CN108220365A - 一种提高肝素抗凝血活性的方法 - Google Patents

一种提高肝素抗凝血活性的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108220365A
CN108220365A CN201810039595.XA CN201810039595A CN108220365A CN 108220365 A CN108220365 A CN 108220365A CN 201810039595 A CN201810039595 A CN 201810039595A CN 108220365 A CN108220365 A CN 108220365A
Authority
CN
China
Prior art keywords
heparin
activity
improving
paps
sulfate donor
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201810039595.XA
Other languages
English (en)
Inventor
陈荫
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhejiang Ocean University ZJOU
Original Assignee
Zhejiang Ocean University ZJOU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang Ocean University ZJOU filed Critical Zhejiang Ocean University ZJOU
Priority to CN201810039595.XA priority Critical patent/CN108220365A/zh
Publication of CN108220365A publication Critical patent/CN108220365A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

一种提高肝素抗凝血活性的方法，该方法是以现有肝素为底物,采用PAPS(3’‑磷酸腺苷‑5’‑磷酸硫酸)为硫酸基供体,以肝素生物合成酶3‑O‑硫酸基转移酶（3‑OST）对其进行修饰,得到高抗凝血活性的肝素；所述硫酸基供体的PAPS由微生物发酵产生，或使用极为廉价的PNPS(对硝基苯酚磺酸钾盐)作为酶修饰反应的硫酸基供体；本发明通过对肝素进行选择性修饰,增加3位硫酸化修饰，提高抗凝血活性中心的数量,从而大幅度提高其抗血栓活性。

