JPWO2019107109A1 - オーキシンデグロンシステムにおけるタンパク質分解阻害剤及びその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2017年11月28日に、日本に出願された特願2017−228310号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
また、厳密かつ自在にタンパク質の分解制御が可能なオーキシンデグロンシステムのキット及び目的タンパク質分解制御方法を提供する。また、オーキシンデグロンシステムにおけるタンパク質の分解阻害に有用な新規化合物を提供する。
本発明の第1態様に係るオーキシンデグロンシステムにおけるタンパク質分解阻害剤は、TIR1オーキシン受容体拮抗剤を含有する。
上記態様のオーキシンデグロンシステムのキット及び目的タンパク質分解制御方法によれば、厳密かつ自在にタンパク質の分解制御が可能である。
また、上記態様の化合物は、オーキシンデグロンシステムにおけるタンパク質の分解阻害に有用である。
本発明の一実施形態に係るオーキシンデグロンシステムにおけるタンパク質分解阻害剤は、TIR1オーキシン受容体拮抗剤を含有する。
本実施形態のタンパク質分解阻害剤に含まれるTIR1オーキシン受容体拮抗剤は、TIR1ファミリータンパク質への結合能を要するが、分解誘導ペプチド(特に、mAID)への結合能を有さないものである。これにより、TIR1ファミリータンパク質と、分解誘導ペプチド(特に、mAID)との結合を阻害することができる。本発明者らは、TIR1−オーキシン類−分解誘導ペプチドの結合構造から、TIR1オーキシン受容体拮抗剤となり得る化合物を分子設計し、オーキシン類の誘導体が有効であることを見出した。
IAA誘導体としては、例えば、下記一般式(I)で示される化合物(以下、「化合物(I)」と略記する)等が挙げられる。
一般式(I)中、Arは置換基を有してもよいアリール基である。
一般式(I)中、Y11は、単結合、又は、エステル結合、エーテル結合、アミド結合及びカルボニル基からなる群から選択される1種以上を含んでもよい炭素数1〜10のアルキレン基である。
Y11がエステル結合、エーテル結合、アミド結合及びカルボニル基からなる群から選択される1種以上を含む炭素数1〜10のアルキレン基である場合、例えば、下記一般式(II)で示される基(以下、「基(II)」と略記することがある)等が挙げられる。
基(II)において、n111及びn112は、それぞれ独立して、0〜10の整数である。また、1≦n111+n112≦10である。また、中でも、n111が0以上2以下であり、n112が1以下上3以下であることが好ましく、n111が0以上1以下であり、n112が1以下上2以下であることがより好ましく、n111が0であり、n112が1であることがさらに好ましい。
Y111は、エステル結合(−C(=O)−O−)、エーテル結合(−O−)、アミド結合(−N(H)−C(=O)−)及びカルボニル基(−C(=O)−)からなる群から選択される1種以上である。中でも、Y111は、カルボニル基(−C(=O)−)であることが好ましい。
一般式(I)中、A11、A12、A13及びA14は、それぞれ独立に、CH又は窒素原子である。また、A11、A12、A13及びA14が窒素原子である場合、n11は0である。
一般式(I)中、R11は、インドール環様構造を形成するベンゼン環の置換基である。また、R11は、ハロゲン原子又は炭素数1〜10のアルキル基である。また、n11が2〜4の整数である場合、n11個のR11は互いに同一であってもよく、異なっていてもよい。中でも、合成が容易であることから、R11を2つ以上有する場合、R11は同一であることが好ましい。
一般式(I)中、R12及びR14は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数1〜10のアルキル基である。R12及びR14は、同じであってもよく、異なっていてもよい。
一般式(I)中、R13は、水素原子、ハロゲン原子又は炭素数1〜10のアルキル基である。
一般式(I)中、n11は、置換基R11の数を示し、0〜4の整数である。例えば、A11、A12、A13及びA14が窒素原子である場合、n11は0である。また、例えば、A11、A12、A13及びA14からなる群の1つ以上がCHである場合、nは0〜4である。中でも、n11は0〜3であることが好ましく、0〜2であることがより好ましく、0又は1がさらに好ましい。
一般式(I−1)中、R15は、ベンゼン環の置換基である。R15は、ハロゲン原子又は炭素数1〜10のアルキル基である。また、n12が2〜5の整数である場合、n12個のR15は互いに同一であってもよく、異なっていてもよい。中でも、合成が容易であることから、R15を2つ以上有する場合、R15は同一であることが好ましい。
一般式(I−1)中、n12は置換基R15の数を示し、0〜5の整数である。中でも、合成が容易であり、タンパク質分解阻害効果が優れることから、n12は0〜4であることが好ましく、0〜3であることがより好ましく、0〜2がさらに好ましい。また、化合物(I−1)において、n12が2である場合、置換基R15は置換基R15同士がメタ位となるように配置されていることが好ましい。
化合物(I−1)でより好ましいものとしては、例えば、R11及びR15がフッ素原子、塩素原子、メチル基又はエチル基であり、R12及びR14が水素原子、メチル基又はエチル基であり、n11及びn12が0〜2であるもの等が挙げられる。
R14としては、上記一般式(I)中のR14と同じである。中でも、R14は、水素原子、メチル基、エチル基、n−プロピル基、n−ブチル基又はn−ペンチル基であることが好ましく、水素原子、メチル基、エチル基又はn−プロピル基であることがより好ましく、水素原子、メチル基又はエチル基であることがさらに好ましい。
R15a及びR15bとしては、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子又は炭素数1〜6のアルキル基である。R15a及びR15bは同一であってもよく、異なっていてもよい。
化合物(I−2)でより好ましいものとしては、例えば、R14が水素原子又はメチル基であり、R15aが水素原子、塩素原子又はメチル基であり、R15bが水素原子又はメチル基であるもの等が挙げられる。
下記式(I−1−1)で示される化合物(以下、「化合物(I−1−1)」と略記する)(PEO−IAA);
下記式(I−1−2)で示される化合物(以下、「化合物(I−1−2)」と略記する)(Auxinole);
下記式(I−1−3)で示される化合物(以下、「化合物(I−1−3」と略記する)(4F−PEO−IAA);
下記式(I−1−4)で示される化合物(以下、「化合物(I−1−4)」と略記する)(PEO−IAA ethyl ester);
