KR100289841B1 - 라이소자임 이량체와 이를 포함하는 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 동물과 사람에서 종양 괴사인자의 생합성을 저해시키기 위한 약물의 제조를 위한 라이소자임 이량체의 신규한 용도에 관계한다. 특히 라이소자임 이량체는 다량의 TNF와 연관된 치료와 예방에 유용하다. 또한 본 발명은 본 발명에 따른 약물의 제약학적 제형에 관계하는데, 즉 라이소자임 이량체 0.01-10mg/ml, 해열성 멸균 조성물로 구성된 주사액과 이때 해열성 멸균용액은 적어도 하나의 생리학적으로 수용가능한 용매와 적어도 하나의 제약학적으로 인증되는 보호제로 구성되고, 폐혈증과 폐쇼크 특히 감염된 상처의 치료와 예방을 위한 라이소자임 이량체와 효과량으로 구성된 연고 또는 겔 또는 멸균드레싱이 있다.

Description

라이소자임 이량체와 이를 포함하는 조성물

제1도는 상이하게 희석시킨 라이소자임 이량체 존재하에, ConA로 자극한 임파구배양물에서 TNF 배출의 시험관내 억제를 설명한다.

제2도는 송아지피에서 TNF의 양을 설명하고,

제3도는 본 발명에 따른 약물의 치료요법적 효과에서 비교실험으로 송아지 혈액의 IFN의 양을 설명한다.

본 발명은 신규한 의료용도의 라이소자임 이량체 및 이런 이량체를 포함하는 조성물에 관계한다. 신규한 용도는 자연 방어 기작의 특정 기능장애의 치료에 관계한다.

단량체 형태의 효소는 오랫동안 다양한 질병의 치료에 치료요법적으로 효과가 있는 것으로 공지되어 있다.

라이소자임은 1922년 플레밍에 의해 발견되었으나, 이의 효소 기능은 1950년 이후에 밝혀졌다. 그 이후로 다양한 연구가 실시되어 다양한 요법적 효과가 보고되었다. 이들 중, 항바이러스성, 항박테리아성, 항염증성 그리고 항히스타민성 특성이 보고되었다. 그러나, 라이소자임의 치료요법적 용도는 단량체의 부작용으로 인하여 다소 제한적이었다.

라이소자임 및 다른 치료요법적 활성효소의 실제적인 사용의 제한은 80년대 후반에, 분리된 이량체형 효소의 개발로 해결되었는데, 상기 이량체형 효소는 공지된 단량체의 모든 유익한 특징을 가지면서, 치료요법량으로 사용하였을 때 전혀 부작용이 나타나지 않는다. 활성성분의 라이소자임 이량체 또는 다른 이량체 효소로 구성된 항균성, 항바이러스성 조성물에 대해서는 WO 89/11294에 상술되어 있다. 이 출원에서는 시험관내 실험에서, 라이소자임 이량체가 환자에서 5-20mg/㎖ 배양물 농도로 취한 시료에서 배양된 세균 균주의 증식을 상당히 억제한다고 보고하였다. 또한, 이량체는 체중당 1-2 mg/kg의 약량으로 일일 2회 경구투여하는 경우, 개 파르보바이러스(Parvovirus)(CPV) 감염치료에 효과적인 것으로 보고되었다.

발명자에 의한 연구작업이 지속됨에 따라, 라이소자임 이량체의 다른 특징이 발견되었고, 이들 약물의 신규한 치료요법적 용도가 개발되었다.

라이소자임 이량체의 항균성, 항바이러스성 효과를 확인하기 위한 임상실험에서, 상기 이량체가 소화기 및 호흡기의 급성 질환 치료에 기대이상의 효과를 가진다는 것이 밝혀졌다. 따라서 자연 방어 기작이 고장난 상이한 질병 단계에서, 라이소자임 이량체의 효과를 결정하기 위한 새로운 연구가 실행되었다.

세균성 독소는 세균이 질병을 유발하는 다수의 독성인자들중의 하나로 공지되어 있다. 최근에는 숙주 면역 체계와 세균성 독소와의 상관관계에 대해 연구가 활발하였다. 우선, 이들의 상호작용은 면역조절을 야기하고, 둘째는 사이토킨과 다른 조절인자의 방출을 야기하는데, 이것은 독소에 의한 많은 생리학적 동요의 원인이 된다. 후자의 효과는 엔도톡신의 작용 측면에서 연구되어 왔는데, 이것은 그램-네거티브 폐혈증 발병에 중요한 역할을 한다(Bayston, D.F., Cohen, J.: Bacterial endotoxins and current concepts in the diagnosis and retreatment of endotoxaemia; J. Med. Microbiol. 1990, 31:73-83). 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)와 스트렙토코커스 피오제네스(Streptococcus pyogenes)에 의한 감염에서 오랜 기간동안 엑소톡신의 역할이 공지되어 왔으나, 이들 유기체에 의해 생산된 엑소톡신에 관심이 증가된 것은 스타필로코커스성 독성 쇼크증후군을 인식하게 되면서부터다.

독성쇼크는 고열, 저혈압증, 모세혈관 파괴, 확산 홍피증, 점막 홍반, 신장손상, 혈청석회감소증, 저알부민혈증, 홍반등의 특징을 가지는 악성 질환이다. 대부분의 독성 쇼크증후군은 월경동안에 사용하는 탐폰과 관계되나, 이런 증상은 외과적 처리후에 솜등을 그대로 두는 경우(비형성술 또는 심한 코피후), 월경과 상관없이 남녀모두에 발생한다. 독성 쇼크증후군(TSS) 환자의 질에서 분리한 스타필로코커스 균주(Staphylococcus st.)가 독성쇼크 증후군 독소-1(TSST-1)을 생산하는 것으로 보이긴 하지만, TSST-1을 생산하는 미생물은 불현성(不懸性) 감염에 의해 제공되기도 한다. 초기 균혈증(菌血症)은 불현성이거나, 또는 수주 또는 수개월내에 국소감염이 나타날 수도 있다. 이와 같은 감염과 함께, 폐혈증 증후군 또는 폐혈쇼크가 나타날 수도 있다. 드물지만 좀더 심한 균혈증은 국소적 감염 없이도 발생될 수 있는데, 이런 상황에서는 쇼크, 심내막염, 유포된 맥관내 응혈이상증 및 다기관 손실이 주로 나타난다(Stevens, D.L. et al. ; Gram-positive shock; Current Opinions in Infect ious Diseases 1992, 5:355-363).

