KR100224377B1 - 수용 중인 검출용 액체를 통하여 타겟-담지 고상물을 이동시키기 위한 장치 및 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 결합 시약 및 유리 표지 시약이 분리되도록 하기 위하여 사용된 고상물 (예를 들어, 비이드(16))이 어느 한 영역으로부터 다른 영역으로 이송되어, 구체적으로는 세척액을 통과하여 고상물로부터 유리 표지 시약을 세척 분리하는 PCR 증폭 및 검출과 같은 제한 반응을 수행하기 위한 장치(10, 30 ; 10A, 30A ; 30B) 및 방법에 관한 것이다. 분리 용기들은 구획 부재(14, 14A, 74)를 지니는데, 이들은 천공 또는 액화에 의하여 붕괴되어 고상물의 이송 통로를 형성한다. 이 통로는 장치 내에 봉쇄된 채로 남아 있게 된다.
Description
제 1 도는 본 발명 장치의 제 1 제한 영역을 도시한 분해 부분 정단면도.
제 2 도는 본 발명 장치의 제 1 제한 영역과 협동하는 제 2 제한 영역과, 본 발명의 공정 중에 타겟을 제한하는 수단을 도시한 분해 부분 정단면도.
제 3 도는 여러 제한 영역의 수용물에 통로를 제공하기 이전의 본 발명의 다른 실시 양태를 도시한 분해 부분 정단면도.
제 4 도는 제 3 도에 나타낸 제한 영역의 수용물에 통로를 개방한 후의 장치의 하부 절반 부분을 도시한 부분 정단면도.
제 5 도는 또 다른 실시 양태로서 제 3 도의 하부 절반 부분과 유사한 부분을 도시한 부분 정단면도.
제 6 도 및 제 7 도는 분석 감응도를 도시한 플롯 또는 그래프.
* 도면의 주요부분에 대한 부호의 설명
10, 10A : 제 1 제한 영역 30, 30A, 30B : 제 2 제한 영역
70, 70B : 중간 영역
12, 12A, 32, 32A, 32B, 72, 72B : 용기(chamber)
14, 14A, 34, 34A, 34B : 덮개 16 : 비이드(bead)
18, 26, 26A, 44, 44A, 96 : 나사 24 : 돌출 립(lip)
33, 33A, 33B : 저부 벽 34, 34A : 덮개
40, 40B : 천공침(prong) 42 : 슬리이브(sleeve)
74, 74B : 장벽 수단 90 : 스커트(skirt)
S : 시료 R : 시약
F : 힘 CF : 원심력
본 발명은 PCR(polymerase chain reaction) 증폭 및 검출과 같은 제한 반응을 제공하는데 유용한 장치 및 방법에 관한 것이다.
고체 입자가 고정되어 있고 액체 시료 및 시약이 그 고정된 고체 입자를 지나 연속적으로 통과하는 반응 용기를 사용하여 PCR 증폭 및 검출을 행하는 것은 공지되어 있다. 이와 같은 반응 용기는 예를 들어 유럽 특허 공개 제381,501호에 기재되어 있다. 이와 같은 용기는 증폭된 DNA가 용기 밖으로 누출되어 다른 시험 용기를 오염시키는 것을 제한하는 작용을 훌륭하게 수행하지만, 검출에 사용된 고정 고체 입자가 제거되지 않게 하면서 액체 용액을 이곳 저곳으로 조심스럽게 이동시켜야 하는 단점을 지니고 있다. 그 결과, 반응 용기는 세심하게 제작되므로 보다 저렴하고 단순한 구조를 사용할 수 없다. 즉, 액체 흐름 및 고정된 고체의 부착은 이러한 고체가 그의 판독 지점에서 벗어나지 않도록 유지되어야 한다.
마찬가지로, 고상물에 결합된 타겟(target)에 부착되어 있는 표지 시약(「결합시약」이라 칭함)을 타겟과 회합되어 있기는 하지만 부착되어 있지는 않은 표지 시약(「유리 시약」이라 칭함)으로부터 분리하는 면역 검정법이 공지되어 있다. 이 방법에서는 고상물을 시험 장치 내에 고정시키는 고정된 고상물 위 또는 그 주위로 세척액을 흘러 보내서 유리 시약을 세척 분리해낸다. 전형적으로는, 세척 단계 후에 결합 시약을 유리 시약으로부터 분리하기 위해서는 고체 필터와 같은 매체를 사용한다. 그의 예가 미합중국 특허 제4,921,677호에 개시되어 있는데, 이들은 그의 목적에 맞게 잘 작동한다. 그러나, 유리 액체를 통과시킬 때 유리 액체가 결합 시약을 담지하고 있는 고상물은 통과시키지 않는 여과 매체를 선택하는데 세심한 주의를 기울여야 한다.
