JPWO2016208699A1 - 光学活性含フッ素アルキルエチレンオキシドの工業的な製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】光学活性含フッ素アルキルエチレンオキシドの工業的な製造方法を提供する。【解決手段】含フッ素アルキルクロロメチルケトンに、該ケトンを不斉還元する活性を有する微生物または該活性を有する酵素を作用させることにより、光学活性含フッ素アルキルクロロメチルアルコールを高い光学純度で収率良く製造することができる。続いて、該アルコールに塩基を作用させることで含フッ素アルキルエチレンオキシドを得ることができる。本発明の製造方法は、工業的な実施が容易である。

Description

本発明は、光学活性含フッ素アルキルエチレンオキシドの工業的な製造方法に関する。

光学活性含フッ素アルキルエチレンオキシドは種々の医農薬中間体として重要な化合物である。光学活性２−トリフルオロメチルエチレンオキシドの製造方法として、非特許文献１では、微生物を用いた１，１，１−トリフルオロプロペンの不斉酸化による方法が、非特許文献２では、ラセミ体の２−トリフルオロメチルエチレンオキシドの速度論的光学分割による方法が、非特許文献３では３−ブロモ−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノンを不斉還元剤で不斉還元し、得られた光学活性１−ブロモ−３，３，３−トリフルオロイソプロピルアルコールに塩基を作用させて閉環する方法が、非特許文献４では、光学分割剤を用いて光学活性３，３，３−トリフルオロ乳酸を得、置換基に対する保護基による保護、脱保護、及びエステル化等、多段階工程を経て、得られたスルホン酸エステルを塩基と作用させる方法が、特許文献１では光学活性３，３，３−トリフルオロ−１，２−プロパンジオールを再結晶によって光学純度を高め、光学活性１−クロロ−３，３，３−トリフルオロイソプロピルアルコールへ誘導した後に塩基を作用させて閉環する方法が開示されている。

一方、本発明者らも特許文献２において、光学活性３，３，３−トリフルオロ乳酸から光学活性３，３，３−トリフルオロ−１，２−プロパンジオールを誘導し、環状硫酸エステル体を経て、ハロヒドリン体に変換し、光学活性２−トリフルオロメチルエチレンオキシドに誘導する方法を開示している。

また、光学活性２−モノフルオロメチルエチレンオキシドについては、非特許文献２にラセミ体の２−モノフルオロメチルエチレンオキシドの速度論的光学分割による方法が開示されている。

他方、光学活性２−ジフルオロメチルエチレンオキシドについてはこれまでに合成例は知られていない。

特開平６−２４７９５３号公報 特開２００６−３２８０１１号公報

Chirality in Industry, Wiley, New York, 1992 S. E. Schaus, B. D. Brandes, J. F. Larrow, M. Tokunaga, . B. Hansen, A. E. Gould, M. E. Furrow, and E. N. Jacobsen, Journal of the American Chemical Society, 2002, 124, 1307-1315 P. V. Ramachandran, B. Gong, H. C. Brown, J. Org. Chem, 1995, 60, 41-46 C. von dem Bussche-Hunnefeld, C. Cescato, D. Seebach, Chem. Ber., 1992, 125, 2795-2802

前述のとおり、２−トリフルオロメチルエチレンオキシドについては、非特許文献１では、微生物による１，１，１−トリフルオロプロペンの不斉酸化による方法が開示されており、生物学的な不斉酸化が適用できることを示しているが、Ｓ体のエナンチオマーしか製造できなかった。非特許文献２では化学触媒を用いたラセミ体の２−トリフルオロメチルエチレンオキシドの速度論的光学分割による方法が開示されており、９９％ｅｅ以上と極めて高い光学純度の光学活性２−トリフルオロメチルエチレンオキシドが得られる旨、開示されているが、望まない立体化学を有する２−トリフルオロメチルエチレンオキシドを利用して再び光学分割を行うにあたり、その操作に難があった。すなわち、２−トリフルオロメチルエチレンオキシドを加水分解させて生じた３，３，３−トリフルオロ−１，２−プロパンジオールを、ラセミ体もしくは目的とする立体化学の２−トリフルオロメチルエチレンオキシドの前駆体に誘導することが極めて難しいことから、結果として、目的の立体化学を有する光学活性２−トリフルオロメチルエチレンオキシドについては、５０％以上の収率を期待することができず、工業的に採用するには難があった。非特許文献３では不斉還元剤を用いた３−ブロモ−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノンの不斉還元による方法が開示されており、９６％ｅｅと高い光学純度の光学活性１−ブロモ−３，３，３−トリフルオロイソプロピルアルコールを経て、光学活性２−トリフルオロメチルエチレンオキシドを得ているが、高価な不斉還元剤を量論的に使用する必要があり、工業的な方法とは言えなかった。非特許文献４では光学活性３，３，３−トリフルオロ乳酸から２−トリフルオロメチルエチレンオキシドを得る方法が開示されているが、反応が多段階で煩雑であるだけでなく、理論収率も最大５０％と工業的な方法とは言えなかった。
特許文献１では種々の方法で得られた、光学活性３，３，３−トリフルオロ−１，２−プロパンジオールを１−クロロ−３，３，３−トリフルオロイソプロピルアルコールに誘導し、塩基により閉環する方法が開示されているが、収率が低いという問題があった。