다른 그램 포지티브 세균과 관련된 유사한 증상이 관찰되고 있다. 가령, 스트렙토코커스(Streptococcus) 발열제 감염은 쇼크와 연관되고, 치사율이 30%가 된다. 스트렙토코커스 뉴모니에(Streptococcus pneumonia)는 폐렴의 원인이 되는데, 이것은 페니실린에 상당한 저항성이 있고, 쇼크증후군을 발생시키는 경향이 있다. 또한 AIDS 환자는 대체로 일반인보다 뉴모코커스(Pneumococcal) 감염가능성이 더 높다.

그램-네거티브 세균에 감염되면 폐혈증 및 폐혈쇼크가 나타난다. 그램-네거티브 바실리(Bacilli)와 비보리오스(Vibrois)는 가장 중요한 장독소이다. 장독소는 그램-네거티브 박테리아 세포벽의 외막의 리포폴리사카라이드(LPS) 성분이다. 주로 장독소는 내장 기관에 영향을 주어 설사를 일으킨다. 동물과 사람에서 그램-네거티브 세균의 가장 빈번한 감염은 대장균(E.coli) 감염이다. 이런 감염에 수반되는 심한 탈수현상으로 종국에는 감염개체가 사망할 수도 있다. WHO에 따르면, 개발도상국가에서 약 32만명의 어린이가 매년 급성 설사에 의해 사망한다. 전체 폐혈증중 약 30%가 그램-네거티브 균에 의한 것이다.

그램-포지티브 세균 및 그램-네거티브 세균 감염에 의한 폐혈증은 모든 국가에서 공통적인 악성 질환이다. 매년 미국에서 400,000건 발생하고, 이중 치사율은 50%에 달한다.

최근에, 폐혈증 및 폐혈 쇼크는 많은 문헌에 주제가 되어 왔다. 폐혈쇼크의 발병에서, 내독소혈증 및 다른 세균성 독소 중재물질이 중요한 역할을 한다. 여기에는 종양 괴사인자(TNF), 인터루킨-1(IL-1), 인터페론(INF), 혈소판 활성인자, 에코사노이드(아라키돈산 유도체)가 포함된다; 이들 중 가장 중요한 것은 대사과정과 면역과 식세포 시스템에 영향을 주는 TNF이다(Berkowitz, F.E. : Bacterial toxins in pathogenesis of infections; Current Opinions In Infectious Diseases, 1991 4:332-337). 폐혈쇼크로 인해 사망한 경우, TNF와 IL-1의 농도가 높은 것으로 입증되었다. 많은 저자들이 폐혈쇼크 환자의 혈장 및 혈액에서, TNF-α의 농도가 상승되었음을 보고하였다. 또한, TNF-α의 독성효과는 신체내에서 TNF의 농도보다는 TNF의 지속성에 의존한다고 지적하였다.

많은 저자들은 폐혈증 및 폐혈쇼크에서 사이토킨 캐스케이드의 조절가능성에 대해 조사하였다. 보고된 성공사례는 단클론 항-TNF 항체를 이용하는 것과 항-리포폴리사카라이드로 리포폴리사카라이드를 중화시키는 것이다. 그러나 이런 항체는 박테리아 제거율을 증가시키지는 못한다. 대식세포에 의한 TNF생산을 차단시키는 덱사메타손과 펜톡시필린과 같은 시약을 사용하는 경우, 다소의 유익한 효과가 관찰되었다.

또한, 다른 사이토킨도 폐혈쇼크에 영향을 준다. 이런 경우, 폐혈쇼크에서 사이토킨 캐스케이드를 조절하는 치료는 감염억제를 잠재적으로 방해할 수 있는데, 그 이유는 숙주방어기작이 이와 동일한 염증성 사이토킨에 의존하기 때문이다. 폐혈쇼크는 예방수단의 발견이 가장 중요한데, 그 이유는 이것이 다수의 환자에게 상당한 도움이 되기 때문이다. TNF 수준조절은 이런 목적에 필수적이다.

열을 내는 다른 방어기작에서, TNF의 역할이 또한 중요한데, 열은 모든 고등동물과 사람에서 일반적인 나타나는 감염에 대한 생리반응이다. 5가지 발열성 사이토킨(IL-1, TNF, 인터페론, IL-2, IL-6)은 열성반응의 주요 내생 조절물질로 인지되고 있는데, 이들은 사람에서 열발생을 억제시키고 열손실을 용이하게 하는 열-민감성 뉴우런을 저해한다. 열병 및 이의 조절물질은 침투한 미생물과 숙주 모두를 손상시킬 수 있다. 최근 몇 년간, IL-1, TNF, IL-6이 감염의 비정상적 발병을 조절함을 암시하는 상당한 데이터가 축적되고 있다. 내생 발열제는 다양한 감염의 발병과정에 이용되기 때문에, 조절물질과 열성(熱性)반응은 숙주에게 상당한 악영향을 준다. 이에 대한 가장 확실한 증거는 그램-네거티브 폐혈증 연구에서 나왔다. 또한 내생 발열제는 전신 및 국소적 폐혈증 증상을 조절하는 것으로 나타났는데, 상기 폐혈증 증상은 그램-포지티브 세균, AIDS, 수막염, 성인 기관지 압박증, 화농성 관절염, 미코박테리움증에 기인한 것이다. 비록 전술한 자료는 열성반응 자체가 실험동물에서 감염 저항성을 강화시킨다는 이전의 관찰과 상충되긴 하지만, 진화과정에서는 개체의 생존보다는 종의 보존이 핵심이 된다. 감염결과(예, 그램-네거티브 폐혈증)에 대한 발열성 사이토킨의 해로운 효과는 급성이 덜한 감염에서 열병의 유익한 국소적 효과로 바뀐다. 따라서, 희망이 없는 감염개체의 죽음을 재촉함으로써 위험한 개체가 죽게 된다. 이런 방식으로, 전체 종은 유행성 질환으로부터 보호받게 된다(Mackowiak, P.A.: Mechanism of Fever ; Current Opinions in Infectious Diseases, 1992, 5:348-354).

