 얻어진 프로시아니딘을 반-정제의 HPLC에 의해서 부분적으로 정제하였다. 다양한 파장 검출기가 장착된 휴렛 팩커드 1050 HPLC 시스템인, 1mL의 주입 루프를 갖는 레오다인 7010 주입 밸브를 파마시아 FRAC-100 분획물 수집기로 조립하였다. 페노메넥스 10μ ODS 울트라카브(60×10㎜)가드 칼럼으로 연결된 페노메넥스 울트라카브 10μ ODS 칼럼(250×22.5㎜)상에서 분리단계를 실행하였다. 다음의 선형 변화도 조건하에 사용된 이동상 조성물은 A = 물 ; B = 메탄올이었다 : [시간, %A] ; 5mL/분의 유량에서 (0, 85), (60, 50), (90, 0) 및 (110, 0) 254nm에서의 UV로 화합물이 검출되었다.

분획물 D+E에 존재하는 프로시아니딘의 분리에 관한 대표적인 반-정제 HPLC 결과는 도 15N에 도시되어 있다. 개개의 피크 또는 선택된 크로마토그래피 영역은 정해진 시간 간격에 따라 수집되었거나 또는 추가정제 및 후속평가를 위한 분획물 수집에 따라 수동으로 수집되었다. 물질의 주입 하중은 25∼100㎎ 이었다.

방법 2. 정상 분리

실시예 2 및/또는 실시예 3A로부터 얻어진 프로시아니딘 추출물을 반-정제 HPLC에 의해서 부분적으로 정제하였다. 휴렛 팩커드 1050 HPLC 시스템인, 254nm에서 셋팅된 밀리포레-워터스 모델 480LC 검출기를 피크모드에서 셋팅된 파마시아 Frac-100 분획물 수집기로 조립하였다. 수펠코 5㎛ 수펠가드 LC-Si 가드 칼럼(20×4.6㎜)로 연결된 수펠코 ㎛ 수펠코실 LC-Si 칼럼(250×10㎜)상에서 분리단계를 실행하였다. 다음의 조건하에서 선형 변화도에 의해서 프로시아니딘이 용리되었다 : (시간, %A, %B) ; (0, 82, 14), (30, 67.6, 28.4), (60, 46, 50), (65, 10, 86), (70, 10, 86). 이어서 10분동안 재평형상태를 유지시켰다. 이동상 조성물은 A=디클로로메탄 ; B=메탄올 ; 및 C=아세트산이었다 : 물(1:1). 3mL/분의 유량이 이용되었다. 245nm에서의 UV로 성분들을 검출하였으며, Kipp & Zonan BD41 레코더로 기록하였다. 주입부피는 70% 수성 아세트산 0.25mL중에 용해된 프로시아니딘 추출물 10㎎의 100∼250μL이었다. 대표적인 반-정제 HPLC 결과를 도 15 O에 도시되어 있다. 개개의 피크들 또는 선택된 크로마토그래피 영역들은 정해진 시간 간격에 따라 수집되었거나 또는 추가 정제 및 후속 평가를 위한 분획물 수집에 따라 수동으로 수집되었다.

HPLC 조건 : 250×10㎜ 수펠코 수펠코실 LC-Si

(5㎛) 반-준비 칼럼

20×4.6㎜ 수펠코 수펠코실 LC-Si

(5㎛) 가드 칼럼

검출기 : 워터스 LC

분광 광도계 모델

480@ 254nm

유량 : 3mL/분

칼럼온도 : 대기온도

주입량 : 70% 수성아세톤 추출물의 250μL

변화도 :시간(분)	CH2Cl2	메탄올	아세트산 : H2O(1 : 1)
0	82	14	4
30	67.6	28.4	4
60	46	50	4
65	10	86	4
70	10	86	4

얻어진 분획물은 다음과 같다 :

분획 물	유 형
1	다이머
2	트라이머
3	테트라머
4	펜타머
5	헥사머
6	헵타머
7	옥타머
8	노나머
9	데카머
10	운데카머
11	도데카머
12	고급 올리고머

실시예 4 : 프로시아니딘 추출물의 HPLC 분석

방법 1. 역상 분리

실시예 3에서 얻어진 프로시아니딘 추출물을 0.45μ필터를 통하여 여과해 낸 다음, 다이오드 어래이 검출기와 HP 모델 1046A 프로그램 형광 검출기가 장착된 휴렛팩커드 1090 3중의 HPLC 시스템으로 분석하였다. 60% B에서 A로의 선형 변화도에 이어서 0.3mL/분의 유량에서 B로 세척한 칼럼에 의해서 플라바놀과 프로시아니딘을 용리하였다. 이동상 조성물은 메탄올중의 B=0.5% 아세트산 및 나노수준으로 순수한 물(이하, 나노-순수한 물이라 한다)(nanopure water)중의 A=0.5% 아세트산이었다. A 및 B 이동상에서의 아세트산 레벨은 2%로 증가될 수 있다. λ_ex=276nm 및 λ_em=316nm 이며, 280nm에서의 UV의 조건하에서, 성분들은 형광분석법에 의해서 검출되었다. (+)-카데킨 및 (-)-에피카테킨의 농도는 표준용액과 비교하면서 결정하였다. (-)-에피카테킨에 대한 반응인자를 사용하여 프로시아니딘 레벨을 측정하였다. 하나의 코코아 유전자형에 대해서 다양한 성분들의 분리를 보여주는 대표적인 HPLC 크로마토그램은 도 2A에 도시되어 있다. 유사한 HPLC 프로파일은 다른 코코아 유전자형으로부터 얻어졌다.

HPLC 조건 : 칼럼 : 200×2.1㎜ 휴렛 팩커드

하이퍼실 ODS(5μ)

가드칼럼 : 20×2.1㎜ 휴렛 팩커드 하이퍼실 ODS(5μ)

검출기 : 다이오드 어래이 @ 280nm

형광 λ_ex= 276nm ;

λ_em= 316nm

유량 : mL/분

칼럼온도 : 45℃

변화도온도(분)	나노-순수한 물중의0.5% 아세트산	메탄올중의0.5% 아세트산
0	100	0
50	40	60
60	0	100

방법 2. 정상 분리

실시예 2 및/또는 3으로부터 얻어진 프로시아니딘 추출물을 0.45μ 필터로 여과해낸 다음, HP 모텔 1046A 프로그램 형광 검출기와 다이오드 어래이 검출기가 장착된 휴렛 팩커드 1090 시리즈 Ⅱ HPLC 시스템에 의해서 분석하였다. 스펠코 스펠가드 LC-Si 5μ 가드 칼럼(20×4.6㎜)에 연결되어 있는 5μ 페노메넥스 리크로스피어 실리카 100칼럼 (250×3.2㎜)상에서 분리단계를 수행하였다. 다음 조건하의 선형 변화도에 의해서 프로시아니딘을 용리하였다 : (시간, %A, %B) ; (0, 82, 14), (30, 67.6, 28.4), (60, 46, 50), (65, 10, 86), (70, 10, 86). 이어서 8분 동안 재평형상태를 유지시켰다. 이동상 조성물은 A=디클로로메탄, B=메탄올 및 C=아세트산이었다 : 물과의 부피비율=1:1, 0.5mL/분의 유량이 이용되었다. λ_ex=276nm 및 λ_em=316nm 조건하의 형광분석법에 의하거나 또는 280nm에서의 UV에 의해서 성분들을 검출하였다. 하나의 유전자형에 대해서 다양한 프로시아니딘의 분리를 보여주는 대표적인 HPLC 크로마토그램은 도 2B에 도시되어 있다. 유사한 HPLC 프로파일은 다른 코코아 유전자형으로부터 얻어졌다.

HPLC 조건 :

250×3.2㎜ 페노메넥스 리크로스피어 실리카 100

칼럼(5μ) 20×4.6㎜

수펠코 수펠가드

LC-Si(5μ)가드 칼럼

검출기 : 포토다이오드 어래이 @ 280nm

형광 λ_ex= 276nm ;

λ_em= 316nm

유량 : 0.5mL/분

칼럼온도 : 37℃

변화도 :시간(분)	CH2-Cl2	메탄올	아세트산/물(1:1)
0	82	14	4
30	67.6	28.4	4
60	46	50	4
65	10	86	4
70	10	86	4

실시예 5 : 프로시아니딘의 확인

세파덱스 LH-20(28×2.5㎝) 칼럼을 사용하는 액체 크로마토그래피에 이어서 10μ 본다팩 C18(100×8㎜) 칼럼을 사용하는 반-정제 HPLC 또는 5μ 수펠코실 LC-Si(250×10㎜) 칼럼을 사용하는 반-정제 HPLC에 의해서 프로시아니딘을 정제하였다.

양이온 모드 및 음이온 모드에서의 액체 이차 이온 질량분석법(LSIMS)을 사용하여 VG ZAB-T 고해상도 MS 시스템을 사용한 고속 원자 충격-질량 분석법(FAB-MS)에 의해서 부분적으로 정제된 분리물(isolates)을 분석하였다. 30kV에서의 이온화 원(source)으로서 세슘이온 총(gun)을 사용하였으며, 양성자 공여체로서 "매직 블리트 매트릭스(Magic Bullet Matrix)"(1:1 디티오트레이톨/디티오에리트리톨)가 사용되었다.

세가지 분획물에 대한 LSIMS에 의한 분석결과는 표에 나타낸 바와 같이 플라반-3-올 올리고머의 존재를 밝혀내었다.

표 3 : 코코아 프로시아니딘 분획물로부터 얻어진 LSIMS(양이온) 데이타

올리고머	(M+1)+m/z	(M+Na)+m/z	몰 중량
모노머(카테킨)	291	313	290
다이머(들)	577/579	599/601	576/578
트라이머(들)	865/867	887/889	864/866
테트라머(들)	1155	1177	1154
펜타머(들)	1443	1465	1442
헥사머(들)	1731	1753	1730
헵타머(들)	-	2041	2018
옥타머(들)	-	2329	2306
노나머(들)	-	2617	2594
데카머(들)	-	2905	2882
운데카머(들)	-	-	3170
도데카머(들)	-	-	3458

주요 토막 이온들(fragment ions)은 프로시아니딘의 양이온 및 음이온 FAB-MS 분석을 통해 이전에 보고된 연구결과(셀프 등, 1986 및 포터 등, 1991)와 일치하였다. m/z 577(M+H)⁺에 상응하는 이온 및 m/z 599(M+Na)⁺에서의 이의 소듐애덕트는 분리물에 이중결합된 프로시아니딘 다이머들이 존재함을 보여주었다. 고급 올리고머들이 그들의 양성자화된 분자이온들(M+H)⁺보다는 소듐 애덕트(M+Na⁺)를 형성하는 것으로 주목되었다. 프로시아니딘 아이소머들 B-2, B-5 및 C-1은 레빌라 등(1991), 셀프등(1986) 및 포터 등에 의해서 보고된 연구에 기초하여 시험적으로 확인되었다. 옥타머와 데카머에 이르는 프로시아니딘은 부분적으로 정제된 분획물에서 FAB-MS에 의해서 확인되었다. 부가적으로, 도데카머에 이르는 프로시아니딘은 정상 HPLC 분석에 의해서 관찰되었다(참고 도 2B). 표 4는 역상 HPLC 분석에 의거한 크산틴 알카로이드가 없는 분리물에서 측정된 프로시아니딘의 상대농도를 나타낸 것이다. 표 5는 정상 HPLC 분석에 의거한 프로시아니딘의 상대농도를 나타낸 것이다.

표 4 : 크산틴 알카로이드가 없는 분리물에서의 프로시아니딘의 상대농도

성 분	함 량
(+)-카테킨	1.6%
(-)-에피카테킨	38.2%
B-2 다이머	11.0%
B-5 다이머	5.3%
C-1 트라이머	9.3%
이중으로 결합된 다이머	3.0%
테트라머(들)	4.5%
펜타머-옥타머	24.5%
미지의 성분 및 고급 올리고머	2.6%

표 5 : 수성 아세톤 추출물에서의 프로시아니딘의 상대농도

성 분	함 량
(+)-카테킨 및(-)-에피카테킨	41.9%
B-2 및 B-5 다이머	13.9%
트라이머들	11.3%
테트라머들	9.9%
펜타머들	7.8%
헥사머들	5.1%
헵타머들	4.2%
옥타머들	2.8%
노나머들	1.6%
데카머들	0.7%
운데카머들	0.2%
도데카머들	< 0.1%

도 3은 여러 가지의 프로시아니딘 구조들을 도시한 것이고, 도 4A-4E는 하기의 항암 활성도 또는 항신생물 활성도를 스크리닝하는데 사용되는 5가지의 분획물들에 대한 대표적인 HPLC 크로마토그램을 도시한 것이다. 도 4A-4E의 HPLC 조건은 다음과 같다 :

HPLC 조건 : 휴렛 팩커드 1090 세 개

HP 모델 1046A 프로그램 형광 검출기가 장착된 HPLC 시스템

칼럼 : 휴렛 팩커드 5μ 하이퍼실 ODS(200×2.1㎜)

0.3mL/분의 유량에서의 60%B에서 A로의 선형 변화도 B=메탄올중의 0.5% 아세트산 ; A=탈이온수중의 0.5% 아세트산 λ_ex=280nm ; λ_em=316nm.

도 15 O는 항암 활성도 또는 항신생물 활성도를 스크리닝하는데 사용되는 부가적인 12가지의 분획물들에 대한 대표적인 반-정제 HPLC 크로마토그램을 도시한 것이다(HPLC 조건은 상기한 바와 같다).

실시예 6 : 코코아 추출물(프로시아니딘)의 항암 활성, 항종양 활성 또는 항신생물 활성

모스만(1983)에 의해서 최초로 개발된 MTT(3-[4,5-디메틸티아졸-2일]-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드)-마이크로티터 플레이트 테트라졸리움 독성분석법이 실시예 5의 테스트 샘플을 스크린하는데 사용되었다. 테스트 샘플, 표준샘플(시스플라틴 및 클로람부실) 및 MTT 시약을 100% DMSO(디메틸 설폭사이드)에 10㎎/mL 농도로 용해시켰다. 원액으로부터 일련의 희석물들을 제조하였다. 테스트 샘플들의 경우, 0.01 내지 100㎍/mL의 희석물들이 0.5% DMSO 중에서 제조되었다.

아메리카 타입 배양균 컬렉션으로부터 모든 사람의 종양 세포주들을 입수하였다. 세포들은 태아단계의 소 혈청 10%, 페니실린, 100유니트/mL, 스트렙토마이신 100㎍/mL 및 니스타틴 240 유니트/mL를 포함하는 알파-MEM에서 단층(mono layers)으로 성장하였다. 37℃의 습윤상태의 5% CO₂대기조건에서 세포들을 유지시켰다.

트립신분해(trypsinization) 후, 세포들을 계측한 다음, 50×105 세포/mL(암세포주에 따라 다양해짐)의 농도로 맞추었다. 세포 현탁액 200μL를 4열의 96-웰(well) 마이크로티터 플레이트로 된 웰에서 배양하였다. 세포들을 4시간 동안 유착시킨 다음, 테스트 샘플 용액을 포함하는 DMSO 2μL를 4개의 웰에 첨가하였다. 초기의 투어-반응 관찰실험에서, 테스트 샘플 희석물을 투여량 범위를 결정하는데 크기 순서대로 사용하였다. 540nm에서의 웰 흡광도는 BIO RAD MP450 플레이트 판독기에 의해서 측정되었다. 테스트 샘플로 처리된 4개의 웰들의 평균 흡광도는 대조군과 비교되었으며, 결과들은 대조 흡광도 +/- 표준편차의 퍼센트로서 표현되었다. 자주색의 포르마잔 생성물로의 MTT의 환원은 웰내의 살아 있는 세포들 수의 선형(linear) 방법과 상관관계가 있다. 따라서, 환원 생성물의 흡광도를 측정하므로써, 주어진 테스트 샘플 투여량에서 세포의 생존 확률을 정량분석할 수 있다. 대조 웰들은 최종 농도의 1% DMSO를 포함하였다.

이 프로토콜에 따라서 2개의 샘플들을 먼저 테스트 하였다. 샘플 MMI는 코코아 프로시아니딘의 조분리물을 나타내었으며, 감지할 수 있을 정도인 양의 카페인과 테오브로민을 포함하였다. 샘플 MM2는 겔투과 크로마토그래피에 의해서 정제된 부분적으로 분리된 코코아 프로시아니딘을 나타내었다. 카페인 및 테오브로민은 MM2에 존재하지 않았다.

전술한 방법을 사용하여, 다음의 암 세포주들에 대한 활성에 대해서 샘플들을 스크리닝하였다 :

HCT 116 결장(colon) 암

ACHN 신장 선암(adenocarcinoma)

SK-5 흑종(melanoma)

A 498 신장 선암

MCF-7 유방암

PC-3 전립선암

CAPAN-2 췌장암

어떠한 암세포주들에 대해서도 MMI에서 활성이 거의 또는 전혀 관찰되지 않았다. MM2는 HCT-116, PC-3 및 ACHN 암세포주들에 대한 활성을 갖는 것으로 관찰되었다. 그러나, MM1와 MM2는 생존 가능한 세포수를 감소시키는데 영향을 미치는 흡광도의 감소가 불명확해지도록 MTT를 방해하는 것으로 관찰되었다. 또한, 이러한 방해는 화학반응이 플레이트 둘레를 따라 웰내에서 더욱 빠르게 진행되므로, 큰 에러 장애가 되었다. 이러한 효과들의 전형적인 예는 도 5에 도시되어 있다. 고농도의 테스트 물질에서, 높은 생존 레벨이 관찰되기 보다는 생존하는 세포수의 큰 감소가 관찰될 것으로 예상하였다. 그럼에도 불구하고, 현미경관찰 실험에서는 MTT 방해 효과에도 불구하고 세포독성 효과가 나타난다는 것을 밝혀내었다. 예를들면, ACHN 세포주에 대한 MM2의 효과에 대해서는 0.5㎍/mL의 IC₅₀값이 얻어졌다.

본 발명자들의 견해에 따르면, 이들 예비 테스트 결과들은 MTT의 방해를 막는 분석과정의 보완을 필요로 하였다. 이는 다음과 같이 수행되었다. 습윤상태의 5% CO₂대기조건하에서 18시간 동안 37℃에서 플레이트를 배양한 후, 주의깊게 배지를 흡출한 다음 새로운 알파-MEM 배지로 대체하였다. 분석 3일째 되는 날에 이 배지를 웰로부터 다시 흡출한 다음 새로이 제조한 맥코이 배지 100μL로 대체하였다. PBS(포스페이트 완충 염수)중의 MTT 원액 5㎎/mL의 11μL를 각각의 플레이트의 웰에 첨가하였다. 습윤상태의 5% CO₂대기조건 하에서 4시간 동안 37℃에서 배양한 후, 이소프로판올중의 0.04N HCl 100μL를 플레이트의 모든 웰에 첨가한 다음, 생존하는 세포들에 의해서, 생성되는 포르마잔을 용해시키기 위해서 혼합하였다. 부가적으로, 활성과 관련있는 특정 성분들을 결정하기 위해서 프로시아니딘을 서브 분획화시켰다.

전술한 서브 분획화 과정은 더 스크리닝 하기 위해서 샘플들을 제조하는데 이용되었다. 도 1에 도시되어 있는 영역을 나타내는 5가지의 분획물 및 도 4A-4E에 도시되어 있는 분포성분(들)을 제조하였다. 분석 특성을 나타내고 카페인 및 테오브로마인의 부재를 확인하기 위해서 이 샘플들을 MM2A 내지 MM2E로 암호화하였다.

HCT-11, PC-3 및 ACHN 암 세포주에 대해서 각각의 분획물을 개별적으로 스크리닝하였다. 활성이 하나의 특정 분획물에 집중되지 않는다는 결과가 얻어졌다. 이러한 유형의 결과는 "활성" 천연 생성분리물중의 성분들이 상호의존적으로 행동할 수 있기 때문에, 통상적이지 못한 것으로 여겨지지는 않는다. 코코아 프로시아니딘 분리물(MM2)의 경우, 검출가능한 20가지 이상의 성분들이 상기 분리물을 포함하였다. 활성은 개개의 성분(들)과 관련된 것이기 보다는 상이한 분획물에 존재하는 성분들로 된 조합물과 관련이 있는 것으로 여겨졌다.

이들 결과를 근거로 하여, 분획물들을 합하는 것으로 결정되었으며, 동일한 암 세포주들에 대한 분석을 되풀이하는 것으로 결정되었다. 여러 분획물 조합물은 PC-3 암 세포주들에 대해서 세포독성 효과를 나타내었다. 상세하게는, 얻어진 IC₅₀값은 MM2A 및 MM2E 조합물 각각 40㎍/mL, MM2C 및 MM2E 조합물 각각 20㎍/mL 이었다. 또한 HCT-116 및 ACHN 세포주들에 대한 활성이 보고 되었으나, MTT 지시자의 방해가 정확한 관찰을 방해하였다. 데이터를 개선하기 위해서 HCT-116 및 ACHN 세포주에 대한 복제실험을 반복실시하였다. 그러나, 이들 결과는 박테리아 오염 및 테스트 샘플물질의 소모로 인하여 결론에 이르지 못하였다. 도 6A-6D는 코코아 추출물과 PC-3 암세포들로 된 조합물간의 투여량-반응 상관관계를 도시한 것이다.

그럼에도 불구하고, 이 데이터로부터 코코아 추출물, 특히 코코아 폴리페놀 또는 프로시아니딘은 사람에게 있어서의 PC-3(전립선), HCT-116(결장) 및 ACHN(신장) 암세포주에 대해 상당한 항종양 활성 ; 항암 또는 항신생물 활성을 갖는다는 사실이 분명해졌다. 뿐만아니라, 이들 결과는 특정의 프로시아니딘 분획물이 PC-3 세포주에 대한 활성의 원인이 될 수도 있다는 사실을 나타내었다.

실시예 7 : 코코아 추출물(프로시아니딘)의 항암, 항종양 또는 항신생물 활성

상기 관찰내용을 확인하고 분획 조합물을 더 연구하기 위해서, 또다른 포괄적인 스크리닝을 수행하였다.

테스트 투여량 당 4가지의 표준 복제물을 테스트 투여량 당 8 또는 12가지의 표준 복제물로 늘린 것을 제외하고는, 모든 제조된 물질과 방법들은 전술한 것과 동일하다. 이 실험을 위해서, 개개의 5가지 코코아 프로시아니딘 분획물과 이들의 조합물을 다음의 암세포주들에 대해서 스크리닝하였다.

PC-3 전립선

KB 비인두(Nasopharyngeal)/HeLa

HCT-116 결장

ACHN 신장

MCF-7 유방

SK-5 흑종

A-549 폐

CCRF-CEM T-세포 백혈병

개개의 스크리닝은 각각의 세포주에 대한 분획물 A, B, C, D 및 E(도 4A-4E 참고, supra)의 상이한 투여 레벨(0.01∼100㎍/mL)을 분석하는 단계들로 이루어졌다. 조합물 스크리닝은 각각의 세포주에 대해서 동등한 투여레벨의 분획물을 A+B, A+C, A+D, A+E, B+C, B+D, B+E, C+D, C+E 및 O+E로 합하는 단계들로 이루어졌다. 이들 분석결과들을 개별적으로 논의하였으며, 전체적으로 요약하였다.

A. PC-3 전립선 세포주

도 7A-7H는 코코아 프로시아니딘 분획물과 PC-3 세포주간의 전형적인 투여 반응 관계를 도시한 것이다. 도 7D 및 7E는 분획물 D 및 E가 75㎍/mL의 IC₅₀에서 활성을 갖는다는 것을 나타내었다. 다른 프로시아니딘 분획 조합물의 투여량-반응곡선으로부터 얻어진 IC₅₀은 분획물 D 또는 E가 존재할 때 60∼80㎍/mL의 범위에 있었다. 개개의 IC₅₀값은 표 6에 나타내었다.

B. KB 비인두/HeLa 세포주

도 8A-8H는 코코아 프로시아니딘 분획물과 KB 비인두/HeLa 세포주 간의 전형적인 투여량-반응관계를 도시한 것이다. 도 8D 및 8E는 분획물 D 및 E가 75㎍/mL의 IC₅₀에서 활성을 가짐을 나타내었다. 도 8F-8H는 분획 조합물의 연구로부터 얻어진 대표적인 결과를 도시한 것이다. 이러한 경우, 프로시아니딘 분획 조합물 A+B는 활성효과를 전혀 나타내지 않는 반면에, 분획 조합물 B+E 및 D+E는 60㎍/mL의 IC₅₀에서 활성을 나타내었다. 분획물 D 또는 E가 존재할 때, 다른 분획 조합물의 투여량 반응 곡선으로부터 얻어진 IC₅₀은 60∼80㎎/mL 범위에 있었다. 개개의 IC₅₀은 표 6에 나타내었다. 기본적으로 이들 결과는 PC-3 세포주에 대하여 얻어진 결과와 동일하였다.

C. HCT-116 결장 세포주

도 9A-9H는 코코아 프로시아니딘 분획물과 HCT-116 결장 세포주간의 전형적인 투여량 반응관계를 도시한 것이다. 도 9D 및 9E는 분획물 E가 약 400㎍/㎖의 IC₅₀에서 활성을 가짐을 나타내었다. 이 값은 곡선의 외삽법(extrapolation)에 의해서 얻어졌다. 또한, 분획물 D의 투여 반응 곡선의 기울기가 활성도를 가리킨다는 것을 주목하여야 한다. 그러나, 곡선의 기울기가 너무 얕아서 신뢰할 수 있는 값을 얻을 수 없기 때문에, 이 곡선으로부터 IC₅₀값을 전혀 측정할 수 없었다. 도 9F-9H는 분획 조합물의 연구로부터 얻어진 대표적인 결과들을 도시한 것이다. 이러한 경우에, 포로시아니딘 분획 조합물 B+D는 감지할 수 있는 활성도를 나타내지 않는 반면에, 분획 조합물 A+E 및 D+E는 각각 500㎍/mL 및 85㎍/mL의 IC₅₀에서 활성을 나타내었다. 분획물 E가 존재할 때 다른 분획 조합물의 투여량 반응곡선으로부터 얻어진 IC₅₀값은 평균적으로 약 250㎍/mL 이었다. 외삽법에 의해 측정된 IC₅₀값은 표 6에 나타내었다.

D. ACHN 신장 세포주

도 10A-10H는 코코아 프로시아니딘 분획물과 ACHN 신장 세포주간의 전형적인 투여량 반응관계를 도시한 것이다. 도 10A-10E는 개개의 분획물이 이 세포주에 대한 활성을 전혀 나타내지 않는다는 것을 보여주었다. 도 10F-10H는 분획 조합물의 연구로부터 얻어진 대표적인 결과들을 도시한 것이다. 이 경우에, 프로시아니딘 분획 조합물 B+C는 불활성을 나타낸 반면에, 분획 조합물 A+E는 외삽법으로 측정된 약 500㎍/mL의 IC₅₀값을 나타내었다. C+D 조합물의 경우와 유사한 투여량 반응곡선은 기울기가 매우 얕기 때문에 비활성을 나타내는 것으로 여겨졌다. 다른 분획 조합물의 외삽법에 의해서 측정된 IC₅₀값은 표 6에 나타내었다.

E. A-549 폐 세포주

도 11A-11H는 코코아 프로시아니딘 분획물과 A-549 폐 세포주간의 전형적인 투여량 반응관계를 도시한 것이다. 분석에 사용된 투여량에서 개개의 분획물 또는 이들 분획물로 된 조합물은 활성도를 전형 나타내지 않았다. 그러나, 그럼에도 불구하고 프로시아니딘 분획물은 이 세포주에 대한 유용성을 가질 수 있다.

F. SK-5 흑종 세포주

도 12A-12H는 코코아 프로시아니딘 분획물과 SK-5 흑종 세포주 간의 전형적인 투여량 반응관계를 도시한 것이다. 분석에 사용된 투여량에서 개개의 분획물 또는 이들 분획물로 된 조합물은 활성도를 전혀 나타내지 않았다. 그러나, 그럼에도 불구하고 프로시아니딘은 이 세포주에 대한 유용성을 가질 수 있다.

G. MCF-7 유방 세포주

도 13A-13H는 코코아 프로시아니딘 분획물과 MCF-7 유방 세포주 간의 전형적인 투여량 반응관계를 도시한 것이다. 분석에 사용된 투여량에서 개개의 분획물 또는 이들 분획물로 된 조합물은 활성도를 전혀 나타내지 않았다. 그러나, 그럼에도 불구하고 프로시아니딘 분획물은 이 세포주에 대한 유용성을 가질 수 있다.

H. CORF-CEM T-세포 루케미아 라인

전형적인 투여량 반응 곡선은 원래 CCRF-CEM T-세포 루케미아 라인에 대해서 얻어진 것이다. 그러나 상이한 분획물 농도에서 시간에 대한 세포수의 미세한 계산은 분획물 A, B 및 D의 500㎍은 4일 이상의 80% 성장 감소에 영향을 미친다는 것을 가리킨다. 대표적인 투여량 반응관계는 도 14에 나타나 있다.

Ⅰ. 요약

이 분석에서 얻은 IC₅₀값은 CCRF-CEM T-세포 루케미아를 제외하고는 모든 세포주에 대해서 표 6에 모아 기입해 놓았다. T-세포 루케미아 데이타는 다른 분석방법이 사용되었으므로 표에서 임의로 생략하였다. 본 결과의 일반적인 요약은 가장 활성인 것은 분획물 D 및 E에 관련되었다는 것이다. 이 분획물들은 PC-3(프로스테이트)와 KB(나소파린기알/Hela)세포주에 대하여 가장 활성이다. 이 분획물들은 높은 투여량에도 불구하고 HCT-116(콜론)과 ACHN(레날) 세포주에 대하여 활성이라는 것 또한 증명되었다. MCF-7(가슴), SK-5(멜라노마) 그리고 A-549(폐) 세포주에 대해서는 활성이 전혀 검출되지 않았다. 그러나, 그럼에도 불구하고, 프로시아니딘 분획물들은 이 세포주들에 관하여 유용성을 갖는다. 활성은 또한 CCRF-CEM(T-세포 루케미아) 세포주에 대해서도 나타났다. 분획물 D와 E는 조성이 가장 복잡하다는 것 또한 언급해야만 한다. 그럼에도 불구하고 이 데이타로부터 코코아 추출물, 특히 코코아 프라시아디닌이 중요한 항-종양, 항-암 또는 항 신생물 활성을 지닌다는 것은 분명하다.

