JPWO2021007429A5 - - Google Patents

Claims (16)

1. Ｎ－，２－Ｏ，３－Ｏ，６－Ｏ硫酸化ヘパラン硫酸（Ｎ，２，３，６－ＨＳ）生成物を酵素的に合成する方法であって、
   （ａ）Ｎ－，２－Ｏ硫酸化ヘパラン硫酸（Ｎ，２－ＨＳ）を有するヘパラン硫酸を有する出発多糖反応混合物を提供する工程；
   （ｂ）前記出発多糖反応混合物を、グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素及び第１のスルホ基供与体を有する第１の反応混合物と組み合わせて、Ｎ－，２－Ｏ，６－Ｏ－硫酸化ヘパラン硫酸（Ｎ，２，６－ＨＳ）生成物を有する第１の生成物混合物を形成する工程；
   （ｃ）前記第１の生成物混合物を、グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素及び第２のスルホ基供与体を有する第２の反応混合物と組み合わせて、Ｎ，２，３，６－ＨＳ生成物を有する第２の生成物混合物を形成する工程；
   を有し、
   前記工程（ｂ）及び（ｃ）の各々におけるスルホトランスフェラーゼ酵素は、天然のスルホトランスフェラーゼ酵素及び改変型スルホトランスフェラーゼ酵素からなる群から選ばれ、
   前記天然のスルホトランスフェラーゼ酵素は、スルホ基供与体としての３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸と共にスルホトランスフェラーゼ活性を有し、天然のスルホトランスフェラーゼ酵素が前記工程（ｂ）又は（ｃ）のいずれかで選ばれるとき、前記スルホ基供与体が３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸であり、
   前記改変型スルホトランスフェラーゼ酵素は、スルホ基供与体としてのアリール硫酸化合物及びスルホ基受容体としてのヘパラン硫酸と共にスルホトランスフェラーゼ活性を有し、改変型スルホトランスフェラーゼ酵素が前記工程（ｂ）又は（ｃ）のいずれかで選ばれるとき、前記スルホ基供与体がアリール硫酸化合物であり、
   前記工程（ｂ）又は（ｃ）で選ばれるスルホトランスフェラーゼ酵素の少なくとも１つは改変型スルホトランスフェラーゼ酵素である、上記方法。
2. 前記グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素が改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素であり、前記第１のスルホ基供与体がｐ－ニトロフェニル硫酸及び４－ニトロカテコール硫酸からなる群から選択されるアリール硫酸化合物である請求項１に記載の方法。
3. 前記改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素が、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５９、配列番号６０、及び配列番号６１からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有する請求項２に記載の方法。
4. 前記グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素が改変型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素であり、前記第２のスルホ基供与体がｐ－ニトロフェニル硫酸及び４－ニトロカテコール硫酸からなる群から選択されるアリール硫酸化合物である請求項１に記載の方法。
5. 前記改変型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素が、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５７、及び配列番号５８からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有する請求項４に記載の方法。
6. 前記出発多糖反応混合物を提供する前記工程が
   （ｉ）Ｎ－アセチル化グルコサミン残基及びグルクロン酸残基からなる二糖単位を有するヘパロサン系多糖を提供する工程；
   （ｉｉ）少なくとも１つのＮ－アセチルグルコサミン残基をＮ－脱アセチル化するのに十分な時間、前記ヘパロサン系多糖を、塩基を有するＮ－脱アセチル化反応混合物と組み合わせて各Ｎ－脱アセチル化がＮ－脱アセチル化グルコサミン残基を形成する工程；
   （ｉｉｉ）Ｎ－硫酸化グルコサミン残基を形成するのに十分な時間、Ｎ－硫酸化剤を少なくとも１つのＮ－脱アセチル化グルコサミン残基と反応させ工程であって、
   前記Ｎ－硫酸化剤が三酸化硫黄－トリメチルアミン付加物、及びＮ－硫酸化反応混合物からなる群から選ばれ、
   前記Ｎ－硫酸化反応混合物はグルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素及び第３のスルホ基供与体を有し、該グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素は天然のスルホトランスフェラーゼ酵素及び改変型スルホトランスフェラーゼ酵素からなる群から選ばれ、
   前記天然のグルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素が、スルホ基供与体としての３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸及びスルホ基受容体としてのヘパロサン系多糖と共にスルホトランスフェラーゼ活性を有し、天然のグルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素が選ばれるとき、前記スルホ基供与体が３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸であり、
   前記改変型グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素が、スルホ基供与体としてのアリール硫酸化合物及びスルホ基受容体としてのヘパロサン系多糖と共にスルホトランスフェラーゼ活性を有し、改変型グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素が選ばれるとき、前記スルホ基供与体がアリール硫酸化合物である工程；
   （ｉｖ）少なくとも１つのグルクロン酸残基をイズロン酸残基に変換させるのに十分な時間、前記ヘパロサン系多糖をヘキスロニルＣ _５ －エピメラーゼと反応させる工程；
   （ｖ）２－Ｏ硫酸化イズロン酸残基を形成するのに十分な時間、ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素及び第４のスルホ基供与体をイズロン酸残基の少なくとも１つと反応させる工程であって、
   前記ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素が天然のスルホトランスフェラーゼ酵素及び改変型スルホトランスフェラーゼ酵素からなる群から選ばれ、
   天然のヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素が、スルホ基供与体としての３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸及びスルホ基受容体としてのヘパロサン系多糖と共にスルホトランスフェラーゼ活性を有し、天然のヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素が選ばれるとき、前記スルホ基供与体が３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸であり、
   改変型ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素が、スルホ基供与体としてのアリール硫酸化合物及びスルホ基受容体としてのヘパロサン系多糖と共にスルホトランスフェラーゼ活性を有し、改変型ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素が選ばれるとき、前記スルホ基供与体がアリール硫酸化合物である工程；
   をさらに有し、
   前記Ｎ，２－ＨＳが２－Ｏ硫酸化イズロン酸残基及びＮ－硫酸化グルコサミン残基からなる少なくとも１つの二糖単位を有する請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
7. Ｎ－硫酸化剤がＮ－硫酸化反応混合物であり、
   前記グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素が改変型グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素であり、
   第３のスルホ基供与体がｐ－ニトロフェニル硫酸及び４－ニトロカテコール硫酸からなる群から選ばれるアリール硫酸化合物である請求項６に記載の方法。
8. 前記改変型グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素が配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、及び配列番号４０からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有する請求項７に記載の方法。
9. 前記ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素が改変型ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素であり、
   第４のスルホ基供与体がｐ－ニトロフェニル硫酸及び４－ニトロカテコール硫酸からなる群から選ばれるアリール硫酸化合物である請求項６に記載の方法。
10. 前記改変型ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素が配列番号１４、配列番号１６、配列番号４１、及び配列番号４２からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有する請求項９に記載の方法。
11. 前記工程（ｉ）～（ｖ）がその順序で行われる請求項６に記載の方法。
12. 前記Ｎ，２，３，６－ＨＳ生成物は、重量平均分子量が少なくとも１，０００Ｄａである多糖類の多分散混合物である請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記Ｎ，２，３，６－ＨＳ生成物が抗凝固活性を有し、下記式Ｉ（式中、Ｘがスルホ基又はアセテート基のいずれかであり、Ｙがスルホ基又はヒドロキシル基のいずれかである）による構造を有する請求項１２に記載の方法。
    