Description

一种提高肝素抗凝血活性的方法
技术领域
本发明涉及的是一种提高肝素抗凝血活性的方法，属于生化技术领域。
背景技术
作为临床上广泛使用的抗凝血药物，肝素从发现至今已经100年了。但是肝素的结构和其在生物体中的功能仍未被完全理解。肝素和相关的糖胺聚糖硫酸乙酰肝素是一种线性的多糖，由糖醛酸和氨基糖通过1,,4-糖苷键交替相连而成。糖醛酸主要有β-D-葡萄糖醛酸(GlcUA),还含有少量的α-L-艾杜糖醛酸(IdoUA)，氨基糖则由α-D-氨基葡萄糖胺(GlcN)组成。糖链上还存在着不同的取代基团，糖醛酸残基可以被2-O-硫酸基取代，而氨基葡萄糖的残基可以产生乙酰氨基，N-硫代，3-O-硫代和/或6-O-硫代基团。正是这些取代基团的随机性和多样性造就了肝素复杂的结构和丰富的生物活性。
肝素抗凝活性取决于它与丝氨酸蛋白酶抑制剂、抗凝血酶III(AT)的相互作用。在与肝素结合的过程中，AT发生了一种构象变化，增强了其不可逆转的抑制凝血酶的能力，包括凝血酶和因子Xa。肝素-AT相互识别是研究较为透彻的多糖和蛋白相互作用的实例。肝素和AT的识别和依赖于肝素中特定的肝素五糖结构区域。而这特定的肝素五糖在结构上的主要特征是在五糖中间的氨基葡萄糖残基存在3-O硫酸基修饰。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，而提供一种对肝素进行选择性修饰,增加3位硫酸化修饰，提高抗凝血活性中心的数量,从而大幅度提高其抗血栓活性的提高肝素抗凝血活性的方法。
本发明的目的是通过如下技术方案来完成的，一种提高肝素抗凝血活性的方法，该方法是以现有肝素为底物,采用PAPS(3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸)为硫酸基供体,以肝素生物合成酶3-O-硫酸基转移酶（3-OST）对其进行修饰,得到高抗凝血活性的肝素。
作为优选：所述硫酸基供体的PAPS由微生物发酵产生，或使用极为廉价的PNPS(对硝基苯酚磺酸钾盐)作为酶修饰反应的硫酸基供体。
作为进一步优选：所述的肝素选用1g猪小肠肝素、2MPAPS、0.1g 3-OST溶于1L MES缓冲液50mM中，35—40℃反应10—15h，95—100℃水浴加热10—20min，离心取上清，上清浓缩至90—110mL，3500kDa透析袋对蒸馏水透析1.5-2.5天，冷冻干燥后即得反应后产物。
本发明采用具有较高酶活的3-O-硫酸基转移酶,结合PAPS硫酸基供体,对肝素进行选择性修饰,增加3位硫酸化修饰，提高抗凝血活性中心的数量,从而大幅度提高其抗血栓活性。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明作详细的介绍：本发明所述的一种提高肝素抗凝血活性的方法，该方法是以现有肝素为底物,采用PAPS(3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸)为硫酸基供体,以肝素生物合成酶3-O-硫酸基转移酶（3-OST）对其进行修饰,得到高抗凝血活性的肝素。
本发明所述硫酸基供体的PAPS由微生物发酵产生，或使用极为廉价的PNPS(对硝基苯酚磺酸钾盐)作为酶修饰反应的硫酸基供体。
作为一种优选的实施例，本发明所述的肝素选用1g猪小肠肝素、2MPAPS、0.1g 3-OST溶于1L MES缓冲液50mM中，35—40℃反应10—15h，95—100℃水浴加热10—20min，离心取上清，上清浓缩至90—110mL，3500kDa透析袋对蒸馏水透析1.5-2.5天，冷冻干燥后即得反应后产物。
本发明的其它实施例可以在上述公开的基础上，进行数值的简单替换以及同步放大获得无数个具体的实施例，且本领域技术人员在本发明公开的基础上，能够方便第实施本发明。
本发明对肝素结构进行改造，人为增加肝素抗凝血活性，提高其效价强度；具体是通过异源表达的3-O-S磺酰基转移酶和磺酰基供体作用于肝素，提高肝素3位硫酸化修饰，进一步提高其生物活性。
本发明具体的含量和活性检测是：由于3位硫酸化，使肝素裂解酶不能识别3位硫酸化氨基糖相邻的非还原端的酶解位点，而从下一个位点水解，从而得到还原端是3位硫酸化氨基糖，非还原端是不饱和糖醛酸的肝素四糖。不同结构的肝素五糖，会产生不同的3-O-S肝素四糖， 所以通过采用肝素裂解酶2对得到肝素进行完全酶解后采用HPLC-MS的方法对3-O-S肝素四糖的分析可以直观的获得肝素3-O-S肝素四糖的结构信息，并进一步得到与肝素活性密切相关的3-O-S肝素五糖的含量。另外对3-O-S肝素5糖的结构和含量的分析还有助于肝素生物活性的构效关系研究。
抗凝血活性检测采用标准试剂盒，以肝素为对照，检测对凝血因子的作用。
通过对肝素酶解后产物分析 产物中3-位硫酸化位点中最普遍的类型由0.48%提高到1.79%， 肝素的抗凝血活性至少提高到原来的1.5倍。

Claims (3)

1.一种提高肝素抗凝血活性的方法，其特征在于该方法是以现有肝素为底物,采用PAPS(3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸)为硫酸基供体,以肝素生物合成酶3-O-硫酸基转移酶（3-OST）对其进行修饰,得到高抗凝血活性的肝素。
2.根据权利要求1所述的提高肝素抗凝血活性的方法，其特征在于所述硫酸基供体的PAPS由微生物发酵产生，或使用极为廉价的PNPS(对硝基苯酚磺酸钾盐)作为酶修饰反应的硫酸基供体。
3.根据权利要求1或2所述的提高肝素抗凝血活性的方法，其特征在于所述的肝素选用1g猪小肠肝素、2MPAPS、0.1g 3-OST溶于1L MES缓冲液50mM中，35—40℃反应10—15h，95—100℃水浴加热10—20min，离心取上清，上清浓缩至90—110mL，3500kDa透析袋对蒸馏水透析1.5-2.5天，冷冻干燥后即得反应后产物。
CN201810039595.XA 2018-01-16 2018-01-16 一种提高肝素抗凝血活性的方法 Pending CN108220365A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810039595.XA CN108220365A (zh) 2018-01-16 2018-01-16 一种提高肝素抗凝血活性的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810039595.XA CN108220365A (zh) 2018-01-16 2018-01-16 一种提高肝素抗凝血活性的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108220365A true CN108220365A (zh) 2018-06-29