표 6. 다양한 세포주에 대한 코코아 프로시아니딘 분획물의 IC₅₀값

(㎍/mL에서의 IC₅₀값)

분획물	PC-3	KB	HCT-116	ACHN	MCF-7	SK-5	A-549
A
B
C
D	90	80
E	75	75	400
A+B
A+C	125	100
A+D	75	75
A+E	80	75	500	500
B+C
B+D	75	80
B+E	60	65	200
C+D	80	75		1000
C+E	80	70	250
D+E	80	60	85

100㎍/mL이상의 값은 복용량 반응 곡선으로부터 추정되었다.

실시예 8. 코코아 추출물(프로시아니딘)의 항-암, 항-종양 또는 항신생물의 활성

생체외 분석 방법에 있어서 몇가지 부가가 실시예 6 및 7에 나타난 결과를 보충하고 확장시키기 위해 사용되었다.

방법 A. 크리스탈 바이올렛 착색 분석

모든 인간 종양 세포주들을 아메리칸 타입 배양균 수집으로 얻었다.

세포들은 항생물질이 없는 10% 어린 소 혈청을 지닌 IMEM에서 단층(monolayer)으로서 성장되었다. 세포들은 37℃에서 습한, 5% CO₂환경에서 유지되었다.

상트립신성이 파괴된(trypsinization) 후에, 세포들은 계산되어 100mL당 1,000∼2,000 세포의 농도로 조절되었다. 세포증식은 96 웰 마이크로타이터 플레이트(well microtiter plate)에 세포(1,000∼2,000 cell/well)를 플레이트시킴으로써 결정되었다. 웰(well)당 100μL 세포를 첨가한 후에 세포들을 24시간 동안 부착시켰다. 24시간 흐른 후에 다양한 코코아 분획물들은 투여량 반응 결과를 얻기 위하여 상이한 농도로 첨가되었다. 코코아 분획물들은 2배 농도로 배지에서 용해되었고 각 용액의 100μL는 3배의 웰에 첨가되었다. 다음날, 플레이트는 15분 동안 50μL 크리스탈 바이올렛(125mL 메탄올, 375mL 물에 용해된 2.5g 크리스탈 바이올렛)으로 염색되었다. 염료를 제거하고, 잉여의 염료를 제거하기 위하여 플레이트를 찬물에 담그었다. 두 번 이상 세척이 반복된후 플레이트를 건조시켰다. 나머지 염료는 각 웰에 대해서 0.1M 소듐 시트레이트/50% 에탄올 100μL를 첨가하여 용해시켰다. 용해후에 세포의 수를 540㎚에서 ELISA 플레이트 판독기(410㎚에서 레프렌스 여과기)로 세었다. ELISA 판독기로부터의 결과를 y-축은 흡광도, x-축을 일일 성장률로 하여 도시화하였다.

방법 B. 부드러운 우무 클로닝 분석

세포들은 나와타등(1981)에 의해 기술된 방법에 따라 부드러운 우무에서 클론되었다. 단일 세포 서스펜션은 다양한 농도의 코코아 분획물과 0.8% 우무가 있는 배지에서 형성되었다. 현탁액들은 1.0% 우무가 포함된 배지로 코우팅된 35㎜ 접시로 나누어졌다. 10일간의 배양후에 지름이 60㎛ 이상인 콜로니의 수는 오미니크론 3600 이미지 분석 시스템(Ominicron 3600 Image Analysis System)에서 결정되었다. 결과는 y-축은 콜로니의 수, x-축은 코코아 분획물의 농도로 도시화하였다.

방법 C. XTT-마이크로컬쳐 테트라졸륨 분석

스쿠디에로 등(1988)에 의해 기술된 XTT 분석 방법은 다양한 코코아 분획물들을 스크린하기 위하여 사용되었다. XTT 분석은 다음의 변형들을 제외하고는 MTT방법(실시예 6)을 사용하여 기술된 분석과 완전히 동일했다. XTT((2,3-비스(2-메톡시-4-니트로-5-설포페닐)-5-((페닐아미노)카르보닐)-2H-테트라졸륨 하이드록사이드)는 37℃까지 미리 데워진, 혈청이 없는 1㎎/mL 배지에서 제조되었다. PMS는 5mM PBS에서 제조되었다. XTT와 PMS는 서로 혼합되었다 ; XTT의 mL당 100μL의 PMS와 50μL의 PMS-XX는 각각 웰에 첨가되었다. 4시간 동안 37℃에서 배양한 후에 미케니칼 쉐이커(mechanical shaker)에서 30분간 혼합되었고, 흡광도는 450∼600㎚에서 측정되었다. 결과는 y-축은 흡광도, x-축은 일일 성장율로 하여 도시화하였다.

방법 A 및 C에 대해서, 결과는 또한 y-축은 퍼센트 조절, x-축은 일일성장율 또는 농도로 도시화하였다.

XTT 분석 방법과 크리스탈 바이올렛 분석방법의 비교는 어떤 분석이 가장 민감한가를 결정하기 위하여 유방암 세포주 MCF-7 P168에 대한 코코아 분획물 D & E(실시예 3B)로 이루어졌다. 도 15A에 나타낸 것처럼, 두 개의 분석은 75㎍/mL를 넘는 농도에서 같은 투여량-반응 효과를 나타냈다. 75㎍/mL 이하의 농도에서, 크리스탈 바이올렛 분석은 XTT 분석 결과보다 더 높은 표준 이탈을 나타내었다. 그러나 크리스탈 바이올렛 분석은 사용하기 쉽기 때문에, 다른 것으로 특정되지 않는다면 그 후의 모든 방법들은 이 방법으로 실행되었다.

크리스탈 바이올렛 분석 결과들은 각각 유방암 세포주 MDA MB231, 전립선암 세포주 PC-3, 유방암 세포주 MCF-7 p163, 그리고 경부암 세포주 HeLa에서 조 폴리페놀 추출물(실시예 2)의 효과를 증명하기 위해 나타내었다(도 15B-15E). 모든 경우에 있어서, 250㎍/mL의 투여량은 5∼7일 이상의 기간에서 모든 암세포의 성장을 완전히 억제시켰다. Hela 세포주는 100㎍/mL 투여량 또한 성장을 억제시켰기 때문에 추출물에 더 민감한 것처럼 보였다. 실시예 3B로부터의 코코아 분획물들은 또한 Hela와 다른 유방암 세포주 SKBR-3에 대해 분석되었다. 분획물 D & E에 나타난 결과들(도 15F 및 15G)은 높은 활성을 가진다. 도 15H와 15I에 나타난 것처럼 약 40㎍/mL의 D & E의 IC₅₀값은 두 개의 암세포주로부터 얻어졌다.

코코아 분획물 D & E는 또한 고정(anchorage) 독립 성장을 억제하기 위한 테스트 화합물(들)의 능력을 결정하는 부드러운 우무 클로닝 분석으로 테스트되었다. 도 15J에 나타난 것처럼, 100㎍/mL의 농도는 Hela세포의 클로니 형성을 완전히 억제하였다.

코코아의 세 개의 원예 품종을 나타내는 8개의 다른 코코아 유전자형으로부터 얻은 조 폴리페놀 추출물들은 또한 Hela 세포주에 대하여 분석되었다. 도 15K에 나타난 것처럼 모든 코코아 종류들은 유사한 투여량-반응 효과를 나타내었다. UIT-1 종은 Hela 세포주에 대하여 최고의 활성을 나타내었다. 이 결과들은 모든 코코아 유전자형은 지리학상의 기원, 원예품종 및 유전자형에 독립한 적어도 하나의 인간 암 세포주에 대한 활성을 유도하는 폴리페놀 분획물을 지니고 있다는 것을 증명했다.

다른 분석의 시리즈는 전통적으로 일톤 규모로부터 1일 기초의 브라질 코코아 원두를 5일 발효시키고 4일동안 태양 건조 단계를 거쳐 제조된 조폴리페놀 추출물에서 실행되었다. 도 15L에 나타난 결과에는 폴리페놀 조성물에 변화가 거의 없다는 사실을 암시하는 이전 공정 단계의 분명한 효과를 나타내지 않았다. 그러나 폴리페놀 옥시다제(PPO)는 발효단계 동안에 폴리페놀을 산화시킬 것이라는 것이 공지되어 있다(레흐리안 및 패터슨, 1983). 효소에 의해 산화된 폴리페놀이 활성에 어떤 효과를 갖는지 결정하기 위해 다른 실험이 실행될 것이다. 조 PPO는 10mL 아세톤에 대해 1gm 파우더의 비로 아세톤을 가지고 미세하게 분쇄되고 발효되지 않았으며, 동결 건조 되고 지방이 빠진 브라질 코코아 원두를 추출하여 제조되었다. 슬러리는 3,000rpm으로 15분동안 원심분리되었다. 원심분리는 부크너 여과 깔대기를 통해 부어진 네 번째 추출물로 매시간 상청액을 버리면서 세차례 반복되었다. 아세톤 분말은 공기중에서 건조된 후에 맥로드와 칼라라(1983)에 의해 기술된 방법에 따라 분석되었다. 조 폴리페놀의 용액(100㎎/10mL 시트레이트-포스페이트 완충용액, 0.02M, pH 5.5)에 아세톤 분말 100㎎(4,000 유니트 활성/㎎ 단백질)이 첨가된 후 슬러리를 통과한 공기방을의 흐름으로 30분동안 교반되었다. 샘플은 5,000xg에서 15분 동안 원심분리되었고, 상청액은 20mL 에틸 아세테이트로 3X 추출되었다. 에틸 아세테이트 추출물들은 혼합되고, 부분 진공에서 증류에 의해 건조되고 5mL 물이 첨가된 후, 동결 건조 되었다. 물질들은 그 후에 Hela 세포에 대해서 분석되었고, 투여량-반응은 효소에 의해서 처리되지 않았던 조 폴리페놀 추출물과 비교되었다. 결과들(도 15M)은 산화된 산물들이 그들의 원래 형태보다 덜 억제한다는 것을 나타내면서, 효소에 의해서 산화된 추출물에 대한 투여량-반응 곡선에서 중요한 이동을 나타낸다.

실시예 9 : 프로시아니딘을 함유하는 코코아 추출물의 항산화제 활성도.

문헌의 증거는 자연적으로 발생하는 항산화제(비타민 C, E 그리고 베타-카로텐)의 소비와 암을 포함한 질병의 낮은 발병률(디자이닝 푸드, 1993 ; 카라가이, 1992)과의 관계를 예시한다. 이들 항산화제는 어떤 타입의 종양 촉진을 포함하는 산화력 있는 자유 라디칼의 공정에 영향을 미치리라고 여겨진다. 또한 항발암성을 나타내는 어떤 식물의 다가 페놀성화합물 역시 실질적으로 항산화제 활성도를 지니고 있다(호 등., 1992 ; 후앙 등., 1992).

프로시아니딘을 함유하는 코코아 추출물이 항산화제 특성을 지니는지 여부를 결정하기 위하여 표준 란시매트 방법(Standard Rancimat method)이 적용되었다. 실시예 1, 2 및 3에 설명된 방법들은 젤침투 크로마토그래피로부터 두개의 분획물을 만들기 위해 더 처리된 코코아 추출물을 제조하기 위해 사용되었다. 이들 두개의 분획물들은 실제로 결합된 분획물 A∼C이고 항산화제의 특성을 지닌 D와 E(도 1 참고)는 합성 항산화제 BHA 및 BHT와 비교된다.

피넛 오일은 껍질을 벗긴 후에 굽지 않은 피넛을 압착하여 생성되었다. 각각의 테스트 화합물을 실제의 레벨이 표 7에 주어진, ∼100ppm 그리고 ∼20ppm의 두 레벨에서 오일에 스파이크(spike) 되었다.

항산화제가 용해된 메탄올 50μL를 항산화제의 분산을 돕기 위하여 각각의 샘플에 첨가하였다. 대조군 샘플은 항산화제가 포함되지 않은 메탄올 50μL로 제조되었다.

샘플들은 100℃, 20cc/min의 공기에서 란시매트 안정성 테스트(Rancimat stability test)를 사용하여 산화 안정성에 대해 복제로 평가되었다. 실험 파라미터는 활성산소법(Active Oxygen Method ; AOM) 또는 신속 안정성 테스트(Swift Stability test)(반 우스텐 등., 1981)가 사용된 것들과 일치시키기 위하여 선택되어졌다. 전형적인 란시매트 선은 도 16에 나타나 있다. 결과적으로 100meq의 퍼옥사이드 레벨에 이르기 위하여 필요한 시간들을 표 8에 나타내었다.

표 7. 항산화제의 농도

샘플 레벨 1 레벨 2ppm
부틸화 하이드록시톨루엔(BHT)	24	120
부틸화 하이드록시아니솔(BHA)	24	120
코코아의 조 에틸아세테이트 분획물	22	110
분획물 A-C	20	100
분획물 D-E	20	100

표 8. 다양한 항산화제를 갖는 피넛 오일의 산화 안정성

샘플 20 ppm 100 ppm평균
대조군	10.5 ± 0.7
BHT	16.5 ± 2.1	12.5 ± 2.1
BHA	13.5 ± 2.1	14.0 ± 1.4
조 코코아 분획물	18.0 ± 0.0	19.0 ± 1.4
분획물 A-C	16.0 ± 6.4	17.5 ± 0.0
분획물 D-E	14.0 ± 1.4	12.5 ± 0.7

이 결과들은 테스트된 모든 첨가제가 포함된 피넛 오일의 증가된 산화 안정성을 증명한다. 산화 안정성의 높은 증가율은 코코아의 조 에틸아세테이트 추출물과 스파이크된(spiked) 샘플에 의해서 이루어진다. 이 결과들은 프로시아니딘을 함유하는 코코아 추출물이 합성 BHA 및 BHT와 동일한 또는 그 이상의 항산화제 퍼텐셜을 갖는다는 것을 증명하였다. 따라서 본 발명은, 예를들어 항산화제 및 / 또는 식품 첨가제로서 BHA 또는 BHT의 공지된 이용에 있어서 BHT 또는 BHA 대신에 적용될 수 있다. 그리고 이와 관련하여 본 발명은 식용원(edible source)으로부터 유래되었다는 것 또한 알려졌다. 주어진 결과에 의해서, 당업자들은 또한 부적절한 실험없이, 예를들어 식품에 첨가하기 위한 양과 같이 "BHA 또는 BHT" 이용에 적용하기 위하여 본 발명의 적당한 양을 쉽게 결정할 수 있다.

실시예 10 : 토포아이소머라제 Ⅱ 억제연구

DNA 토포아이소머라제 Ⅰ과 Ⅱ는 DNA 사슬의 분해와 결합을 촉진하는 효소이고, 이것에 의하여 DNA의 위상적인 상태(topological states)가 조절된다(왕, 1985). 토포아이소모라제의 세포내의 기능에 관한 연구외에 가장 중요한 발견중의 하나는 관심없는 에피포도필로톡신 뿐만 아니라 인터칼레이팅 시약(intercalating agent)(m-AMSA, 아드리암신 및 엘립티신)을 포함하는 많은 임상학적으로 중요한 항암성 화합물(야마시타 등., 1990)에 대한 1차 세포 타겟(primary cellular target)으로서의 토포아이소머타제 Ⅱ를 증명한 것이다. 증거의 몇개의 선들은 어떤 항종양성 약들은 DNA 분리를 유도하는 결과를 가져오는(뮬러 등., 1989) 변성시약에 노출된 DNA-토포아이소머라제 Ⅱ 복합체("분리 복합체")를 안정화시키는 공통적인 특성을 지니고 있다는 것을 나타낸다. 항종양성 약품에 의한 분리 복합체의 형성은 세포를 죽일 수 있는 부피가 큰 DNA 부가물을 생성시킨다는 것을 암시한다.

이러한 흥미있는 모델에 따라서, DNA 토포아이소머라제 Ⅱ 분리 복합체의 특이하고 새로운 유도체는 항-암, 항-종양, 항신생물의 시약으로서 유용하다. 활성을 지니는 세포독소 화합물이 타겟 DNA라는 것을 증명하기 위한 시도에 있어서, 코코아 프로시아니딘은 세포주에 민감한 몇몇의 DNA-손상물에 대해 강화된 세포독소 활성으로 스크린되었고, 인간 토포아이소머라제 Ⅱ의 효소 분석은 임파종으로부터 얻어졌다.

A. 토포아이소머라제 Ⅱ에 의한 키네토플라스트 DNA의 분리.

뮬러 등(1989)에 의해 기술된 키네토플라스트 DNA에 있는 토포아이소머라제 Ⅱ 분리의 생체외 억제는 다음과 같이 실행된다.

토포아이소모라제 Ⅱ 활성을 지니는 핵 추출물은 밀레 등(1981) 그리고 단스크 등(1988)의 방법을 변형시켜서 인간 임파종으로부터 제조되었다. 정제된 효소의 한개의 유니트는 34℃에서 30분동안 키네토플라스트 DNA 0.25μg을 분리시키는데 충분했다. 키네토플라스트 DNA는 트리파노솜 크리티디아 파시큘라타(trypanosome Crithidia fasciculata)로부터 얻었다. 각각의 반응은 H₂O 19.5μL, 10X완충용액 2.5μL(1X완충용액은 PH 8.0의 트리스-HCl 50mM, KCl 120mM, MgCl₂10mM, ATP 0.5mM, 디티오트레이톨 0.5mM 및 30μg BSA/mL를 포함한다), 키네토플라스트 DHA 1μL(0.2μg), 그리고 여러가지 농도를 지닌 코코아 프로시아니딘 테스트 분획물을 포함한 1μL DMSO가 있는 0.5mL의 미량원심분리기 튜브(microcentrifuge tube)에서 일어났다. 이러한 조합물을 완전히 혼합하고 얼음에 방치시켰다. 토포아이소머라제의 하나의 유니트를 즉시 첨가하고 나서 30분동안 34℃의 수조에서 배양하였다.

배양 후에, 분리 분석은 5μL의 스톱 완충용액(5% 사르코실, 0.0025% 브로모페놀 블루, 25% 글리세롤)의 첨가에 의해서 중지되었고 얼음에 놓여졌다. DNA는 에티디움 브로마이드(0.5μg/mL)를 포함하는 TAE 완충용액에 있는 1% 아가로스 젤상에서 전기이동되었다. 310nm 파장에서의 자외선 조도는 DNA를 예상하게 하였다. 젤은 폴라로이드 랜드 카메라(Polaroid Land Camera)를 사용하여 촬영했다.

도 17은 이들 실험결과를 나타낸다. 완전히 결합된 키네토플라스트 DNA는 1% 아가로스 젤로 이동하지 않는다. 토포아이소머라제 Ⅱ에 의한 키네토플라스트 DNA의 분리는 젤로 이동하는 단위체 DNA의 밴드(모노머 써클, Ⅰ과 Ⅱ를 형성)를 생성한다. 코코아 프로시아니딘의 첨가에 의한 효소의 억제는 농도의 증가에 따라 모노머 밴드가 점차적으로 사라짐으로써 분명해진다. 이 결과를 기초로 하여, 코코아 프로시아니딘 분획물 A, B, D 및 E는 0.5∼5.0μg/mL의 농도범위에서 토포아이소모라제Ⅱ를 억제시킨다는 것이 알려졌다. 이들 억제제 농축물들은 미톡산트론 및 m-AMSA(4'-(9-아크리디닐아미노)메탄설폰-m-아니시디드)용으로 얻어진 것들과 매우 유사했다.

B. 약물 민감성 세포주

코코아 프로시아니딘은 몇개의 DNA-손상 민감성 세포주에 대해 세포독성으로 스크린되었다. 세포주중의 하나는 피, 제고(켐프 등., 1984)에 의해 개발된 xrs-6 DNA 이중사슬을 절단하는 수복 돌연변이체였다.

xrs-6 세포주의 DNA 수복 결실은 특히 X-선에 민감하게 만들고, 블레오미신처럼 직접 DNA 이중사슬을 절단하고, 토포아이소머라제 Ⅱ를 억제하므로 왈터 등(1991)에 의해 제안된 것처럼 간접적으로 이중사슬의 절단을 유도할 수 있다. 수복 결실 라인을 향한 세포독성은 DNA 수복 프로피션트(proficient) CHO 라인, BR1에 대한 세포독성과 비교되었다. 수복 결실(xrs-6)라인을 향한 강화된 세포독성은 DNA 분리된 이중사슬의 절단 형성을 증거로 설명되었다.

DNA 수복 콤피텐트 CHO 라인, BR1은 바로우스 등(1987)에 의해 개발되었고 정상적인 CHO DNA 수복 효소를 첨가하여 O⁶-알킬구아닌-DNA-알킬트랜스퍼라제로 발현되었다. CHO 이중사슬을 절단하는 수복 결실 라인(xrs-6)은 Dr. P. 제고와 그의 협력자들(제고 등., 1989)로부터의 관대한 선물이었다. 이들 두개의 라인들은 실시예 6에 기술된 바와 같이 혈청과 항생물질을 포함하는 알파-MEM에서 단층으로 성장하였다. 세포들은 습기찬 5% CO₂환경에서 37℃가 유지되었다. 코코아 프로시아니딘으로 처리하기 전에, 단층으로의 세포 성장을 트립신 처리로 분리시켰다. 실시예 6에 기술된 MTT 분석방법을 사용하여 분석되었다.

xrs-6 세포를 향한 어떤 강화된 세포독성도 없다는 결과(도 18)는 분리된 이중사슬 절단형성과는 다른 방법으로, 코코아 프로시아니딘은 토포아이소머라제 Ⅱ를 억제한다는 것을 예시하는 것이다. 즉, 코코아 프로시아니딘은 비분리 복합체를 형성하기 위하여 DNA와 상호작용 하기 전에 토포아이소머라제 Ⅱ와 상호작용한다.

화합물을 형성하는 비분리 복합체는 상대적으로 새로운 발견이다. 안트라시클린(anthracyclines), 포도필린 알카로이드(podophylin alkaloids), 안트라세네디온(anthracenediones), 아크리딘(acridines) 및 엘립티신의(ellipticines) 멤버들은 모두 임상적인 항-암, 항-종양 또는 항신생물의 사용을 위해 입증되고, 이들은 분리 복합체(리우, 1989)를 만든다. 분리 복합체를 만든다는 것이 나타나 있지 않은 몇가지 새로운 종류의 토포아이소머라제 Ⅱ 억제제들이 최근에 증명되었다. 이들에는 아모나파이드(흐시앙 등., 1989), 티스타미신(페센 등., 1989), 플라바노이드(야마시타 등., 1990), 사인토핀(야마시타 등., 1991), 멤브라논(드레이크 등., 1989), 테르페노이드(카와다 등., 1991), 안트라피라졸(프리 등., 1985), 디옥소피페라진(타나베 등., 1991), 그리고 마린 아크리딘-데르시틴(부레스 등., 1989)이 있다.

코코아 프로시아니딘은 분리 복합체가 형성되기 전에는 토포아이소머라제 Ⅱ를 비활성화시키므로, 단독으로 또는 다른 공지되고 기계론적으로 정의된 토포아이소머라제 Ⅱ 억제제와 결합하여 화학요법 값을 지닌다. 게다가, 코코아 프로시아니딘은 또한 새로운 종류의 토포아이소머라제 Ⅱ 억제제(카시와다 등., 1993)인 것처럼 보이고, 다른 공지된 억제제보다 세포에 대한 독성이 덜하며, 이로 인하여 화학요법에서 이용률을 높인다.

멤브레인을 발현하는 인간 유방암 세포주 MCF-7(ADR)는 다-약품 저항성(레오네사 등., 1994)을 주기 위해서 글리코프로틴(gp170)과 결합하였고, 그것의 부계 MCF-7 p168은 코코아 분획물 D & E의 효과를 분석하기 위해서 사용되었다. 도 19에 나타난 것처럼 부계는 분획물 D & E의 증가하는 투여량 레벨에서 억제되었고, 여기에서 아드리암신(ADR) 저항 라인은 투여량이 높을수록 덜 효과적이었다. 코코아 분획물 D & E는 다-약품 저항 세포주에서 효과가 있다는 결과를 보여준다.

실시예 11 : 프로시아니딘의 합성

프로시아니딘의 합성은 델코우어 등(1983)에 의해 개발된 방법을 변형시켜 실행되었다. 환원조건하에서 (+)-카테킨과 디하이드로케르세틴을 농축시킨 후에, (-)-에피카테킨은 또한 비발효된 코코아 원두에서 자연적으로 발생하는 (-)-에피카테킨의 고농도를 나타내기 위하여 사용되었다. 합성된 생성물은 실시예 3,4 및 5에 기술된 방법에 의해서 분리, 정제, 분석 및 증명되었다. 이러한 방법으로 바이플라바노이드(biflavanoid), 트리플라바노이드(triflavanoid) 및 테트라플라바노이드(tetraflavanoid)가 제조되었고, 코코아 추출물과 연관된 상기 기술된 방법으로 분석의 표준으로서 사용되었다.

실시예 12 ; 정상 반-정제 분획물의 분석

폴리페놀 추출물들은 구조적으로 복합체이므로, 성분들은 그 이상의 정제, 투여량-반응 분석 및 포괄적인 구조적 확인을 위하여 암 세포주에 대하여 활성이었다. 정상 반 정제된 HPLC 분리(실시예 3B)는 올리고머 크기를 기초로 하여 코코아 프로시아니딘을 분리하기 위해 사용되었다. 원래의 추출물 외에, 12개의 분획물들이 제조되었고(도 2B 및 15 0) 어떤 올리고머가 최대 활성을 지니는가를 결정하기 위하여 HeLa 및 SKBR-3 암세포주에 대하여 100μg/mL와 25μg/mL 투여량으로 분석되었다. 도 20A와 B에 나타난 것처럼, 분획물 4-11(펜타머-도데카머)은 100μg/mL 레벨에서 HeLa와 SKBr-3 암세포주를 상당히 억제시켰다. 이들 결과는 특이한 올리고머가 Hela와 SKBr-3 세포에 대하여 최대의 활성을 갖는다는 것을 나타낸 것이다. 또한 코코아 분획물 D & E의 정상 HPLC 분석은 예를들어 실시예 7과 같은 공지의 연구에서 사용된 분획물이 이들 올리고머로 강화되었다는 것을 나타내었다.

실시예 13 : HPLC 정제방법

방법 A. GPC 정제

실시예 2에서 얻은 프로시아니딘은 3.5mL/min의 유량에서 용리용매로서 100% 메탄올을 사용하여 세파덱스 LH 20(72.5×2.5cm)상에서 용액 크로마토그래피에 의해서 부분적으로 정제되었다. 용리액의 분획물들을 처음 1.5시간 후에 모았고, 물에 재용해된 회전식 증발기로 분획물들을 농축시킨 후 동결 건조시켰다. 이들 분획물들은 펜타머 강화 분획물로서 언급되었다. 실시예 2로부터 얻어진 추출물의 약 2.00g을 이 방법으로 서브 분획시켰다. 결과는 표 9에 나타내었다.

표 9. 획득 분획물의 조성

분획물(시간)	모노머(%)	다이머(%)	트라이머(%)	테트라머(%)	펜타머(%)	헥사머(%)	헵타머(%)	옥타머(%)	노나머(%)	데카머(%)	운데카머(%)	나머지(%)
1:15	73	8	16	3	ND	ND	ND	ND	ND	ND	ND	ND
1:44	67	19	10	3	1	tr	tr	tr	tr	tr	tr	tr
2:13	30	29	24	11	4	1	tr	tr	tr	tr	tr	tr
2:42	2	16	31	28	15	6	2	tr	tr	tr	tr	tr
3:11	1	12	17	25	22	13	7	2	1	tr	tr	tr
3:40	tr	18	13	18	20	15	10	5	2	tr	tr	tr
4:09	tr	6	8	17	21	19	14	8	4	2	tr	tr

ND = 분리되지 않은 것

tr = 선량

방법 B. 정상 분리

실시예 2에서 얻은 프로시아니딘은 유량이 1.0mL/min인 수펠코실 LC-Si, 100Å, 5μm(250×4.6mm), 또는 선택적으로 유량이 0.5mL/min인 리크로스페어 실리카 100, 100Å, 5μm(235×3.2mm)에서 정상 크로마토그래피에 의해서 정제되면서 분류되었다. 다음 조건의 단계 변화도에 의해서 분리가 촉진되었다 ; (시간, %A, %B) ; (0, 82, 14), (30, 67.6, 28.4), (60, 46, 50), (65, 10, 86), (70, 10, 86). 이동상 조성은 A=디클토로멘탄 ; B=메탄올 ; 및 C=아세트산 : 물(1:1)이었다. 성분들은 280nm의 UV에 의해서, λ_ex=276nm이고 λ_em=316nm인 형광에 의하여 검출되었다. 주입 용량은 실시예 2로부터 얻은 프로시아니딘 5.0μL(20mg/mL)이었다. 이 결과들을 도 40A 및 40B에 나타내었다.

선택적으로, 다음 조건의 단계 변화도에 의해서 분리가 촉진되었다 ; (시간, %A, %B) ; (0, 76, 20) : (25, 46, 50) ; (30, 10, 86). 이동상 조성은 A=디클로로메탄 ; B=메탄올 ; 및 C=아세트산 : 물(1:1)이었다. 결과를 도 41A 및 41B에 나타내었다.

방법 C. 역-상 분리

실시예 2에서 얻은 프로시아니딘은 휴렛 팩커드 하이퍼실 ODS(Hewlett Packard Hypersil ODS) 5μm(200×2.1mm)상의 역 상 크로마토그래피 그리고 휴렛 팩커드 하이퍼실 ODS 5μm 가드 칼럼(20×2.1mm)에 의해서 정제되고 분리되었다. 프로시아니딘은 20분동안 A에 대한 20% B의 선형 기울기로 용리되었고 이어서 칼럼은 0.3mL/min의 유량에서 100% B로 세척되었다. 이동상 조성은 B=메탄올에서의 1.0% 아세트산 그리고 A=나노수준으로 순수한 물(이하, 나노-순수한 물이라 한다)에서의 2.0% 아세트산인 가스가 제거된 혼합물이었다. 성분들은 280nm의 UV와 λ_ex=276nm이고 λ_em=316인 형광으로 검출되었다 ; 그리고 주입용량은 2.0μL(20mg/mL)이었다.