下記式(I−1−5)で示される化合物(以下、「化合物(I−1−5)」と略記する)(N−methyl−PEO−IAA);
下記式(I−1−6)で示される化合物(以下、「化合物(I−1−6)」と略記する)(4Cl−PEO−IAA);
下記式(I−1−7)で示される化合物(以下、「化合物(I−1−7)」と略記する)(4’−Methyl−PEO−IAA);
下記式(I−1−8)で示される化合物(以下、「化合物(I−1−8)」と略記する)(6’−F−Auxinole)
化合物(I)は、例えば、Ar及びリンカーであるY11の種類に応じて、公知の方法を用いて、単環又は多環式芳香族炭化水素を二環式化合物に反応させることで製造できる。より具体的には、以下のとおりである。
化合物(I)のうち、化合物(I−1)は、R14が水素原子である場合、例えば、以下の工程1)及び工程2)を備える製造方法により製造できる。
1)下記一般式(I−1a)で示される化合物(以下、「化合物(I−1a)」と略記する)と、無水マレイン酸とを反応させて、下記一般式(I−1b)で示される化合物(以下、「化合物(I−1b)」と略記する)を得る工程(以下、「化合物(I−1b)製造工程」と略記する);
2)化合物(I−1b)と、下記一般式(I−1c)で示される化合物(以下、「化合物(I−1c)」と略記する)とを反応させて、下記一般式(I−1)−1aで示される化合物(以下、「化合物((I−1)−1a)」と略記する)を得る工程(以下、「化合物((I−1)−1a)製造工程」と略記する)
前記化合物(I−1b)製造工程では、化合物(I−1a)と無水マレイン酸とをフリーデル−クラフツ(Friedel−Crafts)アルキル化反応により反応させて、化合物(I−1b)を得る。
化合物(I−1a)は置換基を有してもよいベンゼンであり、公知化合物である。
化合物(I−1a)において、R16はベンゼン環中の置換基を示す。また、R16はハロゲン原子又は炭素数1〜10のアルキル基である。また、R16は無水マレイン酸との反応前のR15であり、R15及びR16は同一である。
また、化合物(I−1a)において、n13が2である場合、置換基R16は置換基R16同士がメタ位となるように配置されていることが好ましい。
化合物(I−1b)は置換基を有してもよいフェニル基を側鎖に有するアクリル酸誘導体であり、公知化合物である。
化合物(I−1b)において、R15はベンゼン環の置換基である。また、R15は、ハロゲン原子又は炭素数1〜10のアルキル基である。また、化合物(I−1b)において、R15は化合物(I−1a)中の無水マレイン酸と反応後のR16であり、R15及びR16は同一である。
化合物(I−1b)製造工程においては、触媒を用いて反応を行うことが好ましい。
前記触媒は特に限定されないが、例えば、塩化鉄(III)、塩化アルミニウム等の金属ハロゲン化物が挙げられる。
前記触媒は、1種を単独で用いてもよいし、2種以上を併用してもよく、2種以上を併用する場合、それらの組み合わせ及び比率は任意に選択できる。
前記触媒の使用量は、化合物(I−1a)の使用量の1倍モル量以上3倍モル量以下であることが好ましい。
前記非プロトン性溶媒は特に限定されないが、例えば、ペルフルオロヘキサン、α,α,α−トリフルオロトルエン、ペンタン、ヘキサン、シクロヘキサン、メチルシクロヘキサン、デカヒドロナフタレン、四塩化炭素、ジオキサン、フルオロトリクロロメタン、ベンゼン、トルエン、トリエチルアミン、二硫化炭素、ジイソプロピルエーテル、ジエチルエーテル、tert−ブチルメチルエーテル、クロロホルム、酢酸エチル、2−メトキシエチルエーテル、1,2−ジメトキシエタン、テトラヒドロフラン、塩化メチレン、ピリジン、2−ブタノン、アセトン、ヘキサメチルホスホルアミド、N−メチルピロリジノン、ニトロメタン、ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、スルホラン、ジメチルスルホキシド、ジイソプロピルエチルアミン、酢酸イソプロピル、ジクロロメタン、ジメチルアミン、N,N−ジメチルホルムアミド、炭酸プロピレン等が挙げられる。
前記溶媒は、1種を単独で用いてもよいし、2種以上を併用してもよく、2種以上を併用する場合、それらの組み合わせ及び比率は任意に選択できる。
前記溶媒の使用量は、化合物(I−1a)の使用量の10倍モル量以上200倍モル量以下であることが好ましい。
前記不活性ガスは特に限定されないが、例えば、窒素、ヘリウム、ネオン、アルゴン、クリプトン、キセノン等が挙げられる。
前記不活性ガスは、1種を単独で用いてもよいし、2種以上を併用してもよく、2種以上を併用する場合、それらの組み合わせ及び比率は任意に選択できる。
化合物(I−1b)製造工程において、反応時間は、30分以上10時間以下であることが好ましく、1時間以上5時間以下であることがより好ましい。
化合物(I−1b)製造工程においては、反応終了後、化合物(I−1b)を取り出さずに、次工程で用いてもよいが、目的物である化合物((I−1)−1a)の収率が向上する点から、化合物(I−1b)を上述の方法で取り出すことが好ましい。
前記化合物((I−1)−1a)製造工程においては、化合物(I−1b)と化合物(I−1c)とをマイケル(Michael)反応により反応させて、化合物((I−1)−1a)を得る。
化合物(I−1c)は、インドール環様構造を有する化合物であり、公知化合物である。
化合物(I−1c)において、R11はインドール環様構造を形成するベンゼン環の置換基である。また、R11は、ハロゲン原子又は炭素数1〜10のアルキル基である。R11を2つ以上有する場合、R11は同一であってもよく、異なっていてもよい。中でも、合成が容易であることから、R11を2つ以上有する場合、R11は同一であることが好ましい。
化合物((I−1)−1a)製造工程においては、非プロトン性溶媒を反応溶媒として用いることが好ましい。前記非プロトン性溶媒としては、上述の「化合物(I−1b)製造工程」において例示されたものと同様のものが挙げられる。
前記溶媒の使用量は、化合物(I−1b)の使用量の10倍モル量以上200倍モル量以下であることが好ましい。
化合物((I−1)−1a)製造工程においては、反応時間は、30分以上10時間以下であることが好ましく、1時間以上5時間以下であることがより好ましい。
化合物(I)のうち、化合物(I−1)は、R14が炭素数1〜10のアルキル基である場合、例えば、以下の工程1)、工程2)及び工程3)を備える製造方法により製造できる。
1)化合物(I−1a)と、無水マレイン酸とを反応させて、化合物(I−1b)を得る工程(化合物(I−1b)製造工程)
2)化合物(I−1b)と、1価のアルコールとを反応させて、下記一般式(I−1d)で示される化合物(以下、「化合物(I−1d)」と略記する)を得る工程(以下、「化合物(I−1d)製造工程」と略記する)
3)化合物(I−1d)と、化合物(I−1c)とを反応させて、下記一般式(I−1)−1bで示される化合物(以下、「化合物((I−1)−1b)」と略記する)を得る工程(以下、「化合物((I−1)−1b)製造工程」と略記する)