따라서, PCR 증폭과 검출 모두에 있어서, 그리고 상기의 면역 검정법에 있어서 중핵적 기술은 고체 입자를 고착 또는 고정시키고 액체를 이동시키는 방법에 관한 것이었다.
또한, 선행 기술로는, 검출액 내로, 예를 들어 면역 검정법에 사용되는 타겟담지 고상 미립자를 주가하여 고체로부터 미결합 표지 시약을 비결합 분리물로서 세척 제거하는 방법이 있다. 이 방법의 예는 예를 들어 이배니가(Evanega)에게 허여된 미합중국 특허 제4,743,536호 등에서 찾아볼 수 있다. 그러나, 이와 같은 고상물을 검출액내로 주가하거나 유입시킬 때에는 반드시 고상물을 수용하고 있는 구획을 개방하여 유체가 유입되도록 하여야 한다. 이와 같은 개방은 PCR증폭에서 필요한 밀폐 요건이 상실되기 때문에 PCR 검출의 방법으로서는 전혀 받아들여질 수 없다. 고상물을 벌크상으로 유입하기 위해서는 각 구획 사이에 적절한 통로를 개방할 필요가 있기 때문에, 종래에는 단순히 벌크상 유입을 제공하는 것에 의해서는 PCR 반응 생성물의 제한 수용을 유지하는데 지장을 받아 왔다.
따라서, 본 발명 이전에는 시판중인 용기 및 통용 중인 방법보다 더 용이하게 공급 가능하고(하거나)더 저렴한 제한되어 있는 PCR의 증폭 및 검출, 또는 면역 검정에 적합한 검출 용기 및 검출 방법을 제공하는 것이 문제로 되어 왔다. 보다 구체적으로, 오염이 발생하지 않도록 증폭 영역을 대기 중으로 개방시키지 않으면서 제한 영역들 사이에, 즉 증폭 영역으로부터 검출 영역까지 벌크상 고상물을 유동시키는 장치 및 방법을 제공하는 것이 문제로 되어 왔다.
본 발명자들은 상기의 문제점들을 극복할 수 있는 장치 및 방법을 고안하였다.
보다 구체적으로 설명하면, 본 발명의 제 1 측면에 따라서 상기의 문제점은 a) 시료 타겟을 고상 미립자에 부착시키는 제 1 제한 영역을 한정하는 첫번째 수단 ; b) 고상물 중 일부로부터 미결합된 표지 시약을 세척 제거하기 위한 적어도 하나의 세척액을 수용하는 적어도 하나의 제 2 제한 영역을 한정하는 두번째 수단 ; c) 제 1 제한 영역과 제 2 제한 영역 사이에 적어도 하나의 통로를 제공하여 이들 제한 영역 사이에 액체의 교류를 허용하는 이송 수단 ; 및 d) 통로가 개방될 때 시료를 전체적으로 장치 내로 한정 봉쇄하는 수단으로 이루어진, 표지 시약 담지 시료 타겟과 고상물을 봉쇄된 상태로 반응시키기 위한 장치에 의하여 해결된다. 이 장치는 고상물이 장치내에서 이동상이고, 이송 수단이 타겟 시료를 전체적으로 장치내로 한정 봉쇄하면서 고상물이 영역들 사이로 이동하여 액상 표지 시약과 접촉하기에 충분한 지수 및 분포를 갖도록 제작되어 있음을 개선점으로 한다.
또한, 본 발명의 다른 측면에 따라서 상기의 문제점은 a) 검출 가능한 충분량의 타겟 복제물을 제공하는 단계 ; b) 검출 가능한 타겟을 일부의 고상 미립자와 상호 작용시키는 단계 ; 및 c) 타겟 및 고상물 상의 표지 시약을 검출하는 단계로 이루어지며,
상기 단계 a) 및 그후의 단계에서 단일 장치내로 한정 봉쇄된 고상 미립자와 표지 시약 담지 시료 타겟을 반응시키는 방법에 의하여 해결된다. 이 방법은 고상 미립자가 이동상인 점에서 개선된 것이고, 또한 이 방법은 고상 미립자와 타겟을 장치내로 한정시키면서 액상 시약을 담지하는 시료 타겟과 반응된 고상 미립자를 세척액에 주가하여 미결합된 표지 시약을 제거하는 단계를 더 포함한다.