실시예 14 : 펜타머 강화 분획물의 HPLC 분리

방법 A. 반-정제 정상 HPLC

펜타머 강화 분획물들은 254nm에 세트된 밀리포오-워터 모델 480LC 탐지기가 장착된 휴렛 팩커드 1050 HPLC 시스템의 반-정제 정상 HPLC에 의해 더 정제되었으며, 피크 모드에 세트된 팔마시아 프락-100 분획물 집진기로 어셈블되었다. 분리는 수펠코 5μ 수펠가드 LC-Si 가드 칼럼(20×4.6mm)과 연결된 수펠코 5μm 수펠코셀 LC-Si, 100Å 칼럼(250×10mm)에서 효과적이었다. 프로시아니딘은 다음 조건하에서 선형 기울기에 의해서 용리되었다 : (시간, %A, %B) ; (0, 82, 14), (30, 67.6, 28.4), (60, 46, 50), (65, 10, 86), (70, 10, 86). 다음에는 10분의 재평형이 이어졌다. 이동상 조성물은 A=디클로로메탄 ; B=메탄올 ; 및 C=아세트산 : 물(1:1)이었다. 3mL/min의 유량이 사용되었다. 성분들은 254nm의 UV에 의해 검출되었고 ; 키프 앤드 조난 BD41 기록계(Kipp & Zonan BD41 recorder)에 기록되었다. 주입 용량은 0.25mL 70% 수용성 아세톤에 용해된 프로시아니딘 추출물 10mg의 100∼250μl 범위에 이른다. 각각의 피크 또는 선택성 크로마토그래피의 영역을 그 이상의 정제와 잇따른 계산을 위한 분획물 수집에 의하여 일정한 시간간격으로 또는 수동식으로 모았다.

HPLC 조건 : 250×100nm 수펠코 수펠코실 LC-Si

(5μm) 반제조 칼럼

20×4.6mm 수펠코 수펠코실 LC-Si

(5μm) 가드 칼럼

검출기 : 물 LC

스펙트로포토미터 모델

480@ 254nm

유량 : 3mL/min

칼럼온도 : 주위온도

주입 : 펜타머 강화 추출물 250μL

아세트산 :

기울기 CH₂Cl₂메탄올 물(1:1)

0 82 14 4

30 67.6 28.4 4

60 46 50 4

65 10 86 4

70 10 86 4

방법 B. 역상 분리

실시예 13에서 얻은 프로시아니딘 추출물은 0.45μ 나이론 필터를 통해 여과 되었고, 다이오드 어레이 검출기(Diode Array detector)와 HP 모델 1046A 프로그래머블 형광 검출기(HP model 1046A Programmable Fluorescence Detector)가 장착된 휴렛 팩커드 1090 터나리 상 HPLC 시스템에 의해서 분석되었다. 45℃, 휴렛 팩커드 5μ 하이퍼실 ODS 칼럼(200×2.1mm)에서 분리는 효과적이었다. 프로시아니딘은 A에 대한 60% B의 선형 기울기로 용리되었으며, 이어서 칼럼은 0.3mL/min의 유량에서 B로 세척되었다. 이동상의 조성물은 B=메탄올에 있는 0.5% 아세트산이고 A=나노-순수한 물에 있는 0.5% 아세트산의 가스가 제거된(de-gassed) 혼합물이었다. A와 B 이동상에서의 아세트산 레벨은 2%까지 증가될 수 있다. 성분들은 λ_ex=276nm이고 λ_em=316nm인 형광과 280nm에서의 UV에 의하여 검출되었다. (+)-카테킨과 (-)-에피카테킨의 농도는 표준용액에 대해서 상대적으로 결정되었다. 프로시아니딘 레벨은 (-)-에피카테킨의 반응 계수를 사용하여 측정되었다.

방법 C. 정상 분리

실시예 13에서 얻은 펜타머 강화 프로시아니딘 추출물은 0.45μ 나일론 필터를 통해 여과되었고, HP 모델 1046A 프로그래머블 형광 검출기와 다이오드 어레이 검출기가 장착된 휴렛 팩커드 1090 시리즈 Ⅱ HPLC 시스템에 의해 분석되었다. 수펠코 수펠가드 LC-Si 5μ 가드 칼럼(20×4.6mm)과 연결된 5μ 페노메넥스 리크로스페어 실리카 100칼럼(250×3.2mm), 37℃에서 분리되는 것이 효과적이었다. 프로시아니딘은 다음의 조건하에서 선형 기울기에 의해서 용리되었다 ; (시간, %A, %B) ; (0, 82, 14), (30, 67.6, 28.4), (60, 46, 50), (65, 10, 86), (70, 10, 86), 이어서 8분동안 재-평형이 이루어졌다. 이동상의 조성은 A=디클로로메탄, B=메탄올, 및 C=용적비가 1:1인 아세트산 : 물이었다. 0.5mL/min의 유량이 사용되었다. 성분들은 λ_ex=276nm, λ_em=316nm인 형광과 280nm에서의 UV에 의해 검출되었다. 다양한 프로시아니딘 분리를 나타내는 대표적인 HPLC 크로마토그램은 하나의 유전자형을 위하여 도 2에 나타나 있다. 유사한 HPLC 프로필이 다른 테오브로마(Theobroma), 헤라니아(Herrania) 및 / 또는 그들의 상호 또는 내부의 특이한 크로스로부터 얻어졌다.

HPLC 조건 :

250×3.2mm 페노메넥스 리크로스페어 실리가 100

칼럼(5μ) 20×4.6mm 수펠코 수펠가드 LC-Si(5μ) 가드 칼럼

검출기 : 포토다이오드 어레이 @280nm

형광 λ_ex=276nm ; λ_em=316nm

유량 : 0.5mL/min

칼럼 온도 : 37℃

아세트산 :

변화도 : CH₂Cl₂메탄올 물(1:1)

0 82 14 4

30 67.6 24.8 4

60 46 50 4

65 10 86 4

70 10 86 4

방법 4. 제조된 정상 분리

실시예 13에서 얻은 펜타머 강화 분획물들은 리가우드 등.,(1993) J.크롬 (654, 255∼260)의 방법을 변형시켜 제조된 정상 크로마토그래피에 의해서 그 이상 정제되었다.

분리는 적당한 가드 칼럼이 있는 5μ 수펠코실 LC-Si 100Å 칼럼(50×2㎝)에서 주위 온도에 영향을 받는다. 프로시아니딘은 다음의 조건하에서 선형 기울기에 의해 용리되었다 ; (시간, %A, %B, 유량) ; (0, 92.5, 7.5, 10) ; (10, 92.5, 7.5, 40) ; (30, 91.5, 18.5, 40) ; (145, 88, 22, 40) ; (150, 24, 86, 40) ; (155, 24, 86, 50) ; (180, 0, 100, 50). 사용하기 전에 이동상 성분들을 다음의 프로토콜과 혼합시켰다.

용매 A 제조(82% CH2Cl2, 14% 메탄올, 2% 아세트산, 2% 물) ;

1. 80mL의 물을 측정하여 4L 병에 붓는다.

2. 80mL의 아세트산을 측정하여 동일한 4L병에 붓는다.

3. 560mL의 메탄올을 측정하여 동일한 4L병에 붓는다.

4. 3280mL의 메틸렌 클로라이드를 측정하여 4L 병에 붓는다.

5. 병뚜껑을 닫고 잘 섞는다.

6. 5∼10분 동안 가스가 빠질때까지 고순도 헬륨으로 혼합물을 세척한다.

용매 A의 부피가 8이 될때까지 1∼6 단계를 2번 반복한다.

용매 B 제조(96% 메탄올, 2% 아세트산, 2% 물)

1. 80mL의 물을 측정하여 4L 병에 넣는다.

2. 80mL의 아세트산을 측정하여 같은 4L병에 넣는다.

3. 3840mL의 메탄올을 측정하여 같은 4L병에 넣는다.

4. 병뚜껑을 닫고 잘 섞는다.

5. 5∼10분동안 가스가 빠질 때까지 고순도 헬륨으로 혼합물을 세척한다.

용액 B의 부피가 4가 될때까지 1∼5단계를 반복한다.

이동상 조성은 A=2% 아세트산과 2% 물이 있는 메틸렌클로라이드 ; B=2% 아세트산과 2% 물이 있는 메탄올이다. 칼럼하중은 7mL에서 0.7g이다. 성분들은 254nm에서 UV에 의해 검출되었다. 전형적으로 준비된 코코아 프로시아니딘의 정상 HPLC 분리는 도 42에 나타나 있다.

HPLC 조건 :

칼럼 : 50×20cm 5μ 수펠코실 LC-Si 런 @주위온도

이동상 : A=2% 아세트산과 2% 물이 있는 메틸렌클로라이드

B=2% 아세트산과 2% 물이 있는 메탄올

변화도 / 흐름 프로필

시간(MIN)	%A	%B	유량(mL/min)
0	92.5	7.5	10
10	92.5	7.5	40
30	91.5	8.5	40
145	88.0	22.0	40
150	24.0	86.0	40
155	24.0	86.0	50
180	0.0	100.0	50

실시예 15 : 프로시아니딘의 확인

실시예 14, 방법 4에 의해 얻어진 프로시아니딘은 레크로이 9350 500 MHz 오실로스코우프가 장착된 HP G2025A MALDI-TOF/MS 시스템을 사용한 매트릭스 어시스티드 레이저 디솔프션 이오니제이션-타임 오브 플라이트/매스 스펙트로메트리(Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight/Mass Spectrometry ; MALDI-TOF/MS)에 의하여 분석되었다. 장치는 제조자의 지시에 따라 저분자량 펩타이드 표준(HP Part No. G2051A) 또는 샘플 매트릭스로서 2,5-디하이드록시벤조산(DHB)(HP Part No. G2056A)의 펩타이드 표준(HP Part No. G2052A)으로 눈금측정되었다. 샘플 하나(1.0)㎎은 70/30 메탄올/물 500mL에 용해되었고, 그 이후에 샘플은 1:1, 1:10 또는 1:50(샘플:매트릭스)의 비율로 DHB 매트릭스와 혼합되었고 진공중에서 메사(mesa)에서 건조되었다. 샘플은 4.75kV로 세트된 검출기 전압으로 양이온 모드에서 분석되었고 레이저 파워는 1.5∼8μJ 사이에 세트되었다. 데이타는 많은 단일 샷(single shots)의 합산으로 모아졌고 분자량과 시간흐름의 유니트로 표시되었다. 대표적인 MALDI-TOF/MS는 도 22A에 나타나 있다.

실시예 3, 방법 A에 기술된 바와 같이 제조되고, 실시예 6 및 7에 기술된 것처럼 생체외 평가용으로 사용된 부분적으로 정제된 프로시아닌으로부터 얻은 MALDI-TOF/MS 스펙트럼은 도 22 및 C에 나타나 있고, 이 결과들은 표 6에 요약되어 있다. 이 데이타는 본 명세서에서 기술된 본 발명의 화합물들은 주로 분획물 D-E에서 발견되고 분획물 A-C에서는 발견되지 않는다는 것을 예시한다.

얻어진 스펙트럼은 다음과 같다 :

SEP-PACK C-18 카트리지(cartridge)에 의해 초기에 정제된 분획물은 예외로 하고, 정제된 D-E 분획물은 상기 기술된 바와 같이 MALDI-TOF/MS에 의한 것이다. 나노-순수한 물 1mL에 있는 분획물 다섯(5)㎎은 미리-평형이 이루어진 SEP-PACK 카트리지에 적재되었다. 칼럼은 나노-순수한 물 5mL로 세척하여 오염물질을 제거하였고, 프로시아니딘은 20% 메탄올 1mL로 용리되었다. 그 이상 정제되지 않고, 실시예 3, 방법 A에서 분리된 것처럼 분획물 A-C는 직접 사용되었다.

이 결과들은 확인되었고 초기의 결과들(실시예 5, 표 3, 도 20A 및 B 참고)을 확장시켰으며, 본 발명의 화합물들이 양이온의 포집제로 이용된다는 것을 나타낸다. 특히, MALDI-TOF/MS 결과는 n=5인 그리고 고차 프로시아니딘 올리고머들(도 20A 및 B ; 그리고 본 발명은 목적과 요약에 있는 구조식)은 HeLa 및 SKBR-3 암 세포주 모델과 항-암 활성이 상당히 연관되어 있다는 것을 결론적으로 나타내었다. n=4 또는 그 이하인 올리고머들은 이 모델로는 효과가 없다. 펜타머 구조는 그 안에 그리고 고차의 올리고머에 있어서 활성을 제공하는 구조적 모티프(motif)를 분명히 지니고 있다. 또한 양이온 포집제로서의 이용을 증명하면서, MALDI-TOF/MS 데이타는 Na⁺, 2Na⁺, K⁺, 2K⁺, Ca⁺⁺의 강한 M⁺이온을 나타낸다는 것이 관찰되었다.

실시예 16 : 올리고머 분획물의 정제

방법 A. 반-정제 역상 HPLC에 의한 정제

실시예 14, 방법 A, B 및 D에 의해서 얻은 프로시아니딘은 그 이상의 구조적 확인과 설명(예를들어 실시예 15, 18, 19 및 20)을 위하여 동일한 올리고머의 실험량을 얻기 위하여 더 분리되었다. 다양한 파장 검출기와 1mL 주입 루프가 있는 레오다인 7010 주입밸브가 장착된 휴렛 팩커드 1050 HPLC 시스템은 파마시아 FRAC-100 분획 수집기로 어셈블되었다. 페노메넥스 10μ ODS 울트라카브(60×10㎜)가드 칼럼과 연결된 페노메넥스 울트라카브 10μ ODS 칼럼(250×22.5㎜)에서 분리되는 것이 효과적이었다. 이동상 조성은 하기의 선형 기울기 조건 : (시간, %A) ; (0, 85), (60, 50), (90, 0) 및 (110, 0)과 5mL/min의 유량에서 사용된 A=물 ; B=메탄올이었다. 각각의 피크 또는 선택 크로마토그래피 영역은 MALDI-TOF/MS 및 NMR에 의해 그 이상 측정하기 위한 분획물 수집에 의해 일정한 시간간격에서 수작업으로 수집되었다. 주입하중은 물질의 25∼100㎎ 범위였다. 대표적인 용리 프로필은 도 23b에 나타나 있다.

방법 B. 변형된 반-정제 HPLC

실시예 14, 방법 A, B 및 D로부터 얻은 프로시아니딘은 그 이상의 구조적 확인 및 설명(예를들어 실시예 15, 18, 19 및 20)을 위하여 동일한 올리고머의 실험량을 얻기 위해 더 분리되었다. 수펠코실 LC-Si 5μ(20×2㎜)가드 칼럼과 연결된 수펠코실 LC-Si 5μ(250×10㎜). 주위 온도, 3.0mL/min의 유량에서 분리가 효과적이었다. 이동상 조성물은 A=디클로로메탄 ; B=메탄올, 그리고 C=아세트산 : 물(1:1)이었고 ; 하기의 선형 기울기 조건하에서 사용되었다 : (시간, %A, %B) ; (0, 82, 14) ; (22, 74, 21) ; (32, 74, 21) ; (60, 74, 50, 4) ; (61, 82, 14), 이어서 칼럼은 7분동안 재-평형되었다. 주입량은 강화된 펜타머 12㎎이 포함되어 60μL이었다. 성분들은 280nm에서 UV에 의해 검출되었다. 대표적인 용리액 프로필은 도 23A에 나타나 있다.

실시예 17 : 펜타머의 분자 모델링

구조를 최소화시키는 에너지는 3.0 버젼의 데스크탑 모리큘러 모델러(Desktop Molecular Modeller ; Oxford University Press, 1994)에 의해 결정되었다. 에피카테킨의 구조를 기초로 하는 [EC(4→8)]₄-EC(EC=에피카테킨)의 4개의 대표적인 그림은 도 24A-D에 나타나 있다. 나선형 구조가 예상된다. 일반적으로 에피카테킨이 첫 번째 모노머이고 결합이 4→8일 때 결론적으로 베타 배열이 나타나며, 첫 번째 모노머가 카테킨이고 결합이 4→8일 때 결론적으로 알파 배열이 나타난다 ; 이 결과들은 두 번째 모노머가 에피카테킨 또는 카테킨(예외는 ent-EC(4→8)ent-EC)이냐에 상관없이 얻어진다. 도 38A-38P는 바람직한 펜타머를 나타내고, 도 39A∼39P는 펜타머까지 그리고 펜타머를 포함하는 입체 이성체의 라이브러리를 나타낸다. 이로부터 본 발명의 범위내에 있는 다른 화합물들은 부적절한 실험 없이도 제조될 수 있다.

실시예 18 : 피로시아니딘의 NMR 측정

¹³C NMR 분광학은 일반적으로 프로시아니딘의 연구를 위한, 특히 일반적으로 양질의 스펙트럼을 제공하는 페놀로서 유용한 기술로 간주되고, 여기서 양성자 NMR 스펙트럼은 상당히 광범위하다. 올리고머의¹³C NMR 스펙트럼으로 A 또는 B고리 치환 유형에 유용한 정보, 어떤 경우에 있어서는 C고리의 상대적인 입체화학, 플라바노이드 사이의 연결(interflavanoid linkages)의 위치를 알 수 있다.

또한 HOHAHA는 알파, 베타, 감마 또는 델타 양성자에 상응하는 크로스 피크(cross peak)를 얻기 위하여 서열상에서 자화(magnetization)를 첫 번째 수소에서 두 번째 수소로 이동시키는 펄스 기술을 사용한다. COSY는 2D-포우리어 변형 NMR 기술이며, 여기에서 수직축과 수평축은¹H 화학적 이동과 1D 스펙트럼을 제공하고 ; 교차점은 양성자 사이의 상관관계를 제공한다. 이것에 의하여 스핀-스핀 커플링이 결정될 수 있다. HMQC 스펙트럼은 양성자보다 핵의 NMR 스펙트럼의 민감성을 증대시키고, 제2차 및 제3차 탄소로부터 각각의 양성자까지의 크로스 피크를 나타낼 수 있다. APT는 탄소에 있는 수소의 수를 결정하는데 사용된¹³C 기술이다. 탄소에 있는 짝수의 양성자는 플러스 신호의 결과로 나타난 것이고, 반면에 탄소에 있는 홀수의 양성자는 마이너스 신호의 결과일 것이다.

그러므로¹³C NMR,¹H NMR, HOHAHA(호모뉴클리어 할트만-한 : homonuclear Hartmann-Hahn), HMQC(헤테로 뉴클리어 멀티플 콴텀 코히어런스 ; heteronuclear multiple quantum coherence), COSY(호모뉴클리어 코릴레이션 스펙트로스코피 ; Homonuclear correlation spectroscopy), APT(어태치 프로톤 테스트 ; attached proton test) 및 XHCORR(HMQC에서의 다양성 : a variation on HMQC) 분광학은 본 발명 화합물의 구조를 설명하기 위하여 사용되었다.

방법 A. 모노머

모든 스펙트럼들은 중수소화된 메탄올, 실온, 샘플 농도는 약 10㎎/mL 조건에서 얻어졌다. 스펙트럼은 내부표준으로서 메탄올을 사용하여 브루커 500 MHZ NMR에서 얻어졌다.

도 44A-E는 에피카테킨 모노머의 구조를 특징짓기 위해 사용된 NMR 스펙트럼을 나타낸다. 도 44A는 판상 형태에서의¹H 및¹³C의 화학적 이동을 나타낸다. 도 44 B-E는 에피카테킨의¹H, APT, XHCORR 그리고 COSY의 스펙트럼을 나타낸다.

유사하게, 도 45A-F는 카테킨 모노머의 구조를 특징짓기 위해 사용된 NMR 스펙트럼을 나타낸다. 도 45A는 판상 형태에서의¹H 및¹³C의 화학적 이동을 나타낸다. 도 44B-F는 카테킨의¹H,¹³C, APT, XHCORR 및 COSY의 스펙트럼을 나타낸다.

방법 B. 다이머

모든 스펙트럼들은 내부 표준으로서 아세톤을 사용하여 D₂O의 75% 중수소화된 아세톤, 샘플 농도가 약 10㎎/mL의 조건에서 얻어졌다.

도 46A-G는 B2 다이머의 구조를 특징짓기 위해 사용한 스펙트럼을 나타낸다. 도 46A는 판상 형태에서의¹H 및¹³C의 화학적 이동을 나타낸다. T와 B라는 용어는 다이머의 윗면 반(top half)과 다이머의 아랫면 반(bottom half)을 나타낸다.

도 46B와 C는 각각 실온, 브루커 500MHZ NMR에서 얻어진¹³C와 APT 스펙트럼을 나타낸다.

도 46D-G는 각각¹H, HMQC, COSY 및 HOHAHA를 나타내고, 이들은 -7℃, AMZ-360 MHZ NMR에서 얻어졌다. COSY 스펙트럼은 기울기 펄스를 사용해서 얻었다.

도 47A-G는 B5 다이머의 구조를 특징짓기 위해 사용된 스펙트럼을 나타낸다. 도 47A는 판상형에서¹³C와¹H의 화학적 이동을 나타낸다.

도 47B-D는 각각¹H,¹³C 및 APT를 나타내는데, 이들은 실온, 브루커 500 MHZ NMR에서 얻어졌다.

도 47E는 기울기 펄스를 사용하여 실온, AMX-360에서 얻어진 COSY 스펙트럼을 나타낸다.

도 47F 및 G는 각각 실온, AMX-360 MHZ NMR에서 얻은 HMQC 및 HOHAHA를 나타낸다.

방법 C. 트라이머-에피카테킨/카테킨

모든 스펙트럼들은 10㎎/mL의 적당한 샘플농도에서 AMX-360 MHZ NMR로 내부 표준으로서 아세톤을 사용하여 -3℃에서 D₂O의 75% 중수소화된 아세톤에서 얻었다.

도 48A-D는 에피카테킨/카테킨 트라이머의 구조를 특징짓기 위해서 사용된 스펙트럼을 나타낸다. 이들 도면은 각각¹H, COSY, HMQC 및 HOHAHA를 나타낸다. COSY 스펙트럼은 기울기 펄스를 사용해서 얻었다.

방법 D. 트라이머-올 에피카테킨

모든 스펙트럼은 10㎎/L의 적당한 샘플농도에서 AMX-360 MHZ NMR으로 내부표준으로서 아세톤을 사용하여 -1.8℃에서 D₂O의 70% 중수소화된 아세톤에서 얻었다.

도 49A-D는 올 에피카테킨 트라이머(all epicatechin trimer)의 구조를 특징짓기 위해 사용된 스펙트럼을 나타낸다. 이 도면들은 각기¹H, COSY, HMQC 및 HOHAHA를 나타낸다. COSY 스펙트럼은 기울기 펄스를 사용해서 얻었다.

실시예 19 : 프로시아니딘의 가티올분해

프로시아니딘의 구조를 특징짓기 위한 노력에서, 벤질 메르캅탄(BM)은 카테킨, 에피카테킨 또는 다이머 B2 및 B5와 반응되었다. 플로로글루시놀 및 티오페놀 뿐만 아니라 벤질 메르캅탄은 알콜/아세트산 환경에서 프로시아니딘의 가수분해(가티올분해)에 사용될 수 있다.

카테킨, 에피카테킨 또는 다이머(B2와 B5 다이머의 1:1 혼합물)(2.5㎎)는 1.5mL의 에탄올, 100μM BM 및 50μL 아세트산에 용해되었고, 용기(베크만 아미노산 분석 용기)는 비워졌으며 마지막 제거물이 없어질때까지 질소로 씻었고, 이어서 반응용기를 밀폐시켰다. 반응용기는 95℃의 히트 블록(heat block)에 방치되었고, 반응의 분취량(aliquots)은 30, 60, 120 및 240분에 얻어졌다. 각 분취량의 상대적인 형광은 도 25A-C에 나타나 있으며, 각각 에피카테킨, 카테킨 및 다이머를 나타낸다. 고차 올리고머는 유사하게 가티올분해된다.

실시예 20 : 다이머의 가티올분해 및 황이탈반응

다이머 B2 및 B5는 다이머(B2 또는 B5 ; 1.0㎎)를 600㎕ 에탄올, 40μL BM 및 20μL 아세트산에서 용해시킴으로써 벤질메르캅탄으로 가수분해되었다. 혼합물은 베크만 아미노산 분석용기(Beckman Amino Acid Analysis vessel)에서 질소하에 4시간 동안 95℃에서 가열되었다. 분취량은 역-상 HPLC에 의한 분석을 위해 제거되었고, 에탄올 라니 니켈 및 갈산(10㎎/mL) 각각 75μL를 2mL 하이포바이알(hypovial)이 있는 나머지 반응 배지에 첨가하였다. 용기를 수소로 씻어내고 1시간동안 수시로 흔들었다. 생성물을 0.45μ 필터로 여과시키고 역-상 HPLC로 분석하였다. 대표적인 용리 프로필은 도 26A 및 B에 나타나 있다. 고차 올리고머는 유사하게 황이탈반응을 한다. 이 데이타는 에피카테킨 또는 카테킨의 중합을 예상하고, 본 발명 화합물의 제조를 위한 합성 경로를 나타낸다.

실시예 21 : MDA MB 231 누드 마우스 모델에서의 펜타머의 생체내 활성

MDA-MB-231/LCC6 세포주. 세포주는 10% 어린 소과 혈청이 포함되어 있는 개선된 최소 필수 배지(IMEM)에서 성장되었고, 습하고 5% CO₂가 있는 37℃ 조건에서 유지되었다.

마우스. 암컷 6∼8주된 NCr nu/nu(아티믹) 마우스는 NCI를 통해 구입되었고, 동물시설에 수용되어 미국 농무부(United States Department of Agriculture)와 실험용 동물 보호의 인정을 위한 아메리칸 연합(American Association for the Accreditation of Laboratory Animal Care)이 발표한 규제에 따라 길러졌다. 종양이 있는 마우스는 적당한 약물 투여량을 결정하기 위해 매주 뿐만이 아니라 매일 무게를 쟀다.

종양이식. 조직배양에 의하여 제조된 MDA-MD-231은 IMEM으로 3.3×10⁶cells/mL까지 희석되었고, 0.15mL(즉, 0.5×10⁶cells)는 마우스의 측면에 있는 2∼3개의 젖꼭지 사이의 피하에 주사되었다. 종양 용적은 길이×넓이×높이×0.5의 곱셈에 의하여 계산되었다. 처리군 이상의 종양 용적은 평균화되었고 학생들의 테스트는 P값을 계산하기 위하여 사용되었다.

샘플 제조. 플라즈마 샘플은 심장에 구멍을 내어 얻었고, 혈액 화학 결정(blood chemistry determination)을 목적으로 15-20mM EDTA로 -70℃에서 저장되었다. 대조군과 실험군 사이에 어떠한 차이점도 나타나지 않았다.

종양 세포주 MDA-MB-231이 있는 500,000 피하세포로 이전에 감염된 15마리의 누드 마우스는 각각 5마리씩 세그룹으로 무작위로 분리되었으며, 다음중의 하나로 복막내 주사에 의해 처리되었다 : (ⅰ) 부형제(DMSO)만을 지닌 플라스보 ; (ⅱ) 부형제(DMSO)에서 실시예 14, 방법 D에서 분리된 정제된 펜타머 프로시아니딘 추출물 2㎎/mouse ; 그리고 (ⅲ) 부형제(DMSO)에서 실시예 14, 방법 D에서 분리된 정제된 펜타머 프로시아니딘 추출물 10㎎/mouse.

그룹 (ⅲ)의 마우스는 10㎎의 투여후 약 48∼72시간 이내에 죽었지만, 그룹(ⅱ)의 마우스는 정상인것처럼 보였다. 그룹(ⅲ)의 마우스가 죽은 원인은 알려지지 않았다 ; 그리고 본 발명의 화합물의 투여에 필수적일 것 같지 않다. 그럼에도 불구하고 10㎎은 독성에 관해서 상극한(upper limit)으로 여겨졌다.

그룹(ⅰ)과 그룹(ⅱ)의 처리는 일주일에 한번 반복되었으며, 종양성장은 각각의 실험군과 대조군에서 체크되었다. 처리후 2주후에 그룹(ⅱ)의 마우스에서는 어떤 독성표시도 관찰되지 않았고, 이 그룹들에 대한 투여량을 한주 걸러 1/2 로그 비율로 증가시켰다. 다음의 표는 그룹(ⅱ)의 마우스의 처리 스케쥴 동안의 투여량을 나타낸 것이다 :

주 투여량

㎎/mouse

1 2

2 2

3 4

4 5

5 5

6 5

7 5

처리결과는 도 27A, B 및 표 10에 나타나 있다.

표 10. 생체내 항-암 결과

일	그룹(ⅰ)의 % 생존율	그룹(ⅱ)의 % 생존율	그룹(ⅲ)의 % 생존율
1	100	100	100
2	100	100	100
3	100	100	0
4	100	100
5	100	100
6	100	100
7	100	100
8	100	100
9	100	100
10	100	100
11	100	100
12	100	100
13	100	100
14	100	100
15	100	100
16	100	100
17	100	100
18	100	100
19	100	100
20	100	100
21	100	100
22	75	100

일	그룹(ⅰ)의 % 생존율	그룹(ⅱ)의 % 생존율	그룹(ⅲ)의 % 생존율
23	75	100
24	75	100
25	75	100
26	75	100
27	75	100
28	75	100
29	50	100
30	50	100
31	50	100
32	50	100
33	50	100
34	50	100
35	50	100
36	25	100
37	25	100
38	25	100
39	25	100
40	25	100
41	25	100
42	25	100
43	25	80
44	25	80
45	25	80
46	25	80

일	그룹(ⅰ)의 % 생존율	그룹(ⅱ)의 % 생존율	그룹(ⅲ)의 % 생존율
47	25	80
48	25	80
49	25	80
50	25	60
51	25	60
52	75	60
53	25	60
54	25	60
55	25	60
56	25	60
57	0	40
58		40
59		40
60		40
61		40
62		40
63		40
64		40

이 결과들은 본 발명의 분획물과 본 발명의 화합물들이 정말로 항신생물 조성에 있어서 유용성을 지니고 있으며, 부적당한 실험 없이도 결정될 수 있는 배지에 적게 투여하면 독성이 없고 많이 투여하면 독성을 갖는다는 것을 증명한다.

