JPWO2018168525A1 - ポリアミン高含有酵母及びそれを含む飲食品組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
[1]
協会7号酵母との比較で、
ロイシン合成酵素、アコニット酸合成酵素、S−アデノシル−L−メチオニン合成酵素、アスパラギン酸/グルタミン酸輸送タンパクのいずれか1つまたはそれ以上のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加、またはそれらの2つ以上の組み合わせで変異されているか、あるいは
第3染色体にコードされているLEU1遺伝子、第10染色体にコードされているACO2遺伝子、第12染色体にコードされているSAM1遺伝子、第16染色体にコードされているAGC1遺伝子のいずれか1つまたはそれ以上の塩基酸配列において、1個または数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加、またはそれらの2つ以上の組み合わせで変異されており、
且つポリアミンを高含有している、酵母変異体。
[2]
協会7号酵母における、LEU1遺伝子の266番目のC、ACO2遺伝子の1964番目のT、SAM1遺伝子の1130番目のC、AGC1遺伝子の744番目のAに対応する位置にある塩基のいずれか1つ又はそれ以上が一塩基置換されている、[1]に記載の酵母変異体。
[3]
LEU1遺伝子の266番目のCに対応する塩基がA、第10染色体にコードされているACO2遺伝子の1964番目のTに対応する塩基がC、第12染色体にコードされているSAM1遺伝子の1130番目のCに対応する塩基がG、第16染色体にコードされているAGC1遺伝子の744番目のAに対応する塩基がTである、[2]に記載の酵母変異体。
[4]
サッカロマイセス(Saccharomyces)に属する酵母である、[1]〜[3]のいずれかに記載の酵母変異体。
[5]
ポリアミンの含有量がプトレシン、スペルミジン及びスペルミンの総量である、[1]〜[4]のいずれかに記載の酵母変異体。
[6]
[1]〜[5]のいずれかに記載の酵母変異体と結晶性多糖類とを含有する飲食品組成物。
[7]
酵母変異体と結晶性多糖類の重量比が1:0.1〜1である、[6]に記載の組成物。
[8]
結晶性多糖類がシクロデキストリン及び/又は難消化性デキストリンである、[6]または[7]に記載の組成物。
[9]
協会7号酵母との比較で、
ロイシン合成酵素、アコニット酸合成酵素、S−アデノシル−L−メチオニン合成酵素、アスパラギン酸/グルタミン酸輸送タンパクのいずれか1つまたはそれ以上のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加、またはそれらの2つ以上の組み合わせについて変異させるか、あるいは
第3染色体にコードされているLEU1遺伝子、第10染色体にコードされているACO2遺伝子、第12染色体にコードされているSAM1遺伝子、第16染色体にコードされているAGC1遺伝子のいずれか1つまたはそれ以上の塩基酸配列において、1個または数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加、またはそれらの2つ以上の組み合わせで変異させる工程、を含む、
ポリアミンを高含有している酵母変異体の製造方法。
一態様において、本発明は、協会7号酵母との比較で、ロイシン合成酵素、アコニット酸合成酵素、S−アデノシル−L−メチオニン合成酵素、アスパラギン酸/グルタミン酸輸送タンパクの中の1つまたはそれ以上のアミノ酸配列において、100個以下、好ましくは20個以下、より好ましくは1個または数個、例えば2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個又は10個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加、またはそれらの2つ以上の組み合わせで変異されているか、あるいは