따라서, 본 발명은 제한 반응 및 수용 장치에 있어서, 이동상인 것이 액체가 아니라 고상물이고 이 고상물이 고정된 액상물로 이동하기 때문에 검출 가능한 고상물이 판독 영역으로부터 이탈되는 것을 방지하는 데에 주의를 기울일 필요가 없다는 유리한 특징을 가지고 있다.
또한, 불순물 도입을 방지하는 밀폐된 봉쇄 환경 하에 봉유된 결합/유리 분리를 위한 세척액에 결합 시약 및 유리 시약 모두를 담지하는 고상물을 주가할 수 있다는 장점을 가지고 있다.
본 발명은 또한 고상 미립자를 고정시키고 이에 대해서 액체를 이동시키는 장치에 고유한 공정 상의 난점을 해소한 장치 및 방법을 제공하는 장점을 지니고 있다.
본 발명의 다른 장점들은 첨부된 도면을 참고로 하여 이하의 상세한 설명을 읽음으로써 명백해질 것이다.
이하에서, 특히 불순물 도입을 방지하기 위하여 PCR 증폭 및 검출을 봉쇄된 환경 하에서 실시하는 특정의 바람직한 실시 양태, 예를 들어 관상의 실시 양태와 관련하여 본 발명을 구체적으로 설명한다. 또한, 본 발명은 타겟 시료(예를 들어, 항체 또는 항원)이 검출될 수 있을 정도로 충분량 제공되고, 고상물이 표지 시약내로 이동할 수 있도록 이동상일 것이 요구되는 방식으로 타겟 시료가 고상 미립자 및 적어도 하나의 액상 표지 시약 모두와 상호 작용하는 한, 반응 양식이 PCR 증폭이거나 또는 면역 검정과 같은 특정의 다른 반응인 것에 관계 없이 적용될 수 있다. 또한, 본 발명은 제한 영역 또는 장치 전체의 형상에 관계 없이 적용될 수 있다.
본 명세서에서 말하는 「표지 시약을 담지하는 시료 타겟」으로는 표지 시약 그자체, 또는 계속하여 아비딘 담지 표지 시약과 반응하는 비오틴(biotin)에서 종결되는 복제 올리고뉴클레오티드 서열인 것이 바람직하다. 표지 시약 그 자체로 서열이 종결되는 경우, 이 표지 시약은 검출 수준에서 그의 형광 능력을 상실하지 않으면서 95℃ 이하의 반복된 온도 증가에 견딜 수 있는 형광성 염료인 것이 바람직하다. 이러한 염료의 예로는 플루오레세인류(fluoresceins) 또는 쿠마린류(coumarins)가 있다.
또한, 「표지 시약 담지 시료 타겟」은 표지 시약 그 자체, 또는 계속하여 아비딘 담지 표지 시약과 반응하는 비오틴을 담지하는 항체(또는 항원)과 복합된 항원(또는 항체)일 수 있다.
본 명세서에서 말하는 「표지 시약」이란 시료 타겟의 존재를 직접적으로 또는 간접적으로 밝혀낼 수 있는, 바람직하게는 용액 내 시약을 말한다. 표지 시약은 외부의 에너지에 의하여 이것을 자극함으로써 검출될 수 있는 경우, 예를 들어 빛에 노출될 때 형광을 발하는 형광 성분인 경우에는 직접적으로 시료 타겟의 존재를 판별할 수 있게 해 준다. 표지 시약은 장치 내에 검출제 시약이 더 존재할 것이 요구되는 경우, 예를 들어 예시적인 색상을 생성하는 기질이 장치 내에 더 존재할 것이 요구되는 효소를 포함하는 경우에는 간접적으로 시료 타겟의 존재를 판별할 수 있게 해 준다.
또한, 본 명세서에서 말하는 「타겟의 고상 미립자 및 적어도 하나의 액상 표지 시약과의 상호 작용」이란, 예를 들어 고상물 상의 항체와 연속적으로 반응하고 이어서 표지화된 항체와 반응하는 2개의 에피토프 부위를 지닌 항원과 같은 시료 타겟의 2개의 분리된 반응 부위에서 통상적으로 일어나는 바와 같은 연속적인 것 ; 또는 타겟 항원이 고상물 상의 항체에 대하여 경쟁적으로 가용성 표지화된 항원과 상호 작용할 때 일어나는 바와 같은 동시적인 것을 말한다.