실시예 22 : 코코아 추출물의 항균성 활성

방법 A :

본 연구는 식품 부패 또는 발병에 있어서 중요한 미생물의 종류에 대한 코코아 원두로부터의 조 프로시아니딘 추출물의 항균성 활성을 측정하기 위하여 수행되었다. 실시예 2, 방법 A로부터의 코코아 추출물이 본 연구에 사용되었다. 각각의 테스트 배양균(99mL)의 성장에 적당한 우무 배지는 0.45% 염수(최종 상태밀도 10²-10⁴cfu/mL)에서 각 세포 배양균 현탁액 1mL로 번식시킨 후 페트리 접시에 부었다. #2 구멍 뚫개(cork borer)(5㎜ 지름)으로 단단해진 우무를 절단했다. 플레이트는 4℃에서 밤새도록 냉동되었고, 추출물을 우무로 확산시킨 후, 텍스트 유기체에 적당한 성장 온도에서 계속해서 배양하였다. 결과는 다음과 같다 :

억제의 샘플구역(㎜)

추출물농 도(㎎/mL)	B.스테리쿠스	B.세레우스	S.아우레우스	P.애루기노사	B.수브틸리스
0	NI	NI	NI	NI	NI
25	NI	12	NI	11	NI
250	12	20	19	19	11
500	14	21	21	21	13

NI=억제안됨

코코아 원두로부터의 정제된 프로시아니딘 추출물의 항균성 활성은 텍스트 배양균으로서 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphalococcus aureus)로 상기 기술된 확산 분석(방법 A)을 사용한 다른 연구에서 증명되었다.

결과는 다음과 같다 :

코코아 추출물 : 실시예 13, 방법 A에서의 10㎎/100μL의 디카페이네이티드/ 디티오브로미네이티드(decaffeinated/detheobrominated) 아세톤 추출물.

실시예 14, 방법 D에서의 10㎎/100μL 다이머(99% 순도)

실시예 14, 방법 D에서의 10㎎/100μL 테트라머(99% 순도)

실시예 14, 방법 D에서의 10㎎/100μL 헥사머(88% 순도)

실시예 14, 방법 D에서의 10㎎/100μL 옥타머/노나머(92% 순도)

실시예 14, 방법 D에서의 10㎎/100μL 노나머 및 그 이상 (87% 순도)

억제제의 샘플구역(㎜)

0.45% 염수 0

다이머 33

테트라머 27

헥사머 24

0.45% 염수 0

옥타머 22

노나머 20

디카페이네이티드/디티오브로미네이티드 26

방법 B :

실시예 2, 방법 2의 조 프로시아니딘 추출물은 다양한 농도로 페놀레드(0.08g/L)와 함께 TSB(트립티카제 소이 브로스 ; Trypticase Soy Broth)에 첨가되었다. TSB는 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis) 또는 에스. 뉴포트(S. newport)의 배양균(10⁵cfu/mL)으로 접종되었고, 35℃에서 18시간 동안 배양되었다. 결과는 다음과 같다 :

에스. 엔테리티디스 에스. 뉴포트

0㎎/mL + +

50 + +

100 + +

250 + -

500 - -

750 - -

산 생성물로 발효액 배양균에서 붉은색에서 노란색의 변화로 증명된 것처럼 + = 자연성장, - = 비성장을 나타낸다. 억제는 XLD 플레이트상에 있는 TSB 튜브로부터 플레이트에 의해 확인되었다.

이 실시예는 본 발명의 화학물은 식품제조와 보존에 있어서 유용하다는 것을 증명한다.

이 실시예는 또한 본 발명의 화합물에 의해 억제될 수 있는 그람 음성 그리고 그람 양성 박테리아 성장을 증명한다. 이로부터 본 발명의 화합물은 헬리코박터 피롤리(Helicobacter pylori)를 억제하는데 사용될 수 있다. 헬리코박터 피롤리는 위궤양과 위암의 원인과 관련되어 있다. 따라서 본 발명의 화합물들은 세균이 원인인 질병의 치료나 예방에 사용될 수 있다. 적당한 투여경로, 투여량 그리고 표시는 질병과 같이 본 분야에서 잘 알려진 성분들, 그리고 대상의 연령, 무게, 성별, 일반적인 건강을 고려하여 부적당한 실험이 없이 결정될 수 있다.

실시예 23 : 추출물의 할로겐-유리(free)의 분석적 분리

실시예 2로부터 얻은 프로시아니딘은, 칼럼온도 37℃와 유량 1.0mL/분으로 100Å 수펠코실 LC-Si 5㎛(250×4.6㎜)상에서 할로겐-유리 표준 상 크로마토그래피에 의한 분석적 분리에 의하여 부분적으로 정제되었다. 분리는 다음 조건 하의 선형 변화도의 도움을 받았다 :(시간, %A, %B) ; (0, 82, 14) ; (30, 67.6, 28.4) ; (60, 46, 50).

이동상 조성물은 A=30/70% 디에틸에테르/톨루엔 ; B=메탄올 ; 및 C=아세트산/물(1 : 1)이었다. 성분들은 280㎚에서의 UV에 의해서 검출되었다. 대표적인 용리 프로파일은 도 28에 도시되어 있다.

실시예 24 : 프로시아니딘의 표준 상 HPLC 분리를 위한 정지상(stationary phase)의 구멍(pore) 크기 효과

프로시아딘의 분리를 증진시키기 위하여, 실리카 정지상의 큰 구멍 크기의 용도를 조사하였다. 분리는 실리카-300, 5㎛, 300Å(250×2.0㎜) 또는 선택적으로는 실리카-1000, 5㎛, 1000Å(250×2.0㎜) 상에서 실행되었다.

선형 변화도는 이동상 조성물로서 사용되었으며, 이는 A=디클로로메탄 ; B=메탄올 ; 및 C=아세트산/물(1 : 1)이었다. 성분들은 형광분석법에 의해 검출되었으며, 여기에서 λ_ex=276㎚ 및, λ_em=316㎚ 이며, 이는 280㎜에서 UV 검출기에 의해 검출되었다. 유량은 1.0mL/분이고, 오븐온도는 37℃이었다. 3개의 상이한 칼럼(100Å 구멍크기, 실시예 13 방법 D)으로 얻어진 대표적인 크로마토그램은 도 29에 도시되어 있다. 이는 프로시아니딘의 분리에 효과적인 구멍크기를 보여준다.

실시예 25 : 발효조작을 통한 원하는 프로시아니딘의 수득

코코아 발효와 관련된 계통의 대표적인 미생물 균주는 M＆M/Mars 코코아 배양균 컬렉션(cocoa culture collection)으로부터 구입된 것이다 :

다음의 분리물들이 사용되었다 :

아세토박테리아 아세티 ATCC 15973

락토바실러스 에스피.(BH 42)

캔니다 크루지(BA 15)

사카로마이세스 세레비시에(BA 13)

바실러스 세레우스(BE 35)

바실러스 스페리커스(ME 12)

각각의 균주는 저장용 배지에서 신선한 배지로 옮겨졌다. 효모와 아세토박테리아는 26℃에서 72시간 동안 배양되었으며, 바실리와 락토바실러스는 37℃에서 48시간동안 배양되었다. 슬랜트(slants)는 사용 전에 인산염 완충액 5ml와 함께 수확되었다.

코코아 원두는 신선한 포드(pods)와 과육으로부터 수확되며, 외종피는 제거되었다. 이 코코아 원두들은 20초 동안 과산화수소(35%)로 살균소독한 다음, 버블링(bubbling)이 끝날 때 까지 과산화수소 분해효소로 처리하였다. 이 원두들은 살균수로 2회 세척한 다음, 이 공정을 반복실시하였다. 원두들을 유리병속에 나누어 담고, 하기 표에서 상세하게 설명된 요법에 따라서 가공 처리하였다 :

물	에탄올/산	발효 인퓨세이트(infusate)	모델발효
매일 신선한 물로갈아줌	과육 모델 발효의각 단계에서 결정되는 레벨에 상응하는 알코올과 산으로 된 용액으로매일 갈아줌	계속되는 발효일마다 저온 살균시킨 발효된 과육으로 매일 갈아줌	테스트 균주로 접종시킨 무균 과육에서의 벤치 스케일 모델 발효

벤치 스케일 발효는 이중으로 실행되었다.

모든 처리들은 아래에서 지시한 바대로 배양되었다.

제1일 : 26℃

제2일 : 26℃∼50℃

제3일 : 50℃

제4일 : 45℃

제5일 : 40℃

모델발효는 미생물 개체군을 평가하기 위하여 연구지속기간에 걸쳐서 플레이트 카운트에 의하여 모니터 하였으며, 미생물 대사산물을 위한 발효배지의 HPLC 분석을 모니터하였다.

처리 후에, 원두들은 물 활성도가 0.64가 되도록 하기 위하여 박막 플로우후드(laminar flow hood)에서 건조하고 15분동안 66℃로 볶았다. 프로시아니딘의 분석을 위하여 샘플을 준비했다. 처리 당 3개의 원두를 곱게 갈아서 가루로 만든 다음, 헥산으로 지방질을 제거하고, 이어서 아세톤 : 물 : 아세트산(70 : 29.5 : 0.5%) 용액으로 추출하였다. 아세톤용액 추출물을 바이알(Vial)로 여과하고, 폴리페놀 레벨을 실시예 13 방법 B의 표준 상 HPLC에 의해서 정량분석했다. 남아있는 원두들을 빻아서 가루로 만들어 맛을 보았다. 모델 벤치-탑 발효 공정의 배양 균 및 분석 프로파일은 도 30A-C에 도시되어 있다. 다양하게 발효처리되는 코코아원두의 프로시아니딘 프로파일은 도 30D에 도시되어 있다.

이 실시예는 본 발명이 어떤 특정의 코코아 유전자형에 제한될 필요가 없으며 ; 그리고, 발효 조작에 의해, 특정의 테오브로마 또는 헤라니아종 또는 이들의 특이적인 이종간 또는 동종간의 교배에 의하여 생산된 프로시아니딘의 레벨이 조절, 예를들면, 증진될 수가 있다는 사실을 예시한 것이다.

다음의 표는 테오브로마 속과 이종간 및 동종간의 특이적 교배종을 대표하는 표본으로 결정된 프로시아니딘 레벨을 나타내었다. 샘플들은 실시예 1 및 2(방법 1 및 2)에 따라서 제조되었으며, 실시예 13 방법 B에 따라서 분석되었다. 이 데이터는 본 발명의 화합물들을 포함하는 추출물이 테오브로마와 헤라니아종 및 이들의 이종간 또는 동종간의 특이적 교배종에서 발견되고 있음을 보여준다.

실시예 26 : 산화질소(NO) 대한 프로시아니딘의 효과

방법 A.

이 연구의 목적은 뇌맥관 확장을 유도하는 것으로 공지된 NO와 프로시아니딘 간의 관계를 확립하는 것이며(실시예 14 방법 D에서와 같이), HUVEC(Human umbilical vein endothelial cells)로부터 질산염(NO의 분해대사물질)의 생성시, 농도범위가 100㎍/ml∼0.1㎍/ml에 이르는 모노머들과 고급 올리고머들의 효과를 평가하였다. HUVEC(크로네틱스)는 24∼48시간 동안에 각 프로시아니딘의 존재 또는 부재하에서 평가되었다. 실험의 끝무렵에, 상청액을 수집한 다음, 모아서 열계량 분석법에 의해 질산염 함량을 결정했다. 각개의 실험에서 HUVEC는 24∼48시간 동안에 프로시아니딘의 존재 또는 부재하에서, NO의 생성을 유도하는 것으로 알려진 아세틸코린으로 배양 하였다. 실험의 끝무렵에, 상청액을 수집한 다음 열계량 분석법으로 질산염 함량을 결정하였다. NO의 역할은 NO신타제의 특이적인 차단제인 니트로아르기닌 또는 (1)-N-메틸아르기닌의 첨가로 확인된다.

방법 B 페닐에프린-유도로 수축된 래트(rat)동맥의 혈관이완

래트 동맥에 대한 농도 100㎍/ml∼0.1㎍/ml에 이르는 프로시아니딘 각각의 효과는 페닐에프린-유도로 수축된 래트 동맥의 혈관이완의 연구 목표이다. 분리된 래트 동맥을 프로시아니딘(실시예 14 방법 D)의 존재 또는 부재하에서 배양하고, 근육질의 변질은 외관검사로 확인한다. 래트 동맥의 이완 또는 수축 모두가 결정된다. 그후에 다른 장기들을 사용하여, 분리된 래트 동맥의 사전수축은 에핀에프린의 첨가에 따라 유도된다.

수축이 안정화 될 때, 프로시아니딘을 첨가하면 래트 동맥의 수축 또는 이완이 결정된다. NO의 역할은 니트로아르기닌 또는 (1)-N-메틸 아르기닌의 첨가에 의하여 확인된다 페닐에프린으로 사전 수축된 래트 대동맥에 의하여 초래되기 때문에, NO의 아세틸코린-유도 이완은 도 31에 도시하였다.

방법 C 래트의 저혈압 유도

이 방법은 혈압에 미치는 각 프로시아니딘(실시예 14, 방법 D에서와 같은)의 효과에 관한 것이다. 래트들의 최고혈압 및 최저혈압을 모니터하기 위하여 기기를 장치한다. 프로시아니딘 각각을 정맥내 주사하고(투여량 범위 = 100-0.1㎍/㎍) 혈압의 변화를 평가한다. 뿐만아니라, 에핀에프린에 의해 유도된 혈압의 변화에 미치는 각 프로시아니딘의 효과가 결정된다. NO의 역할은 니트로아르기닌 또는 (1)-N-메틸 아르기닌의 첨가에 의하여 확인된다.

다음의 실시예와 함께, 이 연구들은 본 발명의 화합물들이 혈관확장을 조절하는데 유용하며, 혈압 조절 또는 관상동맥증 및 편두통증 어드레싱(addressing)에 관해서도 더욱더 유용함을 예시하는 것이다.

실시예 27 : 포만감에 미치는 코코아 폴리페놀의 효과

식욕 및 포만감의 조절을 위하여 생체 내에서 발생하는 신호(signal event)의 지시자로서 혈액 글루코스 레벨을 사용하는, 코코아 폴리페놀이 글루코스 레벨을 조절하는지를 결정하기 위하여 48세의 건강한 성인 남자5∼6명을 대상으로 실험들을 실행하였다.

글래페르톤 등(1992)에 의하여 설명된 방법에 따라서 브라질산 코코아 원두의 코코아 폴리페놀을 부분적으로 정제하였다. 이 물질은 카페인 또는 테오 브로민을 전혀 포함하지 않았다. 단식한 혈액 글루코스 레벨은 75㎎의 코코아 폴리페놀이 있는 것과 없는 것의 텍시코라사 75(카페인이 없는)글로코스 내성 테스트용 음료(커틴 마세슨 091-421) 10 FL.oz를 섭식한 후에 시간을 기초로 하여 분석하였다. 이 수준의 폴리페놀은 테스트용 음료의 전체 글루코스의 0.1%를 나타내며, 표준의 100g 쵸콜렛에 존재하는 개략적인 양을 반영한다. 혈액의 글로코스 레벨은 아큐-첵 Ⅲ 혈액 글로코스 모니터링 시스템(베링지 맨헤임 회사)를 사용하여 결정하였다. 혈액 글루코스 레벨을 테스트용 음료를 섭식하기 전에 측정되었으며, 테스트용 음료를 섭식한 후에는 다음의 시간 간격으로 측정되었다. : 15, 30, 45, 60, 75, 90, 120 및 180분. 각각의 글루코스 내성테스트를 시작하기 전에, 고저의 글루코스 레벨 대조군이 결정되었다. 각각의 글루코스 내성테스트는 이중으로 실행되었다. 증류수 10 fl. oz(글루코스 없음)에 용해된 코코아 페놀 75㎎을 포함하는 대조용 테스트 용액을 또한 실행하였다.

하기 표 11은 이 연구에서 실시된 각각의 글루코스 내성 실험을 위해서 얻어진 날짜와 대조값을 나타내었다.

도 32는 3시간 코스에 걸쳐서 얻은 혈액 글루코스 레벨의 표준 편차와 함께 평균값을 도시한 것이다. 코코아 폴레페놀을 포함하는 테스트용 혼합물의 섭식 후에 얻어진 혈액중 혈당 레벨이 상당히 증가된다는 것은 매우 분명하다. 두가지의 주요한 글루코스 내성 프로파일 사이의 차이는 코코아 폴리페놀만의 용액을 섭식 한후에 얻어진 프로파일에 의해서는 해결될 수 없다. 글루코스 테스트용 음료에 코코아 폴리페놀의 첨가는 글루코스 내성 프로파일을 상당히 상승시키게 된다.

이같은 혈액 글루코스 레벨의 상승은, 전형적인 글루코스 내성 프로파일이 정상적인 것으로 여겨질지라도 조심해서 당뇨병으로 여겨지는 범위이다(Davidson, I. 등, Eds. Todd-Sandford clinical Diagnosis by Lab oratory. Methods 14판 ; W.B. Saunders Co.; 필라델피아, PA 1969, 1025, 550-9페이지). 부가적인 글루코스의 차이는 본 발명의 화합물들의 결과로서, 이는 글리코겐 저장고로부터 혈류로 방출됨을 가리킨다. 따라서, 당의 존재시에 본 발명의 화합물들은 혈액의 글루코스 레벨을 조절하는데 사용될 수 있다.

표11. 글루코스 내성 시험 데이터 및 조절 결과

주	설 명	고 조절a	저 조절b
0	글루코스 내성	265㎎/dL	53㎎/dL
1	0.1% 폴리페놀과함께 글루코스내성	310	68
2	글루코스 내성	315	66
4	0.1% 폴리페놀과함께 글루코스내성	325	65
5	0.1% 폴리페놀	321	66

a = 기대 범위 : 253-373㎎/dL

b = 기대 범위 : 50-80㎎/dL

실험 대상자들은 또한 안면의 홍조(홍진)와 머리의 어찔어찔한 증상을 경험했으며, 이어서 본 발명의 화합물을 섭식한 다음에는 혈관확장의 조절을 나타내었다.

표 12 및 13의 데이터는 코코아 원료와 상업적인 쵸콜렛에 속해 있는 본 발명의 추출물들과, 이에 포함된 본 발명의 화합물들은 제약, 수의학 및 식품과학 제조 및 응용을 위한 부형제로 사용될 수 있음을 예시한다.

표 13 : 상업용 쵸콜렛중의 프로시아니딘 레벨(㎍/g)

샘플	모노머	다이머	트라이머	테트라머	펜타머	헥사머	헵타머 및고급 올리고머	합계
브랜드 1	366	166	113	59	56	23	18	801
브랜드 2	344	163	111	45	48	ND*	ND	711
브랜드 3	316	181	100	41	40	7	ND	685
브랜드 4	310	122	71	27	28	5	ND	563
브랜드 5	259	135	90	46	29	ND	ND	559
브랜드 6	308	139	91	57	47	14	ND	656
브랜드 7	196	98	81	58	54	19	ND	506
브랜드 8	716	472	302	170	117	18	ND	1,795
브랜드 9	1,185	951	633	298	173	25	21	3,286
브랜드 10	1,798	1,081	590	342	307	93	ND	4,211
브랜드 11	1,101	746	646	372	347	130	75	3,417
브랜드 12	787	335	160	20	10	8	ND	1,320

ND* = 검출안됨.

표 14 : 코코아 원료물질중의 프로시아니딘 레벨(㎍/g)

샘플	모노머	다이머	트라이머	테트라머	펜타머	헥사머	헵타머 및고급 올리고머	합계
미발효	13,440	6,425	6,401	5,292	4,236	3,023	5,913	44,910
발효	2,695	1,538	1,362	740	470	301	277	7,383
볶음	2,656	1,597	921	337	164	ND*	ND	5,675
쵸콜릿 액	2,805	1,446	881	442	184	108	ND	5,866
코코아 훌스	114	53	14	ND	ND	ND	ND	181
코코아 분말,1% 지방	506	287	112	ND	ND	ND	ND	915
코코아 분말,11% 지방	1,523	1,224	680	46	ND	ND	ND	3,473
레드 네델란드식 코코아분말, pH 7.4,11% 지방	1,222	483	103	ND	ND	ND	ND	1,808
레드 네델란드식 코코아분말, pH 8.2,23% 지방	168	144	60	ND	ND	ND	ND	372

ND* = 검출안됨.

실시예 28 : 시클로옥시게나제 1 및 2에 대한 프로시아니딘의 효과

시클로옥시게나제 1및 2(COX1/COX2) 활성도에 대한 프로시아니딘의 효과는 모노머∼데카머와 프로시아니딘 혼합물을 포함하는 프로시아니딘 용액의 농도를 다양하게 한 용액의 존재하에서, 실온에서 10분동안 아라키돈산(5㎛)과 함께, 숫양 정액 소낭과 양 태반, 각각으로부터 유래된 효소를 배양시켜서 평가하였다. 반전(turnover)은 인터킴(프랑스)으로 부터의 PGE2EIA 킷트를 사용하여 평가하였다. 인도메타킨은 기준 물질로 사용하였다.

결과는 다음의 표에 나타내었으며, 여기에서 IC₅₀값은 μM의 단위로 표현된다.(실시예 13 방법 A로부터 제조된 프로시아니딘 혼합물을 나타내는 S11을 제외하고는, 여기에서 샘플 SI∼S10은 실시예 14 방법 D에 따른 프로시아니딘 올리고머(모노머∼데카머)를 나타내고, IC₅₀은 ㎎/mL의 단위로 표시된다).

표

샘플#	IC50COX-1(*)	IC50COX-2(*)	비율 IC50COX-2/COX-1
1	0.074	0.197	2.66
2	0.115	0.444	3.86
3	0.258	0.763	2.96
4	0.154	3.73	24.22
5	0.787	3.16	4.02
6	1.14	1.99	1.75
7	1.89	4.06	2.15
8	2.25	7.2	3.20
9	2.58	2.08	0.81
10	3.65	3.16	0.87
11	0.0487	0.0741	1.52
인도메타킨	0.599	13.5	22.54

(^*)㎎/mL로 표현된 샘플 11을 제외하고는 μM으로 표현됨.

억제 연구에 관한 결과들은 도 33A 및 B에 나타나 있으며, 이는 COX1과 COX2 활성도에 관한 인도메타킨의 효과를 보여준다. 도 34A 및 B COX1과 COX2와 함께 프로시아니딘과 IC₅₀의 중합반응의 정도 간의 상호관계를 보여준다 : 도 35는 COX1 및 COX2에 관한 IC₅₀값들의 상호관계를 보여준다 ; 그리고, Y를 통한 도 36은 COX1과 COX2와 함께 각 시료(S1∼S11)의 IC₅₀값을 보여준다. 이 결과들은 본 발명의 화합물들이 진통성 혈액 응고를 막고, 항염증의 이용성을 갖고 있음을 나타낸다. 더구나 COX2는 결장암에도 연계되어 있다. 본 발명의 화합물에 의한 COX2 활성도의 억제는 본 발명의 화합물들이 결장암에 대하여 항종양 활성을 갖고 있다는 그럴듯한 메카니즘에 의해 예시된다. COX1과 COX2는 또한 프로스타글란딘(prostaglandins)의 합성에 관련된다. 따라서, 이 실시예의 결과들은 본 발명의 화합물들이 신장기능, 면역반응, 열병, 통증, 마이토제네시스(mitogenesis), 아폽토시스(apoptosis), 프로스타글랜딘 합성, 궤양화형성(예를 들면, 위의) 및 재현을 조절할 수 있음을 보여준다. 신장기능의 조절은 혈압에 영향을 미칠 수 있다는 것에 유의하여야 한다 : 또한, 본 발명의 화합물들은 혈압 조절, 혈관확장 및 관상동맥증(예를 들면, 앤지오텐실, 브래디키닐의 조절)에도 영향을 미친다.

참고문헌은 사이버트 등의, PNAS USA 91 : 12013-12017(1994년. 12월), 미첼 등의, PNAS USA 90 : 11693-11697(1994년 12월), 데위트 등 Cell 83 : 345-348(1995년 11월 3일), 랑겐바흐 등의 Cell 83 : 483-92(1995년 11일 3일)과 슈지 등의 Cell 83 : 493-501(1995년 11일 3일), 모르헴 등, cell 83 : 473-82(1995. 11. 3.)로 이루어진다.

참고는 실시예 9, 26 및 27에서 더 이루어진다. 실시예 9에 본 발명의 화합물들의 산화방지제 활성도가 예시되어 있다. 실시예 26에 NO에 관한 효과가 예시되어 있다. 그리고 실시예 27은 안면의 혈관 확장의 증거를 제공한다.

이 실시예의 결과들로부터, 실시예 9, 26 및 27과 공동으로, 본 발명의 화합물들은 생리적 효과를 유도하는 자유라디칼 메카니즘을 조절할 수 있다. 이와 유사하게, 류코 트리엔 합성을 생화학적으로 지향하는 리폭시게나제 중재의 자유라디칼 유형 반응들은 본 발명의 화합물들에 의해 조절될 수가 있으며, 따라서 차후에 일어나는 생리적인 효과들(예, 염증, 면역반응, 관상동맥증, 발암성 메카니즘, 열병, 통증, 궤양형성)에 영향을 미친다.

따라서, 무통성을 갖는 것 이외에도, 다른 진통제와 함께 투여시에는 본 발명의 화합물들에 의하여 상승작용 효과를 나타낼 수도 있다. 마찬가지로, 항종양 성질을 갖는것 이외에도, 다른 항종양제들과 함게 투여시에는 본 발명의 화합물들에 의하여 상승작용 효과를 나타낼 수도 있다.

실시에 29 : 원형이색성(circular Dichroism)/프로시아니딘의 연구

CD연구는 실시예 14, 방법 D에 설명된바에 따라서 정제된 프로시아니딘의 구조를 밝히기 위한 노력으로 행해졌다. CD스펙트럼 소프트웨어 AVIⅤ 60DS V4.1f.를 사용하여 25℃에서 스텍트럼을 수집하였다.

1.50㎚의 밴드폭에서, 300㎚로부터 185㎚에 이르도록 샘플들을 1.00㎚마다주사(scan)하였다. 대표적인 CD스펙트럼은 도 43A∼G에 도시되어 있으며, 이는 다이머로부터 옥타머의 CD스펙트럼을 보여준다.

이 결과들은 본 발명의 화합물들의 나선형 성질을 나타낸다.

실시예 30 : 헬리코박테리아 피롤리 및 스태필로코커스 오레우스에 관한 코코아 프로시아니딘의 억제 효과

이 연구는 헬레코박테리아 피롤리 및 스태필로코커스 오레우스에 대한 프로시아니딘 올리고머의 항균성 활성도를 평가하기 위하여 실행한 것이다. 펜타머로보강된 물질은 실시예 13, 방법 A에 따라서 제조하였으며, 실시예 14 방법 C에 설명된 바에 따라 분석하였는데, 펜타머가 89%이였고, 올리고며는 11%였다(n은 6∼12이다). 정제된 펜타머(96.3%)는 실시예 14 방법 D에 설명된 바에 따라서 제조하였다.

헬리코박테리아 피롤리와 스태필로코커스 오레우스는 ATCC로부터 구입했다. 헬리코 박테리아 피롤리의 경우, 바이알은 0.5ml의 트립티카제 소이브로드 배지로 다시 수화하고 현탁액은 5%의 탈섬유소 양(sheep) 혈액을 포함하는 신선한 TSA의 슬랜트로 옮긴다. 슬랜트를 무산소성 유리용기 내의 미호기성 조건하에서 3∼5일 동안 37℃로 배양하였다(5∼10% CO₂; CampyPakplus, BBL)슬랜트의 바닥에서 브로드의 풀내에서 양호한 성장이 이루어졌을 때, 브로드는 양 혈액과 함께 TSA의 부가적인 슬랜트를 접종하는데 사용되었다. 연속적인 제대 배양에 따라서 생존력이 감소되기 때문에, 슬랜트로부터 수확된 브로드를 수집하고 -80℃에서 저장했다. 분석을 위한 배양액은 냉동된 바이알로부터 바로 사용하였다. 에스. 오레우스 배지는 TSA슬랜트 상에서 유지되었으며, 사용하기 24시간 전에 신선한 슬랜트로 옮겼다.

각 배양액의 세포현탁액을 제조하였으며,(H. Pylori, 10⁸∼10⁹cfu/mL; S. aureus 10⁶∼10⁷cfu/mL) 0.5mL는 5% 양 혈액과 함께 TSA 플레이트에 살포했다. 표준 스탠다드 분석 디스크(Difco 회사제)를 살균된 필터에 담구고, 펜타머를 연속적으로 희석시켰다(살균수중에서 23㎎/mL). 테스트용 디스크와 블랭크 콘트롤(blank control) 디스크(살균수)를 접종된 플레이트 상에 놓는다. 80㎍의 메트로니다졸(H. pylori 억제제) 또는 30㎍의 반코마이신(S. aureus 억제제)(BBL Sensidiscs)을 포함하는 대조군 디스크를 적절한 플레이트 셋트상에 놓는다. H. pylori가 접종된 플레이트는 미호기성 조건하에서 배양하였고, S. aureus 셋트는 호기적으로 배양하였다. 억제효과가 나타나는 지역(zone)은 잘 증식하는 것으로 나타났다.

표 14. 펜타머를 이용한 H. pylori와 S. aureus에 대한 생물학적 분석

펜타머가 강화된분획(㎎/ml)	S. aureus억제(㎜)	H. pylori억제(㎜)
0	NI	NI
15	0	10
31	10	10
62	11	11
125	13	13
250	15	13
밴코마이신 표준	15	- -
메트로니다졸 표준	- -	11
96% 순수 펜타머	15	11

NI = 억제 없음(no inhibition)

실시예 31 : 기니아 피그에서 NO 의존성 저혈압

기니아 피그의 혈압에 대한 5개의 코코아 프로시아니딘 분획의 효과를 조사하였다. 간단히 말하면, 기니아 피그(체중 약 400g; 수놈과 암놈)를 40㎎/㎍의 소듐펜토바비탈을 주사하여 마취하였다. 동맥 혈압을 모니터링하기 위하여 경동맥을 캐널을 만들었다(cannulating). 다섯 개의 코코아 프로시아니딘 분획 각각을 경정맥을 통하여 정맥내 주사했다(사용량 범위 0.1㎎/㎏∼100㎎/㎏). 혈압의 변동을 폴리그래프에 기록했다. 이 실험에서 코코아 프로시아니딘 분획을 투여하기 10분 전에 L-N-메틸 아르기닌을 투약(1㎎/㎏)함으로써 NO의 역할을 확인하였다.