本発明の課題は、光学活性含フッ素アルキルエチレンオキシドを工業的に製造する方法を提供することにある。

本発明者らは、上記の課題を解決すべく、鋭意検討した結果、含フッ素アルキルクロロメチルケトンに特定の生体触媒（微生物または酵素）を作用させることにより、不斉還元が効率的に進行し、高い立体選択性で光学活性含フッ素アルキルクロロメチルアルコールが得られる方法を見出した。また、該アルコールから光学純度を維持したまま、高い収率で含フッ素アルキルエチレンオキシドに誘導する知見を得、本発明を完成した。
すなわち本発明は、以下の［発明１］−［発明１７］に記載する発明を提供する。
［発明１］
式［１］：

［式中、Ｒｆはフッ素原子を少なくとも１つ以上有する炭素数１〜６の直鎖または分岐鎖のフルオロアルキル基を表す。］
で表される含フッ素アルキルクロロメチルケトンに、該ケトンを不斉還元する活性を有する微生物または該活性を有する酵素を作用させる工程を含む、式［２］：

［式中、＊は不斉原子を表す。Ｒｆは式［１］に同じ。］
で表される光学活性含フッ素アルキルクロロメチルアルコールの製造方法。
［発明２］
式［１］で表される含フッ素アルキルクロロメチルケトンにおけるＲｆが、トリフルオロメチル（ＣＦ₃）基またはジフルオロメチル（ＣＦ₂Ｈ）基である、発明１に記載の製造方法。
［発明３］
前記微生物が、クリプトコッカス・カルバタス（Cryptococcus curvatus）、ピキア・ファリノーサ（Pichia farinosa）、トルラスポーラ・デルブルエキィ (Torulaspora delbrueckii)、キャンディダ・カカオイ (Candida cacaoi)、ロドトルラ・ムシラギノサ (Rhodotorula mucilaginosa)、スポリディボラス・ジョンソニイ (Sporidibolus johnsonii)、及びトリコスポロン・キュタネウム (Trichosporon cutaneum) からなる群より選ばれる少なくとも１種である、発明１または２に記載の製造方法。
［発明４］
前記微生物が、下記に示す受託番号を有する微生物であることを特徴とする、発明３に記載の製造方法。

［発明５］
前記酵素がアルコール脱水素酵素またはカルボニル還元酵素であることを特徴とする、発明１に記載の製造方法。
［発明６］
アルコール脱水素酵素またはカルボニル還元酵素がシロキクラゲ科、サッカロミケス科、ロドトルラ属、スポリディボラス属、トリコスポロン科の微生物、該処理物、該培養液、及び／または、該微生物から得られる酵素であることを特徴とする発明５に記載の製造方法。
［発明７］
前記反応における温度（反応温度）が、５〜６０℃であることを特徴とする、発明１乃至６の何れかに記載の製造方法。
［発明８］
前記反応におけるｐＨ（反応時におけるｐＨ）が、４．０〜８．０の範囲であることを特徴とする、発明１乃至７の何れかに記載の製造方法。
［発明９］
前記反応終了後に得られる光学活性含フッ素アルコールと、不純物とを含む混合液を蒸留することにより、該混合液から不純物を分離し、光学活性含フッ素アルコールを精製する工程を含む、発明１乃至８の何れかに記載の製造方法。
［発明１０］
発明１乃至９の何れかの方法で式［２］で表される光学活性含フッ素アルキルクロロメチルアルコールを製造し、次いで、該アルコールに塩基を作用させることを特徴とする、式［３］：

［式中、＊は不斉原子を表す。Ｒｆは請求項１における式［１］に同じ。］
で表される光学活性含フッ素アルキルエチレンオキシドの製造方法。
［発明１１］
塩基が、アルカリ金属水素化物、アルカリ土類金属水素化物、アルカリ金属水酸化物、アルカリ土類金属水酸化物、アルカリ金属炭酸塩、アルカリ土類金属炭酸塩、アルカリ金属炭酸水素塩、及びアルカリ土類金属炭酸水素塩からなる群より選ばれる少なくとも一つである、発明１０に記載の製造方法。
［発明１２］
前記光学活性含フッ素アルキルエチレンオキシドを加水分解することにより、式［４］：