특히 유용한 표지 시약은 퍼옥시다아제, 특히 호스-라디쉬(horse-radish) 퍼옥시다아제와 같은 스트렙-아비딘에 부착된 효소를 함유한다. 호스-라디쉬 퍼옥시다아제가 사용되는 경우, 미합중국 특허 제4,670,386호 및 동 제4,089,747호에 기재된 것과 같은 H2O2및 트리아릴이미다졸 염료가 유용한 기질이다.
본 명세서에서 말하는 「고상 미립자」란 타겟이 그에 용이하게 결합될 수 있는 고상물을 말하는데, 비교적 작은 치수의 것, 예를 들어 그의 최대 치수가 300㎛ 이하인 것이 바람직하다. 크기가 0.1 내지 100㎛인 폴리스티렌의 비이드가 매우 바람직하다.
본 발명의 특징을 종합적으로 설명하면, 상기에서 간략하에 기재한 장치의 각 특징 요소 a) 내지 b)는 그 자체가 이미 공지되어 있다. 즉, 이들은 상기한 유럽 특허 공개 제381,501호에 개략적으로 개시되어 있지만, 여기서는 고상 미립자가 고정되어 있고 이 고정된 고상물 위로 액상 시약이 유동한다.
따라서, 본 발명에 따라 제작된 장치는 제 1 도에서 볼 수 있는 바와 같이, PCR 증폭에 필요한 시약 (R) 및 시료 (S) 모두가 투입된 후에 장치를 밀봉할 수 있는 제거 가능한 밀봉 캡(14)가 있는 용기 (12)에 의하여 제공되는 제 1 제한 영역(10)을 포함한다. 용기(12)에는 「Y」로 나타낸 연결 그룹을 담지하는 비이드(16)이 사전 투입되어 있는데, 이 그룹은 용기(12)내에서 증폭되는 타겟 DNA에 어닐링(annealing)되도록 설계된 올리고뉴클레오티드 프로브(probe)인 것이 바람직하다. 시료 (S) 및 증폭에 필요한 시약 모두를 장치에 주가하고 캡(14)를 밀봉한다. 모든 종류의 밀봉 수단을 사용할 수 있지만, 바람직하게는 용기(12)의 정부(22)에 수나사가 위치하도록 수나사 및 암나사(18, 20)을 포함하는 것이 바람직하다.
용기(12)는 모든 액상물을 장치 내에 한정 수용되도록 하면서 용기(12)의 내용물이 장치의 나머지 영역(들) (30)내로 주가될 수 있도록 영역(30)에 견고하게 부착되도록 하는 제한 수단을 그의 외면에 갖추고 있다. 바람직하게는 제한 수단은 그 상부에 스크류 수나사(26)이 탑재되어 있는 돌출 립(24)를 포함한다.
또한, 시약(R)은 형광 표지가 부착된 타겟팅된 핵산 서열을 위한 프라이머(primer)를 포함하는 것이 바람직하다.
이어서, 공지된 온도 사이클링을 사용하여 PCR 증폭을 용기(12)내에서 일으켜서, 장치 및 방법의 다른 부분에서 용이하게 검출될 수 있는 DNA와 같은 타겟팅화 핵산 서열의 표지화 복제물을 충분량 제공한다. 증폭이 비이드에 대한 조숙 어닐링에 의하여 과도하게 방해받지 않게 하기 위하여, 잘 알려진 바에 따라 비이드 상의 프로브를 낮은 Tm, 즉 증폭 프라이머의 Tm보다 더 낮은 융점을 지닌 것을 선택한다.
그 결과, 제 2 도에 「X」로 나타낸 바와 같이 특정 비이드(16)은 그에 결합된 타겟팅화 핵산 서열을 갖게 된다.
이 지점에서 용기(12)의 비이드(16)은 형광 매질을 담지하는 느슨하게 부착된 비어닐링화 프라이머를 그 위에 담지한다. 이들 비이드중 일부는 이와 같은 느슨하게 부착된 비어닐링화 프라이머만을 지닐 수 있다.