열성 병원체의 기본개념은 기원 또는 구조와 관계없이, 외부 발열제는 숙주(일차 대식세포)가 내인성 발열제를 유도하게 하여 열병을 야기한다는 것이다. 따라서, 항-내생 발열제 항체 및 내생 발열제 수용체 길항물질의 이용에 기초한 요법적 방법은 효과적이다. 가능성중의 하나는 TNF의 생합성을 차단시키는 것이다. 동물에 대한 연구에서 TNF는 감염에 대한 반응캐스케이드에서 IL-1과 다른 사이토킨에 앞서 생성되는 것으로 밝혀졌다. 많은 과학자들에 따르면, TNF 생합성의 저해는 또한, IL-1 생합성의 중단을 의미한다. 그러나, TNF 생합성의 저해는 또한, 다소 급성인 악성감염의 유해효과 중단을 의미한다.

또한, TNF는 염증과정의 조절물질중의 하나로 공지되어 있다. 많은 경우에 염증은 폐혈쇼크 발병 과정의 제 1단계 질환이다. 조직의 연속성이 파괴된 경우, 예를 들면, 감염되기 용이한 상처, 전쟁 상처, 특히 복부 상처(복막염), 위장관 질환(예, 충수염을 수반하는 급성 감염), 후-인플루엔자에서 발견되는 급성 박테리아 및 바이러스 감염, 종양 분해기의 종양 질환의 경우 염증은 TNF생산 증가의 제 1증상이다. 따라서, TNF수준 조절은 이런 감염의 유용한 치료법이 된다.

AIDS 자체에서 TNF의 역할은 좀더 확실하다. AIDS는 상당한 면역결핍으로 특징지어진다. AIDS는 CD4+임파구 수의 감소로 확인한다. HIV로 감염된 세포수는 AIDS 환자의 말초혈 단핵세포(PBMC)에서 상대적으로 적다(≤1/100-1000). CD4+ 임파구가 우선적으로 감염되지만, 이들 세포가 HIV 감염의 유일 표적은 아니다. 최근에는 HIV 표적세포의 스펙트럼이 상당히 넓은 것으로 나타났다. 단세포/대식세포 대 T-임파구에서 HIV 감염의 결과에서 분명한 차이가 나타났다. T-임파구는 파괴되는 반면, 단세포/대식세포는 지속적인 감염상태를 유지한다. 따라서, HIV는 체내의 단세포/대식세포와 다른 세포에 의해 저장물질로 숨게 된다. HIV 감염반응에 대한 단세포/대식세포의 반응형태가 숙주에서 잠복기를 결정하게 된다; 이런 반응은 또한, 감염된 세포에 만들어진 가용성 인자로 인한 병인 후유증의 원인이 된다(Toshifumi Matsuyama et al. : Cytokines and HIV infection: Is AIDS a Tumor Necrosis Factor disease?; AIDS 1991, 5:1405-1417). 많은 과학자들의 보고에 따르면, HTLV-1에 감염된 사람 T 세포주는 HIV 감염에 매우 민감한데, 이것은 HIV의 복제강화와 연관된 극적인 세포 병원성 효과를 입증한다. 또한, HIV 감염된 세포는 이들 세포의 상청액에 의해 쉽게 손상을 받는다. 이런 상청액으로 처리한 바이러스의 적정검사에서, T 세포(MT-2)에 의해 생산된 인자가 HIV 복제를 강화하는 것으로 밝혀졌다. 이 인자는 TNF-β로 확인되었는데, 이와 같은 발견은 T세포(MT-2)가 TNF-β를 생산한다는 보고와 일치하는 것이다. TNF-α를 사용하는 경우에, 동일한 효과가 관찰되었다. TNF-α와 TNF-β는 HIV-감염된 세포를 선택적으로 죽이고, HIV 복제를 강화했다. 또한, HIV-감염된 T-세포주 및 HIV-감염된 개체에서 새로이 분리한 PBMC는 TNF와 반응하여 그 수준을 상승시키는 것으로 보고되고 있다. 이것은 동일한 HIV 발현강화가 생체내에서도 일어날 수 있음을 암시한다. 사실, TNF의 강화된 활성은 항-TNF 항체로 중화할 수 있다.

TNF-α와 TNF-β 처리후의 HIV 복제강화는 최대 10±배까지 이루어진다(Yakarnam, A. et al. : Tumor necrosis factors(α, β) induced by HIV-1 in peripheral blood monocellular cells potentate virus replication; AIDS 1990, 421-427).

다양한 사이토킨이 HIV 생산에 영향을 준다는 것이 확인되었다. 정상 말초혈에서 정제된 단핵 대식세포를 이용한 IL-6 및 TNF-α 유도는 HIV 바이러스에 노출된 후 수시간 내에 관찰되었다. 이와 같은 사이토킨 유도는 가열-불활화된 HIV를 사용하여 관찰하였다. 많은 관찰과 Toshifumi Matsuyama et al.(op. cit.)에 기초하면, AIDS는 사이토킨 또는 TNF 질환임이 확실해진다. AIDS의 사이토킨 네트워크에서, TNF-α와 TNF-β는 HIV 복제의 강화 및 다른 사이토킨의 유도에 중요한 분자가 되는 것으로 보인다. TNF-α는 다양한 세포형에서, 다른 사이토킨의 유출을 촉진하고, 따라서 제 1 방어 기작에서 사이토킨 캐스케이드의 핵심 사이토킨이 된다.