미국특허 제5,554,645호에 개시된 방법에 따라서 코코아 프로시아니딘 분획이 제조, 분석하였다.

분획 A; 모노머 내지 테트라머로 구성된 제조 HPLC 분획을 나타내며, HPLC 분석결과는 다음의 조성과 같다:

모노머 47.2%

다이머 23.7%

트라이머 18.7%

테트라머 10.3%

분획 B; 펜타머 내지 데카머 구성된 제조 HPLC 분획을 나타내며, HPLC 분석결과는 다음의 조성과 같다:

펜타머 64.3%

헥사머 21.4%

헵타머 7.4%

옥타머 1.9%

노나머 0.9%

데카머 0.2%

분획 C; 상기 분획 A와 B의 제조에 사용된 영양강화된 코코아 프로시아니딘 분획을 나타내며, HPLC 분석결과는 다음의 조성과 같다:

단량체 34.3%

다이머 17.6%

트라이머 16.2%

테트라머 12.4%

펜타머 8.5%

헥사머 5.2%

헵타머 3.1%

옥타머 1.4%

노나머 0.7%

데카머 0.3%

분획 D ; 밀크 쵸콜렛으로부터 제조된 프로시아니딘 추출물을 나타낸다. HPLC 분석결과는 브랜드 8을 나타낸 표 12에 기재된 것과 유사한 조성물로 밝혀졌다. 카페인 10% 테오브로인 6.3%가 추가로 존재하였다..

분획 E; 알카리 액체로 제조된 짙은 쵸콜렛으로부터 제조된 프로시아니딘 추출물을 나타낸다. HPLC 분석결과는 브랜드 12에 기재된 것과 유사한 조성물로 밝혀졌다. 카페인 16.0% 테오브로인 5.8%가 추가로 존재하였다.

독립적인 3번의 실험에서, 마취한 기니아 피그의 동액 혈압에 대한 코코아 프로시아니딘 분획 10㎎/㎍의 투여효과를 조사하였다. 정맥내 주사시에 프로시아니딘 분획 A와 E는 약 20% 정도의 혈압 감소를 야기했다. 이 감소는 용매(DMSO)콘트롤(15 ± 5%, n=5)로부터 얻은 것과는 큰 차이가 없었다. 이에 반하여, 프로시아니딘 분획 B, C와 D(10㎎/kg)은 C의 경우는50∼60%에 이르는 등 상당한 혈압저하를 초래하였다. 이 실험들에서 혈압강하효과의 순서는 C＞B＞D＞A＝E 였다.

프로시아니딘 분획을 주사한 후에 유도되는 혈압의 전형적인 기록은, 분획 A에 대해서는 도 50A, 분획 C에 대해서는 도 50B에 나타내었다. 도 51은 이 분획들에 의한 혈압에 관한 상대효과를 도시한다.

L-N-메틸알기닌(LNMMA)를 사용하여 저혈압 기니아 피그에서, 분획 C 투여에 의해 유도되는 NO의 기여 여부에 대하여 분석하였다. 이러한 약물학적 제제는 NO신타제를 억제하므로서 NO의 생성을 억제한다. 1㎎/㎏의 L-NMMA를 코코아 프로시아니딘 분획을 주사하기 10분전에 투여하였다. 도 52에서 알 수 있듯이 L-NMMA을 동물에 투여하면 프로시아니딘 분획 C에 의해 야기되는 저혈압을 완전히 봉쇄한다. 참고로, 이 억제제로 다음과 같이 투여하면 분획 C에 의해 생기는 혈압의 변화는 용매만을 사용했을 경우와 유사하였다.

[실시예 32]

인간 제대 정맥의 내피세포에서 코코아 프로시아니딘 분획물이 NO 생성에 미치는 영향

인간 제대 정맥 내피세포 (이하 HUVEC)는 크로네틱스 (Clonetics)에서 수득되었고 이는 제조업자의 설명서에 따라 배양되었다. HUVEC 세포는 12개의 웰이 갖추어진 플레이트 (Falcon)에 종배양되었다. 동일한 조건으로 3번 종배양하여 배양세포가 전면성장 상태에 이르렀다. 상청액은 일정한 농도의 브라디키닌 (25, 50 및 100nM) 또는 실시예 31에서 설명된 코코아 프로시아니딘 분획물 A-E (100ug/mL)를 함유한 새로운 배지 (medium)로 상청액이 교체되었다. 배양은 24시간동안 지속되었고 아래에 기술된 NO 함유량을 측정하기 전에 무세포 상청액은 수득되고 냉동 저장되었다. 소정의 실험에서는 NO 신타제 (NOS) 길항제인 N-니트로-L-아르기닌 메틸 에스테르 (L-NAME, 10uM)를 첨가하여 NO 생성에 있어서 NOS의 연관성을 평가하였다.

Griess 반응에 의한 배양 상청액의 아질산 농도를 측정하여 HUVEC NO 생성을 평가하였다. Griess 시약은 1% 술퍼닐아미드와 0.1% N-(1-나프틸)-에틸렌디아민 중염산염을 함유하였다. 50uL 분취량을 여러 상청액에서 4 번 추출하여150uL의 Griess 시약을 가하여 배양하였다. 멀티스캔 장치 (Labsystems Multiskans MCC/340)에서 540nm의 흡수능 (absorbency)이 측정되었다. 소정 농도의 질산나트륨을 사용하여 표준 곡선을 얻었다. 무세포 배지 (바탕값)의 흡수능은 세포를 포함한 상청액의 값에서 감하였다.

투여량 의존성 NO 방출이 관찰된 경우에 있어서 도 53은 브라디키닌이 HUVEC의 NO 생성에 미치는 영향을 도시하고 있다. L-NAME 길항제는 브라디키닌으로 유발된 NO의 방출을 완전하게 억제하였다.

도 54는 코코아 프로시아니딘 분획물이 HUVEC 세포에 의한 NO 생성에 미치는 영향을 설명하고 있다. 분획물 B, C와 D는 유의미한 어느 정도의 HUVEC에 의한 NO 생성을 유발하였다. 그 중에서도 아질산염의 생성에 의한 측정에 따르면 분획물 C가 NO의 형성을 유발시키는 가장 효율적인 분획물이었으며 분획물 F는 거의 효과가 없었다. L-NAME의 존재 하에서는 분획물 C가 NO 생성에 미치는 영향이 상당히 감소하였다. 참고로 분획물 B, C와 D는 분획물 A와 B보다 프로시아니딘 올리고머를 더 많이 함유하고 있었다. 분획물 D와 분획물 E의 두드러진 차이점은 분획물 E는 초콜렛을 만드는 부분에 있어서 알칼리화된 코코아 액제를 사용한 다크 초콜렛 (dark chocolate)으로부터 제조되었다는 것이다. 알칼리화는 염기 촉매의 의한 프로시아니딘의 중합을 유도하며 이들의 화합물의 레벨을 급속히 소모시킨다. 표 12에서는 이와 같은 종류의 초콜렛에서 찾아 볼 수 있는 프로시아니딘의 레벨을 분석 비교하고 있으며 여기서 브랜드 12는 알칼리화된 코코아 액제를 사용한 다크 초콜렛이며 브랜드 11은 일반 밀크 초콜렛이다. 따라서 밀크 초콜렛에서 수득된 추출물은 NO을 유발할 수 있는 프로시아니딘 올리고머를 고비율로 함유하고 있다. 분획물 C 시료에 NO의 억제인자인 L-NAME을 첨가하므로써 NO가 명백하게 억제되었다. 프로시아니딘 분획물에서 얻은 결과는 브라디키닌으로 유발시킨 NO 실험에서 관찰된 것과 일치하였다 (도 53 참조).

HUVEC 결과와 같이 코코아 프로시아니딘 분획물 C는 기니 피그에서 주요한 저혈압증성의 효과를 유도하였으며 분획물 A와 E는 가장 효력이 없었다. NO 생성의 조절에 있어서 고분자량을 갖은 프로시아니딘 올리고머가 연관되어 있었다.

[실시예 33]

코코아 프로시아니딘 분획물이 마크로파지 NO 생성에 미치는 영향

헤파린처리된 신선한 인간 혈액 (70mL)을 인산염 완충제 (PBS)에 동일한 분량으로 상온에서 첨가되었다. 3mL의 피스콜-히파크 (Ficoll - Hypaque) 대 10mL의 혈액-PBS의 회석 비율을 사용하여 혈액-PBS의 하층에 피스콜-히파크 용액층을 형성하였다. 튜브는 18-20℃하에 30분 동안 2,000 rpm에서 원심 분리되었다. 혈장과 혈소판을 포함한 상층은 폐기하였다. 모노사이트층은 다른 원심 분리용 튜브에 이전되었고 세포는 한크 (Hanks) 평형 식염수에 의해 2번 세척되었다. 상기 모노사이트층은 10% 태아 송아지 혈청제로 보강된 완전 RPMI 1640에 재현탁되어 집계된 후 트리판-블루-배제법에 의해 이의 타당성이 확인되었다. 세포 펠렛은 20% 태아 송아지 혈청제로 보강된 완전 RPMI 1640에 1 x 106 세포수/mL의 최종 농도로 재현탁되었다. 세포 현탁액의 알리쿼트는 96웰을 갖춘 플레이트에 종배양후 10% 태아 송아지 혈청제로 보강된 완전 RPMI 1640으로 3번 세척되었으며 무유착성 세포(림프구)는 폐기하였다.

상기 세포는 실시예 31에서 기술된 5본의 프로시아니딘 분획물 존재 또는 무존재하에서 48시간 동안 배양되었다. 배양후 배지를 수득하여 원심 분리하였으며 질산염 검정 (nitrate assay) 측정을 의해 무세포 상청액은 냉동 저장되었다.

마크로파지 NO 생성은 Greiss 반응에 의한 아질산염 농도를 측정하여 확정되었다. Griess 시약은 1% 술퍼닐아미드와 0.1% N-(1-나프틸)-에틸렌디아민 중염산염을 함유하였다. 50uL 분취량을 여러 상청액에서 4 번 추출하여 150uL의 Griess 시약을 가하여 배양하였다. 멀티스캔 장치 (Labsystems Multiskans MCC/340)에서 540nm의 흡수능 (absorbency)이 측정되었다. 소정 농도의 질산나트륨이 사용되어 표준 곡선이 구축되었다. 무세포 배지 (바탕값)의 흡수능은 세포를 포함한 상청액의 값에서 감하였다.

별개의 실험에서 마크로파지는 감마-인터페론 5U/mL 존재 하에 프라임된 후 5본의 프로시아니딘 분획물 100ug/mL 의 존재 또는 무존재하에 LPS 10ug/mL에 의해 3시간동안 자극하였다.

도 55는 프로시아니딘 분획물 C가 단독적으로100ug/mL의 농도에서 모노사이트/마크로파지에 의한 NO 생성은 유발할 수 있다는 것을 보여 주고 있다. 상기 세포에 의한 기저 NO 생성은 감지가 안되었고 100ug/mL의 농도에서 사용된 어떤 코코아 프로시아니딘 분획물에서 아질산은 발견 안되었다. 프로시아니딘 분획물 A와 D가 γ-인터페론로 초회항원 자극된 모노사이트/마크로파지에 의한 LPS-유발성 NO 생성을 향상시킨 것을 도 56은 예증하고 있다. 프로시아니딘 분획물이 없이 배양된 LPS-자극 모노사이트/마크로파지는 단지 4μmole/10⁵세포수/48시간을 생성하였으므로 프로시아니딘 분획물 C는 소정의 미미한 효력을 발휘한 것으로 보인다. γ-인터페론 단독으로는 NO을 생성을 유발하는데 있어서 효력이 없었다.

종합적으로, 이러한 상기 결과는 본 발명 화합물의 일정한 농도의 혼합물이 LPS 또는 시토킨(cytokine)에 의한 자극과 독립적 또는 종속적인 모노사이트/마크로파지 NO 생성을 유발할 수 있다는 것을 증명하고 있다.

상기에 언급한 바와 같이 당해 추출물과 코코아 폴리페놀, 특히 본 발명의 화합물, 조성물, 제조방법 및 장비는 주요하고 다양한 실용성이 있다고 판단된다.

당해 생체내 및 실험관 데이터는 본 발명의 항신생물제 실용성을 명백하게 입증하고 있으며 본 발명의 화합물이 기존의 항신생물제와 함께 사용되거나 대체할 수 있다는 것을 보여주고 있다.

본 발명의 화합물은 BHT 및 BHA와 같은 항산화제 활성과 산화 안정성을 가지고 있다. 그러므로, 본 발명은 항산화제 및 식품 첨가제와 같이 이미 알려진 BHT 및 BHA의 실용분야에서 BHT 및 BHA를 대체 또는 병합해서 활용할 수 있다.

본 발명은 이미 알려진 당해 실용 용도로 토포이소머라제 (topoisomerase) II-억제인자를 대체 또는 병합해서 활용할 수 있다.

본 발명의 화합물은 식품을 보전 및 준비하는데 사용될 수 있으며 박테리아로 유발된 질환을 치료 또는 예방하는 데에도 활용될 수 있다. 단순하게는 본 발명의 화합물은 살균제로 사용될 수 있다는 것이다.

본 발명의 화합물은 시클로-옥시게나제 및 리폭시게나제 또는 어느 한쪽, NO, NO-신타제, 혈액 또는 생체내 글루코스 조절물질로 사용될 수 있어 통증, 열, 관상 염증 상태, 궤양형성, 발암물질 기전 및 혈관확장의 치료, 예방 또는 변질물질로써 유용하며 진통약제, 항응고제, 항염증약 및 면역반응 조절제로도 사용 가능하다.

또한, 본 발명은 화합물 또는 추출물을 약학적 제제의 부형제으로 사용되는 용도를 포함하고 있다. 따라서, 본 발명은 여러 조성물과 방법을 예시하고 있다. 예를 들어, 항산화제 또는 방부제 조성물, 토포이소머라제 (topisomerase) II-억제인자 조성물, 산화 등으로부터 식품을 보전하는 방법, 토포이소머라제 II를 억제하는 방법 등의 용도를 본 발명은 포함하고 있다. 본 발명의 화합물은 조성물로도 구성될 수 있다. 상기 방법은 식품, 품목 및 토포이소머라제 II를 해당 조성물 또는 본 발명의 화합물과 접촉하는 공정으로 구성될 수 있다. 본 발명의 기타 조성물, 방법 및 구현은 상기 기술된 내용으로부터 추론할 수 있다.

이에 있어서 본 발명은 식용 원료로부터 제조되며 실험관의 활성이 최소한 소정의 생체내 활성을 암시해 주고 있다. 당해 실험관 및 생체내 실험 데이터를 기초로 하여 투여량, 투여 경로 및 조성을 과도의 실험 없이 얻을 수 있다.

[실시예 34]

코코아 프로시아니딘의 미셀-동전기적-모세관(micellar electrokinetic capillary) 크로마토그래피

프로시아니딘 올리고머를 분리하기 위하여 미셀-동전기적-모세관 크로마토그래피 (MECC)를 사용한 신속한 방법이 개발되었으며 이는 1994년 Delgado등이 보고한 공정과정을 개조한 방법이다. 일반 정상 HPLC 분석으로 70분 동안 분리되는 동일한 양을 MECC 방법은 단지 12분만으로 처리할 수 있다. 도 57은 실시예 2에서 수득된 코코아 프로시아니딘을 MECC 분리한 것을 보여주고 있다.

MECC 조건

코코아 프로시아니딘 추출물은 실시예 2에서 기술된 바와 같은 방법으로 제조되었다. 즉, 붕산 200mM과 도데실 황산나트륨 (전기영동으로 정제된 sodium dodecyl sulfate) 50mM으로 구성되어 수산화나트륨을 가하여 pH가 8.5로 조절된 MECC 완충액에 코코아 프로시아니딘 추출물을 1mg/mL의 농도로 용해하였다.

시료는 0.45um 필터에 여과되어 휴렛 패커드 HP-3D CZE 시스템을 사용하여 아래와 같은 조건하에 전기영동 처리되었다:

입구 완충액 : 완충액을 상기 설명한 바와 같이 가동

출구 완충액 : 완충액을 상기 설명한 바와 같이 가동

모세관 (capillary) : 50cm x 75um, 무피복 용융 실리카

검출 : 200nm, 다이오우드 배열 검출기 (Diode Array Detector)

분사 : 3초에 50mBar (초당 150mBar)

전압 : 6와트

암페어 수 : 시스템 한계선 (<300uA)

온도 : 25℃

모세관 조건 : 운전 전후 운전 완충제로 5분 동안 관류시킴

상기 방법은 온도, 기압, 전압 파라미터 및 운전 완충제의 유기 조절제와 키랄 선택성 제제를 조절함에 따라 변경될 수 있다.

[실시예 35]

금속염 용액을 포함한 프로시아니딘 올리고머의 MALDI - TOF/MS 분석

올리고머의 양이온 애덕트 (adducts)의 검출 여부를 측정하기 위하여 여러 금속염 용액이 혼합된 트라이머를 대상으로 일련의 MALDI - TOF/MS 분석이 시행되었다. 생리과정과 질환에 중요한 금속 양이온을 킬레이트화 또는 전이여 프로시아니딘 올리고머가 실험관 및 생체내에서 생리적인 역할을 한다는 것을 본 실험을 통해 입증되었다. 실시예 15에서 기술되었던 방법이 사용되었다. 황화 아연 2수화물 (Zinc sulfate dihydrate), 염화칼슘, 황산마그네슘, 염화철 6수화물 (ferric chloride hexahydrate), 황산철 7수화물 (ferrous sulfate heptahydrate) 및 황산 제2구리를 함유한 2uL의 10nM 용액을 실시예 14에서 설명된 바와 같이 정제 외견상 균질성을 갖도록 정제된 4uL의 트라이머에 각각 혼합 (10mg/mL)시킨 후 44uL의 DHB가 첨가되었다.

도 58A-F의 결과는 구리 및 철 (제1철 및 제2철) [금속-트라이머 + H]+ 이온의 m/z 값이 질량의 이론적 산정 수치에 해당하는 ±1 amu 표준 편차수치와 동일하다는 것을 보여 주고있다. 칼슘과 마그네슘의 [금속-트라이머 + H]+ 질량은 당해 m/z 값이 ±1 amu 표준 편차수치의 범위 안에 속하는 나트륨 및 칼륨의 [금속-트라이머 + H]+ 질량으로부터 명료하게 결정할 수 가 없었다. NO [Zn+2 - 트라이머 + H]+ 이온은 검출되었다. 이들 양이온의 일부분이 다가성이므로 다금속-올리고머 리간드 종류 및 금속-다올리고머 종류 또는 어느 한쪽이 가능하였다. 그러나, 이들의 애덕트를 예측 질량에서 스캔하는 시도는 실패하였다.

해당 이온의 주기표율의 상대적인 위치 및 산화상태를 참조하여 기타 금속 이온들과 본 발명의 화합물 반응의 향후 분석에 있어서 구리, 철, 칼슘, 마르네슘 및 아연의 상기 결과를 사용할 수 있을 것이다.

[실시예 36]

고분자량 프로시아니딘 올리고머의 MALDI - TOF/MS 분석

실시예 3의 방법 (가)에서 준비된 고분자량 프로시아니딘 올리고머와 연관된 GPC 용출제에 대해서 분석 검사하였다. 이의 목적은 n > 12의 값을 갖은 프로시아니딘 올리고머가 존재하는 여부를 파악하는 것이었다. 만약에 존재한다면 이들의 올리고머는 본 발명의 추가적인 화합물을 예시한다. 항발암, 항종양, 항신생물제 활성, 항산화제 활성, DNA 토포이소머라제 (topisomerase II) 효소 억제성, 산화의 의한 DNA의 파손, 항세균, NO 또는 NO-신타제, 아폽토시스 , 혈소판 응집, 혈액 또는 생체내 글루코스 조절 활성, 비스테로이드 항염증 제제의 활성과 관련하여 추후 실험관 및 생체내 실험평가를 위하여 본 발명에서 구현된 기존의 격리, 분리 및 정제 방법을 조절하여 상기 올리고머를 수득할 수 있다.

도 59는 상기 설명된 GPC 용출제의 MALDI-TOF 질량 스펙트럼을 보여 주고 있다. 여기서 프로시아니딘 올리고머의 테트라머 내지 십헥사머의 특징이라고 할 수 있는 [M + Na]+ , [M + K]+ 및 [M + 2Na]+ 이온 또는 어느 한쪽이든 두 쪽의 이온은 분명하게 보여주고 있다.

산과 열처리에 의해 프로시아니딘 올리고머의 가수분해가 이루어진다는 사실을 알게 되었다. 그러므로, 저분자량 프로시아니딘 올리고머 (예,n이 2 내지 12일 경우)의 제조방법의 일환으로 고분자량 프로시아니딘 올리고머의 통제된 가수분해 방법을 본 발명을 포함하고 있다.

[실시예 37]

프로시아니딘 올리고머와 개 및 고양이 세포주 (cell line)의 투여량 반응 관계

프로시아니딘 올리고머의 투여량 반응은 개 및 고양이 세포주을 대상으로 평가되었다. 여기서 해당 세포주은 영국 레이케스털샤열, 멜톤 모우브레이, 왈탐 온도월즈 (Waltham on-the-Wolds, Melton Mowbray, Leicestershire, U.K.)에 위치한 애완 동물 영양을 의한 왈탐 센터 (Waltham Center for Pet Nutrition)에서 취득하였다. 더욱 상세하게는 상기 세포주은 아래와 같다:

개 정상 신장 GH 세포주;

개 정상 신장 MDCK 세포주;

고양이 정상 신장 CRFK 세포주 및

실시예 8의 방법 (가)에서 기술된 조건으로 배양되고 백혈병 바이러스를 생성하는 고양이 림프아구 FeA 세포주.

실시예 14의 방법 (라)에 기술된 방법으로 n이 2내지 10인 모노머 및 프로시아니딘 올리고머가 정제되었다. 실시예 14의 방법 (다)에 설명된 바와 같이 상기 올리고머는 분석 정상 HPLC로 인해 조사되어 다음과 같은 결과가 얻었다.

프로시아니딘 HPLC에 의한 순도 (%)

모노머 95.4

다이머 98.0

트라이머 92.6

테트라머 92.6

펜타머 93.2

헥사머 89.2 (펜타머 4.4% 함유)

헵타머 78.8 (헥사머 18.0% 함유)

옥타머 76.3 (헵타머 16.4% 함유)

노나머 60.3 (옥타머 27.6% 함유)

데카머 95.4

(노나머 4.4%, 옥타머 16.5%, 헵타머 13.6% 함유)

올리고머의 순도가 90% 미만일 경우, 본 발명에서 구현된 방법으로 재정제되었다.

모노머와 각 프로시아니딘 올리고머가 각 세포주에 10ug/mL, 50ug/mL 및 100ug/mL의 농도로 투여되었고 이의 결과는 도 60-63에 기재되어 있다. 도면에서 보여주듯이, 각 올리고머의 높은 투여량 (100ug/mL)은 고양이 림프아구 FeA 세포주와 고양이 정상 신장 CRFK 세포주에 유사한 억제효과를 초래하였다. 이에 있어서 세포독성이 펜타머인 경우에 나타났고 올리고머의 구성수가 증가할수록 높은 세포독성을 유발하였다. 이와 반대로, 개 GH 및 MDCK 정상 신장 세포주에 고투여량 (100ug/mL)으로 투여된 각 올리고머는 구성수가 보다 높아야지 만 세포독성이 발생하였다. 개 GH 정상 신장 세포주인 경우에는 펜타머에서 세포독성이 발생하였다. 개 MDCK 정상 신장 세포주인 경우에는 헵타머에서 세포독성이 나타났다. 상기 두 경우에는 높은 구성수를 갖은 올리고머가 투여됨에 따라 보다 상승된 세포독성이 발생하였다.

[실시예 38]

정제의 조성

1996년 9월 6일자로 출원되었던 미국출원번호 제 08/709,406에서 기술된 방법에 의하여 코코아 고체를 사용하여 정제 조성물이 제조되었다. 기존 가공 코코아에서 감지되는 당해 화합물 레벨과는 비교하여 본 식용 물질은 자연 발생되는 본 발명의 화합물 레벨을 향상시켜주는 방법으로 제조되었다. 이러한 방법으로 인하여 가공전후의 본 발명의 화합물의 함유 비율이 2이하가 되도록 처리되었다. 편의상 상기 코코아 고체물질을 이하 CP-코코아 고체이라 한다. 본 실시예에서 언급된 바와 같이 단리 및 정제 또는 어느 한쪽의 형태로 처리된 본 발명의 화합물이 CP-코코아 고체를 정제에 대체하거나 병합 사용될 수 있다.

정제 조성물은 아래와 같이 구성되었다 (백분율은 중량퍼센트로 표기됨):

CP-코코아 고체 24.0%

4배 자연 바닐람 추출물

(부슈 보우크 앨렌: Bush Boake Allen) 1.5%

스테아르마그네슘 (Magnesium stearate)

(건조 윤활제로써 에얼켐사, AerChem, Inc.,에서 제조) 0.5%

디팩 정제용 당 (Dipac tabletting sugar) 37.0%

크실리톨

(아메리카 자이로핀사, American Xyrofin, Inc.) 37.0%

100.0%

CP-코코아 고체와 바닐라 추출물은 식품 가공기 (믹서)에 2분 동안 혼합되었다. 설탕과 스테아르마그네슘 (Magnesium stearate)을 부드럽게 섞은 후 CP-코코아 고체/바닐라 혼합물에 배합되었다. 이 물질을 최대압력과 성형 세팅에서 매네스티 정제 압착기 (Manesty Tablet Press; B3B)로 처리되어 중량 1.5-1.8g의 원형 정제가 제조되었다. 상기 조성에 따른 별개의 정제는 CP-코코아 고체 대신 상용적으로 공급되는 저지방 자연산 코코아 분말 (11% 지방)을 사용하여 제조되었다. 상기 두 정제 조성물은 조미특성과 구성감을 용인할 수 있는 레벨의 제품을 제공하였다.

상기 두 정제 조성물의 분석은 실시예 4의 방법 (2)에 언급된 방법으로 시행되었다. 펜타머의 농도 및 모노머와 n이 2내지 12인 본 발명의 화합물의 총합계 레벨에 상기 분석의 초점을 맞추었으며 이의 결과는 다음과 같다:

정제 시료	오량체(ug/g)	총합계(ug/g)	오량체(ug/1.8g 일인분)	총합계(ug/1.8g 일인분)
CP-코코아 고체를함유한 정제	239	8,277	430	14,989
상용 저지방 코코아분말을 함유한 정제	검출 안됨	868	검출 안됨	1,563

상기 데이터는 펜타머 및 본 발명의 화합물이 다른 정제 조성물보다 CP-코코아 고체 정제에서 보다 높은 레벨을 갖추고 있다는 것을 입증하고 있다. 그러므로, 경구투여에 있어서 CP-코코아 고체로 조제된 정제 조성물은 약제, 보충재 및 식품 응용분야에 적합한 부형약으로 간주된다.

당해 분야에 통상적인 지식을 소유한 자라면 다음과 같은 광범위한 성질을 가진 기타 정제 조성물을 조제할 수 있을 것이다: 조미, 색채, 부형제, 비타민, 광물, OTC 약물, 당 (糖) 첨가제, UV 보호제 (예, 이산화 티탄, 착색체 등), 결합제, 수산화알루미늄 겔 (hydrogels) 및 본 발명의 화합물 또는 그의 배합물을 불가역성적으로 결합시키는 폴리비닐 피롤리돈을 제외한 이들의 나머지 유사체. 당 첨가제의 양을 조절하여 본 발명의 화합물 또는 이들의 배합물의 투여량을 조작할 수 있다.

본 발명의 피상적인 변형은 자명하다고 판단되며 이는 본 실시예의 범위와 요지를 벗어나지 않아도 가능하다.

[실시예 39]

캡슐제 조성

본 발명 화합물의 경구투여에 있어서, 실시예 38의 변형은 젤라틴으로 구성된 밀어-맞춤 (push-fit) 캡술제 및 젤라틴과 글리세롤과 같은 가소제로 구성된 봉합된 연질형 캡술제가 있다. 밀어-맞춤 (push-fit) 캡술제는 본 발명의 화합물, 이의 배합물 또는 실시예 38과 40에서 예시된 CP-코코아 고체 분말을 함유하고 있다. 본 발명의 투여량은 조절하기 위하여 유당 또는 자당과 같은 첨가제를 상기 분말에 선택적으로 혼합할 수 있다. 연질성 캡슐인 경우에는 본 발명의 화합물, 이의 배합물 또는 CP-코코아 고체를 지방유, 코코아 버터 또는 이의 혼합물가 같은 적당한 액체에 현탁시킨다. 본 발명의 화합물이 UV등 감광성을 띌 수 있으므로 UV에서부터 보호하기 위하여 본 캡슐은 이산화 티탄 또는 색체 등과 같은 UV 보호제를 함유할 수 있다. 상기 실시예에서 언급된 첨가제 또한 캡슐에 함유시킬 수 있다.

본 발명의 피상적인 변형은 자명하다고 판단되며 이는 본 실시예의 범위와 요지를 벗어나지 않아도 가능하다.

[실시예 40]

아이덴터티 표준 (standard of identity, SOI)와 비표준 (Non-standard of identity, non-SOI) 다크 및 밀크 초콜렛

본 발명의 방법으로 제조된 화합물 또는 이의 배합물의 조성으로부터 의학 및 수의용 SOI 및 non-SOI 다크 초콜렛과 이의 밀크 초콜렛을 조제할 수 있다. 동시 계류중인 미국특허출원 제 08/709,406호 (1996년 9월 6일 출원)는 여기서 인용되는데 이는 공정과정의 특이한 결합을 사용하여 코코아 열매로부터 본 발명의 화합물이 저제된 레벨으로 함유되어 있는 코코아 버터 및 코코아 고체 또는 어느 한쪽의 조성물을 제조하는 방법을 공지하고 있다. 상기 공정과정으로 수득된 식용 코코아 고체는 자연 발생된 본 발명의 화합물을 보존함으로써 기존방법으로 가공된 코코아의 당해 화합물 레벨과 대조된다. 즉, 이러한 방법으로 인하여 코코아 열매의 가공전후의 본 발명 화합물의 함유 비율이 2이하가 되도록 처리되었다. 편의상 상기 코코아 고체물질을 이하 CP-코코아 고체이라 한다. SOI 초콜렛, non-SOI 초콜렛, 음료수, 과자, 제과 및 요리용 재료 등으로 만드는데 있어서 CP-코코아 고체는 분말 또는 액제로 사용될 수 있다.