제 2 도를 참고로 하면, 장치의 다른 부분은 지점(36)에서 천공된 덮개(34)로 커버링된 저벽(33)을 지닌 용기(32)를 포함하는 제 2 제한 영역(30)으로 이루어져 있다. 덮개(34)의 중앙 부위(38)은 접촉되는 덮개(14)를 통하여 파열될 수 있는 천공침(40)을 지니고 있다. 덮개(34)위에는 용기(12)의 나사(26)과 맞물리는 암나사(44)가 제공된 슬리이브(42)가 올라와 있다. 나사(44 및 26)이 맞물려질 때, 덮개(14)는 덮개의 점선(14' 위치)으로 나타낸 바와 같이 침(40)과 접촉하지 않도록 공간적으로 이격되어 있다. 그런, 용기(12)가 스크류 회전에 의하여 슬리이브(42)중으로 진행됨에 따라, 침(40)은 고상물(16) 및 그 위의 시약에 통로를 제공하기에 충분할 정도로 덮개(14)에 침입하게 된다. 용기(32)의 액상 내용물은 적어도 하나의 세척액이다. 세척액은 비이드가 저벽(33)을 향한 힘 F에 의하여 낙하함에 따라 비이드로부터 느슨하게 부착된 어닐링되지 않은 표지화 프라이머를 세척 제거하는 효과를 지니고 있다. 이와 같이 세척 제거된 프라이머는 세척액의 표면 S' 근처에 머무른다. 힘 F는 중력 또는 원심력의 형태로 제공될 수 있다.
이 때 저벽(33)에 도달하는 것은 비이드에 어닐링됨에 따른 증폭 공정으로 인하여 표지화 DNA의 일부인 표지 시약과 비이드 뿐이다. 표지 시약은 그의 형광성으로 인하여 적절한 파장의 빛을 조사함으로써 용기(32)의 바닥 영역인 화살표(50) 부근에서 검출될 수 있다.
따라서, 이송 메카니즘이 액상물이 아닌 고상물을 제 1 영역(10)으로부터 제 2 영역(30)으로까지 이송시키는 것일 때에도 증폭, 세척 및 검출 모두가 단일의 밀봉된 봉쇄 장치 내에서 일어나게 된다.
상기한 바와 같이, 표지 시약은 형광 성분일 필요는 없으나, 그 대신 검출될 수 있는 색상을 발생하는 기질과 협동하는 효소를 함유할 수 있다. 이 경우에, 제 3 도 및 제 4 도에 나타낸 바와 같은 3개의 용기로 된 장치가 바람직하다. 전술한 바와 유사한 부분들은 동일한 참조 부호를 지니는데, 구별을 위하여 접미사 A를 덧붙였다.
즉, 이 장치는 앞에서와 마찬가지로 덮개(14A)의 천공을 가능하게 하는 대응 나사(26A 및 44A)에 의하여 스크류식으로 부착된 2개의 협동하는 제한 영역(10A 및 30A)를 포함하고 있다. 덮개(14A)는 전술한 실시 양태에서와 같이 스크류식으로 부착될 수 있다. 그러나, 용기(32A)의 벽면을 신장시키고 장벽 수단(74)위에 추가의 제한 영역(70)을 삽입시켜서 장벽 수단(74)와 덮개(34A) 사이에 위치한 세번째 용기(72)를 설치한다.
이러한 구성에 있어서, 용기(72)내의 액체는 용기(12A)중에서 생성된 타겟팅화 핵산 서열과 반응하도록 화학적으로 개질된 효소를 함유한다. 면역 검정이 포함되는 경우, 효소의 화학적 개질은 효소가 타겟팅화 항원에 복합된 항체와 반응할 수 있게 한다. 타겟팅화 핵산 서열이 비오틴으로 종결되는 경우, 효소와 화학적으로 반응하는 아비딘을 사용하는 것이 바람직하다. 영역(70)내의 액체로서 매우 바람직한 예는 스트렙-아비딘 호스라디쉬 퍼옥시다아제이다.
효소가 퍼옥시다아제인 경우, H2O2를 영역(30A) 내의 용기(72)중에 더 포함시킨다.
다양한 장벽 수단(74)를 사용할 수 있다. 제 3 도 및 제 4 도의 실시 양태에 있어서, 장벽 수단(74)는 온도 변화 또는 원심력의 영향하에서 액화될 수 있는 것이 바람직하다. 온도 변화에 의하여 액화될 수 있는 장벽 수단의 예로는 효소의 실활 온도보다 더 낮은 온도, 예를 들어 60℃미만의 온도로 가열할 때 액화되는 왁스를 들 수 있다. 파라핀이 바람직한 예이다.
원심력 하에서 액화되는 장벽 수단의 예로는 높은 원심력 CF, 예를 들어 10,000G's이상의 원심력에서 비이드를 통과시키는 틱소트로피성 겔을 들 수 있다. 이와 같은 겔의 바람직한 예로는 사스테트 코포레이션(Sarstedt Corp.)에 의하여 상품명 「겔 모노베트(Gel Monovette)」로 시판되며 통상적으로 실리카와 폴리에스테르로 이루어진 튜브에 포장된 겔이 있다.
