JPWO2019186274A5

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Publication number: JPWO2019186274A5
Application number: JP2020552746A
Authority: JP
Publication date: 2022-04-11

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本発明の他の目的、特徴、及び利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、本発明の趣旨及び範囲内の様々な変更及び修正が、この詳細な説明から当業者に明らかになるため、詳細な説明及び具体的な実施例は、本発明のある特定の実施形態を示すが、例示説明のみの目的でのみ与えられることが理解されるべきである。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
プロモーター要素と、少なくとも５０ヌクレオチドの長さのスペーサーと、ｍｉＲＮＡヘアピンと、を含む、ｍｉＲＮＡ発現構築物。
（項目２）
前記スペーサーが、５０～１，０００ヌクレオチドの長さである、項目１に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
（項目３）
前記スペーサーが、５０～９００、５０～８００、１００～８００、または５０～８００ヌクレオチドの長さである、項目１に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
（項目４）
前記スペーサーが、少なくとも６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、または２００ヌクレオチドの長さである、項目１に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
（項目５）
前記スペーサーが、前記プロモーター要素に対して異種である、項目１に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
（項目６）
前記スペーサーが、コードされたオープンリーディングフレームを含む、項目１に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
（項目７）
前記スペーサーが、少なくとも３７５ヌクレオチドの長さである、項目１に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
（項目８）
前記プロモーターが、真核生物プロモーターである、項目１に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
（項目９）
前記真核生物プロモーターが、ＰｏｌＩＩまたはＰｏｌＩＩＩプロモーターである、項目８に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
（項目１０）
前記真核生物プロモーターが、ＰｏｌＩＩプロモーターである、項目９に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
（項目１１）
前記プロモーターが、誘導性、組織特異的、または細胞系統特異的プロモーターである、項目１に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
（項目１２）
前記プロモーター要素が、表１のプロモーター要素から選択される、項目１～１１のいずれかに記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
（項目１３）
前記プロモーター要素が、前記ＥＦ１αプロモーターと少なくとも８０％同一である、項目１２に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
（項目１４）
前記ＥＦ１αプロモーターが、前記ＥＦ１αプロモーターのスプライスバリアントである、項目１３に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
（項目１５）
前記ＥＦ１αプロモーターの前記スプライスバリアントが、ＥＦ１ｓである、項目１４に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
（項目１６）
前記ＥＦ１ｓプロモーターが、配列番号４５と少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％同一である配列を有する、項目１５に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
（項目１７）
前記スペーサーが、表９のスペーサーから選択される、項目１～１６のいずれかに記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
（項目１８）
前記スペーサーが、配列番号４６と少なくとも８０％同一である、項目１７に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
（項目１９）
前記スペーサーの配列が、配列番号４６である、項目１８に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
（項目２０）
前記スペーサーが、配列番号４７と少なくとも８０％同一である、項目１７に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
（項目２１）
前記スペーサーの配列が、配列番号４７である、項目２０に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
（項目２２）
前記スペーサーが、配列番号４８と少なくとも８０％同一である、項目１７に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