AIDS와 연관된 많은 증상은 상이한 생물학적 기능체의 사이토킨 방출로 설명할 수 있다. 두 개의 공지된 발열제, IL-1과 TNF-α의 생산강화는 AIDS 환자에서 보이는 열병을 설명한다. TNF-α는 AIDS와 연관된 악태증과 관계된다. TNF-α와 TNF-β는 단세포 조절된 세포독성에서 면역조절물질과 주효체분자로 작용한다. 또한, TNF는 면역반응의 활성을 담당하고, HIV 감염된 세포를 직접적으로 죽여 HIV 복제를 강화시킬 수 있다. 또한, AIDS에서 CD4-T 세포 결실을 설명할 수 있는 면역학적 기작이 제시되었다(Matsuyama et al., op. cit). 또한, AIDS 연관된 카포시 육종이 TNF-α에 의해 유도된다: TNF-α는 자외선광과 같은 생리학적 자극에 의해 케라틴성 세포에서 생산할 수 있는데, 이런 자극은 피부에서 IL-6의 유도 및 AIDS에서 카포시 육종의 진전에 한 원인이 된다. 시험관내 실험에서, TNF-α는 신경수질소(myelin) 및 회돌기교세포를 손상시킬 수 있다; 또한 일부 글리오마-유도된 세포주는 TNF-α의 항-증식 효과에 민감한 것으로 나타났다. 여기에서, AIDS 환자의 중추신경계 장애가 TNF-α 관여의 결과라는 결론에 이르게 된다. 몇몇 보고서는 TNF-α와 IL-1의 혈청수준이 AIDS와 ARC(AIDS 관련)의 발생과 함께 실질적으로 상승하는 반면, HIV의 무증후증 담체의 혈청 실험에서는 건강한 컨트롤의 수치 범위에 속한다는 것을 보였다. AIDS는 TNF 질환으로 HIV 질환이기도 하다. 이것은 TNF 유도의 조절이 AIDS 환자에 대한 효과적인 치료법이 될 수 있음을 나타낸다.

다음의 기초적인 발견에서, 전술한 문제점을 해결하고 전술한 병인하에 라이소자임 이량체의 신규한 요법적 용도를 찾을 수 있었다:

1. 라이소자임 이량체는 TNF 합성을 저해한다.

2. 라이소자임 이량체는 IFN-α 합성을 촉진시킨다.

3. 라이소자임 이량체는 대식세포 활성을 강화한다.

따라서, 본 발명의 목적은 전술한 과도한 수준의 TNF와 연관된 질병의 치료에 요법적으로 유용한 제약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 전술한 것과 같이 과도한 수준의 TNF와 연관된 질병의 예방에 유용한 제약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 과도한 수준의 TNF와 연관된 질환의 예방과 치료에 유용한 제약학적 조성물과 건강식품을 제공하는 것이다.

본 발명에 따라 상기 설정된 목적은 이량체형의 라이소자임 및 활성성분으로 이량체의 라이소자임을 포함하는 신규한 제약학적 조성물을 사용하여 성취할 수 있다:

- 동물과 사람에서 TNF의 생합성을 저해하기 위한 약물의 제조를 위한 라이소자임 이량체;

- 과도한 수준의 TNF와 연관된 질환의 치료를 위한 제약학적 물질제조용 라이소자임 이량체;

- 과도한 수준의 TNF와 연관된 질환의 예방을 위한 제약학적 물질제조용 라이소자임 이량체;

-무증후증 수용체와 AIDS-관련 합병증 환자에서 TNF의 HIV 유도성 배출을 조절하기 위한 약물제조용 라이소자임 이량체;

- AIDS 치료를 위한 제약학적 조성물의 제조를 위한 라이소자임 이량체;

- 폐혈증과 폐혈쇼크의 예방과 치료를 위한 제약학적 조성물의 제조를 위한 라이소자임 이량체;

- 악태증의 치료와 예방을 위한 제약학적 조성물의 제조용 라이소자임 이량체;

- 열병의 예방과 치료를 위한 제약학적 조성물의 제조용 라이소자임 이량체;

- 0.01-10 mg/㎖, 적절하게는 0.1-1.0 mg/㎖의 해열성 멸균 조성물 양으로 라이소자임 이량체를 포함하는 주사, 이때 상기 멸균 조성물은 생리학적으로 수용가능한 용매와 제약학적으로 승인된 보존제를 포함한다;

- 체중당 0.02 mg/kg의 단일 복용량 또는 반복 복용량으로 i.v 투여되는 주사;

- 감염된 상처의 치료와 폐혈증과 폐혈쇼크의 예방을 위한 라이소자임 이량체의 효과량으로 구성된 연고 또는 겔이 포함된 탐폰과 멸균 드레싱;

- 생리동안에 사용할 수 있도록 라이소자임 이량체의 효과량이 포함된 질(vaginal)용 탐폰.

라이소자임 이량체로는, 분리 정제된 라이소자임 이량체를 사용하는 것이 적절하다. 몇 가지 경우에, 라이소자임 이량체 이외에 효소의 삼량체 및 고차 올리고머의 분취물을 소량 포함하는 조성물을 사용할 수도 있다.

본 발명에 따른 주사는 또한, 근육 또는 피하로 투여하기도 한다. 몇몇 경우에는, 동일 액상 조성물을 자궁내 또는 유방 -또는 국소적으로-결국 다른 국소적 제제와 함께 투여하기도 한다.

적어도 하나의 생리학적으로 수용가능한 용매 그리고/또는 적어도 하나의 제약학적으로 승인된 보존제로 구성된 적당한 해열성 멸균 조성물은 용매인 해열성 멸균수 또는 PBS 수용액 및 제약학적 단백질 제제에 승인된 보존제인 티오메르잘로 구성된다.

이량체 라이소자임은 효소 단량체의 조절 중합과정 및 이후의 조심스런 정제과정, 특히, 공지된 독성부작용을 가진 반응후의 삼량체 및 고차 올리고머의 분취물과 단량체의 혼합물을 제거하는 과정에서 얻을 수 있다. 정제단계로 구성된 하나의 제조공정은 WO 91/10731에 상술되어 있다.

기존의 라이소자임 이량체 선-임상 실험에서는 어떠한 돌연변이나 배자기형 발생효과가 드러나지 않았고, 또한, 내성효과도 전혀 나타나지 않았다. 경구/경피 LD₅₀에서 단일 복용량 독성은 측정할 수 없었고(> 2000 mg/kg), i.v. LD₅₀> 1000 mg/kg이었다.