前記化合物(I−1d)製造工程では、化合物(I−1b)と1価のアルコールとを脱水縮合により反応させて、化合物(I−1d)を得る。
1価のアルコールは公知化合物である。
1価のアルコールとしては、炭素数1〜10のアルキル基を有する1価のアルコールであること好ましい。前記1価のアルコールとして具体的には、例えば、メタノール、エタノール、1−プロパノール、2−プロパノール、1−ブタノール、2−ブタノール、2−メチル−1−プロパノール、2−メチル−2−プロパノール、1−ペンタノール、2−ペンタノール、3−ペンタノール、2−メチル−1−ブタノール、3−メチル−1−ブタノール、2−メチル−2−ブタノール、3−メチル−2−ブタノール、2−エチル−1−ブタノール、2,2−ジメチル−1−プロパノール、1−ヘキサノール、2−ヘキサノール、3−ヘキサノール、4−メチル−1−ペンタノール、4−メチル−2−ペンタノール、2−メチル−2−ペンタノール、3−メチル−2−ペンタノール、3−メチル−3−ペンタノール、2,3−ジメチル−2−ブタノール、3,3−ジメチル−1−ブタノール、3,3−ジメチル−2−ブタノール、1−ヘプタノール、2−ヘプタノール、3−ヘプタノール、4−ヘプタノール、3−エチル−3−ペンタノール、2,4−ジメチル−3−ペンタノール、2,4−ジメチル−2−ペンタノール、2,3−ジメチル−2−ペンタノール、2,3−ジメチル−3−ペンタノール、2,2−ジメチル−3−ペンタノール、2,3,3−トリメチル-2-ブタノール、2,3,3−トリメチル−3−ペンタノール、2,2−ジエチル−1−ペンタノール、1−オクタノール、2−オクタノール、7−メチル−1−オクタノール、2−エチル−1−ヘキサノール、3,5,5−トリメチル−1−ヘキサノール、1−ノナノール、2−ノナノール、3−ノナノール、4−ノナノール、5−ノナノール、2,6−ジメチル−4−ヘプタノール、3,5−ジメチル−4−ヘプタノール1−デカノール等が挙げられ、これらに限定されない。中でも、1価のアルコールとしては、メタノール、エタノール、1−プロパノール、1−ブタノール又は1−ペンタノールが好ましく、メタノール、エタノール又は1−プロパノールがより好ましく、メタノール又はエタノールがさらに好ましい。
化合物(I−1d)は公知化合物である。
化合物(I−1d)において、R15はベンゼン環の置換基である。ハロゲン原子又は炭素数1〜10のアルキル基である。また、R15は、ハロゲン原子又は炭素数1〜10のアルキル基である。R15を2つ以上有する場合、R15は同一であってもよく、異なっていてもよい。中でも、合成が容易であることから、R15を2つ以上有する場合、R15は同一であることが好ましい。
化合物(I−1d)製造工程においては、縮合剤を用いて反応を行うことが好ましい。
前記縮合剤は特に限定されないが、例えば、N,N−ジメチル−4−アミノピリジン(N,N−dimethyl−4−aminopyridine;DMAP)等が挙げられる。
前記縮合剤は1種を単独で用いてもよいし、2種以上を併用してもよく、2種以上を併用する場合、それらの組み合わせ及び比率は任意に選択できる。
前記縮合剤の使用量は、化合物(I−1b)の使用量の0.05モル量以上0.2倍モル量以下であることが好ましい。
前記溶媒の使用量は、化合物(I−1b)の使用量の10倍モル量以上200倍モル量以下であることが好ましい。
化合物(I−1d)製造工程においては、反応時間は、30分以上10時間以下であることが好ましく、1時間以上5時間以下であることがより好ましい。
前記化合物((I−1)−1b)製造工程においては、化合物(I−1d)と化合物(I−1c)とをマイケル(Michael)反応により反応させて、化合物((I−1)−1b)を得る。
化合物((I−1)−1b)製造工程においては、非プロトン性溶媒を反応溶媒として用いることが好ましい。前記非プロトン性溶媒としては、上述の「化合物(I−1b)製造工程」において例示されたものと同様のものが挙げられる。
前記溶媒の使用量は、化合物(I−1d)の使用量の10倍モル量以上100倍モル量以下であることが好ましい。
化合物((I−1)−1b)製造工程においては、反応時間は、30分以上10時間以下であることが好ましく、1時間以上5時間以下であることがより好ましい。
本実施形態のタンパク質分解阻害剤は、上述のTIR1オーキシン受容体拮抗剤の他に、タンパク質分解阻害効果を妨げない範囲で、添加剤等を含んでいてもよい。
<第1実施形態>
本発明の一実施形態に係るオーキシンデグロンシステムのキットは、上記実施形態に係るオーキシンデグロンシステムにおけるタンパク質分解阻害剤と、TIR1ファミリータンパク質をコードする第一の核酸と、少なくともmAIDをコードする第二の核酸と、を備える。
本実施形態のキットが備える上記タンパク質分解阻害剤以外の構成成分について、以下に詳細を説明する。
第一の核酸はTIR1ファミリータンパク質をコードする核酸である。
本実施形態のキットにおいて、TIR1ファミリータンパク質をコードする第一の核酸の5’末端に、該第一の核酸の転写を制御するプロモーター配列が作動可能に連結されていることが好ましい。これによって、より確実にTIR1ファミリータンパク質を発現できる。
誘導性プロモーターとしては、特別な限定はなく、例えば、化学的誘導性プロモーター、熱ショック誘導性プロモーター、電磁気的誘導性プロモーター、核レセプター誘導性プロモーター、ホルモン誘導性プロモーター等が挙げられる。中でも、本実施形態の細胞において、TIR1ファミリータンパク質をコードする第一の核酸に作動可能に連結された誘導性プロモーターとしては、化学的誘導性プロモーターであることが好ましい。
ウイルス性プロモーターとしては、特別な限定はなく、例えば、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター(CMV極初期プロモーター(例えば、特許文献8参照。)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)由来のプロモーター(例えば、HIV長末端リピート等)、ラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーター(例えば、RSV長末端リピート等) 、マウス乳腫瘍ウイルス(MMTV)プロモーター、HSVプロモーター(Lap2プロモーター又はヘルペスチミジンキナーゼプロモーター等)(例えば、非特許文献4参照) 、SV40又はエプスタイン バール ウイルス由来のプロモーター、アデノ随伴ウイルスプロモーター(例えば、p5プロモーター等)等が挙げられる。