（項目２３）
前記スペーサーの配列が、配列番号４８である、項目２２に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
（項目２４）
前記スペーサーが、配列番号４９と少なくとも８０％同一である、項目１７に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
（項目２５）
前記スペーサーの配列が、配列番号４９である、項目２４に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
（項目２６）
前記ｍｉＲＮＡヘアピンが、５’から３’へ、かつ（ａ）～（ｇ）の順序で：
（ａ）配列番号２５の配列を含むｍｉｒ－１６フランキング配列、
（ｂ）配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、または配列番号３０のｍｉｒ－１６配列を含む第１の下側ステム配列、
（ｃ）２２ヌクレオチドの長さのアンチセンス標的配列、
（ｄ）配列番号３１の配列を含むｍｉｒ－３０ループ配列、
（ｅ）前記（ｃ）の配列に対して１つまたは２つのミスマッチを含むことを除き、前記（ｃ）の配列と相補的であるセンス配列であって、前記１つまたは２つのミスマッチが、
ｉ）前記センス配列の８～１４位に位置するミスマッチ、または
ｉｉ）前記センス配列の終端の３’位（２２位）におけるミスマッチを含む、前記センス配列、
（ｆ）前記（ｂ）の配列と相補的である、第２の下側ステム配列、及び
（ｇ）第２のフランキング配列、を含む、項目１～２５のいずれかに記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
（項目２７）
前記ｍｉＲＮＡヘアピンの前記センス配列（ｅ）が、前記センス配列（ｅ）のヌクレオチド１１位に位置する配列（ｃ）に対して１つのミスマッチを含む、項目２６に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
（項目２８）
前記ｍｉＲＮＡヘアピンの前記センス配列（ｅ）が、（ｉ）前記センス配列（ｅ）の１１位、及び（ｉｉ）前記センス配列（ｅ）の末端の３’ヌクレオチド（２２位）に位置する配列（ｃ）に対して２つのミスマッチを含む、項目２６に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
（項目２９）
フランキング配列（ｇ）が、前記ｍｉｒ－１６フランキング配列（ａ）と相補的ではない、項目２６～２８のいずれかに記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
（項目３０）
前記ｍｉＲＮＡヘアピン配列が、表６に記載されている配列から選択される、項目１～２９のいずれかに記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
（項目３１）
前記核酸分子が、ＲＮＡである、項目１～３０のいずれか１項に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
（項目３２）
前記核酸分子が、ＤＮＡである、項目１～３０のいずれか１項に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
（項目３３）
前記核酸分子が、前記ｍｉＲＮＡヘアピンのうちの少なくとも２つの反復を含む、項目１～３２のいずれか１項に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
（項目３４）
前記少なくとも２つの反復が、介在配列によって分離されている、項目３３に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
（項目３５）
前記アンチセンス標的配列が、ＣＣＲ５ｍＲＮＡ配列と相補的である、項目２６～３４のいずれか１項に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
（項目３６）
項目１～３５のいずれかに記載のｍｉＲＮＡ発現構築物を含む、発現ベクター。
（項目３７）
項目１に記載の核酸配列の２つ以上のコピーを含む、項目３６に記載の発現ベクター。
（項目３８）
項目１に記載の核酸配列の２つ以上のコピーが、ポリシストロニック転写産物をコードする配列を形成する、項目３７に記載の発現ベクター。
（項目３９）
前記発現ベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターである、項目３６に記載の発現ベクター。
（項目４０）
少なくとも１つの薬剤耐性マーカーをさらに含む、項目３６に記載の発現ベクター。
（項目４１）
項目１～３５のいずれか１項に記載の核酸分子または項目３６～４０のいずれか１項に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
（項目４２）
前記宿主細胞が、免疫エフェクター細胞である、項目４１に記載の宿主細胞。
（項目４３）
前記宿主細胞が、Ｔ細胞またはＣＡＲＴ細胞である、項目４１に記載の宿主細胞。
（項目４４）
細胞内の遺伝子の発現を低減するための方法であって、前記細胞において項目２６～３５のいずれか１項に記載の核酸分子を発現させることを含み、前記アンチセンス標的配列（ｃ）が、前記遺伝子のセンス鎖と相補的である、前記方法。
（項目４５）
前記細胞における前記核酸分子の発現が、核酸を用いて、前記細胞をトランスフェクトすることを含む、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
前記細胞における前記核酸分子の発現が、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によって前記細胞のゲノムに前記核酸分子を挿入することを含む、項目４４に記載の方法。
（項目４７）
前記細胞における前記核酸分子の発現が、前記核酸分子を発現ベクターから発現することを含む、項目４４に記載の方法。
（項目４８）