여기서 사용되는 "SOI 초콜렛"은 연방식품, 약품 및 화장품법 (Federal Food, Drug and Cosmetic Act)에 의거 미국식품 및 약품관리청 (U.S. Food and Drug Administration, FDA)이 개정한 표준주체 (Standard of Identity)의 의하여 미국 내에서 사용되는 모든 초콜렛을 의미한다. 미국에서는 여러 종류의 초콜렛의 정의와 표준이 잘 확립되어 있다. 여기서 "non-SOI 초콜렛"은 표준 초콜렛의 일정한 범위를 벗어나는 조성물을 가진 모든 비표준 초콜렛을 의미한다.

다음과 같은 과정을 거친 때 비표준 초콜렛을 형성된다: 예로써, 코코아 버터 또는 우유지방이 부분 또는 완전하게 대체된 경우; 영양 탄수화물 감미제가 부분 또는 완전하게 대체된 경우; 향미료 우유, 버터, 코코아 분말 또는 초콜렛의 맛을 내는 향미제가 첨가된 경우; 및 초콜렛 또는 이의 배합에 대한 미국 FDA 아이덴터티 표준 (Standard of Identity) 범위를 벗어 나는 기타 첨가 또는 삭감이 있을 경우.

일종의 과자로써 초콜렛은 바 (bar) 또는 새로운 모양의 고체형태를 가질 수 있다. 또한, 초콜렛은 한 구성 성분으로써 더욱 복잡한 과자에 함유될 수 있다. 여기서 초콜렛은 다음과 같은 물질과 선택적으로 배합될 수 있다: 자연 향미 물질로 구분되는 향미와 추출물 제조업체 협회 (Flavor & Extract Manufacturers Association, FEMA)에 의한 물질, 자연산 주스, 향신료 및 추출물; 자연산과 동일한 물질; FEMA GRAS 목록, FEMA 및 FDA 목록, 유럽의회 (Council of Europe, CoE) 목록, FAO/WHO 식품 표준 프로그램 (FAO/WHO Food Standard Programme)에서 채택된 향미산업 국제기구 (International Organization of the Flavor Industry, IOFI) 목록, 코덱스 아리멘타리스 목록(Codex Alimentarius), 식품화학 코덱스 (Food Chemicals Codex) 목록에서 정의된 인공 항미제; 캐러멜, 누가, 견과, 웨이퍼 또는 이의 유사체와 같은 기타 식품을 일반적으로 코우팅하는 인공 향미제. 상기 식품물은 온도 65-85。F에서 정상적인 기압에서 미생물적 저장 안정성의 특징을 가지고 있다. 기타 복합 과자는 감로 체리 또는 땅콩 버터와 같은 초콜렛 연질 봉입체로 에워 싸워서 제조된다. 또 복합 과자는 아이스크림 및 기타 냉동 또는 냉각된 후식을 초콜렛으로 코우팅하여 제조 될 수도 있다. 일반적으로 식품을 코우팅 또는 에워싸는 용도로 사용되는 초콜렛은 고체 바 또는 새로운 모양용 일반 초콜렛보다 더욱 유동성이 있어야 한다.

부수적으로, 초콜렛은 저지방 초콜렛도 될 수 있고 이는 지방과 무지방 고체, 영양 탄소화물 감미제 및 식용 유화제로 구성된다. 저지방 초콜렛에 관해서는 아래의 특허가 인용될 수 있다: 미국특허 제 4,810,516호, 제 4,701,337호, 제 5,464,649호, 제 5,474,795호 및 WO 96/19923.

< 참 고 문 헌 >

Claims (208)

1. 일반식 A_n으로 표시되며, 여기서 A는 하기 일반식의 모노머이고, n은 3 내지 18의 정수이며, 최소한 하나의 말단 모노머 유니트 A와 복수의 부가적 모노머 유니트가 존재하는 폴리머 화합물과 약제학적으로 허용가능한 그의 염과 유도체 및 그의 산화물:

   여기에서,

   R은 3-(α)-OH, 3-(β)-OH, 3-(α)-O-당(sugar), 또는 3-(β)-O-당이고;

   인접한 모노머들은 4번, 6번 및 8번 위치 중에서 선택되는 위치에서 서로 결합하며;

   4번 위치에서의 부가적 모노머 유니트에 대한 결합은 알파 또는 베타 입체화학구조이고;

   X, Y 및 Z는 모노머 유니트 A, 수소 및 당으로 구성된 그룹에서 선택되며, 최소한 하나의 말단 모노머 유니트에 대한 부가적 모노머 유니트의 결합은 4번 위치에서 이루어지고, 선택적으로 Y=Z=수소이며;

   당은 선택적으로 페놀 부분으로 치환된다.
2. 제1항에 있어서, n은 5인 화합물.
3. 제1항에 있어서, 당은 글루코스, 갈락토스, 자일로스, 람노스 및 아라비노스로 이루어진 그룹에서 선택되는 화합물.
4. 제1항에 있어서, 천연 소스(source)로부터 분리되는 화합물.
5. 제4항에 있어서, 상기 천연 소스는 테오브로마(Theobroma) 또는 헤라니아(Herrania) 종이거나, 그들의 이종간(inter-species) 종특이적 잡종 또는 동종간(intra-species) 종특이적 잡종인 화합물.
6. 제1항에 있어서, 실질적으로 순수한 화합물.
7. 제1항에 있어서, 균질성을 갖도록 정제된 화합물.
8. 제1항에 있어서, 페놀 부분은 카페인산, 시나민산, 쿠마린산, 페룰린산, 갈린산, 하이드록시벤조산 및 시나핀산으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 화합물.
9. 일반식 A_n으로 표시되며, 여기서 A는 하기 일반식의 모노머이고, n은 3 내지 18의 정수이며, 최소한 하나의 말단 모노머 유니트 A와 복수의 부가적 모노머 유니트가 존재하는 폴리머 화합물과 약제학적으로 허용가능한 그의 염과 유도체 및 그의 산화물과 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 항신생물 조성물 :

   여기에서,

   R은 3-(α)-OH, 3-(β)-OH, 3-(α)-O-당, 또는 3-(β)-O-당이고;

   인접한 모노머들은 4번, 6번 및 8번 위치 중에서 선택되는 위치에서 서로 결합하며;

   4번 위치에서의 부가적 모노머 유니트에 대한 결합은 알파 또는 베타 입체화학구조이고;

   X, Y 및 Z는 모노머 유니트 A, 수소 및 당으로 구성된 그룹에서 선택되며, 최소한 하나의 말단 모노머 유니트에 대한 부가적 모노머 유니트의 결합은 4번 위치에서 이루어지고, 선택적으로 Y=Z=수소이며;

   당은 선택적으로 페놀 부분으로 치환된다.
10. 제9항에 있어서, n은 5 내지 12인 조성물.
11. 제9항에 있어서, 당은 글루코스, 갈락토스, 자일로스, 람노스 및 아라비노스로 이루어진 그룹에서 선택되는 조성물.
12. 제9항에 있어서, 상기 폴리머 화합물은 실질적으로 순수한 것인 조성물.
13. 제9항에 있어서, 페놀 부분은 카페인산, 시나민산, 쿠마린산, 페룰린산, 갈린산, 하이드록시벤조산 및 시나핀산으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 조성물.
14. 제9항에 있어서, n은 5인 조성물.
15. 제9항에 따른 항신생물 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 항신생물제에 의한 치료가 필요한 대상을 치료하는 방법.
16. 제15항에 있어서, 하나 이상의 추가적인 항신생물제를 투여하는 것을 더 포함하는 방법.
17. 제9항에서 언급한 화합물과 담체 또는 희석제의 개별포장을 포함하며, 혼합방법 또는 투여방법에 대한 설명서를 선택적으로 포함하는 제9항의 조성물을 위한 키트.
18. 제9항에 있어서, 정제, 캡슐, 아이덴터티 표준 쵸콜렛 및 아이덴터티 비표준 쵸콜렛으로 이루어진 그룹에서 선택되는 조성물.
19. 일반식 A_n으로 표시되며, 여기서 A는 하기 일반식의 모노머이고, n은 2 내지 18의 정수이며, 최소한 하나의 말단 모노머 유니트 A와 복수의 부가적 모노머 유니트가 존재하는 폴리머 화합물과 약제학적으로 허용가능한 그의 염과 유도체 및 그의 산화물과 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 항산화 조성물 :

    여기에서,

    R은 3-(α)-OH, 3-(β)-OH, 3-(α)-O-당, 또는 3-(β)-O-당이고;

    인접한 모노머들은 4번, 6번 및 8번 위치 중에서 선택되는 위치에서 서로 결합하며;

    4번 위치에서의 부가적 모노머 유니트에 대한 결합은 알파 또는 베타 입체화학구조이고;

    X, Y 및 Z는 모노머 유니트 A, 수소 및 당으로 구성된 그룹에서 선택되며, 최소한 하나의 말단 모노머 유니트에 대한 부가적 모노머 유니트의 결합은 4번 위치에서 이루어지고, 선택적으로 Y=Z=수소이며;

    당은 선택적으로 페놀 부분으로 치환된다.
20. 제19항에 있어서, n은 2 내지 10인 조성물.
21. 제19항에 있어서, 당은 글루코스, 갈락토스, 자일로스, 람노스 및 아라비노스로 이루어진 그룹에서 선택되는 조성물.
22. 제19항에 있어서, 상기 폴리머 화합물은 실질적으로 순수한 것인 조성물.
23. 제19항에 있어서, 페놀 부분은 카페인산, 시나민산, 쿠마린산, 페룰린산, 갈린산, 하이드록시벤조산 및 시나핀산으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 조성물.
24. 제19항에 있어서, n은 2 내지 12인 조성물.
25. 제19항에 따른 항산화 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 항산화제에 의한 치료가 필요한 대상을 치료하는 방법.
26. 제25항에 있어서, 하나 이상의 추가적인 항산화제를 투여하는 것을 더 포함하는 방법.
27. 제19항에 있어서, 정제, 캡슐, 아이덴터티 표준 쵸콜렛 및 아이덴터티 비표준 쵸콜렛으로 이루어진 그룹에서 선택되는 조성물.
28. 제19항에서 언급한 화합물과 담체 또는 희석제의 개별포장을 포함하며, 혼합방법 또는 투여방법에 대한 설명서를 선택적으로 포함하는 제19항의 조성물을 위한 키트.
29. 제19항에 따른 항산화 조성물을 접촉시키는 것을 포함하는, 목적 품목을 산화로부터 보존 또는 보호하기 위한 방법.
30. 일반식 A_n으로 표시되며, 여기서 A는 하기 일반식의 모노머이고, n은 2 내지 18의 정수이며, 최소한 하나의 말단 모노머 유니트 A와 복수의 부가적 모노머 유니트가 존재하는 폴리머 화합물과 약제학적으로 허용가능한 그의 염과 유도체 및 그의 산화물과 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 항균성 조성물 :

    여기에서,

    R은 3-(α)-OH, 3-(β)-OH, 3-(α)-O-당, 또는 3-(β)-O-당이고;

    인접한 모노머들은 4번, 6번 및 8번 위치 중에서 선택되는 위치에서 서로 결합하며;

    4번 위치에서의 부가적 모노머 유니트에 대한 결합은 알파 또는 베타 입체화학구조이고;

    X, Y 및 Z는 모노머 유니트 A, 수소 및 당으로 구성된 그룹에서 선택되며, 최소한 하나의 말단 모노머 유니트에 대한 부가적 모노머 유니트의 결합은 4번 위치에서 이루어지고, 선택적으로 Y=Z=수소이며;

    당은 선택적으로 페놀 부분으로 치환된다.
31. 제30항에 있어서, n은 2 내지 10인 조성물.
32. 제30항에 있어서, 당은 글루코스, 갈락토스, 자일로스, 람노스 및 아라비노스로 이루어진 그룹에서 선택되는 조성물.
33. 제30항에 있어서, 상기 폴리머 화합물은 실질적으로 순수한 것인 조성물.
34. 제30항에 있어서, 페놀 부분은 카페인산, 시나민산, 쿠마린산, 페룰린산, 갈린산, 하이드록시벤조산 및 시나핀산으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 조성물.
35. 제30항에 있어서, n은 2, 4, 5, 6, 8 및 10에서 선택되는 조성물.
36. 제30항에 있어서, 정제, 캡슐, 아이덴터티 표준 쵸콜렛 및 아이덴터티 비표준 쵸콜렛으로 이루어진 그룹에서 선택되는 조성물.
37. 제30항에 따른 항균성 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 항균제에 의한 치료가 필요한 대상을 치료하는 방법.
38. 제37항에 있어서, 하나 이상의 추가적인 항균제를 투여하는 것을 더 포함하는 방법.
39. 제30항에서 언급한 화합물과 담체 또는 희석제의 개별포장을 포함하며, 혼합방법 또는 투여방법에 대한 설명서를 선택적으로 포함하는 제30항의 조성물을 위한 키트.
40. 일반식 A_n으로 표시되며, 여기서 A는 하기 일반식의 모노머이고, n은 2 내지 18의 정수이며, 최소한 하나의 말단 모노머 유니트 A와 복수의 부가적 모노머 유니트가 존재하는 폴리머 화합물과 약제학적으로 허용가능한 그의 염과 유도체 및 그의 산화물과 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 시클로-옥시게나제 및/또는 리폭시게나제 조절 조성물 :

    여기에서,

    R은 3-(α)-OH, 3-(β)-OH, 3-(α)-O-당, 또는 3-(β)-O-당이고;

    인접한 모노머들은 4번, 6번 및 8번 위치 중에서 선택되는 위치에서 서로 결합하며;

    4번 위치에서의 부가적 모노머 유니트에 대한 결합은 알파 또는 베타 입체화학구조이고;

    X, Y 및 Z는 모노머 유니트 A, 수소 및 당으로 구성된 그룹에서 선택되며, 최소한 하나의 말단 모노머 유니트에 대한 부가적 모노머 유니트의 결합은 4번 위치에서 이루어지고, 선택적으로 Y=Z=수소이며;

    당은 선택적으로 페놀 부분으로 치환된다.
41. 제40항에 있어서, n은 2 내지 10인 조성물.
42. 제40항에 있어서, 당은 글루코스, 갈락토스, 자일로스, 람노스 및 아라비노스로 이루어진 그룹에서 선택되는 조성물.
43. 제30항에 있어서, 상기 폴리머 화합물은 실질적으로 순수한 것인 조성물.
44. 제40항에 있어서, 페놀 부분은 카페인산, 시나민산, 쿠마린산, 페룰린산, 갈린산, 하이드록시벤조산 및 시나핀산으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 조성물.
45. 제40항에 있어서, n은 2 내지 5인 조성물.
46. 제40항에 있어서, 정제, 캡슐, 아이덴터티 표준 쵸콜렛 및 아이덴터티 비표준 쵸콜렛으로 이루어진 그룹에서 선택되는 조성물.
47. 제40항에 따른 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 시클로-옥시게나제 및/또는 리폭시게나제 조절제에 의한 치료가 필요한 대상을 치료하는 방법.
48. 제47항에 있어서, 하나 이상의 추가적인 시클로-옥시게나제 및/또는 리폭시게나제 조절제를 투여하는 것을 더 포함하는 방법.
49. 제40항에서 언급한 화합물과 담체 또는 희석제의 개별포장을 포함하며, 혼합방법 또는 투여방법에 대한 설명서를 선택적으로 포함하는 제40항의 조성물을 위한 키트.
50. 일반식 A_n으로 표시되며, 여기서 A는 하기 일반식의 모노머이고, n은 2 내지 18의 정수이며, 최소한 하나의 말단 모노머 유니트 A와 복수의 부가적 모노머 유니트가 존재하는 폴리머 화합물과 약제학적으로 허용가능한 그의 염과 유도체 및 그의 산화물과 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 NO 또는 NO-신타제(synthase) 조절 조성물 :

    여기에서,

    R은 3-(α)-OH, 3-(β)-OH, 3-(α)-O-당, 또는 3-(β)-O-당이고;

    인접한 모노머들은 4번, 6번 및 8번 위치 중에서 선택되는 위치에서 서로 결합하며;

    4번 위치에서의 부가적 모노머 유니트에 대한 결합은 알파 또는 베타 입체화학구조이고;

    X, Y 및 Z는 모노머 유니트 A, 수소 및 당으로 구성된 그룹에서 선택되며, 최소한 하나의 말단 모노머 유니트에 대한 부가적 모노머 유니트의 결합은 4번 위치에서 이루어지고, 선택적으로 Y=Z=수소이며;

    당은 선택적으로 에스테르 결합에 의해 페놀 부분으로 치환된다.
51. 제50항에 있어서, n은 2 내지 10인 조성물.
52. 제50항에 있어서, 당은 글루코스, 갈락토스, 자일로스, 람노스 및 아라비노스로 이루어진 그룹에서 선택되는 조성물.
53. 제50항에 있어서, 상기 폴리머 화합물은 실질적으로 순수한 것인 조성물.
54. 제50항에 있어서, 페놀 부분은 카페인산, 시나민산, 쿠마린산, 페룰린산, 갈린산, 하이드록시벤조산 및 시나핀산으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 조성물.
55. 제50항에 있어서, 정제, 캡슐, 아이덴터티 표준 쵸콜렛 및 아이덴터티 비표준 쵸콜렛으로 이루어진 그룹에서 선택되는 조성물.
56. 제50항에 따른 NO 또는 NO-신타제 조절 조성물을 투여하는 것을 포함하는, NO-조절제에 의한 치료가 필요한 대상을 치료하는 방법.
57. 제56항에 있어서, 하나 이상의 추가적인 NO 또는 NO-신타제 조절제를 투여하는 것을 더 포함하는 방법.
58. 제50항에서 언급한 화합물과 담체 또는 희석제의 개별포장을 포함하며, 혼합방법 또는 투여방법에 대한 설명서를 선택적으로 포함하는 제50항의 조성물을 위한 키트.
59. 일반식 A_n으로 표시되며, 여기서 A는 하기 일반식의 모노머이고, n은 2 내지 18의 정수이며, 최소한 하나의 말단 모노머 유니트 A와 복수의 부가적 모노머 유니트가 존재하는 폴리머 화합물과, 약제학적으로 허용가능한 그의 염과 유도체 및 그의 산화물과, 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 조성물을 포유류에게 투여하는 것을 포함하는, NO 또는 NO-신타제 조절제에 의한 치료가 필요한 포유류를 치료하는 방법 :

    여기에서,

    R은 3-(α)-OH, 3-(β)-OH, 3-(α)-O-당, 또는 3-(β)-O-당이고;

    인접한 모노머들은 4번, 6번 및 8번 위치 중에서 선택되는 위치에서 서로 결합하며;

    4번 위치에서의 부가적 모노머 유니트에 대한 결합은 알파 또는 베타 입체화학구조이고;

    X, Y 및 Z는 모노머 유니트 A, 수소 및 당으로 구성된 그룹에서 선택되며, 최소한 하나의 말단 모노머 유니트에 대한 부가적 모노머 유니트의 결합은 4번 위치에서 이루어지고, 선택적으로 Y=Z=수소이며;

    당은 선택적으로 페놀 부분으로 치환된다.
60. 일반식 A_n으로 표시되며, 여기서 A는 하기 일반식의 모노머이고, n은 2 내지 18의 정수이며, 최소한 하나의 말단 모노머 유니트 A와 복수의 부가적 모노머 유니트가 존재하는 폴리머 화합물과, 약제학적으로 허용가능한 그의 염과 유도체 및 그의 산화물과, 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 조성물을 포유류에게 투여하는 것을 포함하는, 포유류의 NO에 영향받는 과콜레스테롤혈증의 완화방법 :

    여기에서,

    R은 3-(α)-OH, 3-(β)-OH, 3-(α)-O-당, 또는 3-(β)-O-당이고;

    인접한 모노머들은 4번, 6번 및 8번 위치 중에서 선택되는 위치에서 서로 결합하며;

    4번 위치에서의 부가적 모노머 유니트에 대한 결합은 알파 또는 베타 입체화학구조이고;

    X, Y 및 Z는 모노머 유니트 A, 수소 및 당으로 구성된 그룹에서 선택되며, 최소한 하나의 말단 모노머 유니트에 대한 부가적 모노머 유니트의 결합은 4번 위치에서 이루어지고, 선택적으로 Y=Z=수소이며;

    당은 선택적으로 페놀 부분으로 치환된다.
61. 제60항에 있어서, n은 2 내지 10인 방법.
62. 일반식 A_n으로 표시되며, 여기서 A는 하기 일반식의 모노머이고, n은 2 내지 18의 정수이며, 최소한 하나의 말단 모노머 유니트 A와 복수의 부가적 모노머 유니트가 존재하는 폴리머 화합물과, 약제학적으로 허용가능한 그의 염과 유도체 및 그의 산화물과, 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 조성물을 모노사이트 및/또는 마크로파지와 접촉시키는 것을 포함하는, 포유류의 모노사이트 및/또는 마크로파지에서의 iNOS의 유도방법 :

    여기에서,

    R은 3-(α)-OH, 3-(β)-OH, 3-(α)-O-당, 또는 3-(β)-O-당이고;

    인접한 모노머들은 4번, 6번 및 8번 위치 중에서 선택되는 위치에서 서로 결합하며;

    4번 위치에서의 부가적 모노머 유니트에 대한 결합은 알파 또는 베타 입체화학구조이고;

    X, Y 및 Z는 모노머 유니트 A, 수소 및 당으로 구성된 그룹에서 선택되며, 최소한 하나의 말단 모노머 유니트에 대한 부가적 모노머 유니트의 결합은 4번 위치에서 이루어지고, 선택적으로 Y=Z=수소이며;

    당은 선택적으로 페놀 부분으로 치환된다.
63. 일반식 A_n으로 표시되며, 여기서 A는 하기 일반식의 모노머이고, n은 2 내지 18의 정수이며, 최소한 하나의 말단 모노머 유니트 A와 복수의 부가적 모노머 유니트가 존재하는 폴리머 화합물과, 약제학적으로 허용가능한 그의 염과 유도체 및 그의 산화물과, 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 조성물을 포유류에게 투여하는 것을 포함하는, 포유류의 모노사이트 및/또는 마크로파지의 NO 생산을 자극하는 방법 :

    여기에서,

    R은 3-(α)-OH, 3-(β)-OH, 3-(α)-O-당, 또는 3-(β)-O-당이고;

    인접한 모노머들은 4번, 6번 및 8번 위치 중에서 선택되는 위치에서 서로 결합하며;

    4번 위치에서의 부가적 모노머 유니트에 대한 결합은 알파 또는 베타 입체화학구조이고;

    X, Y 및 Z는 모노머 유니트 A, 수소 및 당으로 구성된 그룹에서 선택되며, 최소한 하나의 말단 모노머 유니트에 대한 부가적 모노머 유니트의 결합은 4번 위치에서 이루어지고, 선택적으로 Y=Z=수소이며;

    당은 선택적으로 페놀 부분으로 치환된다.
64. 제63항에 있어서, n은 2 내지 10인 방법.
65. 일반식 A_n으로 표시되며, 여기서 A는 하기 일반식의 모노머이고, n은 2 내지 18의 정수이며, 최소한 하나의 말단 모노머 유니트 A와 복수의 부가적 모노머 유니트가 존재하는 폴리머 화합물과 약제학적으로 허용가능한 그의 염과 유도체 및 그의 산화물과 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 생체내(in vivo) 글루코스-조절 조성물 :

    여기에서,

    R은 3-(α)-OH, 3-(β)-OH, 3-(α)-O-당, 또는 3-(β)-O-당이고;

    인접한 모노머들은 4번, 6번 및 8번 위치 중에서 선택되는 위치에서 서로 결합하며;

    4번 위치에서의 부가적 모노머 유니트에 대한 결합은 알파 또는 베타 입체화학구조이고;

    X, Y 및 Z는 모노머 유니트 A, 수소 및 당으로 구성된 그룹에서 선택되며, 최소한 하나의 말단 모노머 유니트에 대한 부가적 모노머 유니트의 결합은 4번 위치에서 이루어지고, 선택적으로 Y=Z=수소이며;

    당은 선택적으로 페놀 부분으로 치환된다.
66. 제65항에 있어서, n은 2 내지 10인 조성물.
67. 제65항에 있어서, 당은 글루코스, 갈락토스, 자일로스, 람노스 및 아라비노스로 이루어진 그룹에서 선택되는 조성물.
68. 제65항에 있어서, 상기 폴리머 화합물은 실질적으로 순수한 것인 조성물.
69. 제65항에 있어서, 페놀 부분은 카페인산, 시나민산, 쿠마린산, 페룰린산, 갈린산, 하이드록시벤조산 및 시나핀산으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 조성물.
70. 제65항에 있어서, 정제, 캡슐, 아이덴터티 표준 쵸콜렛 및 아이덴터티 비표준 쵸콜렛으로 이루어진 그룹에서 선택되는 조성물.
71. 제65항에 따른 글루코스-조절 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 글루코스-조절제에 의한 치료가 필요한 대상을 치료하는 방법.
72. 제71항에 있어서, 하나 이상의 추가적인 글루코스-조절제를 투여하는 것을 더 포함하는 방법.
73. 제65항에서 언급한 화합물과 담체 또는 희석제의 개별포장을 포함하며, 혼합방법 또는 투여방법에 대한 설명서를 선택적으로 포함하는 제65항의 조성물을 위한 키트.
74. 일반식 A_n으로 표시되며, 여기서 A는 하기 일반식의 모노머이고, n은 2 내지 18의 정수이며, 최소한 하나의 말단 모노머 유니트 A와 복수의 부가적 모노머 유니트가 존재하는 폴리머 화합물과 약제학적으로 허용가능한 그의 염과 유도체 및 그의 산화물과 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 토포아이소머라제 Ⅱ-억제 조성물 :

    여기에서,

    R은 3-(α)-OH, 3-(β)-OH, 3-(α)-O-당, 또는 3-(β)-O-당이고;

    인접한 모노머들은 4번, 6번 및 8번 위치 중에서 선택되는 위치에서 서로 결합하며;

    4번 위치에서의 부가적 모노머 유니트에 대한 결합은 알파 또는 베타 입체화학구조이고;

    X, Y 및 Z는 모노머 유니트 A, 수소 및 당으로 구성된 그룹에서 선택되며, 최소한 하나의 말단 모노머 유니트에 대한 부가적 모노머 유니트의 결합은 4번 위치에서 이루어지고, 선택적으로 Y=Z=수소이며;

    당은 선택적으로 페놀 부분으로 치환된다.
75. 제74항에 있어서, 당은 글루코스, 갈락토스, 자일로스, 람노스 및 아라비노스로 이루어진 그룹에서 선택되는 조성물.
76. 제74항에 있어서, 상기 폴리머 화합물은 실질적으로 순수한 것인 조성물.
77. 제74항에 있어서, 페놀 부분은 카페인산, 시나민산, 쿠마린산, 페룰린산, 갈린산, 하이드록시벤조산 및 시나핀산으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 조성물.
78. 제74항에 있어서, 정제, 캡슐, 아이덴터티 표준 쵸콜렛 및 아이덴터티 비표준 쵸콜렛으로 이루어진 그룹에서 선택되는 조성물.
79. 제74항에 따른 조성물을 토포아이소머라제 Ⅱ와 접촉시키는 것을 포함하는, 토포아이소머라제 Ⅱ 억제방법.
80. 제74항에서 언급한 화합물과 담체 또는 희석제의 개별포장을 포함하며, 혼합방법 또는 투여방법에 대한 설명서를 선택적으로 포함하는 제74항의 조성물을 위한 키트.
81. 일반식 A_n으로 표시되며, 여기서 A는 하기 일반식의 모노머이고, n은 2 내지 18의 정수이며, 최소한 하나의 말단 모노머 유니트 A와 복수의 부가적 모노머 유니트가 존재하는 폴리머 화합물과 약제학적으로 허용가능한 그의 염과 유도체 및 그의 산화물과 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 비스테로이드계 항염증 조성물 :

    여기에서,

    R은 3-(α)-OH, 3-(β)-OH, 3-(α)-O-당, 또는 3-(β)-O-당이고;

    인접한 모노머들은 4번, 6번 및 8번 위치 중에서 선택되는 위치에서 서로 결합하며;

    4번 위치에서의 부가적 모노머 유니트에 대한 결합은 알파 또는 베타 입체화학구조이고;

    X, Y 및 Z는 모노머 유니트 A, 수소 및 당으로 구성된 그룹에서 선택되며, 최소한 하나의 말단 모노머 유니트에 대한 부가적 모노머 유니트의 결합은 4번 위치에서 이루어지고, 선택적으로 Y=Z=수소이며;

    당은 선택적으로 페놀 부분으로 치환된다.
82. 제81항에 있어서, 당은 글루코스, 갈락토스, 자일로스, 람노스 및 아라비노스로 이루어진 그룹에서 선택되는 조성물.
83. 제81항에 있어서, 상기 폴리머 화합물은 실질적으로 순수한 것인 조성물.
84. 제81항에 있어서, 페놀 부분은 카페인산, 시나민산, 쿠마린산, 페룰린산, 갈린산, 하이드록시벤조산 및 시나핀산으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 조성물.
85. 제81항에 있어서, 정제, 캡슐, 아이덴터티 표준 쵸콜렛 및 아이덴터티 비표준 쵸콜렛으로 이루어진 그룹에서 선택되는 조성물.
86. 제81항에 따른 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 비스테로이드계 항염증제에 의한 치료가 필요한 대상을 치료하는 방법.
87. 제86항에 있어서, 하나 이상의 추가적인 비스테로이드계 항염증제를 투여하는 것을 더 포함하는 방법.
88. 제81항에서 언급한 화합물과 담체 또는 희석제의 개별포장을 포함하며, 혼합방법 또는 투여방법에 대한 설명서를 선택적으로 포함하는 제81항의 조성물을 위한 키트.
89. 일반식 A_n으로 표시되며, 여기서 A는 하기 일반식의 모노머이고, n은 2 내지 18의 정수이며, 최소한 하나의 말단 모노머 유니트 A와 복수의 부가적 모노머 유니트가 존재하는 폴리머 화합물과 약제학적으로 허용가능한 그의 염과 유도체 및 그의 산화물과 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 항치은염 또는 항치근막염 조성물 :