ハウスキーピング遺伝子プロモーターとしては、特別な限定はなく、例えば、GAPDH(glyceraldehyde−3−phosphate dehydrogenase)遺伝子プロモーター、β-アクチン遺伝子プロモーター、β2−マイクログロブリン遺伝子プロモーター、HPRT 1(hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1)遺伝子プロモーター等が挙げられる。
組織特異的プロモーターとしては、特別な限定はなく、例えば、黒色腫細胞又はメラニン細胞の場合は、チロシナーゼプロモーター又はTRP2プロモーター;乳房細胞又は乳癌の場合は、MMTVプロモーター又はWAPプロモーター;腸細胞又は腸癌の場合は、ビリンプロモーター又はFABPプロモーター;膵細胞の場合は、PDXプロモーター;膵ベータ細胞の場合は、RIPプロモーター;ケラチノサイトの場合は、ケラチンプロモーター;前立腺上皮の場合は、プロバシンプロモーター;中枢神経系(CNS)の細胞又は中枢神経系の癌の場合は、ネスチンプロモーター又はGFAPプロモーター;ニューロンの場合は、チロシンヒドロキシラーゼ、S100プロモーター又は神経フィラメントプロモーター;非特許文献5に記載される、膵臓特異的プロモーター;肺癌の場合は、クラーラ細胞分泌タンパク質プロモーター;心細胞の場合は、αミオシンプロモーター等が挙げられる。
本実施形態のキットにおいて、TIR1ファミリータンパク質をコードする第一の核酸及び上流に作動可能に連結されたプロモーター配列は、ベクターに挿入された形であってもよい。
第二の核酸はAux/IAAファミリータンパク質の全長又は部分タンパク質をコードする核酸である。中でも、第二の核酸は、Aux/IAAファミリータンパク質のうち、mAIDの全長又は部分タンパク質をコードする核酸を含むことが好ましい。
本実施形態のキットにおいて、第二の核酸の5’末端に、該第二の核酸の転写を制御するプロモーター配列が作動可能に連結されていることが好ましい。これによって、より確実に分解誘導ペプチドを発現できる。前記プロモーターとしては、上述の「第一の核酸」において例示されたものと同様のものが挙げられる。
本実施形態のキットにおいて、第二の核酸及び上流に作動可能に連結されたプロモーター配列は、ベクターに挿入された形であってもよい。前記ベクターとしては、上述の「第一の核酸」において例示されたものと同様のものが挙げられる。
本発明の一実施形態に係るオーキシンデグロンシステムのキットは、上記実施形態に係るオーキシンデグロンシステムにおけるタンパク質分解阻害剤と、TIR1ファミリータンパク質をコードする第一の核酸、並びに、目的タンパク質をコードする第三の核酸及び前記第三の核酸の上流又は下流に連結されたAux/IAAファミリータンパク質の全長又は部分タンパク質をコードする第二の核酸を含む真核細胞と、を備える。
本実施形態のキットが備える上記タンパク質分解阻害剤以外の構成成分について、以下に詳細を説明する。
本実施形態のキットが備える真核細胞としては、株化された真核動物由来細胞やES細胞、iPS細胞であればよい。真核細胞として具体的には、例えば、株化されたヒト由来細胞、株化されたマウス由来細胞、株化されたニワトリ由来細胞、ヒトES細胞、マウスES細胞、ヒトiPS細胞、マウスiPS細胞等が挙げられる。中でも、ヒトHCT116細胞、ヒトHT1080細胞、ヒトNALM6細胞、ヒトES細胞、ヒトiPS細胞、マウスES細胞、マウスiPS細胞又はニワトリDT40細胞が好ましく、HCT116細胞、ヒトES細胞、ヒトiPS細胞、マウスES細胞又はマウスiPS細胞がより好ましい。
本発明の一実施形態に係る目的タンパク質分解制御方法は、上記実施形態に係るオーキシンデグロンシステムにおけるタンパク質分解阻害剤を用いた方法である。
より具体的には、例えば、上述の真核細胞にオーキシン類を添加して、発現した目的タンパク質の分解を誘導した後、前記オーキシン類を除去して、上述のタンパク質分解阻害剤を添加し、新たに発現した目的タンパク質の分解を抑制する方法等によって検討することができる。又は、例えば、上述の細胞にオーキシン類を添加して、発現した目的タンパク質の分解を誘導した後、上述のタンパク質分解阻害剤を添加して、新たに発現した目的タンパク質の分解を抑制する方法等によって検討することができる。
工程1aでは、特定の構成を含む真核細胞を含む第一の培養物に、上記オーキシンデグロンシステムにおけるタンパク質分解阻害剤、及びテトラサイクリンを添加する。工程1aに用いられる真核細胞は、TIR1ファミリータンパク質をコードする第一の核酸、及び前記第一の核酸の5’末端に、作動可能に連結されているテトラサイクリン誘導性プロモーターと、目的タンパク質及びAux/IAAファミリータンパク質の全長又は部分タンパク質を含む融合タンパク質をコードする第四の核酸と、を含む。これにより、前記TIR1ファミリータンパク質、及び前記融合タンパク質を発現した真核細胞を含む第二の培養物を得る。
工程2aでは、前記第二の培養物から、前記タンパク質分解阻害剤を除去し、オーキシン類を添加し、前記目的タンパク質を分解させた第三の培養物を得る。
工程1bでは、特定の構成を含む真核細胞を含む第一の培養物に、オーキシン類を添加し、前記目的タンパク質を分解させた第二の培養物を得る。工程1bに用いられる真核細胞は、TIR1ファミリータンパク質をコードする第一の核酸、及び前記第一の核酸の5’末端に、作動可能に連結されているプロモーターと、目的タンパク質及びAux/IAAファミリータンパク質の全長又は部分タンパク質を含む融合タンパク質をコードする第四の核酸と、を含み、前記TIR1ファミリータンパク質、及び前記融合タンパク質を発現している。
工程2bでは、前記第二の培養物から、前記オーキシン類を除去し、上記オーキシンデグロンシステムにおけるタンパク質分解阻害剤を添加し、前記目的タンパク質を発現させた第三の培養物を得る。
以下に示す経路で、Auxinole(化合物(I−1−2))を製造した。
50mL丸底フラスコ内で、窒素充填下でm−キシレン(1.00g、9.42mmol)をジクロロメタン(40mL) に溶解させた。次いで、無水マレイン酸(0.93g、9.42mmol)と塩化アルミニウム(2.51g、18.84mmol)とを加え、室温で4時間攪拌した。次いで、反応液に1N塩酸(10mL)を加え、pH1にした。次いで、酢酸エチル(40mL)で3回抽出した。次いで、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで脱水した。次いで、溶媒を減圧留去した。次いで、ベンゼンから再結晶で精製を行い、化合物(I−1b−1)(trans−4−(2,4−dimethyl−phenyl)−4−oxo−but−2−enoic acid)を得た(収量:1.49g、収率:77%、融点:85.4〜88.2℃)。
1H NMR (CDCl3):δ7.75 (d, J=15.6 Hz, 1H), 7.56 (d, J=8.2 Hz, 1H), 7.10(m, 2H), 6.70 (d, J=15.6 Hz, 1H), 2.50(s, 3H), 2.38(s, 3H).