前記発現ベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターである、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
前記遺伝子が、ＣＣＲ５である、項目４４に記載の方法。
（項目５０）
前記細胞が、ヒト細胞である、項目４４に記載の方法。
（項目５１）
インビボ法としてさらに規定される、項目４４に記載の方法。
（項目５２）
インビトロまたはエクスビボ法としてさらに規定される、項目４４に記載の方法。
（項目５３）
前記核酸分子を発現する細胞を、生物に移植することをさらに含む、項目５２に記載の方法。
（項目５４）
前記細胞が、生物に含まれる、項目４４に記載の方法。
（項目５５）
組換え核酸分子であって、プロモーター要素と、少なくとも５０ヌクレオチドの長さのスペーサーと、少なくとも１つのｍｉＲＮＡヘアピンと、を含み、前記ｍｉＲＮＡヘアピンが、５’から３’へ、かつ（ａ）～（ｇ）の順序で：
（ａ）ｍｉｒ－１６フランキング配列、
（ｂ）ｍｉｒ－１６配列を含む第１の下側ステム配列、
（ｃ）２２ヌクレオチドの長さのアンチセンス標的配列、
（ｄ）ｍｉｒ－３０ループ配列、
（ｅ）前記（ｃ）の配列に対して１つまたは２つのミスマッチを含むことを除き、前記（ｃ）の配列と相補的である、センス配列であって、前記１つまたは２つのミスマッチが、
ｉ）前記センス配列の８～１４位に位置するミスマッチ、または
ｉｉ）前記センス配列の終端の３’位（２２位）におけるミスマッチを含む、前記センス配列、
（ｆ）前記（ｂ）の配列と相補的である、第２の下側ステム配列であって、前記下側ステムが、少なくとも１１ヌクレオチドの長さである、前記第２の下側ステム配列、及び
（ｇ）第２のフランキング配列、を含む、前記組換え核酸分子。
（項目５６）
前記下側ステムが、１１、１２、１３、１４、１５、１６、または１７ヌクレオチドの長さである、項目５５に記載の核酸分子。
（項目５７）
前記第１の下側ステム（ｂ）が、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、または配列番号３０のｍｉｒ－１６配列を含む、項目５５に記載の核酸分子。
（項目５８）
前記ｍｉｒ－１６フランキング配列（ａ）が、配列番号２５の配列を含む、項目５５に記載の核酸分子。
（項目５９）
前記ｍｉｒ－３０ループ配列が、配列番号３１の配列を含む、項目５５に記載の核酸分子。
（項目６０）
前記センス配列（ｅ）が、前記センス配列（ｅ）のヌクレオチド１１位に位置する配列（ｃ）に対して１つのミスマッチを含む、項目５５に記載の核酸分子。
（項目６１）
前記センス配列（ｅ）が、（ｉ）前記センス配列（ｅ）の１１位、及び（ｉｉ）前記センス配列（ｅ）の末端の３’ヌクレオチド（２２位）に位置する配列（ｃ）に対して２つのミスマッチを含む、項目５５に記載の核酸分子。
（項目６２）
フランキング配列（ｇ）を含み、前記フランキング配列が、前記ｍｉｒ－１６フランキング配列（ａ）と相補的でない、項目５５～６１のいずれか１項に記載の核酸分子。
（項目６３）
前記ｍｉＲＮＡヘアピン配列が、表６または表１０に記載されている配列から選択される、項目５５～６２のいずれか１項に記載の核酸分子。
（項目６４）
前記核酸分子が、ＲＮＡである、項目５５～６３のいずれか１項に記載の核酸分子。
（項目６５）
前記核酸分子が、ＤＮＡである、項目５５～６３のいずれか１項に記載の核酸分子。
（項目６６）
前記核酸分子が、前記配列（ａ）～（ｇ）のうちの少なくとも２つの反復を含む、項目５５～６５のいずれか１項に記載の核酸分子。
（項目６７）
前記少なくとも２つの反復が、介在配列によって分離されている、項目６６に記載の核酸分子。
（項目６８）
前記アンチセンス標的配列が、ＣＣＲ５ｍＲＮＡ配列と相補的である、項目５５～６７のいずれか１項に記載の核酸分子。
（項目６９）
項目５５～６８のいずれか１項に記載の核酸を含む、発現ベクター。
（項目７０）
前記プロモーターが、真核生物プロモーターである、項目６９に記載の発現ベクター。
（項目７１）
前記真核生物プロモーターが、ＰｏｌＩＩまたはＰｏｌＩＩＩプロモーターである、項目７０に記載の発現ベクター。
（項目７２）
前記真核生物プロモーターが、ＰｏｌＩＩプロモーターである、項目７１に記載の発現ベクター。
（項目７３）
前記プロモーターが、誘導性、組織特異的または細胞系統特異的プロモーターである、項目６９に記載の発現ベクター。
（項目７４）
項目５５に記載の核酸配列の２以上のコピーを含む、項目６９に記載の発現ベクター。
（項目７５）
項目５５に記載の核酸配列の２つ以上のコピーが、ポリシストロニック転写産物をコードする配列を形成する、項目７４に記載の発現ベクター。
（項目７６）
前記発現ベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターである、項目６９に記載の発現ベクター。
（項目７７）
少なくとも１つの薬剤耐性マーカーをさらに含む、項目６９に記載の発現ベクター。
（項目７８）
項目５５～６８のいずれか１項に記載の核酸分子または項目６９～７７のいずれか１項に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
（項目７９）
細胞内の遺伝子の発現を低減するための方法であって、前記細胞において項目５５～６８のいずれか１項に記載の核酸分子を発現させることを含み、前記アンチセンス標的配列（ｃ）が、前記遺伝子のセンス鎖と相補的である、前記方法。
（項目８０）
前記細胞における前記核酸分子の発現が、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用して、前記細胞のゲノムに前記核酸分子を組み込むことを含む、項目７９に記載の方法。
（項目８１）
前記細胞における前記核酸分子の発現が、核酸を用いて、前記細胞をトランスフェクトすることを含む、項目７９に記載の方法。
（項目８２）
前記細胞における前記核酸分子の発現が、前記核酸分子を発現ベクターから発現することを含む、項目７９に記載の方法。
（項目８３）