이 실시 양태에 있어서, 제한 영역(30A)의 액상 내용물은 용기(72)의 효소용 기질, 예를 들어 수용액 증의 류코 염료를 함유한다. 따라서, 액상 함유물은 2가지의 작용을 제공한다 : 즉, 비이드가 제 4 도의 장벽 수단(74)를 통과할 때 비이드를 세척하여 비이드에 대한 아비딘-비오틴 이송에 의하여 반응하지 않은 느슨하게 부착된 효소를 제거하는 작용과, 효소에 개질을 제공하는 작용을 한다.
저벽(33) 상에 모아진 비이드는 그의 색상 변화에 의하여 검출된다. 세척분리된 느슨하게 부착된 효소로 인하여 용기(30A)의 정부(80)에서 나타나는 모든 색상 변화는 벽면(33A)에서의 비이드의 색상 변화와는 공간적으로 용이하게 구별될 수 있다.
장벽 수단(74)는 반드시 액화될 수 있는 것이거나, 실제로 강성 구조이외의 것일 필요는 없다. 즉, 제 5 도에 나타낸 바와 같이, 용기(32A)를 포함하여 그 아래의 모든 것으로부터 용기(72)를 떼어낼 수 있는 벽구조일 수 있다. 제 5 도에서는 전술한 바와 유사한 부분들은 동일한 참조 부호를 지니는데, 구별을 위하여 접미사B를 덧붙였다.
제 5 도에 나타낸 바와 같이, 이 장치는 용기로부터의 접근을 밀폐 차단하기 위하여 장벽 수단(74B)가 용기(72B)의 벽면의 신장에 의하여 형성된 박벽을 포함하는 것을 제외하고는 중앙 영역(70B), 그의 용기(72B) 및 제 1 제한 영역(도시되지 않음)에 관한한 전술한 장치와 동일하다. 또한, 스커트(90)이 장벽 수단(74B) 하부로 신장되어 지점(92)에서 내부적으로 나사 형태를 이룬다. 제 3 제한 영역(30B)는 덮개(34A)와 실질적으로 동일하게 구성된 천공화 덮개(34B) 및 나사(92)와 맞물리는 외부 나사(96)이 영역(30B)의 정부(94)에 배치되어 있는 것을 제외하고는 앞에서 설명한 바와 마찬가지로 저벽(33B)를 지닌 용기(32B)를 포함하고 있다. 따라서, 천공침(40B)는 단순히 용기(32B)를 스커트(90)내로 스크류식으로 전진시킴으로써 장벽(74B) 를 파열 관통하는 작용을 한다. 어느 위치에서든 스커트(90)과 나사(96)의 나사상 맞물림은 장치 밖으로 누출이 일어나지 않도록 한다. 천공침(40B)가 장벽(74B)를 파열시킬 때, 용기(72B)중의 고상물(비이드)들은 앞에서와 마찬가지로 용기(32B)중으로 유입되어, 미결합된 표지 시약을 세척 분리하고 결합 표지 시약과 반응하여 벽면(33B)에 근접한 저면 부위에서 유색 비이드를 형성하게 된다.
[실시예]
본 발명을 이하의 비제한적인 실시예를 들어 보다 더 상세히 설명한다.
[실시예 1]
장벽 수단 및 세척 단계가 앞에서 설명한 바와 같이 작용하는 것을 보이기 위하여, 합성 DNA 시료를 200 피코몰(pmole)로부터 0 피코몰까지의 농도로 조제하였다. DNA를 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄-에틸렌디아민테트라아세트산 완충액에 현탁시킨 다음, 다량의 염을 함유한 완충액에 1 : 30으로 희석시켰다.
DNA 프로브를 폴리[스티렌-코-3-(p-비닐벤질티오)프로피온산)(중량비 95 : 5)(대략 1 미크론)의 비이드에 공유 결합적으로 부착시켰다. 비이드를 0.24% 고상물 및 6셀라이드(CeliteTM) 규조토의 농도로 스트렙트아비딘-HRP(SA-HRP)용액에 현탁시켰다.
4, 5-비스(4-디메틸아미노페닐)-2-(4-하이드록시-3, 5-디메톡시페닐)이미다졸류코 염료액 중의 0.5% 아가로스/4% 염화 나트륨 100㎕의 저층을 함유하는 미세원심분리 튜브를 준비하였다. 제 2 층에는 물중의 0.5% 아가로스/2% 염화 나트륨 500㎕를 함유시켰다.