    
14. 前記Ｎ，２，３，６－ＨＳ生成物をさらに分画化し低分子量ヘパラン硫酸（ＬＭＷ－ＨＳ）生成物を形成する請求項１～５のいずれか一項に記載の方法であって、
    該方法が、
    （ｄ）１つ以上の解重合剤を提供する工程；及び
    （ｅ）前記Ｎ，２，３，６－ＨＳ生成物内の多糖類の少なくとも一部を解重合するのに十分な時間、前記Ｎ，２，３，６－ＨＳ生成物を前記１つ以上の解重合剤で処理し、それによって前記ＬＭＷ－ＨＳ生成物を形成する工程；
    をさらに有し、
    前記１つ以上の解重合剤がβ脱離剤、脱アミノ化剤、及び酸化剤からなる群から選ばれ、
    前記β脱離剤は、少なくとも１つの炭素－酸素リアーゼ酵素を有する炭素－酸素リアーゼ反応混合物、及び塩基からなる群から選ばれ、該塩基は、水酸化ナトリウム、第四級水酸化アンモニウム及びホスファゼン塩基からなる群から選ばれ、
    前記脱アミノ化剤は、硝酸イソアミル及び亜硝酸からなる群から選ばれ、
    前記酸化剤は、過酸化物又は超酸化物からなる群から選ばれる、上記方法。
15. 前記ＬＭＷ－ＨＳ生成物が少なくとも約２，０００Ｄａから約１２，０００Ｄａまでの範囲内の重量平均分子量を有する請求項１４に記載の方法。
16. 前記ＬＭＷ－ＨＳ生成物が抗凝固活性を有する請求項１５に記載の方法。