13C NMR (CDCl3):δ192.5, 170.9, 143.1, 141.7, 139.5, 133.6, 133.0, 130.9, 130.0, 126.4, 21.5 21.2.
IR v max (neat) :2986, 1703, 1667 cm-1.
FAB-MS :m/z 205 [M+H+].
次いで、30mL丸底フラスコ内で、化合物(I−1b−1)(0.40g、1.96mmol)をベンゼン(10mL)で溶解させた。次いで、インドール(0.47g、4.01mmol)を加えて、80℃で8時間撹拌し、室温になるまで攪拌した。次いで、反応液を減圧留去した。次いで、ベンゼンから再結晶を行い、Auxinole(化合物(I−1−2))を得た(収量:0.46g、収率:72%、融点:178.8〜183.2℃)。
1H NMR (DMSO-d6) :δ7.79 (d, J=7.8 Hz, 1H), 7.65 (d, J=7.8 Hz, 1H), 7.36 (d, J=8.2 Hz, 1H), 7.31 (d, J=2.3 Hz, 1H), 7.10 (m, 3H), 7.00 (td, J=7.3 Hz, 1.0, 1H), 4.32 (dd, J=10.6, 3.9 Hz, 1H), 3.89 (dd, J=17.9, 10.6 Hz, 1H), 3.23 (dd, J=17.9, 3.9 Hz, 1H), 2.37 (s, 3H), 2.31 (s, 3H).
13C NMR (DMSO-d6) :δ198.8, 175.7, 144.5, 137.8, 134.9, 130.2, 129.0, 127.2, 124.1, 122.1, 112.0, 119.5, 112.9, 112.4, 42.0, 38.6, 22.1.
IR v max (neat): 3428, 2923, 1707 cm-1.
HRFAB-MS: m/z 322.1422 [M+H]+, calcd for 322.1443, C19H17NO3.
以下に示す経路で、4F−PEO−IAA(化合物(I−1−3))を製造した。
50mL丸底フラスコ内で、窒素充填下でフルオロベンゼン(0.50g、5.21mmol)をジクロロメタン(20mL)で溶解させた。次いで、無水マレイン酸(0.51g、5.20mmol)と塩化アルミニウム(1.40g、10.49mmol)とを加え、室温で4時間攪拌した。次いで、反応液に1N塩酸(10mL)を加え、pH1にした。次いで、酢酸エチル(40mL)で3回抽出した。次いで、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで脱水した。次いで、溶媒を減圧留去した。次いで、ベンゼンから再結晶で精製を行い、化合物(I−1b−2)(trans−4−(4−fluorophenyl)−4−oxo−but−2−enoic acid)を得た(収量:0.57g、収率:56%、融点:114.8〜119.6℃)。
1H NMR (CDCl3) :δ8.06 (m, 2H), 7.98 (d, J=15.4 Hz, 1H), 7.21 (m, 2H), 6.90 (d, J=15.4 Hz, 1H).
13C NMR (CDCl3) :δ187.5, 170.7, 166.3 (d, JC-F=255.5 Hz), 138.0, 132.8 (d, JC-F=3.2 Hz), 131.7 (d, JC-F=9.9 Hz), 131.6, 116.2 (d, JC-F=22.1 Hz) .
FAB-MS: m/z 195 [M+H] +
200mLのナスフラスコ内で、化合物(I−1b−2)(5g、25.8mmol、分子量194.16)とインドール(6g、51.5mmol、分子量117.15)をトルエンに溶かし、80℃で4時間撹拌した。次いで、析出した固体を桐山漏斗(登録商標)で集めた。次いで、析出した固体を酢酸エチルとヘキサンとから再結晶し、4F−PEO−IAA(化合物(I−1−3))を白色の粉末として得た(収量:4.8g、収率:60%、融点:162〜166℃)。
1H NMR (400 MHz, acetone-d6): δ 3.41 ( 1H, dd, J=0.4,0.4) 4.11 (1H, q), 7.05 (1H, m), 7.13 (1H, m ), 7.28 (2H, m,), 7.37 (2H, m), 7.78 (1H, d, J=0.8), 8.16 (2H, m), 10.2 (1H, s).
13C NMR (100 MHz, acetone-d6): δ 38.58, 42.40, 112.32, 113.50, 116.22, 116.44, 119.83, 120.05, 122.42, 131.73, 131.8, 137.71, 167.74, 175.14, 197.16.
FAB-MS: m/z 312 [M+H] +
以下に示す経路で、PEO−IAA ethyl ester(化合物(I−1−4))を製造した。
50mL丸底フラスコ内で、PEO−IAA(0.50g、1.71mmol)をエタノール(15mL) に溶解させた。次いで、塩化アセチル(0.5g、6.36mmol)を滴下し、室温で6時間攪拌した。反応液から溶媒を減圧留去した後,酢酸エチルとヘキサンから再結晶で精製を行い、(化合物(I−1−4)(PEO−IAA ethyl ester)を得た(収量:0.50g、収率:92%、融点:89〜92℃)。
1H NMR (DMSO-d6) :δ11.0 (brs, 1H), 8.04 (d, J=7.4, 2H), 7.69 (d, J=8.2, 1H), 7.65 (t, J=7.3, 1H), 7.53 (t, J=7.3, 2H), 7.38 (s, 1H), 7.37 (d, J=6.2, 1H), 7.10 (t, J=8.2, 1H), 7.01 (t, J=7.2, 1H), 4.30 (dd, J=10.5 3.6, 1H) , 4.02 (dd, J=18.0, 7.3, 1H), 4.04 (m, 2H), 3.34 (dd, 18.0, 4.0), 1.10 (t, J=7.3, 3H).