前記発現ベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターである、項目８２に記載の方法。
（項目８４）
前記遺伝子が、ＣＣＲ５である、項目７９に記載の方法。
（項目８５）
前記細胞が、ヒト細胞である、項目７９に記載の方法。
（項目８６）
インビボ法としてさらに規定される、項目７９に記載の方法。
（項目８７）
インビトロまたはエクスビボ法としてさらに規定される、項目７９に記載の方法。
（項目８８）
前記核酸分子を発現する細胞を、生物に移植することをさらに含む、項目８７に記載の方法。
（項目８９）
前記細胞が、生物に含まれる、項目７９に記載の方法。
（項目９０）
プロモーター配列及び少なくとも２つのｍｉＲＮＡヘアピンを含むｍｉＲＮＡ発現構築物であって、前記少なくとも２つのｍｉＲＮＡヘアピンが、免疫チェックポイント遺伝子の転写産物を標的とする、前記ｍｉＲＮＡ発現構築物。
（項目９１）
前記少なくとも２つのｍｉＲＮＡヘアピンが、同一である、項目９０に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
（項目９２）
前記少なくとも２つのｍｉＲＮＡヘアピンが、異なる配列を標的とする、項目９０に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
（項目９３）
前記少なくとも２つのｍｉＲＮＡヘアピンが、同じ遺伝子の転写産物の異なる配列を標的とする、項目９２に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
（項目９４）
前記ｍｉＲＮＡヘアピンが、異なる転写産物を標的とする、項目９２に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
（項目９５）
前記ｍｉＲＮＡヘアピンが、異なる遺伝子の転写産物を標的とする、項目９４に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
（項目９６）
少なくとも３つのｍｉＲＮＡヘアピンを含む、項目９０に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
（項目９７）
前記少なくとも３つのｍｉＲＮＡヘアピンが、それぞれ、異なる、項目９６に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
（項目９８）
前記少なくとも３つのｍｉＲＮＡヘアピンのうちの少なくとも２つが、異なる、項目９６に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
（項目９９）
前記少なくとも３つの異なるｍｉＲＮＡヘアピンが、２つまたは３つの異なる免疫チェックポイント遺伝子の転写産物を標的とする、項目９７に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
（項目１００）
少なくとも４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０のｍｉＲＮＡヘアピンを含む、項目９０のｍｉＲＮＡ発現構築物。
（項目１０１）
前記少なくとも４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０のｍｉＲＮＡヘアピンのうちの少なくとも２つが、異なる、項目１００に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
（項目１０２）
前記少なくとも４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０のｍｉＲＮＡヘアピンが、それぞれ、異なる、項目１００に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
（項目１０３）
前記少なくとも４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０の異なるｍｉＲＮＡヘアピンが、２つ、３つ、４つ、または５つの異なる免疫チェックポイント遺伝子の転写産物を標的とする、項目１０２に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
（項目１０４）
前記プロモーターと前記少なくとも２つのｍｉＲＮＡヘアピンとの間にスペーサー配列位置をさらに含む、項目９０に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
（項目１０５）
前記スペーサーが、５０～１，０００ヌクレオチドの長さである、項目９０に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
（項目１０６）
前記少なくとも２つのｍｉＲＮＡヘアピンが、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＢＴＬＡ、ＫＩＲ、アデノシンＡ２ａ受容体、ＡＲＧ２（アルギナーゼ２）、Ｖｉｓｔａ、ＩＤＯ、ＦＡＳ、ＳＩＲＰアルファ、ＣＩＳＨ、ＳＨＰ－１、ＦＯＸＰ３、ＬＡＩＲ１、ＰＶＲＩＧ、ＰＰＰ２ＣＡ、ＰＰＰ２ＣＢ、ＰＴＰＮ６、ＰＴＰＮ２２、ＣＤ１６０、ＣＲＴＡＭ、ＳＩＧＬＥＣ７、ＳＩＧＬＥＣ９、ＣＤ２４４、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ１０、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ６、ＣＡＳＰ７、ＦＡＤＤ、ＴＧＦＢＲＩＩ、ＴＧＦＲＢＲＩ、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ１０、ＳＫＩ、ＳＫＩＬ、ＴＧＩＦ１、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ、ＨＭＯＸ２、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６ＳＴ、ＥＩＦ２ＡＫ４、ＣＳＫ、ＰＡＧ１、ＳＩＴ１、ＰＲＤＭ１、ＢＡＴＦ、ＧＵＣＹ１Ａ２、ＧＵＣＹ１Ａ３、ＧＵＣＹ１Ｂ２、及びＧＵＣＹ１Ｂ３からなる群から選択される少なくとも１つの免疫チェックポイント遺伝子の転写産物を標的とする、項目９０に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