    여기에서,

    R은 3-(α)-OH, 3-(β)-OH, 3-(α)-O-당, 또는 3-(β)-O-당이고;

    인접한 모노머들은 4번, 6번 및 8번 위치 중에서 선택되는 위치에서 서로 결합하며;

    4번 위치에서의 부가적 모노머 유니트에 대한 결합은 알파 또는 베타 입체화학구조이고;

    X, Y 및 Z는 모노머 유니트 A, 수소 및 당으로 구성된 그룹에서 선택되며, 최소한 하나의 말단 모노머 유니트에 대한 부가적 모노머 유니트의 결합은 4번 위치에서 이루어지고, 선택적으로 Y=Z=수소이며;

    당은 선택적으로 페놀 부분으로 치환된다.
90. 제89항에 있어서, 당은 글루코스, 갈락토스, 자일로스, 람노스 및 아라비노스로 이루어진 그룹에서 선택되는 조성물.
91. 제89항에 있어서, 상기 폴리머 화합물은 실질적으로 순수한 것인 조성물.
92. 제89항에 있어서, 페놀 부분은 카페인산, 시나민산, 쿠마린산, 페룰린산, 갈린산, 하이드록시벤조산 및 시나핀산으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 조성물.
93. 제89항에 있어서, 정제, 캡슐, 아이덴터티 표준 쵸콜렛 및 아이덴터티 비표준 쵸콜렛으로 이루어진 그룹에서 선택되는 조성물.
94. 제89항에서 언급한 화합물과 담체 또는 희석제의 개별포장을 포함하며, 혼합방법 또는 투여방법에 대한 설명서를 선택적으로 포함하는 제89항의 조성물을 위한 키트.
95. 일반식 A_n으로 표시되며, 여기서 A는 하기 일반식의 모노머이고, n은 2 내지 18의 정수이며, 최소한 하나의 말단 모노머 유니트 A와 복수의 부가적 모노머 유니트가 존재하는 폴리머 화합물과 약제학적으로 허용가능한 그의 염과 유도체 및 그의 산화물과 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 조성물을 포유류에게 투여하는 것을 포함하는, 포유류의 치근막 질환의 감소방법 :

    여기에서,

    R은 3-(α)-OH, 3-(β)-OH, 3-(α)-O-당, 또는 3-(β)-O-당이고;

    인접한 모노머들은 4번, 6번 및 8번 위치 중에서 선택되는 위치에서 서로 결합하며;

    4번 위치에서의 부가적 모노머 유니트에 대한 결합은 알파 또는 베타 입체화학구조이고;

    X, Y 및 Z는 모노머 유니트 A, 수소 및 당으로 구성된 그룹에서 선택되며, 최소한 하나의 말단 모노머 유니트에 대한 부가적 모노머 유니트의 결합은 4번 위치에서 이루어지고, 선택적으로 Y=Z=수소이며;

    당은 선택적으로 페놀 부분으로 치환된다.
96. 제95항에 있어서, n은 2 내지 10인 방법.
97. 일반식 A_n으로 표시되며, 여기서 A는 하기 일반식의 모노머이고, n은 2 내지 18의 정수이며, 최소한 하나의 말단 모노머 유니트 A와 복수의 부가적 모노머 유니트가 존재하는 폴리머 화합물과 약제학적으로 허용가능한 그의 염과 유도체 및 그의 산화물과 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 조성물을 치근막 질환의 치료가 필요한 포유류에게 투여하는 것을 포함하는, 치근막 질환의 치료방법 :

    여기에서,

    R은 3-(α)-OH, 3-(β)-OH, 3-(α)-O-당, 또는 3-(β)-O-당이고;

    인접한 모노머들은 4번, 6번 및 8번 위치 중에서 선택되는 위치에서 서로 결합하며;

    4번 위치에서의 부가적 모노머 유니트에 대한 결합은 알파 또는 베타 입체화학구조이고;

    X, Y 및 Z는 모노머 유니트 A, 수소 및 당으로 구성된 그룹에서 선택되며, 최소한 하나의 말단 모노머 유니트에 대한 부가적 모노머 유니트의 결합은 4번 위치에서 이루어지고, 선택적으로 Y=Z=수소이며;

    당은 선택적으로 페놀 부분으로 치환된다.
98. 일반식 A_n으로 표시되며, 여기서 A는 하기 일반식의 모노머이고, n은 2 내지 18의 정수이며, 최소한 하나의 말단 모노머 유니트 A와 복수의 부가적 모노머 유니트가 존재하는 폴리머 화합물과 약제학적으로 허용가능한 그의 염과 유도체 및 그의 산화물과 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 혈소판 응집 조절 조성물 :

    여기에서,

    R은 3-(α)-OH, 3-(β)-OH, 3-(α)-O-당, 또는 3-(β)-O-당이고;

    인접한 모노머들은 4번, 6번 및 8번 위치 중에서 선택되는 위치에서 서로 결합하며;

    4번 위치에서의 부가적 모노머 유니트에 대한 결합은 알파 또는 베타 입체화학구조이고;

    X, Y 및 Z는 모노머 유니트 A, 수소 및 당으로 구성된 그룹에서 선택되며, 최소한 하나의 말단 모노머 유니트에 대한 부가적 모노머 유니트의 결합은 4번 위치에서 이루어지고, 선택적으로 Y=Z=수소이며;

    당은 선택적으로 페놀 부분으로 치환된다.
99. 제98항에 있어서, 당은 글루코스, 갈락토스, 자일로스, 람노스 및 아라비노스로 이루어진 그룹에서 선택되는 조성물.
100. 제98항에 있어서, 상기 폴리머 화합물은 실질적으로 순수한 것인 조성물.
101. 제98항에 있어서, 페놀 부분은 카페인산, 시나민산, 쿠마린산, 페룰린산, 갈린산, 하이드록시벤조산 및 시나핀산으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 조성물.
102. 제98항에 있어서, 정제, 캡슐, 아이덴터티 표준 쵸콜렛 및 아이덴터티 비표준 쵸콜렛으로 이루어진 그룹에서 선택되는 조성물.
103. 제98항에서 언급한 화합물과 담체 또는 희석제의 개별포장을 포함하며, 혼합방법 또는 투여방법에 대한 설명서를 선택적으로 포함하는 제98항의 조성물을 위한 키트.
104. 제98항에 따른 조성물을 혈소판 응집 조절치료가 필요한 포유류에게 투여하는 것을 포함하는, 혈소판 응집 조절방법.
105. 일반식 A_n으로 표시되며, 여기서 A는 하기 일반식의 모노머이고, n은 2 내지 18의 정수이며, 최소한 하나의 말단 모노머 유니트 A와 복수의 부가적 모노머 유니트가 존재하는 폴리머 화합물과 약제학적으로 허용가능한 그의 염과 유도체 및 그의 산화물과 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 아폽토시스 조절 조성물 :

     여기에서,

     R은 3-(α)-OH, 3-(β)-OH, 3-(α)-O-당, 또는 3-(β)-O-당이고;

     인접한 모노머들은 4번, 6번 및 8번 위치 중에서 선택되는 위치에서 서로 결합하며;

     4번 위치에서의 부가적 모노머 유니트에 대한 결합은 알파 또는 베타 입체화학구조이고;

     X, Y 및 Z는 모노머 유니트 A, 수소 및 당으로 구성된 그룹에서 선택되며, 최소한 하나의 말단 모노머 유니트에 대한 부가적 모노머 유니트의 결합은 4번 위치에서 이루어지고, 선택적으로 Y=Z=수소이며;

     당은 선택적으로 페놀 부분으로 치환된다.
106. 제105항에 있어서, 당은 글루코스, 갈락토스, 자일로스, 람노스 및 아라비노스로 이루어진 그룹에서 선택되는 조성물.
107. 제105항에 있어서, 상기 폴리머 화합물은 실질적으로 순수한 것인 조성물.
108. 제105항에 있어서, 페놀 부분은 카페인산, 시나민산, 쿠마린산, 페룰린산, 갈린산, 하이드록시벤조산 및 시나핀산으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 조성물.
109. 제105항에 있어서, 정제, 캡슐, 아이덴터티 표준 쵸콜렛 및 아이덴터티 비표준 쵸콜렛으로 이루어진 그룹에서 선택되는 조성물.
110. 제105항에서 언급한 화합물과 담체 또는 희석제의 개별포장을 포함하며, 혼합방법 또는 투여방법에 대한 설명서를 선택적으로 포함하는 제105항의 조성물을 위한 키트.
111. 일반식 A_n으로 표시되며, 여기서 A는 하기 일반식의 모노머이고, n은 2 내지 18의 정수이며, 최소한 하나의 말단 모노머 유니트 A와 복수의 부가적 모노머 유니트가 존재하는 폴리머 화합물과 약제학적으로 허용가능한 그의 염과 유도체 및 그의 산화물과 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 조성물을 COX-2 발현 암세포와 접촉시키는 것을 포함하는, 아폽토시스 조절방법 :

     여기에서,

     R은 3-(α)-OH, 3-(β)-OH, 3-(α)-O-당, 또는 3-(β)-O-당이고;

     인접한 모노머들은 4번, 6번 및 8번 위치 중에서 선택되는 위치에서 서로 결합하며;

     4번 위치에서의 부가적 모노머 유니트에 대한 결합은 알파 또는 베타 입체화학구조이고;

     X, Y 및 Z는 모노머 유니트 A, 수소 및 당으로 구성된 그룹에서 선택되며, 최소한 하나의 말단 모노머 유니트에 대한 부가적 모노머 유니트의 결합은 4번 위치에서 이루어지고, 선택적으로 Y=Z=수소이며;

     당은 선택적으로 페놀 부분으로 치환된다.
112. 제111항에 있어서, n은 5인 방법.
113. 일반식 A_n으로 표시되며, 여기서 A는 하기 일반식의 모노머이고, n은 2 내지 18의 정수이며, 최소한 하나의 말단 모노머 유니트 A와 복수의 부가적 모노머 유니트가 존재하는 폴리머 화합물과 약제학적으로 허용가능한 그의 염과 유도체 및 그의 산화물과 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 조성물을 DNA와 접촉시키는 것을 포함하는, DNA의 산화적 손상을 억제하는 방법 :

     여기에서,

     R은 3-(α)-OH, 3-(β)-OH, 3-(α)-O-당, 또는 3-(β)-O-당이고;

     인접한 모노머들은 4번, 6번 및 8번 위치 중에서 선택되는 위치에서 서로 결합하며;

     4번 위치에서의 부가적 모노머 유니트에 대한 결합은 알파 또는 베타 입체화학구조이고;

     X, Y 및 Z는 모노머 유니트 A, 수소 및 당으로 구성된 그룹에서 선택되며, 최소한 하나의 말단 모노머 유니트에 대한 부가적 모노머 유니트의 결합은 4번 위치에서 이루어지고, 선택적으로 Y=Z=수소이며;

     당은 선택적으로 페놀 부분으로 치환된다.
114. 제113항에 있어서, 당은 글루코스, 갈락토스, 자일로스, 람노스 및 아라비노스로 이루어진 그룹에서 선택되는 방법.
115. 제113항에 있어서, 상기 폴리머 화합물은 실질적으로 순수한 것인 방법.
116. 제113항에 있어서, 페놀 부분은 카페인산, 시나민산, 쿠마린산, 페룰린산, 갈린산, 하이드록시벤조산 및 시나핀산으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
117. 제113항에 있어서, 상기 조성물은 정제, 캡슐, 아이덴터티 표준 쵸콜렛 및 아이덴터티 비표준 쵸콜렛으로 이루어진 그룹에서 선택되는 방법.
118. 제113항에서 언급한 화합물과 담체 또는 희석제의 개별포장을 포함하며, 혼합방법 또는 투여방법에 대한 설명서를 선택적으로 포함하는 제113항의 조성물을 위한 키트.
119. 일반식 A_n으로 표시되며, 여기서 A는 하기 일반식의 모노머이고, n은 2 내지 18의 정수이며, 최소한 하나의 말단 모노머 유니트 A와 복수의 부가적 모노머 유니트가 존재하는 폴리머 화합물과 약제학적으로 허용가능한 그의 염과 유도체 및 그의 산화물과 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 아테롬성 동맥경화증 또는 레스테노시스의 치료, 예방 또는 감소용 조성물 :

     여기에서,

     R은 3-(α)-OH, 3-(β)-OH, 3-(α)-O-당, 또는 3-(β)-O-당이고;

     인접한 모노머들은 4번, 6번 및 8번 위치 중에서 선택되는 위치에서 서로 결합하며;

     4번 위치에서의 부가적 모노머 유니트에 대한 결합은 알파 또는 베타 입체화학구조이고;

     X, Y 및 Z는 모노머 유니트 A, 수소 및 당으로 구성된 그룹에서 선택되며, 최소한 하나의 말단 모노머 유니트에 대한 부가적 모노머 유니트의 결합은 4번 위치에서 이루어지고, 선택적으로 Y=Z=수소이며;

     당은 선택적으로 페놀 부분으로 치환된다.
120. 제119항에 있어서, 당은 글루코스, 갈락토스, 자일로스, 람노스 및 아라비노스로 이루어진 그룹에서 선택되는 조성물.
121. 제119항에 있어서, 상기 폴리머 화합물은 실질적으로 순수한 것인 조성물.
122. 제119항에 있어서, 페놀 부분은 카페인산, 시나민산, 쿠마린산, 페룰린산, 갈린산, 하이드록시벤조산 및 시나핀산으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 조성물.
123. 제119항에 있어서, 정제, 캡슐, 아이덴터티 표준 쵸콜렛 및 아이덴터티 비표준 쵸콜렛으로 이루어진 그룹에서 선택되는 조성물.
124. 일반식 A_n으로 표시되며, 여기서 A는 하기 일반식의 모노머이고, n은 2 내지 18의 정수이며, 최소한 하나의 말단 모노머 유니트 A와 복수의 부가적 모노머 유니트가 존재하는 폴리머 화합물과 약제학적으로 허용가능한 그의 염과 유도체 및 그의 산화물과 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 조성물을 포유류에게 투여하는 것을 포함하는, 포유류의 아테롬성 동맥경화증 또는 레스테노시스의 치료, 예방 또는 감소방법:

     여기에서,

     R은 3-(α)-OH, 3-(β)-OH, 3-(α)-O-당, 또는 3-(β)-O-당이고;

     인접한 모노머들은 4번, 6번 및 8번 위치 중에서 선택되는 위치에서 서로 결합하며;

     4번 위치에서의 부가적 모노머 유니트에 대한 결합은 알파 또는 베타 입체화학구조이고;

     X, Y 및 Z는 모노머 유니트 A, 수소 및 당으로 구성된 그룹에서 선택되며, 최소한 하나의 말단 모노머 유니트에 대한 부가적 모노머 유니트의 결합은 4번 위치에서 이루어지고, 선택적으로 Y=Z=수소이며;

     당은 선택적으로 페놀 부분으로 치환된다.
125. 제124항에 있어서, n은 2 내지 10인 방법.
126. 일반식 A_n으로 표시되며, 여기서 A는 하기 일반식의 모노머이고, n은 2 내지 18의 정수이며, 최소한 하나의 말단 모노머 유니트 A와 복수의 부가적 모노머 유니트가 존재하는 폴리머 화합물과 약제학적으로 허용가능한 그의 염과 유도체 및 그의 산화물과 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 조성물을 포유류에게 투여하는 것을 포함하는, 포유류에서의 LDL의 산화를 억제하는 방법:

     여기에서,

     R은 3-(α)-OH, 3-(β)-OH, 3-(α)-O-당, 또는 3-(β)-O-당이고;

     인접한 모노머들은 4번, 6번 및 8번 위치 중에서 선택되는 위치에서 서로 결합하며;

     4번 위치에서의 부가적 모노머 유니트에 대한 결합은 알파 또는 베타 입체화학구조이고;

     X, Y 및 Z는 모노머 유니트 A, 수소 및 당으로 구성된 그룹에서 선택되며, 최소한 하나의 말단 모노머 유니트에 대한 부가적 모노머 유니트의 결합은 4번 위치에서 이루어지고, 선택적으로 Y=Z=수소이며;

     당은 선택적으로 페놀 부분으로 치환된다.
127. 제126항에 있어서, n은 2 내지 12인 방법.
128. 제1항의 화합물과 적합한 담체 또는 희석제를 포유류에게 투여하는 것을 포함하는 포유류의 혈전증 조절방법.
129. 제128항에 있어서, n은 2 내지 12인 방법.
130. 일반식 A_n으로 표시되며, 여기서 A는 하기 일반식의 모노머이고, n은 2 내지 18의 정수이며, 최소한 하나의 말단 모노머 유니트 A와 복수의 부가적 모노머 유니트가 존재하는 폴리머 화합물과 약제학적으로 허용가능한 그의 염과 유도체 및 그의 산화물과 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 조성물을 염증성 장질환의 치료가 필요한 포유류에게 투여하는 것을 포함하는, 염증성 장질환의 치료를 위한 시클로옥시게나제-1(COX-1)의 조절방법:

     여기에서,

     R은 3-(α)-OH, 3-(β)-OH, 3-(α)-O-당, 또는 3-(β)-O-당이고;

     인접한 모노머들은 4번, 6번 및 8번 위치 중에서 선택되는 위치에서 서로 결합하며;

     4번 위치에서의 부가적 모노머 유니트에 대한 결합은 알파 또는 베타 입체화학구조이고;

     X, Y 및 Z는 모노머 유니트 A, 수소 및 당으로 구성된 그룹에서 선택되며, 최소한 하나의 말단 모노머 유니트에 대한 부가적 모노머 유니트의 결합은 4번 위치에서 이루어지고, 선택적으로 Y=Z=수소이며;

     당은 선택적으로 페놀 부분으로 치환된다.
131. 일반식 A_n으로 표시되며, 여기서 A는 하기 일반식의 모노머이고, n은 2 내지 18의 정수이며, 최소한 하나의 말단 모노머 유니트 A와 복수의 부가적 모노머 유니트가 존재하는 폴리머 화합물과 약제학적으로 허용가능한 그의 염과 유도체 및 그의 산화물과 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 조성물을 포유류에게 투여하는 것을 포함하는, 포유류에서의 세균성장 억제방법:

     여기에서,

     R은 3-(α)-OH, 3-(β)-OH, 3-(α)-O-당, 또는 3-(β)-O-당이고;

     인접한 모노머들은 4번, 6번 및 8번 위치 중에서 선택되는 위치에서 서로 결합하며;

     4번 위치에서의 부가적 모노머 유니트에 대한 결합은 알파 또는 베타 입체화학구조이고;

     X, Y 및 Z는 모노머 유니트 A, 수소 및 당으로 구성된 그룹에서 선택되며, 최소한 하나의 말단 모노머 유니트에 대한 부가적 모노머 유니트의 결합은 4번 위치에서 이루어지고, 선택적으로 Y=Z=수소이며;

     당은 선택적으로 페놀 부분으로 치환된다.
132. 제131항에 있어서, n은 2, 4, 5, 6, 8 및 10인 방법.
133. 일반식 A_n으로 표시되며, 여기서 A는 하기 일반식의 모노머이고, n은 2 내지 18의 정수이며, 최소한 하나의 말단 모노머 유니트 A와 복수의 부가적 모노머 유니트가 존재하는 폴리머 화합물과 약제학적으로 허용가능한 그의 염과 유도체 및 그의 산화물과 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 조성물을 포유류에게 투여하는 것을 포함하는, 포유류에서의 고혈압증 감소방법:

     여기에서,

     R은 3-(α)-OH, 3-(β)-OH, 3-(α)-O-당, 또는 3-(β)-O-당이고;

     인접한 모노머들은 4번, 6번 및 8번 위치 중에서 선택되는 위치에서 서로 결합하며;

     4번 위치에서의 부가적 모노머 유니트에 대한 결합은 알파 또는 베타 입체화학구조이고;

     X, Y 및 Z는 모노머 유니트 A, 수소 및 당으로 구성된 그룹에서 선택되며, 최소한 하나의 말단 모노머 유니트에 대한 부가적 모노머 유니트의 결합은 4번 위치에서 이루어지고, 선택적으로 Y=Z=수소이며;

     당은 선택적으로 페놀 부분으로 치환된다.
134. 제133항에 있어서, n은 2 내지 10인 방법.
135. 제1항에 따른 최소한 하나의 화합물의 치료유효량을 포유류에게 투여하는 것을 포함하는, 포유류의 암치료방법.
136. 제135항에 있어서, 상기 암은 전립선암인 방법.
137. 제135항에 있어서, 상기 암은 신장암인 방법.
138. 제135항에 있어서, 상기 암은 결장암인 방법.
139. 제135항에 있어서, 상기 암은 유방암인 방법.
140. 제135항에 있어서, 상기 암은 고양이 백혈병인 방법.
141. 제135항에 있어서, 상기 암은 경부암인 방법.
142. 제135항에 있어서, 상기 암은 T-세포 백혈병인 방법.
143. 제1항에 따른 화합물과 적합한 담체 또는 희석제를 포유류에게 투여하는 것을 포함하는, 포유류의 암세포 성장 억제방법.
144. 제143항에 있어서, n은 5인 방법.
145. 코코아 추출물을 포함하는 약제용 담체 또는 비히클.
146. 3 내지 18개의 올리고머를 함유하는 폴리페놀을 포함하는 테오브로마 또는 헤라니아 종, 또는 이들의 이종간 종특이적 잡종 또는 동종간 종특이적 잡종 유래의 실질적으로 순수한 폴리페놀.
147. 도48A-D에 도시된 NMR 스펙트럼을 나타내는 구조를 갖는 제1항의 화합물.
148. 도49A-D에 도시된 NMR 스펙트럼을 나타내는 구조를 갖는 제1항의 화합물.
149. 발효조건을 조절하므로써 코코아 열매중의 코코아 프로시아닌의 농도 및 분포를 향상시키는 방법.
150. 일반식 [EC-(4β→8)]₂-EC의 트라이머인 제1항의 화합물.
151. 일반식 [EC-(4β→8)]₃-EC의 테트라머인 제1항의 화합물.
152. 일반식 [EC-(4β→8)]₄-EC의 펜타머이고, 펜타머의 말단 모노머 유니트의 3-위치는 선택적으로 갈레이트 및/또는 β-D-글루코스에서 파생된 제1항의 화합물.
153. 일반식 [EC-(4β→8)]₅-EC의 헥사머인 제1항의 화합물.
154. 일반식 [EC-(4β→8)]₆-EC의 헵타머인 제1항의 화합물.
155. 일반식 [EC-(4β→8)]₇-EC의 옥타머인 제1항의 화합물.
156. 일반식 [EC-(4β→8)]₈-EC의 노나머인 제1항의 화합물.
157. 일반식 [EC-(4β→8)]₉-EC의 데카머인 제1항의 화합물.
158. 일반식 [EC-(4β→8)]₁₀-EC의 운데카머인 제1항의 화합물.
159. 일반식 [EC-(4β→8)]₁₁-EC의 도데카머인 제1항의 화합물.
160. 화합물이 일반식 [EC-(4β→8)]₄-EC의 펜타머, 일반식 [EC-(4β→8)]₅-EC의 헥사머, 일반식 [EC-(4β→8)]₆-EC의 헵타머, 일반식 [EC-(4β→8)]₇-EC의 옥타머, 일반식 [EC-(4β→8)]₈-EC의 노나머, 일반식 [EC-(4β→8)]₉-EC의 데카머, 일반식 [EC-(4β→8)]₁₀-EC의 운데카머 및 일반식 [EC-(4β→8)]₁₁-EC의 도데카머로 이루어진 그룹에서 선택되는 제9항의 조성물.
161. 화합물이 일반식 EC-(4β→8)-EC의 다이머, 일반식 [EC-(4β→8)]₂-EC의 트라이머, 일반식 [EC-(4β→8)]₃-EC의 테트라머, 일반식 [EC-(4β→8)]₄-EC의 펜타머, 일반식 [EC-(4β→8)]₅-EC의 헥사머, 일반식 [EC-(4β→8)]₆-EC의 헵타머, 일반식 [EC-(4β→8)]₇-EC의 옥타머, 일반식 [EC-(4β→8)]₈-EC의 노나머 및 일반식 [EC-(4β→8)]₉-EC의 데카머로 이루어진 그룹에서 선택되는 제19항의 조성물.
162. 화합물이 일반식 EC-(4β→8)-EC의 다이머, 일반식 [EC-(4β→8)]₂-EC의 트라이머, 일반식 [EC-(4β→8)]₃-EC의 테트라머, 일반식 [EC-(4β→8)]₄-EC의 펜타머, 일반식 [EC-(4β→8)]₅-EC의 헥사머, 일반식 [EC-(4β→8)]₆-EC의 헵타머, 일반식 [EC-(4β→8)]₇-EC의 옥타머, 일반식 [EC-(4β→8)]₈-EC의 노나머 및 일반식 [EC-(4β→8)]₉-EC의 데카머로 이루어진 그룹에서 선택되는 제30항의 조성물.
163. 화합물이 일반식 EC-(4β→8)-EC의 다이머, 일반식 [EC-(4β→8)]₂-EC의 트라이머, 일반식 [EC-(4β→8)]₃-EC의 테트라머, 일반식 [EC-(4β→8)]₄-EC의 펜타머, 일반식 [EC-(4β→8)]₅-EC의 헥사머, 일반식 [EC-(4β→8)]₆-EC의 헵타머, 일반식 [EC-(4β→8)]₇-EC의 옥타머, 일반식 [EC-(4β→8)]₈-EC의 노나머 및 일반식 [EC-(4β→8)]₉-EC의 데카머로 이루어진 그룹에서 선택되는 제40항의 조성물.
164. 화합물이 일반식 EC-(4β→8)-EC의 다이머, 일반식 [EC-(4β→8)]₂-EC의 트라이머, 일반식 [EC-(4β→8)]₃-EC의 테트라머, 일반식 [EC-(4β→8)]₄-EC의 펜타머, 일반식 [EC-(4β→8)]₅-EC의 헥사머, 일반식 [EC-(4β→8)]₆-EC의 헵타머, 일반식 [EC-(4β→8)]₇-EC의 옥타머, 일반식 [EC-(4β→8)]₈-EC의 노나머 및 일반식 [EC-(4β→8)]₉-EC의 데카머로 이루어진 그룹에서 선택되는 제50항의 조성물.
165. 화합물이 일반식 EC-(4β→8)-EC의 다이머, 일반식 [EC-(4β→8)]₂-EC의 트라이머, 일반식 [EC-(4β→8)]₃-EC의 테트라머, 일반식 [EC-(4β→8)]₄-EC의 펜타머, 일반식 [EC-(4β→8)]₅-EC의 헥사머, 일반식 [EC-(4β→8)]₆-EC의 헵타머, 일반식 [EC-(4β→8)]₇-EC의 옥타머, 일반식 [EC-(4β→8)]₈-EC의 노나머 및 일반식 [EC-(4β→8)]₉-EC의 데카머로 이루어진 그룹에서 선택되는 제65항의 조성물.
166. 화합물이 일반식 EC-(4β→8)-EC의 다이머, 일반식 [EC-(4β→8)]₂-EC의 트라이머, 일반식 [EC-(4β→8)]₃-EC의 테트라머, 일반식 [EC-(4β→8)]₄-EC의 펜타머, 일반식 [EC-(4β→8)]₅-EC의 헥사머, 일반식 [EC-(4β→8)]₆-EC의 헵타머, 일반식 [EC-(4β→8)]₇-EC의 옥타머, 일반식 [EC-(4β→8)]₈-EC의 노나머, 일반식 [EC-(4β→8)]₉-EC의 데카머, 일반식 [EC-(4β→8)]₁₀-EC의 운데카머 및 일반식 [EC-(4β→8)]₁₁-EC의 도데카머로 이루어진 그룹에서 선택되는 제74항의 조성물.
167. 화합물이 일반식 EC-(4β→8)-EC의 다이머, 일반식 [EC-(4β→8)]₂-EC의 트라이머, 일반식 [EC-(4β→8)]₃-EC의 테트라머, 일반식 [EC-(4β→8)]₄-EC의 펜타머, 일반식 [EC-(4β→8)]₅-EC의 헥사머, 일반식 [EC-(4β→8)]₆-EC의 헵타머, 일반식 [EC-(4β→8)]₇-EC의 옥타머, 일반식 [EC-(4β→8)]₈-EC의 노나머, 일반식 [EC-(4β→8)]₉-EC의 데카머, 일반식 [EC-(4β→8)]₁₀-EC의 운데카머 및 일반식 [EC-(4β→8)]₁₁-EC의 도데카머로 이루어진 그룹에서 선택되는 제81항의 조성물.
168. 화합물이 일반식 EC-(4β→8)-EC의 다이머, 일반식 [EC-(4β→8)]₂-EC의 트라이머, 일반식 [EC-(4β→8)]₃-EC의 테트라머, 일반식 [EC-(4β→8)]₄-EC의 펜타머, 일반식 [EC-(4β→8)]₅-EC의 헥사머, 일반식 [EC-(4β→8)]₆-EC의 헵타머, 일반식 [EC-(4β→8)]₇-EC의 옥타머, 일반식 [EC-(4β→8)]₈-EC의 노나머 및 일반식 [EC-(4β→8)]₉-EC의 데카머로 이루어진 그룹에서 선택되는 제89항의 조성물.
169. 화합물이 일반식 EC-(4β→8)-EC의 다이머, 일반식 [EC-(4β→8)]₂-EC의 트라이머, 일반식 [EC-(4β→8)]₃-EC의 테트라머, 일반식 [EC-(4β→8)]₄-EC의 펜타머, 일반식 [EC-(4β→8)]₅-EC의 헥사머, 일반식 [EC-(4β→8)]₆-EC의 헵타머, 일반식 [EC-(4β→8)]₇-EC의 옥타머, 일반식 [EC-(4β→8)]₈-EC의 노나머, 일반식 [EC-(4β→8)]₉-EC의 데카머, 일반식 [EC-(4β→8)]₁₀-EC의 운데카머 및 일반식 [EC-(4β→8)]₁₁-EC의 도데카머로 이루어진 그룹에서 선택되는 제98항의 조성물.
170. 화합물이 일반식 [EC-(4β→8)]₄-EC의 펜타머인 제105항의 조성물.
171. 화합물이 일반식 EC-(4β→8)-EC의 다이머, 일반식 [EC-(4β→8)]₂-EC의 트라이머, 일반식 [EC-(4β→8)]₃-EC의 테트라머, 일반식 [EC-(4β→8)]₄-EC의 펜타머, 일반식 [EC-(4β→8)]₅-EC의 헥사머, 일반식 [EC-(4β→8)]₆-EC의 헵타머, 일반식 [EC-(4β→8)]₇-EC의 옥타머, 일반식 [EC-(4β→8)]₈-EC의 노나머 및 일반식 [EC-(4β→8)]₉-EC의 데카머로 이루어진 그룹에서 선택되는 제119항의 조성물.
172. 일반식 A_n으로 표시되며, 여기서 A는 하기 일반식의 모노머이고, n은 2 내지 18의 정수이며, 최소한 하나의 말단 모노머 유니트 A와 복수의 부가적 모노머 유니트가 존재하는 폴리머 화합물, 약제학적으로 허용가능한 그의 염, 유도체, 그의 산화물 또는 이들의 조합에 의하여 유도 또는 억제된 적어도 하나의 유전자의 동정방법으로서, 상기 방법은 유전자 발현 분석법을 이용하여 상기 폴리머 화합물을 적어도 하나의 유전자 또는 그의 유전자 산물과 접촉시키는 것을 포함하는 방법 :