DNA 시료 200㎕를 5분 동안 95℃에서 변성시켰다. 이 시료에 100㎕의 비이드/셀라이트/SA-HRP를 가하였다. 시료를 5초 동안 와동(渦動)시킨 다음, 100㎕의 시료를 상기 준비한 미세원심분리 튜브에 투입하여 제 3 도에 나타낸 실시 양태에 따라 처리하였다. (덮개 (14 또는 14A)를 사용하지 않았음.)
튜브를 14,000rpm에서 5분 동안 원심분리한 다음, 펠렛의 색상을 관찰하였다.
제 6 도의 그래프로 알 수 있듯이, 이 방법은 최소 0.05나노몰/ℓ의 시료를 검출한다.
[실시예 2]
비이드 현탁액을 1.2% 고상물 농도로 하고, 규조토를 듀폰 디 네모아(dupont de Nemours)에서 시판하는 비이온성 플루오르화 계면활성제인 1% 조닐(Zonyl) FSN으로 대체한 것 외에는 실시예 1과 동일한 절차를 반복 실시하였다. 튜브로서 사스테트에서 시판하는 「마이크로베트(microvette) SCB 1000」겔 튜브를 사용하고, 아가로스를 류코 염료액으로부터 제거하였다. 유일한 장벽 수단(제 3 도의 74)는 사스테트 겔이었다. NaCl의 농도를 15%로 증가시켰다. 공정은 다음과 같이 수행하였다 : 위와 같이 준비된 튜브를 14,000rpm에서 1분 동안 원심분리하고, 미세 여과 탈이온 증류수로 세정하여 류코 염료액을 장벽 수단 아래에 위치하게 하였다. 5% 셀라이트를 함유한 스트렙트아비딘-HRP(SA-HRP) 용액 50㎕를 겔위에 적층시켰다.
DNA 시료 307㎕를 95℃에서 5분 동안 변성시켰다. 이 시료에 34㎕의 비이드/조닐 FSN을 가하였다. 시료를 42℃에서 5분 동안 배양하였다. 이어서, 100㎕의 시료를 상기 제조한 튜브에 가하였다.
튜브를 14,000rpm에서 5분동안 원심분리한 다음, 펠렛의 색상을 관찰하였다.
제 7 도의 그래프로부터 알 수 있듯이, 이 방법은 최소 0.2 나노몰/ℓ의 시료를 검출하며, 시료가 존재하지 않을 때는 색상이 관찰되지 않는다.
본 명세서에 기재된 본 발명은 본 명세서에서 특별히 기재하지 않은 특정한 구성 요소의 부재 하에서도 실시될 수 있다.
Claims (16)
- a) 시료 타겟을 고상 미립자에 부착시키는 제 1 제한 영역을 한정하는 첫번째 수단 ; b) 고상물 중 일부로부터 미결합된 표지 시약을 세척 제거하기 위한 적어도 하나의 세척액을 수용하는 적어도 하나의 제 2 제한 영역을 한정하는 두번째 수단 ; c) 제 1 제한 영역과 제 2 제한 영역 사이에 적어도 하나의 통로를 제공하여 이들 제한 영역 사이에 액체의 교류를 허용하는 이송 수단 ; 및 d) 통로가 개방될 때 타겟 시료를 전체적으로 장치 내로 한정 봉쇄하는 한정수단으로 이루어지며, 고상물 중 일부는 장치내에서 이동상이고, 상기 이송 수단이 타겟 시료를 전체적으로 장치내로 한정 봉쇄하면서 일부 고상물이 영역들 사이로 이동하여 액상 표지 시약 및 세척액과 접촉하기에 충분한 치수 및 분포를 갖도록 제작되어 있는 것을 특징으로 하는, 고상물과 표지 시약 담지 시료 타겟을 봉쇄된 상태로 반응시키기 위한 장치.
- 제 1 항에 있어서, 제 1 제한 영역은 제 1 의 용기 및 이 용기를 완전 밀봉할 수 있는 임시 덮개로 이루어져 있고, 제 2 제한 영역은 제 2 용기 및 그를 위한 천공화 덮개로 이루어져 있으며, 이송 수단이 임시 덮개와의 접촉시에 이를 관통하는 천공 수단을 포함하고 있고, 한정 수단 d)는 2개의 공간적으로 이격된 위치에서 상기 2개의 용기를 함께 분리 가능하게 보유하기 위한 나사상 수단을 포함하는데, 그 하나의 위치는 천공 수단이 임시 덮개와 접촉하지 않도록 하기에 효과적이고 다른 하나의 위치는 임시 덮개가 천공 수단에 의하여 관통되도록 하기에 효과적임을 특징으로 하는 장치.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 제 1 및 제 2 한정 수단 사이에 위치한 제 3 제한 영역을 한정하고 액체를 수용하는 제 3 한정 수단을 추가로 포함하는 장치.