（項目１０７）
前記プロモーター配列が、前記ＥＦ１ｓプロモーター配列と少なくとも８０％同一である、項目９０～１０６のいずれかに記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
（項目１０８）
前記プロモーター配列が、前記ＵＢＩプロモーター配列と少なくとも８０％同一である、項目９０～１０６のいずれかに記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
（項目１０９）
前記ｍｉＲＮＡ発現構築物が、キメラ抗原受容体配列をさらに含む、項目９０～１０８のいずれかに記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
（項目１１０）
前記ｍｉＲＮＡ発現構築物が、Ｔ細胞受容体配列をさらに含む、項目９０～１０８のいずれかに記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
（項目１１１）
前記ｍｉＲＮＡ発現構築物が、選択遺伝子をさらに含む、項目９０～１１０のいずれかに記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
（項目１１２）
前記選択遺伝子が、ＬＮＧＦＲまたはその誘導体である、項目１１１に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
（項目１１３）
前記ｍｉＲＮＡ発現構築物が、自殺遺伝子をさらに含む、項目９０～１１０のいずれかに記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
（項目１１４）
前記自殺遺伝子が、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｔｋ）、誘導性カスパーゼ９（ｉＣａｓｐ９）、切断型内皮増殖因子受容体（ｔＥＧＦＲ）、ＲＱＲ８、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、及びチミジル酸生成酵素（ＴＹＭＳ）からなる群から選択される、項目１１３に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
（項目１１５）
前記ｍｉＲＮＡ発現構築物が、ペプチド切断部位をさらに含む、項目９０～１１３のいずれかに記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
（項目１１６）
前記ペプチド切断部位が、２Ａペプチドである、項目１１５に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
（項目１１７）
前記２Ａペプチドが、２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ、Ｆ２Ａ、ＢｍＣＰＶ２Ａ、及びＢｍＩＦＶ２Ａを含む群から選択される、項目１１６に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
（項目１１８）
前記２Ａペプチドが、Ｔ２Ａである、項目１１７に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
（項目１１９）
項目９０～１１８のいずれかに記載のｍｉＲＮＡ発現構築物を含む、ベクター。
（項目１２０）
前記ベクターが、ウイルスベクターである、項目１１９に記載のベクター。
（項目１２１）
前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターである、項目１２０に記載のベクター。
（項目１２２）
項目９０～１１８のいずれかに記載のｍｉＲＮＡ発現構築物または項目１１９～１２１のいずれかに記載のベクターを含む、哺乳動物細胞。
（項目１２３）
前記哺乳動物細胞が、免疫エフェクター細胞である、項目１２２に記載の哺乳動物細胞。
（項目１２４）
前記細胞が、ＣＣＲ５の発現の低減のために操作される、項目１２２に記載の哺乳動物細胞。
（項目１２５）
前記免疫エフェクター細胞が、Ｔ細胞、ＴＩＬＳ、ＴＣＲ操作されたＴ細胞、ＣＡＲＴ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫ／Ｔ細胞、Ｔ制御性細胞、単球、及びマクロファージを含む群から選択される、項目１２３に記載の免疫エフェクター細胞。
（項目１２６）
操作された免疫エフェクター細胞を調製するための方法であって、項目９０～１１８のいずれかに記載のｍｉＲＮＡ発現構築物を用いて、前記免疫エフェクター細胞をトランスフェクトもしくは形質導入すること、または項目１１８～１２１のいずれかに記載のベクターを用いて、前記免疫エフェクター細胞を形質導入することを含む、前記方法。
（項目１２７）
操作された免疫エフェクター細胞を調製するための方法であって、免疫エフェクター細胞にキメラ抗原受容体配列またはＴ細胞受容体配列をトランスフェクトまたは形質導入し、次いで、前記細胞に、項目９０～１１８のいずれかに記載のｍｉＲＮＡ発現構築物または項目１１９～１２１のいずれかに記載のベクターをトランスフェクトまたは形質導入することを含む、前記方法。
（項目１２８）
操作された免疫エフェクター細胞を調製するための方法であって、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、ｍｅｇａＴＡＬ、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によって、項目９０～１１８のいずれかに記載のｍｉＲＮＡ発現構築物を前記細胞のゲノムに組み込むことを含む、前記方法。
（項目１２９）
患者からの操作された免疫エフェクター細胞を調製するための方法であって、
（ａ）前記患者からの免疫エフェクター細胞を収集することと、