第3染色体にコードされているLEU1遺伝子、第10染色体にコードされているACO2遺伝子、第12染色体にコードされているSAM1遺伝子、第16染色体にコードされているAGC1遺伝子のいずれか1つまたはそれ以上の塩基酸配列において、1個または数個、例えば2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個又は10個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加、またはそれらの2つ以上の組み合わせで変異されており、
且つポリアミンを高含有している酵母変異体(以下、「変異酵母」、「変異体」、「ポリアミン高含有酵母」とも言う)を提供する。
より具体的には、本発明に係る酵母変異体はポリアミンを酵母1g(乾燥重量)当たり1.5mg以上、好ましくは2.0mg以上、より好ましくは3.0mg、より更に好ましくは10mg以上含有し得る。
別の態様において、本発明はポリアミン高含有酵母、特にスペルミジン高含有酵母を含む組成物であって、特に細胞を活性化する組成物を提供する。ポリアミンに熱安定性等の機能を付与する観点から、組成物中には酵母以外に結晶性多糖類が含まれていてもよい。結晶性多糖とは天然で結晶性の固体として存在する多糖を意味し、その例として、デンプン、デキストリン、グリコーゲン及びセルロースがある。結晶性多糖類以外の通常の糖類を組成物と併用した場合、糖類があめ状に変化して固まってしまい、組成物の取り扱いが困難になってしまう。
別の態様において、本発明はポリアミン高含有酵母を製造する方法を提供する。ポリアミン高含有酵母の製造方法は、協会7号酵母との比較で、
ロイシン合成酵素、アコニット酸合成酵素、S−アデノシル−L−メチオニン合成酵素、アスパラギン酸/グルタミン酸輸送タンパクのいずれか1つまたはそれ以上のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加、またはそれらの2つ以上の組み合わせについて変異させるか、あるいは
第3染色体にコードされているLEU1遺伝子、第10染色体にコードされているACO2遺伝子、第12染色体にコードされているSAM1遺伝子、第16染色体にコードされているAGC1遺伝子のいずれか1つまたはそれ以上の塩基酸配列において、1個または数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加、またはそれらの2つ以上の組み合わせで変異させる工程、を含む。当該方法は更に、酵母にポリアミンを高含有させる任意の工程を含んでもよい。
サンプル10〜100mgに、5%の過塩素酸及び2ppmの1,7−ジアミノヘプタンを溶解した水溶液を4ml加えて懸濁し、50℃で10分〜1時間保持することにより、粉体中のポリアミンを抽出した。その後、抽出物を遠心分離し、得られた上清0.1mlに対して、2%の過塩素酸及び2ppmの1,7−ジアミノヘプタンを溶解した水溶液を0.4ml加えた後、18%炭酸ナトリウム水溶液0.25mlに混合した。混合物をさらに1%ダンシルクロリド0.5mlと混合し、45℃で1時間保持した。これに10%プロリン水溶液を0.25ml加え、さらに45℃で10分保持した。その後、混合物にトルエンを2ml加え、激しく混合したのち、トルエン層を1ml取得した。更にトルエン層を窒素吹込みによって乾固し、アセトニトリル0.5mlに再溶解したものを液体クロマトグラフィーによって分析した。検量線は、1,7−ジアミノヘプタンの濃度を2ppmに固定したうえで、スペルミジン、スペルミン、プトレシンンの各ポリアミンについて0.125〜8ppmの希釈系列を作成し、その液体クロマトグラフィー分析値(ピーク面積値)から作成した。特に断りのない限り、上記の試薬は和光純薬製のものを使用した。
装置:島津製作所、高速液体クロマトグラフィー、LC−20A
カラム:YMC−Pack ODS−TMS(5μm)、150x4.6mm I.D.