13C NMR (DMSO-d6) :δ198.81, 173.78, 136.79, 133.87, 129.26,128.53, 126.62, 123.81, 121.75, 119.38, 119.23, 112.09, 111.83, 60.6, 41.73, 38.23, 14.54.
FAB-MS: m/z 332 [M+H] +
以下に示す経路で、N−methyl−PEO−IAA(化合物(I−1−5))を製造した。
30mL丸底フラスコ内で、化合物(I−1b−3)(0.40g、2.27mmol)をベンゼン(10mL)で溶解させた。次いで、N−メチルインドール(0.45g、3.41mmol)を加えて、80℃で8時間撹拌し、室温になるまで攪拌した。反応液を室温まで冷却後、析出した結晶を桐山漏斗(登録商標)で集め、ベンゼン(1mL)で結晶を洗浄した。その後、結晶を減圧乾燥してN−methyl−PEO−IAA(化合物(I−1−5)を得た(収量:0.38g、収率:54%、融点:183〜186℃)。
1H NMR (DMSO-d6) : δ12.2 (brs, 1H), 8.03 (d, J=6.9, 2H), 7.69 (d, J=7.8, 1H), 7.63 (t, J=7.3, 1H), 7.53 (t, J=7.8, 2H), 7.41 (d, J=8.2, 1H), 7.35 (s, 1H), 7.16 (t, J=6.9, 1H), 7.05 (t, J=7.2, 1H), 4.34 (dd, J=10.5 3.6, 1H) , 4.02 (dd, J=18.0, 7.3, 1H), 3.75 (s, 3H), 3.34 (m, 1H).
13C NMR (DMSO-d6) : δ198.79, 175.14, 137.15, 136.91, 133.81, 129.26, 128.47, 128.02, 127.06, 121.81, 119.74, 119.27, 111.72, 110.24, 41.75, 38.01, 32.87.
FAB-MS: m/z 308 [M+H] +
以下に示す経路で、4Cl−PEO−IAA(化合物(I−1−6))を製造した。
50mLのナスフラスコ内で、化合物(I−1b−4)(市販試薬)(0.50g、2.38mmol)とインドール(0.42g、3.57mmol)とをトルエンに溶かし、80℃で4時間撹拌した。室温まで冷却後、次いで、析出した結晶を桐山漏斗(登録商標)で集め、トルエン(1mL)で結晶を洗浄した。その後、結晶を減圧乾燥して、4Cl−PEO−IAA(化合物(I−1−6))を淡黄色結晶として得た(収量:0.49g、収率:63%、融点:185〜190℃)。
1H NMR(DMSO-d6) : 11.0 (brs, 1H), 8.06 (d, J=8.7, 2H), 7.69 (d, J=8.2, 1H), 7.63 (d, J=8.7, 1H), 7.59 (d, J=8.7, 2H), 7.35 (s, 1H), 7.10 (t, J=8.2, 1H), 7.01 (t, J=7.2, 1H), 4.34 (dd, J=10.5 3.6, 1H) , 4.02 (dd, J=18.3, 10.5, 1H), 3.34 (dd, 18.0, 4.0).
FAB-MS: m/z 328 [M+H] +
以下に示す経路で、4’−Methyl−PEO−IAA(化合物(I−1−7))を製造した。
30mLのナスフラスコ内で、化合物(I−1b−3)(0.60g、3.40mmol)と4−メチルインドール(0.60g、5.11mmol)とをトルエンに溶かし、80℃で4時間撹拌した。室温まで冷却後、次いで、析出した結晶を桐山漏斗(登録商標)で集め、トルエン(1mL)で結晶を洗浄した。その後、結晶を減圧乾燥して、4’−Methyl−PEO−IAA(化合物(I−1−7)を無色結晶として得た(収量:0.56g、収率:58%、融点:176〜180℃)。
1H NMR (DMSO-d6) : 11.0 (brs, 1H), 8.04 (d, J=7.9, 2H), 7.63 (t, J=7.3, 1H), 7.53 (d, J=7.8, 1H), 7.51 (t, J=7.3, 1H), 7.30 (d, J=2.8, 1H), 7.20 (d, J=8.2, 1H), 6.96 (t, J=7.8, 1H), 6.74 (d, J=7.3, 1H), 4.72 (dd, J=10.1 4.1, 1H) , 3.94 (dd, J=18.3, 10.5, 1H), 3.34 (dd, 18.0, 4.0), 2.71 (s, 3H).
13C NMR (DMSO-d6) : 198.94, 175.81, 136.95, 136.75, 133.8, 130.07, 129.24, 128.54, 125.37, 123.38, 121.61, 121.18, 113.76, 110.19, 43.49, 38.33, 20.67.
FAB-MS: m/z 308 [M+H] +
以下に示す経路で、6’−F−Auxinole(化合物(I−1−8))を製造した。
30mL丸底フラスコ内で、化合物(I−1b−1)(0.40g、1.96mmol)をベンゼン(10mL)で溶解させた。次いで、6−フルオロインドール(0.40g、2.95mmol)を加えて、80℃で4時間撹拌した。室温まで冷却後、次いで、析出した結晶を桐山漏斗(登録商標)で集め、ベンゼン(1mL)で結晶を洗浄した。その後、結晶を減圧乾燥して、6’−F−Auxinole(化合物(I−1−8)を得た(収量:0.45g、収率:67%、融点:178〜179℃)。
1H NMR (DMSO-d6) : 11.0 (brs, 1H) 7.79 (d, J=7.8, 1H), 7.64 (dd, J=11.4, 5.5, 1H), 7.31 (d, J=2.3, 1H), 7.13 (m, 3H), 6.87 (td, J=9.6, 2.7, 1H), 4.29 (dd, J=10.5 4.1, 1H) , 3.87 (dd, J=17.4, 10.9, 1H), 3.34 (dd, 18.0, 4.0), 2.37 (s, 3H), 2.31 (s, 3H).