（ｂ）操作された免疫エフェクター細胞を生成するために、項目９０～１１８のいずれかに記載のｍｉＲＮＡ発現構築物を用いて、前記免疫エフェクター細胞をトランスフェクトすること、または項目１１９～１２１のいずれかに記載のベクターを用いて、前記免疫エフェクター細胞を形質導入することと、を含む、前記方法。
（項目１３０）
患者からの操作された免疫エフェクター細胞を調製するための方法であって、
（ａ）前記患者から免疫エフェクター細胞を収集することと、
（ｂ）改変された免疫エフェクター細胞を生成するために、キメラ抗原受容体またはＴ細胞受容体を用いて、前記免疫エフェクター細胞を形質導入またはトランスフェクトすることと、
（ｃ）操作された免疫エフェクター細胞を生成するために、項目９０～１１８のいずれかに記載のｍｉＲＮＡ発現構築物または項目１１９～１２１のいずれかに記載のベクターを用いて、前記改変された免疫エフェクター細胞を形質導入またはトランスフェクトすることと、を含む、前記方法。
（項目１３１）
前記キメラ抗原受容体またはＴ細胞受容体が、前記ｍｉＲＮＡ発現構築物またはベクターによってコードされる、項目１３０に記載の方法。
（項目１３２）
前記ｍｉＲＮＡ発現構築物を用いた前記免疫エフェクター細胞の形質導入またはトランスフェクトが、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、ｍｅｇａＴＡＬ、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によって、前記ゲノムに、前記ｍｉＲＮＡ発現構築物を組み込むことを含む、項目１２９～１３１のいずれかに記載の方法。
（項目１３３）
治療を必要とする患者を治療する方法であって、前記患者に、項目１２２～１３２のいずれかに記載の細胞を導入することを含む、前記方法。
（項目１３４）
ＣＣＲ５及び免疫チェックポイント阻害遺伝子を標的とする１つ以上のｍｉＲＮＡ発現構築物を含む、免疫エフェクター細胞。
（項目１３５）
前記チェックポイント阻害遺伝子が、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＢＴＬＡ、ＫＩＲ、アデノシンＡ２ａ受容体、ＡＲＧ２（アルギナーゼ２）、Ｖｉｓｔａ、ＩＤＯ、ＦＡＳ、ＳＩＲＰアルファ、ＣＩＳＨ、ＳＨＰ－１、ＦＯＸＰ３、ＬＡＩＲ１、ＰＶＲＩＧ、ＰＰＰ２ＣＡ、ＰＰＰ２ＣＢ、ＰＴＰＮ６、ＰＴＰＮ２２、ＣＤ１６０、ＣＲＴＡＭ、ＳＩＧＬＥＣ７、ＳＩＧＬＥＣ９、ＣＤ２４４、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ１０、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ６、ＣＡＳＰ７、ＦＡＤＤ、ＴＧＦＢＲＩＩ、ＴＧＦＲＢＲＩ、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ１０、ＳＫＩ、ＳＫＩＬ、ＴＧＩＦ１、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ、ＨＭＯＸ２、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６ＳＴ、ＥＩＦ２ＡＫ４、ＣＳＫ、ＰＡＧ１、ＳＩＴ１、ＰＲＤＭ１、ＢＡＴＦ、ＧＵＣＹ１Ａ２、ＧＵＣＹ１Ａ３、ＧＵＣＹ１Ｂ２、またはＧＵＣＹ１Ｂ３である、項目１３４に記載の細胞。
（項目１３６）
前記チェックポイント阻害遺伝子が、ＰＤ１である、項目１３４に記載の細胞。
（項目１３７）
前記ＰＤ１標的配列が、配列番号５９である、項目１３４に記載の細胞。
（項目１３８）
前記免疫エフェクター細胞が、Ｔ細胞、ＴＩＬＳ、ＴＣＲ操作されたＴ細胞、ＣＡＲＴ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫ／Ｔ細胞、Ｔ制御性細胞、単球、及びマクロファージからなる群から選択される、項目１３４に記載の細胞。
（項目１３９）
前記免疫エフェクター細胞が、Ｔ細胞である、項目１３４に記載の細胞。
（項目１４０）
前記免疫エフェクター細胞が、ＣＡＲＴ細胞である、項目１３８に記載の細胞。
（項目１４１）
前記ＣＡＲが、ＨＩＶ感染細胞を標的とする、項目１４０に記載の細胞。
（項目１４２）
ＣＣＲ５及び少なくとも２つの免疫チェックポイント阻害遺伝子を標的とする１つ以上のｍｉＲＮＡ発現構築物を含む、項目１３４に記載の細胞。
（項目１４３）
前記細胞に、項目９０～１１８のいずれかに記載のｍｉＲＮＡ発現構築物または項目１１９～１２１のいずれかに記載のベクターを含む、項目１３４に記載の細胞。
（項目１４４）
前記ｍｉＲＮＡ発現構築物が、項目１～４０のいずれか１項に従う、項目１３４に記載の細胞。
（項目１４５）
ＣＣＲ５及び免疫チェックポイント阻害遺伝子を標的とするｍｉＲＮＡ配列を含む、発現構築物。
（項目１４６）
前記ｍｉＲＮＡ配列が、項目１～４０のいずれか１項に従う、項目１４５に記載の構築物。
（項目１４７）
ＣＡＲ発現配列をさらに含む、項目１４５に記載の構築物。
（項目１４８）
前記ＣＡＲが、ＨＩＶ感染細胞を標的とする、項目１４７に記載の構築物。

Claims

５’から３’へ、プロモーター要素と、３００～６００ヌクレオチドの長さのスペーサーと、少なくとも１つのｍｉＲＮＡヘアピンと、を含む、ｍｉＲＮＡ発現構築物。
前記スペーサーが、前記プロモーター要素に対して異種である、請求項１に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
前記スペーサーが、コードされたオープンリーディングフレームを含む、請求項１に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
前記スペーサーが、少なくとも３７５ヌクレオチドの長さである、請求項１に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
前記プロモーターが、真核生物プロモーターである、請求項１に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