測定温度:40℃
検出:蛍光検出器励起365nmにおける、510nm蛍光
溶離液:アセトニトリル:水=72:28
溶出速度:1.5mL/min
変異前の親株として、酵母はサッカロマイセス(協会7号株)を使用した。親株をBacto製酵母エキス1%、Bacto製ペプトン2%、グルコース2%を含む液体培地で30℃で16時間振とう培養した後、培養液に45Wの紫外線を照射した。その後、培養液を50mMリン酸カリウムバッファ(pH7)で1〜10万倍希釈し、Bacto製酵母エキス1%、Bacto製ペプトン2%、グルコース2%、アガロース2%を含む寒天培地に塗布した。寒天培地を30℃で2日間静置し、出現したコロニーの中からポリアミン高生産株を割り出した。
上記ポリアミン高生産の変異酵母菌株を培養した。培養はスクロース50g/L、硫酸アンモニウム3g/L、リン酸2水素カリウム4g/L、リン酸水素2カリウム2g/L、硫酸マグネシウム・7水和物0.4g/L、バクト酵母エキス10g/L、ビオチン0.002g/L、塩化カルシウム・2水和物0.4g/L、塩化マンガン・4水和物0.01g/L、硫酸亜鉛・7水和物0.02g/L、クエン酸鉄・n水和物0.06g/L、ホウ酸0.002g/L、モリブデン酸アンモニウム・4水和物0.001g/L、ヨウ化カリウム0.001g/L、硫酸銅・5水和物0.001g/L、塩化コバルト・6水和物0.001g/L、食塩0.05g/Lの組成の培地で行った。培養温度30℃で攪拌しながら4日間変異酵母を培養した。培養液を遠心分離して菌体を濃縮し、さらに水洗した。これを60℃で1時間加熱処理し、スプレードライした。スプレードライはビュッヒ製ミニスプレードライヤーb−290を使用した。出口温度85〜90℃で乾燥酵母を得た。乾燥酵母にはプトレシン0.72mg/g、スペルミジン3.62mg/g、スペルミン0.38mg/g(合計4.72mg/g)が含まれていた。
特許第5974891号公報段落0014記載の方法で、S−アデノシルメチオニン(SAMe)含有酵母を得た。プトレシンは検出されず、スペルミジンは0.29mg/g、スペルミンは0.16mg/g(合計0.45mg/g)であった。
サッカロマイセス(協会7号株)を実施例1と同様の条件で培養等することで比較例1の乾燥酵母を得た。プトレシンは非検出、スペルミジンの含有量は0.51mg/g、スペルミンの含有量は0.45mg/g(合計0.96mg/g)であった。
結晶性多糖類の効果を確認するために、上記の実施例及び比較例に加え、スプレードライ工程前にγ―シクロデキストリンを添加したサンプルを調製した。
実施例1の変異酵母を実施例1と同様の条件で培養した。製造した酵母(プトレシン1.07mg/g、スペルミジン4.24mg/g、スペルミン0.36mg/gで、合計5.66mg/g)を含む培養液を遠心分離して菌体を濃縮し、さらに水洗した。この菌体にαーシクロデキストリンが50重量%になるようにαーシクロデキストリンを含む水溶液を加えた。これを60℃で1時間処理した。この時点でのポリアミン含量は、乾燥固形分当たり、プトレシンが0.58mg/g、スペルミジンが2.18mg/g、スペルミンが0.18mg/gであり、合計で2.93mg/gであった。シクロデキストリンを入れた分、単位重量当たりのポリアミン含量は低くなっているが、酵母菌中のポリアミンは失われていない。続いて酵母をスプレードライした。スプレードライはビュッヒ製ミニスプレードライヤーb−290を使用した。出口温度95〜100℃で乾燥酵母粉体を得た。乾燥粉体中のポリアミン含有量は、プトレシンが0.63mg/g、スペルミジンが2.26mg/g、スペルミンが0.19mg/g(合計3.08mg/g)であった。スプレードライ前後でポリアミン含量は減少していなかった。
菌体濃縮前の実施例2の酵母培養液と比較例1の酵母培養液を2:3の割合で混合し、これを60℃で1時間処理した。その後、酵母培養液を真空乾燥することで乾燥酵母を得た。その結果、プトレシンの含有量が0.29mg/g、スペルミジンの含有量が1.75mg/g、スペルミンの含有量が0.42mg/g(合計2.46mg/g)の酵母粉体が得られた。
96ウェルプレートのウェルにHela細胞を2000個ずつ、100ulのDMEM・10%ウシ胎児血清混合培地に懸濁した状態で撒いた。次に、実施例1記載の酵母粉体、実施例2記載の酵母粉体、実施例4記載の酵母粉体、参考例記載の酵母粉体、比較例1記載の酵母粉体、大豆抽出物(比較例2)、米胚芽エキス(比較例3)、酵母エキス(比較例4)を、それぞれ水に10000mg/Lの濃度で懸濁し、オートクレーブ滅菌した。各液体をよく懸濁し、ウェルに6.3ul添加した。この操作により、各サンプルの濃度は600mg/Lとなった。また、滅菌水を別のウェルに6.3ul入れたものをコントロールとした。96ウェルプレートを、37℃で5%二酸化炭素条件で20時間静置した。その後、培地を廃棄し、さらに各ウェルをDMEM培地100ulで洗浄した。その後新たに各ウェルにDMEMと、同仁化学研究所製のcell counting kit 8液を10:1の体積比で混合した液を100ul入れ、37℃で40分間静置した。最後にPerkin Elmer ARVO X3を用いて各ウェルの450nm吸光度を測定した。細胞の増殖を、コントロールとの吸光度の比で評価した。