본원의 라이소자임 이량체는 시험관내 실험에 의해 확실히 뒷받침되고 있으며, 생체내 임상실시에서도 효과적이었다. 몇몇 비교연구도 실행하였다.

TNF 배출에 대한 저해효과는 광범위한 스펙트럼의 라이소자임 이량체의 활성, 다시 말하면, INF 배출을 유도하는 능력 및 대식세포증에 대한 이의 강화효과를 유도하는 능력으로 인하여 효과적인 것으로 입증되었다. 전술한 두 가지 특징은 자연방어 기작에 매우 중요한 인자이다. 따라서, 상기 확인된 라이소자임 이량체의 신규한 용도의 치료요법적, 예방적 효과는 이에 의해 동시에 강화되는 자연방어 기작에 의해 뒷받침된다.

본 발명은 특정분야의 시험결과를 설명하는 첨부된 도면을 참고하여 작성된 실시예에서 설명한다.

라이소자임 이량체의 면역활성을 결정하기 위하여, FACS 분석과 함께 사람 말초혈의 임파구에서 검사를 실시하였다.

사람 말초 임파구에서 유사분열 자극은 면역시스템에서 가장 중요한 세포의 반응성을 검사하기 위한 잘 정립된 방법이다. 건강한 혈액 제공자에서 취한 임파구의 활성과 증식에 대한 치료요법적 물질의 영향을 검사하기 위하여, 유사분열 물질은 적정량 이하로 첨가하고, 임파구 반응은 면역연관 변수를 사용하여 최종적으로 정량측정한다. 결과는 약물없이 측정한 조절치와 비교한다.

임파구를 자극하기 위해, 배지 ㎖ 당 20㎍ 농도 ConA를 이용하였다. 초기세포 농도는 10⁶세포/㎖이다. CO₂배양기에서 단시간 배양은 1일(임파구에서 IL-2 수용체와 HLA-Dr) 또는 2일(모든 다른 실험)동안에 실시하였다. 다음의 변수는 세포활성을 위한 기준으로 측정되었다:

- 네오프테린(면역 활성을 위한 표식)

- β -2-마이크로글로블린(활성표식)

- 인터루킨-2(T-헬퍼 임파구 유도된 오토크린과 파라크린물질)

- 인터루킨-6(세포분화 호르몬)

- 종양 괴사인자-TNF(혈관 활성, 다기능 인터루킨)

- 인터페론 α(B-임파구에 특이적인 분화인자)

- 티미딘 카이나제(효소, 증식세포에서 상향제어됨)

- 임파구 인터루킨-2 수용체(오토크린과 파라크린 IL-2의 수용분자)

- 임파구 Ki-67(활성화된 증식세포에서 발현되는 항원)

- 임파구 HLA-DR(면역 반응동안에 상향조절된 조직적합성 항원 II)

세포산물에 대한 다음의 조사는 배양 상청액에서 실시되었다:

네오프테린은- 면역반응 동안에 자극받은 배양물에서 T-임파구에 의해 생산- 본 실험에서, 시험 이량체없이 ConA 자극된 세포에서 라이소자임 이량체에 의해 조절치 이상으로 눈에 띄게 상승하지는 않았다. 시험 이량체의 농도가 증가함에 따라, 네오프테린 수치가 약간 상승하였다.

유사하게, 라이소자임 이량체의 모든 농도에서, β -2-마이크로글로빈 값은 조절치 부근에서 유동되었다.

IL-2 수용체는- 배양동안에 임파구 표면에서 유출되고, 전체 IL-2 수용체 전환에 대한 정보를 제공- 임파구 표면에 있는 IL-2 수용체와 유사한 수준이고, 시험 이량체의 최대 농도에서 분명한 억제를 보였다.

IL-6은 약량에 의존하는 경향을 보였는데, 농도가 높을수록, 수치가 높았다. 상기 분자는 조혈, 세포증식, 면역반응에 매우 중요하다. 실험에서, 첫 3개수치를 추정하였는데, 그 이유는 최고 표준이 단지 2000 pg/㎖에 불과했기 때문이다.

나머지 분자에 대한 결과는 아래의 표 1에 나타낸다. IL-6과는 달리, TNF-α는 마지막 2번의 희석단계를 제외하고는, 배양상청액에서 예상치 않게 상당히 감소된 농도로 존재하였다. 이는 TNF 농도 억제에 효과가 없음을 증명하는 것이다.

[표 1]

세포 펠렛의 냉동과 해동후, 임파구 세포혈장에서 티미딘 카이나제를 측정하였다. 티미딘 카이나제는 세포분열시 상향제어되기 때문에, 세포증식에 대한 훌륭한 마크가 된다. 표 1 데이터는 시험 라이소자임 이량체 최고 농도에 의한 억제를 보여준다; 다른 희석 단계에서는, 명확한 경향이 나타나지는 않는다. 또한, 동일한 조건하에서 인터페론-α는 높은 농도에서, ConA 단독의 조절치 이상의 값을 보여준다. 가시적인 증가는 제 2 수치와 제 3 수치사이에 발생된다.

임파구 표식 :

세포 적합성 표식인 HLA-Dr/CD3은 면역반응동안에 활성화된 T-임파구에서 발현된다. 수득된 결과는 컨트롤 배양물에서 일정 퍼센트의 활성화 T세포를 보여준다, 배양물상의 다양한 라이소자임 이량체 농도에서, 수치는 조절치 주변에서 변한다.