前記真核生物プロモーターが、ＰｏｌＩＩまたはＰｏｌＩＩＩプロモーターである、請求項５に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
前記真核生物プロモーターが、ＰｏｌＩＩプロモーターである、請求項６に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
前記プロモーターが、誘導性、組織特異的、または細胞系統特異的プロモーターである、請求項１に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
前記プロモーター要素が、表１のプロモーター要素から選択される、請求項１～８のいずれか１項に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
前記プロモーター要素が、前記ＥＦ１αプロモーターと少なくとも８０％同一である、請求項９に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
前記ＥＦ１αプロモーターが、前記ＥＦ１αプロモーターのスプライスバリアントである、請求項１０に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
前記ＥＦ１αプロモーターの前記スプライスバリアントが、ＥＦ１ｓである、請求項１１に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
前記ＥＦ１ｓプロモーターが、配列番号４５と少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％同一である配列を有する、請求項１２に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
前記スペーサーが、配列番号４８と少なくとも８０％同一である、請求項１～１３のいずれか１項に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
前記スペーサーの配列が、配列番号４８である、請求項１４に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
前記スペーサーが、配列番号４９と少なくとも８０％同一である、請求項１～１３のいずれか１項に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
前記スペーサーの配列が、配列番号４９である、請求項１６に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
前記ｍｉＲＮＡヘアピンが、５’から３’へ、かつ（ａ）～（ｇ）の順序で：
（ａ）配列番号２５の配列を含むｍｉｒ－１６フランキング配列、
（ｂ）配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、または配列番号３０のｍｉｒ－１６配列を含む第１の下側ステム配列、
（ｃ）２２ヌクレオチドの長さのアンチセンス標的配列、
（ｄ）配列番号３１の配列を含むｍｉｒ－３０ループ配列、
（ｅ）前記（ｃ）の配列に対して１つまたは２つのミスマッチを含むことを除き、前記（ｃ）の配列と相補的であるセンス配列であって、前記１つまたは２つのミスマッチが、
ｉ）前記センス配列の８～１４位に位置するミスマッチ、または
ｉｉ）前記センス配列の終端の３’位（２２位）におけるミスマッチを含む、前記センス配列、
（ｆ）前記（ｂ）の配列と相補的である、第２の下側ステム配列、及び
（ｇ）第２のフランキング配列、を含む、請求項１～１７のいずれか１項に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
前記ｍｉＲＮＡヘアピンの前記センス配列（ｅ）が、前記センス配列（ｅ）のヌクレオチド１１位に位置する配列（ｃ）に対して１つのミスマッチを含む、請求項１８に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
前記ｍｉＲＮＡヘアピンの前記センス配列（ｅ）が、（ｉ）前記センス配列（ｅ）の１１位、及び（ｉｉ）前記センス配列（ｅ）の末端の３’ヌクレオチド（２２位）に位置する配列（ｃ）に対して２つのミスマッチを含む、請求項１８に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
フランキング配列（ｇ）が、前記ｍｉｒ－１６フランキング配列（ａ）と相補的ではない、請求項１８～２０のいずれか１項に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
前記核酸分子が、ＲＮＡである、請求項１～２１のいずれか１項に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
前記核酸分子が、ＤＮＡである、請求項１～２１のいずれか１項に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
前記核酸分子が、前記ｍｉＲＮＡヘアピンのうちの少なくとも２つの反復を含む、請求項１～２３のいずれか１項に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
前記少なくとも２つの反復が、介在配列によって分離されている、請求項２４に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つまたは１０のｍｉＲＮＡヘアピンを含む、請求項１～２５のいずれか１項に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
前記ｍｉＲＮＡヘアピンの少なくとも２つが、同じ配列を標的とする、請求項２６に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
前記ｍｉＲＮＡヘアピンの少なくとも２つが、異なる配列を標的とする、請求項２６に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