- 제 3 항에 있어서, 제 3 영역 중의 액체가 시료 타겟 상의 어떤 성분과 반응하여 결합됨으로써 세척액에 의해서 고상물로부터 제거되지 않는 복합체를 생성할 수 있는 액상 표지 시약을 함유하는 것을 특징으로 하는 장치.
- 제 3 항에 있어서, 제 2 영역 중의 액체가 타겟의 존재를 직접적으로 판별할 수 있게 하는 표지 시약과 반응할 수 있는 검출제 시약을 함유하고, 제 3 수단은 제 2 및 제 3 제한 영역을 액체의 교류로부터 임시로 분리할 수 있는 분리 수단을 포함하며, 이 분리 수단은 변성되어 통로를 형성하고 그를 통하여 제 2 및 제 3 제한 영역 사이에 고상 비이드의 흐름을 제공하고, 한정 수단 d)는 통로가 분리 수단 내에 형성될 때 타겟 시료를 장치 내에 수용하기에 효과적인 것을 특징으로 하는 장치.
- 제 3 항에 있어서, 세척액이 제 2 영역 내에 위치하는 것을 특징으로 하는 장치.
- 제 6 항에 있어서, 세척액 및 검출제 시약이 단일의 용액으로 이루어짐을 특징으로 하는장치.
- 제 3 항에 있어서, 제 3 한정 수단이 관통될 때까지 모든 물질을 제 3 영역 중으로 한정하기에 유효한 천공성 벽면을 포함하고, 제 2 한정 수단은 천공화 덮개가 있는 용기 및 상기 천공성 벽면을 관통하기 위한 수단을 포함하며, 2개의 공간적으로 이격된 위치에서 제 2 및 제 3 용기를 함께 분리 가능하게 보유하기 위한 나사상 수단을 추가로 포함하고, 그 하나의 위치는 천공 수단을 벽면과 접촉하지 않도록 하기에 효과적이고 다른 하나의 위치는 벽면을 관통하기에 효과적인 것을 특징으로 하는 장치.
- 제 3 항에 있어서, 제 3 한정 수단이 온도 변화 또는 원심력의 작용 하에서 액화되는 재료의 장벽 층으로 이루어진 것을 특징으로 하는 장치.
- 제 3 항에 있어서, 제 3 의 수단이 가열될 때 액화되는 왁스로 이루어져 있고, 표지 시약이 적어도 제 3 수단의 액화 온도까지 열적으로 안정함을 특징으로 하는 장치.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 표지 시약이 효소를 함유함을 특징으로 하는 장치.
- 제 11 항에 있어서, 효소가 퍼옥시다아제임을 특징으로 하는 장치.
- 제 3 항에 있어서, 제 3 의 수단이 적어도 10,000G's의 원심력이 가해질 때 고상 미립자를 통과시키기에 유효한 틱소트로피성 겔로 이루어진 것을 특징으로 하는 장치.
- a) 검출 가능한 충분량의 타겟 복제물을 제공하는 단계 ; b) 검출 가능한 타겟을 일부의 고상 미립자와 상호 작용시키는 단계 ; 및 c) 타겟 및 고상물 상의 표지 시약을 검출하는 단계로 이루어지고, 상기 단계 a) 및 그후의 단계를 단일 장치내로 한정하여 수행하며, 고상 미립자가 이동상이고, 또한 고상 미립자와 타겟을 장치내로 한정시키면서 표지 시약을 담지하는 시료 타겟과 반응된 고상 미립자를 세척액에 주가하여 미결합된 표지 시약을 제거하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 고상 미립자와 표지 시약 담지 시료 타겟을 봉쇄된 상태로 반응 및 검출하는 방법.
- 제 14 항에 있어서, a)중에 타겟과 반응한 고상물을 분리 수단에 의하여 액상의 표지 시약으로부터 임시로 분리한 다음, 타겟과 반응한 고상물을 분리 수단내로 침투시켜 장치내로 한정된 상태에서 표지 시약내로 고상물이 유동하도록 하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제 15 항에 있어서, 반응된 고상물이 분리 수단내로 침투한 후에 타겟의 존재를 직접적으로 판별하도록 하기에 효과적인 검출제 시약과 표지 시약을 반응시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
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