임파구에서 IL-2 수용체: 인터루킨-2는 IL-1을 통한 활성화후, T-헬퍼 임파구에 의해 생산된 사이토킨이다. IL-2는 오토크린과 파라크린이다. T-헬퍼 임파구는 IL-2를 생산할 뿐만 아니라, 이 분자에 의한 증식을 자극한다. T-헬퍼 임파구의 표면에서 IL-2에 대한 수용체는 활성화 직후, 상향 조절된다. 표 1은 라이소자임 이량체의 최대농도에서, 임파구에서 IL-2 수용체의 억제가 현저한 반면, 나머지 값은 생물학적 밴드폭이상으로 변하지 않는다는 것을 보여준다. 표 1은 또한, Ki-67/CDβ과 Ki-67/CD4에 관련된 자료를 포함한다. Ki-67은 유사분열동안에 세포에 나타나는 증식분자이다. Ki-67은 종양진단에서 자극된 세포를 추정하기 위한 매우 중요한 변수이다. 보고된 결과에서, Ki-67⁺억제(CD8) 세포의 세포증식은 라이소자임 이량체의 2가지 최고 약량에서 약간 저해된다. 최고약량의 헬퍼(CD4)임파구에서, 포지티브 세포비율이 실제적으로 증가됨을 볼 수 있다. 낮은 약량에서, Ki-67/CD4를 발현하는 세포 퍼센트는 기준치보다 약간 높았다.

TNF의 현저한 억제는 제1도에 보인다.

면역반응에서 중요도로 선택한 상기 면역학적 변수의 분석방법은 잘 정립되고, 민감하여, 다수의 상이한 변수를 평가할 수 있는 적정량이하의 ConA 자극된 사람 말초 임파구에 대한 시험물질의 영향을 측정함으로써 이루어졌다. 라이소자임 이량체의 일부 농도에서, ConA 단독으로 자극시킨 임파구의 값과 비교하면, 실험 결과에 상당한 차이가 있긴 하지만, TNF와 TNF-α에 대해서 관찰된 효과는 분명히 시험된 모든 희석수치 범위내에 있다.

[실시예 2]

실험실 실험은 시험관에서 우유와 혈액세포에서 대식세포 활성에 대한 라이소자임 이량체의 효과를 결정하기 위해 실시되었다. 표준 시험관 실험에서 라이소자임 이량체는 소의 감염된 유선에서 분리한 미생물의 증식을 억제하지 못한다. 유방내 그리고 동시에 정맥내로 투여된 라이소자임 이량체를 임상적으로 사용하면, 소의 유선감염이 효과적으로 제거되기 때문에, 소의 유선에서 주된 항균기작은 대식작용임을 분명히 알 수 있다. 따라서, 대식증에 대한 라이소자임 이량체의 효과를 결정하기 위한 시험관 시험에, 건강한 소와 감염된 소의 혈액 및 우유를 사용하였다. 비교를 위하여, 실험은 동일 농도의 검사 물질 및 동일 배양시간으로 실시하고, 세포는 건강한 소 및 감염된 소, 또는 동일 소 유선의 감염된 부분과 건강한 부분에서 분리한 세포를 사용하여 개별 반응차를 없앴다.

실행된 실험에서, 라이소자임의 정제된 이량체형을 비롯하여 삼량체 및 고차 올리고머 분취물과 이량체의 혼합물을 25-0.25 ㎍/㎖의 농도로 건강한 소와 감염된 소의 혈액 또는 우유에 첨가하고, 혼합물은 0.5-24 시간동안 37℃에서 배양하였다. 각 시료에 대한 식작용 세포(Wisniewski et al에 다른 식작용 색인)퍼센트와 입상세포 NBT-포지티브(Park) 퍼센트를 결정하였다.

라이소자임 이량체는 시험관내 실험에서 백혈구 세포의 식활성을 강화시킨다. 효과는 약량과 배양시간에 따라 달라진다. 고농도의 라이소자임 이량체는 혈액 백혈구보다는 우유 백혈구를 활성화시키는데 필수적이다. 과도한 농도의 이량체는 시험관에서 식활성을 약간 감소시킨다. 선별된 결과는- 주로, 중합반응후 혼합물이 이량체의 세포독성 단량체를 포함하지 않는 한, 고도 정제된 그리고 정제가 덜된 이량체 라이소자임에서 얻은 결과는 유사하다는 것을 보여주는 결과- 다음의 표 2와 3에 나타내며, 여기서, “라이소자임 이량체+”는 명세서에서 전술한 바와 같이, 라이소자임 삼량체 및 고차 올리고머의 분취물을 소량 포함하는 조성물을 나타낸다.

[표 2]

[표 3]

라이소자임 이량체의 정제정도는 우유 백혈구 세포의 식활성에 그다지 영향을 주지 않았다. 주효체세포는 과립백혈구인 것으로 보인다.

다른 실시예에서, 생체내 연구결과를 보고하였다. 임상실험에서, PBS 용액 10㎖에 녹인 라이소자임 이량체 2mg 조성물을 사용하였다. 이 제제는 KLP-602라 한다.

[실시예 3]

정맥 주사할 때 KLP-602는 건강한 송아지와 아픈 송아지, 건강한 망아지와 젖소에서 혈액 과립백혈구의 식활성을 자극하는 것으로 나타났다. 효과는 호중구의 수의 증가 및 포도구균(Staphylococcus)을 흡수하고, NBT를 감소시키는 능력의 향상으로 분명히 드러났다. 이와 같은 현상은 투여후, 처음 12-24 시간동안에 주로 나타난다. 유방에서의 식활성에 대한 KLP-602의 효과는 약량, 약물형태, 개별 동물의 반응에 따라 달라진다.

실시예 4 내지 7에서 라이소자임 이량체는 소, 돼지, 말, 개의 감염성 질환치료에 사용하였다. 상이한 약량과 상이한 시간간격으로, 제제는 정맥내, 근육내, 피하내, 유방내, 자궁내로 투여하였다. 약물은 346 마리 소, 274 마리 송아지, 110 마리 암퇘지와 수퇘지, 294 마리 새끼돼지, 709 마리 젖먹이 새끼 돼지, 35 마리 망아지, 107 마리 개에 투여하였다. 대안치료는 컨트롤로 한다. 실험 동물의 특성으로 인하여, 도덕적 이유로 인하여 치료를 받지 않은 것은 없다. 하지만, 수의학 문헌에서 공지된 치료 질환의 임상적 특징과 비교하여 결론을 유추하였다.