13C NMR DMSO-d6) : 201.55, 174.65, (160.00, 157.67: JC-F=234 Hz), 141.44, 137.42, (136.14, 136.01: JC-F=12.4 Hz), 134.62, 132.31, 129.25, 126.40, 123.82, 123.07, (120.09, 119.99: JC-F=10.5 Hz), 112.1, (107.24, 107.00: JC-F=24.0 Hz), (97.52, 97.27: JC-F=25.8 Hz), 43.58, 37.98, 20.87, 20.85.
FAB-MS: m/z 340[M+H] +
1.細胞の準備
Tet−OsTIR1遺伝子を含むプラスミドが導入されており、MCM2−mAID−mClover遺伝子が染色体上に挿入されているHCT116細胞(ヒト結腸腺癌由来細胞)(以下、「MCM2−mAID−mClover発現細胞」と称する)を準備した。また、Tet−OsTIR1遺伝子を含むプラスミドが導入されており、SMC6−mAID−mClover遺伝子が染色体上に挿入されているHCT116細胞(ヒト結腸腺癌由来細胞)(以下、「SMC6−mAID−mClover発現細胞」と称する)を準備した。
MCM2−mAID−mClover発現細胞及びSMC6−mAID−mClover発現細胞にテトラサイクリン系抗生物質としてドキシサイクリン(Dox)(培地中の濃度:2μg/mL)と、タンパク質分解阻害剤候補化合物として、PEO−IAA(和光純薬工業社製)又は合成例1〜7で得られた各化合物(培地中の濃度:各100μM)とを添加して、24時間培養した。また、対照として、Dox及び候補化合物を添加していない細胞、Doxのみを添加した細胞、Dox及び天然オーキシンであるIAAを添加した細胞、Dox及びアンチオーキシンとして知られているパラクロロイソ酪酸(PCIB)を添加した細胞も準備した。
各種化合物の添加から24時間後に細胞を回収し、FACS解析を行った。結果を図1に示す。図1において、「Control」とは、Doxのみを添加した細胞を示し、「Untreated」とは、Dox及び候補化合物を添加していない細胞を示す。
特に、MCM2−mAID−mClover発現細胞では、Auxinolを添加した細胞において、MCM2タンパク質の分解が顕著に抑制されていた。また、SMC6−mAID−mClover発現細胞では、Auxinol、PEO−IAA ethyl ester及び4Cl−PEO−IAAを添加した細胞において、SMC6タンパク質の分解が顕著に抑制されていた。
実施例1の結果からAuxinolを用いて、再度タンパク質の分解阻害効果を確認した。
実施例1の「1.」に記載のSMC6−mAID−mClover発現細胞を準備した。
SMC6−mAID−mClover発現細胞にDox及びAuxinoleを培地中の濃度がそれぞれ2μg/mL及び100μMとなるように添加して、24時間培養した。対照として、Dox及びAuxinoleを添加していない細胞、Doxのみを添加した細胞、Dox及び天然オーキシンであるIAAを添加した細胞も準備した。
Dox及びAuxinoleの添加から24時間後に細胞を回収し、FACS解析を行った。結果を図2に示す。図2において、「+OsTIR1」とは、Doxのみを添加した細胞を示し、「Untreated」とはDox及びAuxinoleを添加していない細胞を示す。
1.細胞の準備
Tet−OsTIR1遺伝子を含むプラスミドが導入されており、DHC1−mAID−mClover遺伝子が染色体上に挿入されているHCT116細胞(ヒト結腸腺癌由来細胞)(以下、「DHC1−mAID−mClover発現細胞」と称する)を準備した。
DHC1−mAID−mClover発現細胞にTet又はDox(培地中の濃度:各2μg/mL)及びAuxinを添加して、72時間培養した。対照として、Dox及びAuxinを添加しない細胞、Tet及びAuxinを添加しない細胞、Doxを添加し、Auxinを添加しない細胞、Tetを添加し、Auxinを添加しない細胞も準備した。
Dox及びAuxin添加時に細胞数の測定し、さらに、Dox及びAuxin添加から24時間後、48時間後、72時間後、及び、96時間後に細胞数を測定した。結果を図3Aに示す。図3Aにおいて、「Control」とは、Dox及びAuxinを添加しない細胞である。「+dox」とは、Doxを添加し、Auxinを添加しない細胞である。
Dox及びAuxin添加から48時間後に、Dox及びAuxinを添加しない細胞、並びに、Doxを添加し、Auxinを添加しない細胞を、顕微鏡(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、型番:VOS XL Core)を用いて観察した(倍率:10倍)。結果を図3Bに示す。
Tet及びAuxin添加から42時間後に細胞を回収し、細胞破砕液を調製した。次いで、得られた細胞破砕液を用いて、ウエスタンブロッティングにより、抗DHC1抗体、抗DIC抗体及び抗p150抗体を用いて、DHC1−mAID−mClover、並びに、DHC1と複合体を形成するDIC及びp150の発現量をそれぞれ解析した。結果を図3Cに示す。図3Cにおいて、「DHC1−mAC」とは、抗DHC1抗体を用いて検出されたDHC1−mAID−mClover融合タンパク質を示す。また、「DIC」とは、dynein intermediate chainの略称であり、ダイニン中間鎖を意味する。また、p150とはダイナクチンのサブユニットである。
参考例1で示唆されたTIR1によるオーキシン非依存性のタンパク質の分解を阻害するために、Auxinoleの添加による阻害効果を検討した。
参考例1の「1.」と同様に、DHC1−mAID−mClover発現細胞を準備した。
次いで、DHC1−mAID−mClover発現細胞にDox及びAuxinoleを培地中の濃度がそれぞれ2μg/mL及び100μMとなるように添加し、24時間培養した。
Dox及びAuxinoleの添加から24時間後の細胞を、デコンボリューション蛍光顕微鏡(横河電機社製、型番:CV1000)を用いて観察した(倍率:60倍)。結果を図4に示す。図4において、「Control」とは、Dox及びAuxinを添加せず、代わりにジメチルスルホキシド(Dimethyl sulfoxide;DMSO)を2μg/mLとなるように添加した細胞である。「+Dox」とは、Doxのみを添加した細胞である。「+Dox and auxinole」はDox及びAuxinoleを添加した細胞である。
Auxinoleを用いた目的タンパク質の分解制御を検討した。