     여기에서,

     R은 3-(α)-OH, 3-(β)-OH, 3-(α)-O-당, 또는 3-(β)-O-당이고;

     인접한 모노머들은 4번, 6번 및 8번 위치 중에서 선택되는 위치에서 서로 결합하며;

     4번 위치에서의 부가적 모노머 유니트에 대한 결합은 알파 또는 베타 입체화학구조이고;

     X, Y 및 Z는 모노머 유니트 A, 수소 및 당으로 구성된 그룹에서 선택되며, 최소한 하나의 말단 모노머 유니트에 대한 부가적 모노머 유니트의 결합은 4번 위치에서 이루어지고, 선택적으로 Y=Z=수소이며;

     당은 선택적으로 페놀 부분으로 치환된다.
173. 제172항에 있어서, 상기 유전자 발현 분석법은 분별 디스플레이, cDNA 라이브러리의 서열화, 유전자 발현의 시리얼 분석법 및 고밀도 올리고뉴클레오티드 배열에 대한 혼성화에 의한 발현 모니터링으로 이루어진 그룹에서 선택되는 방법.
174. 제1항에 있어서,

     인접한 모노머들은 4번 위치에서 (4→6) 또는 (4→8)로 결합하고;

     X, Y 및 Z의 각각은 H, 당 또는 인접한 모노머이며, X와 Y가 인접한 모노머인 경우에는 Z는 H 또는 당이고, X와 Z가 인접한 모노머인 경우에는 Y는 H 또는 당이며, 두 말단 모노머중의 적어도 하나에 대한 인접한 모노머의 결합은 4번위치에서 이루어지며, 선택적으로 Y=Z=수소인 화합물.
175. 제9항에 있어서, 상기 화합물에서

     인접한 모노머들은 4번 위치에서 (4→6) 또는 (4→8)로 결합하고;

     X, Y 및 Z의 각각은 H, 당 또는 인접한 모노머이며, X와 Y가 인접한 모노머인 경우에는 Z는 H 또는 당이고, X와 Z가 인접한 모노머인 경우에는 Y는 H 또는 당이며, 두 말단 모노머중의 적어도 하나에 대한 인접한 모노머의 결합은 4번위치에서 이루어지며, 선택적으로 Y=Z=수소인 조성물.
176. 제19항에 있어서, 상기 화합물에서

     인접한 모노머들은 4번 위치에서 (4→6) 또는 (4→8)로 결합하고;

     X, Y 및 Z의 각각은 H, 당 또는 인접한 모노머이며, X와 Y가 인접한 모노머인 경우에는 Z는 H 또는 당이고, X와 Z가 인접한 모노머인 경우에는 Y는 H 또는 당이며, 두 말단 모노머중의 적어도 하나에 대한 인접한 모노머의 결합은 4번위치에서 이루어지며, 선택적으로 Y=Z=수소인 조성물.
177. 제30항에 있어서, 상기 화합물에서

     인접한 모노머들은 4번 위치에서 (4→6) 또는 (4→8)로 결합하고;

     X, Y 및 Z의 각각은 H, 당 또는 인접한 모노머이며, X와 Y가 인접한 모노머인 경우에는 Z는 H 또는 당이고, X와 Z가 인접한 모노머인 경우에는 Y는 H 또는 당이며, 두 말단 모노머중의 적어도 하나에 대한 인접한 모노머의 결합은 4번위치에서 이루어지며, 선택적으로 Y=Z=수소인 조성물.
178. 제40항에 있어서, 상기 화합물에서

     인접한 모노머들은 4번 위치에서 (4→6) 또는 (4→8)로 결합하고;

     X, Y 및 Z의 각각은 H, 당 또는 인접한 모노머이며, X와 Y가 인접한 모노머인 경우에는 Z는 H 또는 당이고, X와 Z가 인접한 모노머인 경우에는 Y는 H 또는 당이며, 두 말단 모노머중의 적어도 하나에 대한 인접한 모노머의 결합은 4번위치에서 이루어지며, 선택적으로 Y=Z=수소인 조성물.
179. 제50항에 있어서, 상기 화합물에서

     인접한 모노머들은 4번 위치에서 (4→6) 또는 (4→8)로 결합하고;

     X, Y 및 Z의 각각은 H, 당 또는 인접한 모노머이며, X와 Y가 인접한 모노머인 경우에는 Z는 H 또는 당이고, X와 Z가 인접한 모노머인 경우에는 Y는 H 또는 당이며, 두 말단 모노머중의 적어도 하나에 대한 인접한 모노머의 결합은 4번위치에서 이루어지며, 선택적으로 Y=Z=수소인 조성물.
180. 제65항에 있어서, 상기 화합물에서

     인접한 모노머들은 4번 위치에서 (4→6) 또는 (4→8)로 결합하고;

     X, Y 및 Z의 각각은 H, 당 또는 인접한 모노머이며, X와 Y가 인접한 모노머인 경우에는 Z는 H 또는 당이고, X와 Z가 인접한 모노머인 경우에는 Y는 H 또는 당이며, 두 말단 모노머중의 적어도 하나에 대한 인접한 모노머의 결합은 4번위치에서 이루어지며, 선택적으로 Y=Z=수소인 조성물.
181. 제74항에 있어서, 상기 화합물에서

     인접한 모노머들은 4번 위치에서 (4→6) 또는 (4→8)로 결합하고;

     X, Y 및 Z의 각각은 H, 당 또는 인접한 모노머이며, X와 Y가 인접한 모노머인 경우에는 Z는 H 또는 당이고, X와 Z가 인접한 모노머인 경우에는 Y는 H 또는 당이며, 두 말단 모노머중의 적어도 하나에 대한 인접한 모노머의 결합은 4번위치에서 이루어지며, 선택적으로 Y=Z=수소인 조성물.
182. 제81항에 있어서, 상기 화합물에서

     인접한 모노머들은 4번 위치에서 (4→6) 또는 (4→8)로 결합하고;

     X, Y 및 Z의 각각은 H, 당 또는 인접한 모노머이며, X와 Y가 인접한 모노머인 경우에는 Z는 H 또는 당이고, X와 Z가 인접한 모노머인 경우에는 Y는 H 또는 당이며, 두 말단 모노머중의 적어도 하나에 대한 인접한 모노머의 결합은 4번위치에서 이루어지며, 선택적으로 Y=Z=수소인 조성물.
183. 제89항에 있어서, 상기 화합물에서

     인접한 모노머들은 4번 위치에서 (4→6) 또는 (4→8)로 결합하고;

     X, Y 및 Z의 각각은 H, 당 또는 인접한 모노머이며, X와 Y가 인접한 모노머인 경우에는 Z는 H 또는 당이고, X와 Z가 인접한 모노머인 경우에는 Y는 H 또는 당이며, 두 말단 모노머중의 적어도 하나에 대한 인접한 모노머의 결합은 4번위치에서 이루어지며, 선택적으로 Y=Z=수소인 조성물.
184. 제98항에 있어서, 상기 화합물에서

     인접한 모노머들은 4번 위치에서 (4→6) 또는 (4→8)로 결합하고;

     X, Y 및 Z의 각각은 H, 당 또는 인접한 모노머이며, X와 Y가 인접한 모노머인 경우에는 Z는 H 또는 당이고, X와 Z가 인접한 모노머인 경우에는 Y는 H 또는 당이며, 두 말단 모노머중의 적어도 하나에 대한 인접한 모노머의 결합은 4번위치에서 이루어지며, 선택적으로 Y=Z=수소인 조성물.
185. 제105항에 있어서, 상기 화합물에서

     인접한 모노머들은 4번 위치에서 (4→6) 또는 (4→8)로 결합하고;

     X, Y 및 Z의 각각은 H, 당 또는 인접한 모노머이며, X와 Y가 인접한 모노머인 경우에는 Z는 H 또는 당이고, X와 Z가 인접한 모노머인 경우에는 Y는 H 또는 당이며, 두 말단 모노머중의 적어도 하나에 대한 인접한 모노머의 결합은 4번위치에서 이루어지며, 선택적으로 Y=Z=수소인 조성물.
186. 제119항에 있어서, 상기 화합물에서

     인접한 모노머들은 4번 위치에서 (4→6) 또는 (4→8)로 결합하고;

     X, Y 및 Z의 각각은 H, 당 또는 인접한 모노머이며, X와 Y가 인접한 모노머인 경우에는 Z는 H 또는 당이고, X와 Z가 인접한 모노머인 경우에는 Y는 H 또는 당이며, 두 말단 모노머중의 적어도 하나에 대한 인접한 모노머의 결합은 4번위치에서 이루어지며, 선택적으로 Y=Z=수소인 조성물.
187. 제1항에 있어서, [EC-(4β→8)]₂-EC, [EC-(4β→8)]₂-C 및 [EC-(4β→6)]₂-EC 로 이루어진 그룹에서 선택되는 트라이머인 화합물.
188. 제1항에 있어서, [EC-(4β→8)]₃-EC, [EC-(4β→8)]₃-C 및 [EC-(4β→8)]₂-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 테트라머인 화합물.
189. 제1항에 있어서, [EC-(4β→8)]₄-EC, [EC-(4β→8)]₃-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₃-EC-(4β→8)-C 및 [EC-(4β→8)]₃-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 펜타머인 화합물.
190. 제1항에 있어서, [EC-(4β→8)]₅-EC, [EC-(4β→8)]₄-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₄-EC-(4β→8)-C 및 [EC-(4β→8)]₄-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 헥사머이고, 헥사머 말단 모노머 유니트의 3-위치는 선택적으로 갈레이트 또는 β-D-글루코스에서 파생되는 화합물.
191. 제1항에 있어서, [EC-(4β→8)]₆-EC, [EC-(4β→8)]₅-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₅-EC-(4β→8)-C 및 [EC-(4β→8)]₅-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 헵타머이고, 헵타머 말단 모노머 유니트의 3-위치는 선택적으로 갈레이트 또는 β-D-글루코스에서 파생되는 화합물.
192. 제1항에 있어서, [EC-(4β→8)]₇-EC, [EC-(4β→8)]₆-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₆-EC-(4β→8)-C 및 [EC-(4β→8)]₆-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 옥타머이고, 옥타머 말단 모노머 유니트의 3-위치는 선택적으로 갈레이트 또는 β-D-글루코스에서 파생되는 화합물.
193. 제1항에 있어서, [EC-(4β→8)]₈-EC, [EC-(4β→8)]₇-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₇-EC-(4β→8)-C 및 [EC-(4β→8)]₇-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 노나머이고, 노나머 말단 모노머 유니트의 3-위치는 선택적으로 갈레이트 또는 β-D-글루코스에서 파생되는 화합물.
194. 제1항에 있어서, [EC-(4β→8)]₉-EC, [EC-(4β→8)]₈-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₈-EC-(4β→8)-C 및 [EC-(4β→8)]₈-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 데카머이고, 데카머 말단 모노머 유니트의 3-위치는 선택적으로 갈레이트 또는 β-D-글루코스에서 파생되는 화합물.
195. 제1항에 있어서, [EC-(4β→8)]₁₀-EC, [EC-(4β→8)]₉-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₉-EC-(4β→8)-C 및 [EC-(4β→8)]₉-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 운데카머이고, 운데카머 말단 모노머 유니트의 3-위치는 선택적으로 갈레이트 또는 β-D-글루코스에서 파생되는 화합물.
196. 제1항에 있어서, [EC-(4β→8)]₁₁-EC, [EC-(4β→8)]₁₀-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₁₀-EC-(4β→8)-C 및 [EC-(4β→8)]₁₀-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 도데카머이고, 도데카머 말단 모노머 유니트의 3-위치는 선택적으로 갈레이트 또는 β-D-글루코스에서 파생되는 화합물.
197. 제9항에 있어서, 상기 화합물이 [EC-(4β→8)]₄-EC, [EC-(4β→8)]₃-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₃-EC-(4β→8)-C 및 [EC-(4β→8)]₃-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 펜타머, [EC-(4β→8)]₅-EC, [EC-(4β→8)]₄-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₄-EC-(4β→8)-C 및 [EC-(4β→8)]₄-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 헥사머, [EC-(4β→8)]₆-EC, [EC-(4β→8)]₅-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₅-EC-(4β→8)-C 및 [EC-(4β→8)]₅-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 헵타머, [EC-(4β→8)]₇-EC, [EC-(4β→8)]₆-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₆-EC-(4β→8)-C 및 [EC-(4β→8)]₆-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 옥타머, [EC-(4β→8)]₈-EC, [EC-(4β→8)]₇-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₇-EC-(4β→8)-C 및 [EC-(4β→8)]₇-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 노나머, [EC-(4β→8)]₉-EC, [EC-(4β→8)]₈-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₈-EC-(4β→8)-C 및 [EC-(4β→8)]₈-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 데카머, [EC-(4β→8)]₁₀-EC, [EC-(4β→8)]₉-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₉-EC-(4β→8)-C 및 [EC-(4β→8)]₉-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 운데카머, [EC-(4β→8)]₁₁-EC, [EC-(4β→8)]₁₀-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₁₀-EC-(4β→8)-C 및 [EC-(4β→8)]₁₀-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 도데카머로 이루어진 그룹에서 선택되는 조성물.
198. 제19항에 있어서, 상기 화합물이 [EC-(4β→8)]₂-EC, [EC-(4β→8)]₂-C 및 [EC-(4β→6)]₂-EC 로 이루어진 그룹에서 선택되는 트라이머, [EC-(4β→8)]₃-EC, [EC-(4β→8)]₃-C 및 [EC-(4β→8)]₂-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 테트라머, [EC-(4β→8)]₄-EC, [EC-(4β→8)]₃-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₃-EC-(4β→8)-C 및 [EC-(4β→8)]₃-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 펜타머, [EC-(4β→8)]₅-EC, [EC-(4β→8)]₄-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₄-EC-(4β→8)-C 및 [EC-(4β→8)]₄-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 헥사머, [EC-(4β→8)]₆-EC, [EC-(4β→8)]₅-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₅-EC-(4β→8)-C 및 [EC-(4β→8)]₅-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 헵타머, [EC-(4β→8)]₇-EC, [EC-(4β→8)]₆-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₆-EC-(4β→8)-C 및 [EC-(4β→8)]₆-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 옥타머, [EC-(4β→8)]₈-EC, [EC-(4β→8)]₇-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₇-EC-(4β→8)-C 및 [EC-(4β→8)]₇-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 노나머 및 [EC-(4β→8)]₉-EC, [EC-(4β→8)]₈-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₈-EC-(4β→8)-C 및 [EC-(4β→8)]₈-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 데카머로 이루어진 그룹에서 선택되는 조성물.
199. 제30항에 있어서, 상기 화합물이 [EC-(4β→8)]₂-EC, [EC-(4β→8)]₂-C 및 [EC-(4β→6)]₂-EC 로 이루어진 그룹에서 선택되는 트라이머, [EC-(4β→8)]₃-EC, [EC-(4β→8)]₃-C 및 [EC-(4β→8)]₂-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 테트라머, [EC-(4β→8)]₄-EC, [EC-(4β→8)]₃-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₃-EC-(4β→8)-C 및 [EC-(4β→8)]₃-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 펜타머, [EC-(4β→8)]₅-EC, [EC-(4β→8)]₄-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₄-EC-(4β→8)-C 및 [EC-(4β→8)]₄-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 헥사머, [EC-(4β→8)]₆-EC, [EC-(4β→8)]₅-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₅-EC-(4β→8)-C 및 [EC-(4β→8)]₅-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 헵타머, [EC-(4β→8)]₇-EC, [EC-(4β→8)]₆-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₆-EC-(4β→8)-C 및 [EC-(4β→8)]₆-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 옥타머, [EC-(4β→8)]₈-EC, [EC-(4β→8)]₇-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₇-EC-(4β→8)-C 및 [EC-(4β→8)]₇-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 노나머 및 [EC-(4β→8)]₉-EC, [EC-(4β→8)]₈-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₈-EC-(4β→8)-C 및 [EC-(4β→8)]₈-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 데카머로 이루어진 그룹에서 선택되는 조성물.
200. 제40항에 있어서, 상기 화합물이 [EC-(4β→8)]₂-EC, [EC-(4β→8)]₂-C 및 [EC-(4β→6)]₂-EC 로 이루어진 그룹에서 선택되는 트라이머, [EC-(4β→8)]₃-EC, [EC-(4β→8)]₃-C 및 [EC-(4β→8)]₂-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 테트라머, [EC-(4β→8)]₄-EC, [EC-(4β→8)]₃-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₃-EC-(4β→8)-C 및 [EC-(4β→8)]₃-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 펜타머, [EC-(4β→8)]₅-EC, [EC-(4β→8)]₄-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₄-EC-(4β→8)-C 및 [EC-(4β→8)]₄-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 헥사머, [EC-(4β→8)]₆-EC, [EC-(4β→8)]₅-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₅-EC-(4β→8)-C 및 [EC-(4β→8)]₅-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 헵타머, [EC-(4β→8)]₇-EC, [EC-(4β→8)]₆-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₆-EC-(4β→8)-C 및 [EC-(4β→8)]₆-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 옥타머, [EC-(4β→8)]₈-EC, [EC-(4β→8)]₇-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₇-EC-(4β→8)-C 및 [EC-(4β→8)]₇-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 노나머 및 [EC-(4β→8)]₉-EC, [EC-(4β→8)]₈-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₈-EC-(4β→8)-C 및 [EC-(4β→8)]₈-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 데카머로 이루어진 그룹에서 선택되는 조성물.
201. 제50항에 있어서, 상기 화합물이 [EC-(4β→8)]₂-EC, [EC-(4β→8)]₂-C 및 [EC-(4β→6)]₂-EC 로 이루어진 그룹에서 선택되는 트라이머, [EC-(4β→8)]₃-EC, [EC-(4β→8)]₃-C 및 [EC-(4β→8)]₂-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 테트라머, [EC-(4β→8)]₄-EC, [EC-(4β→8)]₃-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₃-EC-(4β→8)-C 및 [EC-(4β→8)]₃-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 펜타머, [EC-(4β→8)]₅-EC, [EC-(4β→8)]₄-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₄-EC-(4β→8)-C 및 [EC-(4β→8)]₄-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 헥사머, [EC-(4β→8)]₆-EC, [EC-(4β→8)]₅-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₅-EC-(4β→8)-C 및 [EC-(4β→8)]₅-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 헵타머, [EC-(4β→8)]₇-EC, [EC-(4β→8)]₆-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₆-EC-(4β→8)-C 및 [EC-(4β→8)]₆-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 옥타머, [EC-(4β→8)]₈-EC, [EC-(4β→8)]₇-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₇-EC-(4β→8)-C 및 [EC-(4β→8)]₇-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 노나머 및 [EC-(4β→8)]₉-EC, [EC-(4β→8)]₈-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₈-EC-(4β→8)-C 및 [EC-(4β→8)]₈-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 데카머로 이루어진 그룹에서 선택되는 조성물.
202. 제65항에 있어서, 상기 화합물이 [EC-(4β→8)]₂-EC, [EC-(4β→8)]₂-C 및 [EC-(4β→6)]₂-EC 로 이루어진 그룹에서 선택되는 트라이머, [EC-(4β→8)]₃-EC, [EC-(4β→8)]₃-C 및 [EC-(4β→8)]₂-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 테트라머, [EC-(4β→8)]₄-EC, [EC-(4β→8)]₃-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₃-EC-(4β→8)-C 및 [EC-(4β→8)]₃-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 펜타머, [EC-(4β→8)]₅-EC, [EC-(4β→8)]₄-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₄-EC-(4β→8)-C 및 [EC-(4β→8)]₄-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 헥사머, [EC-(4β→8)]₆-EC, [EC-(4β→8)]₅-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₅-EC-(4β→8)-C 및 [EC-(4β→8)]₅-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 헵타머, [EC-(4β→8)]₇-EC, [EC-(4β→8)]₆-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₆-EC-(4β→8)-C 및 [EC-(4β→8)]₆-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 옥타머, [EC-(4β→8)]₈-EC, [EC-(4β→8)]₇-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₇-EC-(4β→8)-C 및 [EC-(4β→8)]₇-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 노나머 및 [EC-(4β→8)]₉-EC, [EC-(4β→8)]₈-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₈-EC-(4β→8)-C 및 [EC-(4β→8)]₈-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 데카머로 이루어진 그룹에서 선택되는 조성물.
203. 제74항에 있어서, 상기 화합물이 [EC-(4β→8)]₂-EC, [EC-(4β→8)]₂-C 및 [EC-(4β→6)]₂-EC 로 이루어진 그룹에서 선택되는 트라이머, [EC-(4β→8)]₃-EC, [EC-(4β→8)]₃-C 및 [EC-(4β→8)]₂-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 테트라머, [EC-(4β→8)]₄-EC, [EC-(4β→8)]₃-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₃-EC-(4β→8)-C 및 [EC-(4β→8)]₃-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 펜타머, [EC-(4β→8)]₅-EC, [EC-(4β→8)]₄-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₄-EC-(4β→8)-C 및 [EC-(4β→8)]₄-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 헥사머, [EC-(4β→8)]₆-EC, [EC-(4β→8)]₅-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₅-EC-(4β→8)-C 및 [EC-(4β→8)]₅-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 헵타머, [EC-(4β→8)]₇-EC, [EC-(4β→8)]₆-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₆-EC-(4β→8)-C 및 [EC-(4β→8)]₆-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 옥타머, [EC-(4β→8)]₈-EC, [EC-(4β→8)]₇-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₇-EC-(4β→8)-C 및 [EC-(4β→8)]₇-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 노나머, [EC-(4β→8)]₉-EC, [EC-(4β→8)]₈-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₈-EC-(4β→8)-C 및 [EC-(4β→8)]₈-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 데카머, [EC-(4β→8)]₁₀-EC, [EC-(4β→8)]₉-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₉-EC-(4β→8)-C 및 [EC-(4β→8)]₉-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 운데카머 및 [EC-(4β→8)]₁₁-EC, [EC-(4β→8)]₁₀-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₁₀-EC-(4β→8)-C 및 [EC-(4β→8)]₁₀-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 도데카머로 이루어진 그룹에서 선택되는 조성물.
204. 제81항에 있어서, 상기 화합물이 [EC-(4β→8)]₂-EC, [EC-(4β→8)]₂-C 및 [EC-(4β→6)]₂-EC 로 이루어진 그룹에서 선택되는 트라이머, [EC-(4β→8)]₃-EC, [EC-(4β→8)]₃-C 및 [EC-(4β→8)]₂-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 테트라머, [EC-(4β→8)]₄-EC, [EC-(4β→8)]₃-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₃-EC-(4β→8)-C 및 [EC-(4β→8)]₃-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 펜타머, [EC-(4β→8)]₅-EC, [EC-(4β→8)]₄-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₄-EC-(4β→8)-C 및 [EC-(4β→8)]₄-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 헥사머, [EC-(4β→8)]₆-EC, [EC-(4β→8)]₅-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₅-EC-(4β→8)-C 및 [EC-(4β→8)]₅-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 헵타머, [EC-(4β→8)]₇-EC, [EC-(4β→8)]₆-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₆-EC-(4β→8)-C 및 [EC-(4β→8)]₆-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 옥타머, [EC-(4β→8)]₈-EC, [EC-(4β→8)]₇-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₇-EC-(4β→8)-C 및 [EC-(4β→8)]₇-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 노나머, [EC-(4β→8)]₉-EC, [EC-(4β→8)]₈-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₈-EC-(4β→8)-C 및 [EC-(4β→8)]₈-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 데카머, [EC-(4β→8)]₁₀-EC, [EC-(4β→8)]₉-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₉-EC-(4β→8)-C 및 [EC-(4β→8)]₉-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 운데카머 및 [EC-(4β→8)]₁₁-EC, [EC-(4β→8)]₁₀-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₁₀-EC-(4β→8)-C 및 [EC-(4β→8)]₁₀-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 도데카머로 이루어진 그룹에서 선택되는 조성물.
205. 제89항에 있어서, 상기 화합물이 [EC-(4β→8)]₂-EC, [EC-(4β→8)]₂-C 및 [EC-(4β→6)]₂-EC 로 이루어진 그룹에서 선택되는 트라이머, [EC-(4β→8)]₃-EC, [EC-(4β→8)]₃-C 및 [EC-(4β→8)]₂-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 테트라머, [EC-(4β→8)]₄-EC, [EC-(4β→8)]₃-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₃-EC-(4β→8)-C 및 [EC-(4β→8)]₃-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 펜타머, [EC-(4β→8)]₅-EC, [EC-(4β→8)]₄-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₄-EC-(4β→8)-C 및 [EC-(4β→8)]₄-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 헥사머, [EC-(4β→8)]₆-EC, [EC-(4β→8)]₅-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₅-EC-(4β→8)-C 및 [EC-(4β→8)]₅-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 헵타머, [EC-(4β→8)]₇-EC, [EC-(4β→8)]₆-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₆-EC-(4β→8)-C 및 [EC-(4β→8)]₆-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 옥타머, [EC-(4β→8)]₈-EC, [EC-(4β→8)]₇-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₇-EC-(4β→8)-C 및 [EC-(4β→8)]₇-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 노나머 및 [EC-(4β→8)]₉-EC, [EC-(4β→8)]₈-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₈-EC-(4β→8)-C 및 [EC-(4β→8)]₈-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 데카머로 이루어진 그룹에서 선택되는 조성물.
206. 제98항에 있어서, 상기 화합물이 [EC-(4β→8)]₂-EC, [EC-(4β→8)]₂-C 및 [EC-(4β→6)]₂-EC 로 이루어진 그룹에서 선택되는 트라이머, [EC-(4β→8)]₃-EC, [EC-(4β→8)]₃-C 및 [EC-(4β→8)]₂-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 테트라머, [EC-(4β→8)]₄-EC, [EC-(4β→8)]₃-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₃-EC-(4β→8)-C 및 [EC-(4β→8)]₃-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 펜타머, [EC-(4β→8)]₅-EC, [EC-(4β→8)]₄-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₄-EC-(4β→8)-C 및 [EC-(4β→8)]₄-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 헥사머, [EC-(4β→8)]₆-EC, [EC-(4β→8)]₅-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₅-EC-(4β→8)-C 및 [EC-(4β→8)]₅-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 헵타머, [EC-(4β→8)]₇-EC, [EC-(4β→8)]₆-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₆-EC-(4β→8)-C 및 [EC-(4β→8)]₆-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 옥타머, [EC-(4β→8)]₈-EC, [EC-(4β→8)]₇-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₇-EC-(4β→8)-C 및 [EC-(4β→8)]₇-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 노나머, [EC-(4β→8)]₉-EC, [EC-(4β→8)]₈-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₈-EC-(4β→8)-C 및 [EC-(4β→8)]₈-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 데카머, [EC-(4β→8)]₁₀-EC, [EC-(4β→8)]₉-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₉-EC-(4β→8)-C 및 [EC-(4β→8)]₉-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 운데카머 및 [EC-(4β→8)]₁₁-EC, [EC-(4β→8)]₁₀-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₁₀-EC-(4β→8)-C 및 [EC-(4β→8)]₁₀-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 도데카머로 이루어진 그룹에서 선택되는 조성물.
207. 제105항에 있어서, 상기 화합물이 [EC-(4β→8)]₄-EC, [EC-(4β→8)]₃-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₃-EC-(4β→8)-C 및 [EC-(4β→8)]₃-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 펜타머인 조성물.
208. 제119항에 있어서, 상기 화합물이 [EC-(4β→8)]₂-EC, [EC-(4β→8)]₂-C 및 [EC-(4β→6)]₂-EC 로 이루어진 그룹에서 선택되는 트라이머, [EC-(4β→8)]₃-EC, [EC-(4β→8)]₃-C 및 [EC-(4β→8)]₂-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 테트라머, [EC-(4β→8)]₄-EC, [EC-(4β→8)]₃-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₃-EC-(4β→8)-C 및 [EC-(4β→8)]₃-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 펜타머, [EC-(4β→8)]₅-EC, [EC-(4β→8)]₄-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₄-EC-(4β→8)-C 및 [EC-(4β→8)]₄-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 헥사머, [EC-(4β→8)]₆-EC, [EC-(4β→8)]₅-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₅-EC-(4β→8)-C 및 [EC-(4β→8)]₅-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 헵타머, [EC-(4β→8)]₇-EC, [EC-(4β→8)]₆-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₆-EC-(4β→8)-C 및 [EC-(4β→8)]₆-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 옥타머, [EC-(4β→8)]₈-EC, [EC-(4β→8)]₇-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₇-EC-(4β→8)-C 및 [EC-(4β→8)]₇-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 노나머 및 [EC-(4β→8)]₉-EC, [EC-(4β→8)]₈-EC-(4β→6)-EC, [EC-(4β→8)]₈-EC-(4β→8)-C 및 [EC-(4β→8)]₈-EC-(4β→6)-C 로 이루어진 그룹에서 선택되는 데카머로 이루어진 그룹에서 선택되는 조성물.