[실시예 4]

송아지에서 실시한 실험에서 INF와 TNF의 혈액량은 건강한 동물과 감염된 동물군에서 결정하고, 후자는 감염 처음 12시간 동안에는 치료하지 않고, 이후 고 순도 라이소자임 이량체와 항생제로 치료하였다.

라이소자임 이량체 치료받은 집단에서, KLP-602를 1회 또는 2회 주사하여, 위염에 걸린 송아지 90% 이상, 급성기관지 폐렴에 걸린 송아지의 85% 이상을 치료하였다. 열과 설사와 같은 증상의 즉각적인 소멸이 매우 특징적이다. 이런 약물치료에는 동물에 보충액을 제공할 필요성이 없다. 회복시간과 속도는 항생제로 치료한 컨트롤 집단에 비해 우수하다.

[실시예 5]

KLP-602는 돼지를 괴롭히는 질병의 치료에 매우 효과적이다. 거의 100%의 동물이 다음과 같은 질병: 산후 후유증(MMA 증후), 이질, 화농성 자궁염, 인플루엔자와 대장균증으로부터 회복되었다. 부종과 기관지폐염의 경우에, 약물은 다소 우수성이 떨어지지만, 다른 요법에 의해 나타나는 결과보다는 상당히 양호하다. 산후유방 및 자궁염증의 경우, 특히 중요한 젖 분비의 재개(새끼돼지의 생명을 구함)를 비롯하여 설사와 열의 즉각적인 중지(통상적으로 처음 24 시간동안)를 관찰할 수 있었다. 다른 치료법과 비교한 KLP-602 치료법의 효과는 아래의 표 4에 나타난다.

[실시예 6]

KLP-602로 치료하는 경우, 장염에 걸린 망아지는 100 %, 기관지폐염에 걸린 망아지는 83.3%가 공지된 약물로 치료한 컨트롤 집단보다 더 빨리 회복되었다.

[실시예 7]

KLP-602는 개에서 일부 질환, 예를 들면, 모낭염(100 %, 효과), 상하 기관지염, 설사로 대변되는 위장관 감염의 치료에 실험하였다. 이 집단에는 파르보바이러스증이 우세하였는데, 상기 질병은 실제 불치의 병으로 공지되어 있다. 그럼에도 불구하고, 파르보바이러스증의 경우에, 약 75%의 회복률이 관찰되었다.

전술한 것과 같이 자연발생 질환에 걸린 동물에서 실행된 실험에서, 몇 가지 중요한 점이 관찰되었다:

1. 본 요법은 다양한 인자의 병인과 병원성을 가지는 질병치료에 대한 효과와 간편함이 입증되었다(이와 같은 질병은 동물집단에 만연하기 때문에, 전염성 질병의 확산이 용이한 번식농장에서는 특히 다루기가 힘들다). 이와 같은 발견은 자연 방어 기작에 대한 라이소자임 이량체의 조절효과를 입증한다.

2. 본 요법은 내독소 쇼크 또는 고열이 지속되는 다른 질환과 같은 자연과정에 관련된 질병에 효과가 있는 것으로 입증되었는데, 상기 질환은 회복후 상당기간 동물의 상태에 영향을 주고, 따라서 경주나 다른 스포츠를 위해 사육된 말과 주로 식품산업을 위해 사육된 동물에 극히 유해한데, 그 이유는 식품산업에서는 생산비가 매우 중요하기 때문이다. 신속하게 회복되면, 이런 질병치료에 대한 비용은 상당한 감소된다.

3. 생체내에서 관측된 결과에서 라이소자임 이량체 치료한 자연발생 감염에서 TNF의 수준이 억제됨을 알 수 있었는데, 이는 청구된 본 발명을 뒷받침한다.

[실시예 8]

실험할 박테리아를 선택하고, 선택된 박테리아에서 가장 효과적인 항생제량을 결정하고, 예상된 효과가 관찰되는 라이소자임 이량체의 농도범위를 찾기 위해, 다양한 미생물에 대한 항생제의 활성에 대한 라이소자임 이량체의 효과를 연구하였다. 실험에서 냉동동결된 정제 라이소자임 이량체를 2개 사용하였는데, 하나는 1991년에 생산된 것이고, 또 다른 하나는 1992년에 생산된 것이다. 폴란드의 제약회사인 폴파에서 공급되는 폴란드 시장에서 입수가능한 항생제, 예를 들면, 페니실린, 네오마이신, 에리스로마이신, 세파로스포린(SEFRIL)을 실험에 사용하였다.

실험할 항생제는 완충액-NaCl 용액(PBS-Biomed) 또는 소 혈청에서 현탁시켰다. 라이소자임 이량체는 이후, 현탁액에 첨가하여, 시료에서 이량체의 농도가 5 ㎍/㎖가 되도록 하였다. 실험하는 항생제의 농도는 각 튜브마다 상이한데, 이는 사용된 미생물의 민감성이 다양하기 때문이다.

대장균(Escherichia coli), 장염균(Salmonella enteritidis), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스트렙토코커스 우베리스(Streptococcus uberis)에 대한 항생제 단독 또는 라이소자임 이량체와 병용한 효과는 PBS 또는 소혈청 현탁액에서 검사하였다. 또한, 사르시나 루티(Sarcina lutea) 9341 ATCC와 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)를 이 실험에 사용하였다.

실험의 사전특징으로 인하여, 각 항체는 다음과 같은 1개, 2개 또는 3개의 상이한 균주에 대해 실험하였다:

1. 플레이트 준비

실험한 박테리아 균주의 18 시간 액체배양물 0.05㎖을 아가 포함된 14㎖ 시료(Biomed)에 첨가하였다. 혼합물은 교반하고, 10mm 직경의 플레이트에 붓는다. 아가를 냉각하여 고형화시킨후, 멸균 실린더를 여기에 놓고, 상기 실린더는 실험할 항생제 용액으로 채웠다.

2. 항생제 용액 준비

실험할 항생제 10mg 시료를 우선, PBS에 용해시켰다; 그 다음, 이 용액의 필요량을 예정된 부피의 PBS 또는 소 혈청에 첨가하여, MIC(최소 저해농도)에 가장 근접한 항생제 농도를 얻었다; 3가지 상이한 농도의 용액을 항상 준비하였다.