Family

ID=62640406

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810039595.XA Pending CN108220365A (zh) 2018-01-16 2018-01-16 一种提高肝素抗凝血活性的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108220365A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114616340A (zh) * 2019-07-09 2022-06-10 奥普蒂姆维亚有限公司 合成抗凝血多糖的方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101531723A (zh) * 2009-02-27 2009-09-16 江南大学 一种用生物酶对肝素进行选择性结构修饰制备肝素衍生物的方法
CN101591401A (zh) * 2009-02-27 2009-12-02 江南大学 一种制备高活性低分子量肝素的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101531723A (zh) * 2009-02-27 2009-09-16 江南大学 一种用生物酶对肝素进行选择性结构修饰制备肝素衍生物的方法
CN101591401A (zh) * 2009-02-27 2009-12-02 江南大学 一种制备高活性低分子量肝素的方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LI FU ET AL.: "Enzymatic Generation of Highly Anticoagulant Bovine Intestinal Heparin", 《J. MED. CHEM.》 *
MICHAEL D. BURKART ET AL.: "Regeneration of PAPS for the Enzymatic Synthesis of Sulfated Oligosaccharides", 《J. ORG. CHEM.》 *
李晓燕等: "多酶催化合成3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸反应体系的构建及优化", 《高校化学工程学报》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114616340A (zh) * 2019-07-09 2022-06-10 奥普蒂姆维亚有限公司 合成抗凝血多糖的方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Liang et al. Effects of sulfate group in red seaweed polysaccharides on anticoagulant activity and cytotoxicity
Conrad Heparin-binding proteins
Liu et al. Lessons learned from the contamination of heparin
Bhaskar et al. Engineering of routes to heparin and related polysaccharides
Jouault et al. Characterization, chemical modifications and in vitro anticoagulant properties of an exopolysaccharide produced by Alteromonas infernus
Atha et al. Evaluation of critical groups required for the binding of heparin to antithrombin.
TWI769176B (zh) 生合成肝素
HUT64087A (en) Process for producing n,o-sulfated heparosanes of high molecular weigh and pharmaceutical compositions comprising such compounds
CS366891A3 (en) N,o-sulfated heparosanes, process of their preparation and pharmaceuticalcompositions containing said n,o-sulfated heparosanes
US8193166B2 (en) Epimerized derivatives of K5 polysaccharide with a very high degree of sulfation
US5849722A (en) Oligosaccharide having affinity for fibroblast growth factor and process for producing same
CN111154819B (zh) 一种非动物源低分子量肝素及其制备方法与应用
CN108220365A (zh) 一种提高肝素抗凝血活性的方法
CN101591401A (zh) 一种制备高活性低分子量肝素的方法
Rodén et al. Heparin—an introduction
Lindblom et al. Endothelial heparan sulphate: compositional analysis and comparison of chains from different proteoglycan populations
EP0642533A1 (en) Heparan sulphate oligosaccharides having hepatocyte growth factor binding affinity
Linhardt et al. New methodologies in heparin structure analysis and the generation of LMW heparins
CN105037586A (zh) 一种抗凝血医用材料及其制备方法
Sutherland Enzymic hydrolysis of colanic acid
CN104404110A (zh) 一种具有高抗凝活性的透明质酸衍生物的制备方法
Zhang et al. Uncovering the detailed mode of cleavage of heparinase I toward structurally defined heparin oligosaccharides
Kjellén et al. Two enzymes in one: N-deacetylation and N-sulfation in heparin biosynthesis are catalyzed by the same protein
CN102924627A (zh) 一种具有抗肿瘤活性的低抗凝肝素的制备方法
CN102660610A (zh) 一种酶法制备高活性低分子量肝素的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20180629