実施例1、実施例2記載の酵母粉体、大豆抽出物粉体(比較例2)、米胚芽エキス粉体(比較例3)、酵母エキス粉体(比較例4)を20mgずつ蓋付きのガラス試験管に封入し、150℃のアルミブロックヒーター上で0〜60分静置したのち、そのポリアミン含量を測定した。
上段の数字はポリアミン含量[mg/g]、下段の数字は加熱前との比[%]である。
上段の数字はスペルミジン含量[mg/g]、下段の数字は加熱前との比[%]である。
実施例1で得た乾燥酵母に対し、αーシクロデキストリンを酵母:αーシクロデキストリンの重量比が1:1になるように添加して粉末のまま混合した(実施例5)。できた食品は50%αーシクロデキストリン含有酵母である。
本発明の変異酵母とシクロデキストリンとを併用することで酵母臭を改善できた。シクロデキストリンはポリアミンの安定性を上げ、熱安定性を増し、加工・調理を容易にする効果と共に酵母臭も改善することができる。
Claims (9)
- 協会7号酵母との比較で、
ロイシン合成酵素、アコニット酸合成酵素、S−アデノシル−L−メチオニン合成酵素、アスパラギン酸/グルタミン酸輸送タンパクのいずれか1つまたはそれ以上のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加、またはそれらの2つ以上の組み合わせで変異されているか、あるいは
第3染色体にコードされているLEU1遺伝子、第10染色体にコードされているACO2遺伝子、第12染色体にコードされているSAM1遺伝子、第16染色体にコードされているAGC1遺伝子のいずれか1つまたはそれ以上の塩基酸配列において、1個または数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加、またはそれらの2つ以上の組み合わせで変異されており、
且つポリアミンを高含有している、酵母変異体。 - 協会7号酵母における、LEU1遺伝子の266番目のC、ACO2遺伝子の1964番目のT、SAM1遺伝子の1130番目のC、AGC1遺伝子の744番目のAに対応する位置にある塩基のいずれか1つ又はそれ以上が一塩基置換されている、請求項1に記載の酵母変異体。
- LEU1遺伝子の266番目のCに対応する塩基がA、第10染色体にコードされているACO2遺伝子の1964番目のTに対応する塩基がC、第12染色体にコードされているSAM1遺伝子の1130番目のCに対応する塩基がG、第16染色体にコードされているAGC1遺伝子の744番目のAに対応する塩基がTである、請求項2に記載の酵母変異体。
- サッカロマイセス(Saccharomyces)に属する酵母である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の酵母変異体。
- ポリアミンの含有量がプトレシン、スペルミジン及びスペルミンの総量である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の酵母変異体。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載の酵母変異体と結晶性多糖類とを含有する飲食品組成物。
- 酵母変異体と結晶性多糖類の重量比が1:0.1〜1である、請求項6に記載の組成物。
- 結晶性多糖類がシクロデキストリン及び/又は難消化性デキストリンである、請求項6または7に記載の組成物。
- 協会7号酵母との比較で、
ロイシン合成酵素、アコニット酸合成酵素、S−アデノシル−L−メチオニン合成酵素、アスパラギン酸/グルタミン酸輸送タンパクのいずれか1つまたはそれ以上のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加、またはそれらの2つ以上の組み合わせについて変異させるか、あるいは
第3染色体にコードされているLEU1遺伝子、第10染色体にコードされているACO2遺伝子、第12染色体にコードされているSAM1遺伝子、第16染色体にコードされているAGC1遺伝子のいずれか1つまたはそれ以上の塩基酸配列において、1個または数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加、またはそれらの2つ以上の組み合わせで変異させる工程、を含む、
ポリアミンを高含有している酵母変異体の製造方法。
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