3. 라이소자임 이량체 용액 준비

냉동동결된 라이소자임 이량체 10mg을 우선, PBS 10㎖에 용해시켰다. 추가 희석물은 PBS 또는 소 혈청으로 만들고, 전술한 바와 같이 준비한 항생제 용액에 첨가하였다. 다음의 복합물을 검사한다:

- 항생제/PBS

- 항생제/PBS + 라이소자임 이량체

- 항생제/혈청

- 항생제/혈청 + 라이소자임 이량체

항생제의 농도는 각 실린더마다 동일하였다; 라이소자임 이량체 농도는 5㎛/㎖이다. 실린더를 용액으로 채운 뒤, 플레이트는 2 시간동안 실온에 유지시키고, 이후 배양물은 37℃에서 배양시켰다.

4. 결과 확인과 활성평가:

배양 18시간 뒤에 플레이트를 히터에서 꺼낸 다음, 박테리아 성장 저해 부위 직경(콜로니 결핍)을 실린더 주변에서 측정하였다.

5 ㎍/㎖ 농도의 라이소자임 이량체 추가에 상관없이, PBS에 항생제 현탁액으로 충전한 실린더에서 박테리아 성장 저해부위의 크기에는 차이가 없었다. 그러나, 소 혈청 항생제 현탁액으로 채워진 실린더에서는 억제부위 크기가 감소한 반면, 소 혈청 항생제 + 라이소자임 이량체로 채워진 실린더에서 억제부위 크기는 증가하였다. 이의 부위 크기는 라이소자임 이량체없이 항생제 단독의 혈청 현탁액으로 채워진 실린더에서의 크기보다 크고 또한 PBS 현탁액으로 채워진 실린더에서 볼 수 있는 크기보다 크다.

사르시니아 루티아(Sarcina lutea)에 대해 사용된 페니실린 실험에서도 이런 현상이 나타났다. 앰피실린을 라이소자임 이량체와 병용하는 경우, 대장균(Escherichia coli), 장염균(Salmonella enteritidis), 스타필로 코커스 에피데르미디스(Staptylococcus epidermidis)의 시험관내 성장 억제에 공조작용이 나타난다. 라이소자임 이량체 존재하에서, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 209 P와 스트렙토코커스 우베리스(Strephococcus uberis)에 대한 에리스로마이신 활성 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 209P에 대한 SEFRIL 활성이 증가하였다. 대장균(Escherichia coli)과 장염균(Salmonella enteritidis)은 이 항생제에 대해 저항성이 있다.

실험한 항생제의 항균활성 증가는 소 혈청을 용매로 사용하는 경우에만 관찰되었다. 전반적으로, 항생제 활성이 약 50% 증가되었으나, 특정 경우에는 라이소자임 이량체 존재로 인하여 100% 증가하였다.

결론:

5㎍/㎖ 농도의 라이소자임 이량체는 소 혈청 존재하에서 MIC(최소 저해농도)에 사용된 몇몇 항생제와 박테리아 성장저해에 공조작용을 보였다. 지금까지 얻은 결과에서 추가 연구가 필수적임을 알 수 있다.

[실시예 9]

[AIDS 환자 치료에서 AZT와 공조작용]

Ito 등은 최근에 TNF-α가 AZT의 항-HIV 활성을 길항할 수 있다고 보고하였다(Ito, M. et al. : “Tumor necrosis factor antagonizes inhibitory effect of azidothymidine on human immunodeficiency virus(HIV) replication in vitro; Biochem Biophys, Res. Commun. 1990, 166; 1095-1101). 진행된 AIDS 환자는 많은 감염으로 고통을 받게 된다. 몇몇 감염작용제는 면역을 억제하거나 또는 HIV 복제를 촉진하는 TNF-α, IL-6, 다른 사이토킨의 증가를 유도하기도 한다.

따라서, AZT 단독 치료로는 충분한 효과가 없다. 그 결과, AZT의 항-HIV 활성을 증가시키기 위해서, AZT 치료와 라이소자임 이량체 투여를 병용하는 방안이 제시되고 있는데, 여기서 상기 라이소자임 이량체는 AZT의 항-HIV 활성을 길항하는 인자인 TNF의 합성을 억제하는 역할을 한다.

Claims (9)

1. 자연 방어 기작을 강화시키는 약물을 제조하는데 사용되는 라이소자임 이량체를 포함하는 제약학적 조성물에 있어서, 라이소자임 이량체는 사람과 동물에서 종양 괴사 인자(TNF) 방출을 저해하고, TNF 수준을 감소시키고, 식작용을 증가시키고, 인터페론 방출을 증가시키고, 인터루킨-6 값을 강화시키는 작용 중 적어도 하나를 가지는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
2. 제1항에 있어서, 13.75pg/㎖ 이상으로 TNF 수준을 감소시키는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
3. 제1항에 있어서, 10⁶백혈구세포당 0.3 ㎍ 내지 1 mg 약량의 단일 또는 반복약량으로 라이소자임 이량체를 투여하기 위한 약물을 제조하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
4. 제1항에 있어서, 약물은 사람 또는 동물에서 면역계를 강화시키는 예방약인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
5. 제1항에 있어서, 약물은 항생제와 복합된 이량체 라이소자임으로 구성된 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
6. 제1항에 있어서, 약물은 항생제의 항균 활성을 최고 100% 까지 증가시키기 위해 항생제와 라이소자임 이량체가 복합된 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
7. 제1항에 있어서, 약물은 비-발열성 멸균 조성물에 라이소자임 이량체 0.01 내지 10mg/㎖로 구성되고, 이때 멸균 조성물은 적어도 하나의 생리학적으로 사용가능한 용매 또는 제약학적으로 승인된 보존제로 구성된 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
8. 제1항에 있어서, 체중 kg 당 0.02 mg 단일 약량 또는 반복약량으로 투여되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
9. 제1항에 있어서, 약물은 효과량의 라이소자임 이량체로 구성된 겔 또는 연고, 라이소자임 이량체 효과량이 흡수된 항균 드레싱 또는 탐폰중 한가지형으로 만들어지는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.