参考例1の「1.」と同様に、DHC1−mAID−mClover発現細胞を準備した。
DHC1−mAID−mClover発現細胞にDox及びAuxinoleを培地中の濃度がそれぞれ2μg/mL及び100μMとなるように添加し、48時間培養した。Dox及びAuxinoleの添加から48時間後の細胞を、デコンボリューション蛍光顕微鏡(横河電機社製、型番:CV1000)を用いて観察した(倍率:60倍)。結果を図5Aに示す。図5Aにおいて、「Control」とは、Dox及びAuxinoleを添加せず、代わりにDMSOを培地中の濃度が2μg/mLとなるように添加した細胞である。「+Dox」とは、Doxを添加した細胞である。「+auxinole」とは、auxinoleを添加した細胞である。
一方、Dox及びAuxinoleを添加した細胞では、Controlと比較して大きな変化は見られなかった。よって、Auxinoleの添加により、分裂期細胞の蓄積が抑制されていることが確認された。
図5Bに示すように、以下のプロトコールに従って、DHC1−mAID−mClover発現細胞を培養し、DHC1−mAID−mClover融合タンパク質の分解制御を検討した。まず、Doxのみを培地中の濃度が2μg/mLとなるように添加、又は、Dox及びAuxinoleを培地中の濃度がそれぞれ2μg/mL及び100μMとなるように添加して、24時間培養した。次いで、Auxinを培地中の濃度が500μMとなるように添加し、Auxinの添加から1時間後及び4時間後に細胞を回収し、FACS解析を行った。また、試験開始前の細胞、Doxのみを添加又はDox及びAuxinoleを添加して24時間培養した細胞も同様に回収し、FACS解析を行った。結果を図5Bに示す。
Auxinoleを用いた目的タンパク質の発現制御を検討した。
CMV−OsTIR1遺伝子を含むプラスミドが導入されており、RAD21−mAID−mClover遺伝子が染色体上に挿入されているHCT116細胞(ヒト結腸腺癌由来細胞)(以下、「RAD21−mAID−mClover発現細胞」と称する)を準備した。
図6に示すように、以下のプロトコールに従って、RAD21−mAID−mClover発現細胞を培養し、RAD21−mAID−mClover融合タンパク質の発現制御を検討した。まず、Auxinを培地中の濃度が100μMとなるように添加し、2時間培養した。次いで、Auxinを含む培養液を取り除き、Auxinoleを培地中の濃度が100μMとなるように添加した培地、又は、Auxinoleを添加しない培地に交換して、培養した。培地交換から1時間後、2時間後、3時間後、4時間後、5時間後及び6時間後に細胞を回収し、FACS解析を行った。結果を図6に示す。
Claims (13)
- TIR1オーキシン受容体拮抗剤を含有するオーキシンデグロンシステムにおけるタンパク質分解阻害剤。
- 前記TIR1オーキシン受容体拮抗剤が、インドール−3−酢酸誘導体である請求項1に記載のオーキシンデグロンシステムにおけるタンパク質分解阻害剤。
- 前記TIR1オーキシン受容体拮抗剤が、下記一般式(I)で示される化合物である請求項1又は2に記載のオーキシンデグロンシステムにおけるタンパク質分解阻害剤。
- 前記TIR1オーキシン受容体拮抗剤が、下記一般式(I−1)で示される化合物である請求項1〜3のいずれか一項に記載のオーキシンデグロンシステムにおけるタンパク質分解阻害剤。
- 前記TIR1オーキシン受容体拮抗剤が、下記一般式(I−2)で示される化合物である請求項1〜4のいずれか一項に記載のオーキシンデグロンシステムにおけるタンパク質分解阻害剤。
- 前記TIR1オーキシン受容体拮抗剤が、下記式(I−1−1)〜(I−1−8)のいずれかで示される化合物である請求項1〜4のいずれか一項に記載のオーキシンデグロンシステムにおけるタンパク質分解阻害剤。
- 前記TIR1オーキシン受容体拮抗剤が、前記式(I−1−2)、(I−1−4)、又は(I−1−6)で示される化合物である請求項6に記載のオーキシンデグロンシステムにおけるタンパク質分解阻害剤。
- 請求項1〜7のいずれか一項に記載のオーキシンデグロンシステムにおけるタンパク質分解阻害剤と、
TIR1ファミリータンパク質をコードする第一の核酸と、
Aux/IAAファミリータンパク質の全長又は部分タンパク質をコードする第二の核酸と、
を備えるオーキシンデグロンシステムのキット。 - 請求項1〜7のいずれか一項に記載のオーキシンデグロンシステムにおけるタンパク質分解阻害剤と、
TIR1ファミリータンパク質をコードする第一の核酸、並びに、目的タンパク質をコードする第三の核酸及び前記第三の核酸の上流又は下流に連結されたAux/IAAファミリータンパク質の全長又は部分タンパク質をコードする第二の核酸を含む真核細胞と、
を備えるオーキシンデグロンシステムのキット。 - 請求項1〜7のいずれか一項に記載のオーキシンデグロンシステムにおけるタンパク質分解阻害剤を用いた目的タンパク質分解制御方法。
- TIR1ファミリータンパク質をコードする第一の核酸、及び前記第一の核酸の5’末端に、作動可能に連結されているテトラサイクリン誘導性プロモーターと、
目的タンパク質及びAux/IAAファミリータンパク質の全長又は部分タンパク質を含む融合タンパク質をコードする第四の核酸と、を含む真核細胞を含む第一の培養物に、請求項1〜7のいずれか一項に記載のオーキシンデグロンシステムにおけるタンパク質分解阻害剤、及びテトラサイクリンを添加して、前記TIR1ファミリータンパク質、及び前記融合タンパク質を発現した真核細胞を含む第二の培養物を得る工程と、
前記第二の培養物から、前記タンパク質分解阻害剤を除去し、オーキシン類を添加し、前記目的タンパク質を分解させた第三の培養物を得る工程と、
を有する目的タンパク質分解制御方法。 - TIR1ファミリータンパク質をコードする第一の核酸、及び前記第一の核酸の5’末端に、作動可能に連結されているプロモーターと、
目的タンパク質及びAux/IAAファミリータンパク質の全長又は部分タンパク質を含む融合タンパク質をコードする第四の核酸と、を含み、前記TIR1ファミリータンパク質、及び前記融合タンパク質を発現している真核細胞を含む第一の培養物に、オーキシン類を添加し、前記目的タンパク質を分解させた第二の培養物を得る工程と、
前記第二の培養物から、前記オーキシン類を除去し、請求項1〜7のいずれか一項に記載のオーキシンデグロンシステムにおけるタンパク質分解阻害剤を添加し、前記目的タンパク質を発現させた第三の培養物を得る工程と、
を有する目的タンパク質分解制御方法。 - 下記一般式(I)で示される化合物。
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