前記ｍｉＲＮＡヘアピンの少なくとも２つが、同じ遺伝子の転写産物の異なる配列を標的とする、請求項２８に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
前記ｍｉＲＮＡヘアピンが、異なる転写産物を標的とする、請求項２８に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
前記ｍｉＲＮＡヘアピンが、異なる遺伝子の転写産物を標的とする、請求項３０に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
前記ｍｉＲＮＡ発現構築物が、異種タンパク質のコード配列をさらに含む、請求項１～３１のいずれかに記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
前記異種タンパク質が、キメラ抗原受容体またはＴ細胞受容体である、請求項３２に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
前記ｍｉＲＮＡ発現構築物が、選択遺伝子をさらに含む、請求項１～３３のいずれかに記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
前記選択遺伝子が、ＬＮＧＦＲまたはその誘導体である、請求項３４に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
前記ｍｉＲＮＡ発現構築物が、自殺遺伝子をさらに含む、請求項１～３５のいずれかに記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
前記自殺遺伝子が、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｔｋ）、誘導性カスパーゼ９（ｉＣａｓｐ９）、切断型内皮増殖因子受容体（ｔＥＧＦＲ）、ＲＱＲ８、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、及びチミジル酸生成酵素（ＴＹＭＳ）からなる群から選択される、請求項３６に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
前記ｍｉＲＮＡ発現構築物が、ペプチド切断部位をさらに含む、請求項１～３７のいずれかに記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
前記ペプチド切断部位が、２Ａペプチドである、請求項３８に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
前記２Ａペプチドが、２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ、Ｆ２Ａ、ＢｍＣＰＶ２Ａ、及びＢｍＩＦＶ２Ａを含む群から選択される、請求項３９に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
前記２Ａペプチドが、Ｔ２Ａである、請求項４０に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
請求項１～４１のいずれかに記載のｍｉＲＮＡ発現構築物を含む、発現ベクター。
前記ベクターが、ウイルスベクターである、請求項４２に記載の発現ベクター。
前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターである、請求項４３に記載の発現ベクター。
請求項１～４１のいずれか１項に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物または請求項４２～４４のいずれか１項に記載の発現ベクターを含む、哺乳動物細胞。
前記哺乳動物細胞が、免疫エフェクター細胞である、請求項４５に記載の哺乳動物細胞。
前記免疫エフェクター細胞が、Ｔ細胞、ＴＩＬＳ、ＴＣＲ操作されたＴ細胞、ＣＡＲＴ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫ／Ｔ細胞、Ｔ制御性細胞、単球、及びマクロファージを含む群から選択される、請求項４６に記載の哺乳動物細胞。
操作された免疫エフェクター細胞を調製するための方法であって、請求項１～４１のいずれか１項に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物を用いて、前記免疫エフェクター細胞をトランスフェクトもしくは形質導入すること、または請求項４２～４４のいずれか１項に記載の発現ベクターを用いて、前記免疫エフェクター細胞を形質導入することを含む、前記方法。
操作された免疫エフェクター細胞を調製するための方法であって、免疫エフェクター細胞にキメラ抗原受容体配列またはＴ細胞受容体配列をトランスフェクトまたは形質導入し、次いで、前記細胞に、請求項１～４１のいずれか１項に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物または請求項４２～４４のいずれか１項に記載のベクターをトランスフェクトまたは形質導入することを含む、前記方法。
前記キメラ抗原受容体またはＴ細胞受容体が、前記ｍｉＲＮＡ発現構築物またはベクターによってコードされる、請求項４９に記載の方法。
操作された免疫エフェクター細胞を調製するための方法であって、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、ｍｅｇａＴＡＬ、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、トランスポザーゼ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によって、請求項１～４１のいずれか１項に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物を前記細胞のゲノムに組み込むことを含む、前記方法。
治療を必要とする患者を治療するための、請求項４５～５１のいずれかに記載の細胞を含む、組成物。