［式中、＊は不斉原子を表す。Ｒｆは請求項１における式［１］に同じ。］
で表される含フッ素アルキル−１，２−エタンジオールに誘導する工程を更に含む、発明１０または発明１１に記載の製造方法。
［発明１３］
加水分解が、酸または塩基を作用させることにより行う、発明１２に記載の方法。
［発明１４］
塩基が、アルカリ金属水素化物、アルカリ土類金属水素化物、アルカリ金属水酸化物、アルカリ土類金属水酸化物、アルカリ金属炭酸塩、アルカリ土類金属炭酸塩、アルカリ金属炭酸水素塩、及びアルカリ土類金属炭酸水素塩からなる群より選ばれる少なくとも一つである、発明１３に記載の製造方法。
［発明１５］
含フッ素アルキル−１，２−エタンジオールに誘導する工程を、前記反応で得られた光学活性含フッ素アルキルエチレンオキシドを単離することなく、そのまま加水分解することにより行う、発明１２乃至１４の何れかに記載の製造方法。
［発明１６］
式：

［式中、＊は不斉原子を表す。］
で表される光学活性１−クロロ−３，３−ジフルオロイソプロピルアルコール。
［発明１７］
式：

［式中、＊は不斉原子を表す。］
で表される光学活性２−ジフルオロメチルエチレンオキシド。

本発明者らは、微生物菌体や酵素といった生体触媒の中から本発明の目的を達成することができる生体触媒のスクリーニングを鋭意実施し、光学活性含フッ素アルキルエチレンオキシドの中間体として利便性の高い光学活性含フッ素アルキルクロロメチルアルコールを与える生体触媒を見出し、本発明を完成するに至った。

また、その過程において、本発明者らは、用いる生体触媒を変えることで光学活性含フッ素アルキルクロロメチルアルコールの両光学異性体を作り分けることができるという、大変有用な知見を得た。

本発明では、生体触媒の基質として式［５］：

で表される含フッ素アルキルブロモメチルケトンも候補に挙げたが、生体触媒を用いた方法では水を溶媒とする必要があり、化合物中の臭素原子が水中で脱離し、目的とする光学活性含フッ素アルキルブロモアルコールが得られないことを確認した（後述の比較例参照）。このように生体触媒を用いる方法では含フッ素アルキルブロモメチルケトンは使用できない知見を踏まえ、本発明では水の存在下であっても安定な、塩素原子が導入された前記化合物を用いることとした。

含フッ素アルキルクロロメチルケトンの濃度は、反応液中の該ケトンの濃度（ｗ／ｖ）のことを意味し（還元された生成物の濃度は考慮されない（除外される））、反応全体を通しての該ケトンの添加総量を規定するものではない。

反応液中に生成した光学活性含フッ素アルキルクロロメチルアルコールは、蒸留や抽出などにより回収することができ、該アルコールに塩基を作用させることで光学純度を維持したまま光学活性含フッ素アルキルエチレンオキシドに変換することができる。さらに、その光学活性含フッ素アルキルエチレンオキシドは加水分解することにより光学純度を維持したまま光学活性含フッ素アルキル−１，２−エタンジオールへの変換が可能である。

本発明のように、高い光学純度で光学活性含フッ素アルキルクロロメチルアルコールを与える生体触媒を見出し、両光学異性の光学活性含フッ素アルキルクロロメチルアルコールを効率良く製造し、光学純度を維持したまま光学活性含フッ素アルキルエチレンオキシドに変換できる知見は従来知られていなかった。
特に、本発明での対象の１つであるＲｆがジフルオロメチル基を有する基質については、通常の化学的手法による含フッ素アルキルクロロメチルケトンの不斉還元が極めて困難であり、従来の技術では高い光学純度の光学活性ジフルオロクロロメチルアルコールを得ることはできなかった（参考例１参照）。

なお、光学活性２−ジフルオロメチルエチレンオキシド（式［３］で表される光学活性含フッ素アルキルエチレンオキシドの、Ｒｆがジフルオロメチル基の場合）、及びそれの前駆体である光学活性１−クロロ−３，３−ジフルオロイソプロピルアルコール（式［２］で表される光学活性含フッ素アルキルクロロメチルアルコールの、Ｒｆがジフルオロメチル基の場合）は新規化合物である。

本発明によれば、医農薬中間体として重要な光学活性含フッ素アルキルエチレンオキシドを、効率良く製造することができる。

また、当該エチレンオキシドの前駆体である光学活性含フッ素アルキルクロロメチルアルコールを与える生体触媒は、含フッ素アルキルクロロメチルケトン水和体を基質に用いたスクリーニングで得ることができ、さらに不斉還元反応（補酵素ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを外部から新たに加えることなく、脱水素酵素により再生させる方法など）を行うことにより、工業的に採用可能な生産性で光学活性含フッ素アルキルクロロメチルアルコールを得ることができる。

以下に、本発明について詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。

本発明は、式［１］で表される含フッ素アルキルクロロメチルケトンに該ケトンを不斉還元する活性を有する微生物または該活性を有する酵素を作用させ、式［２］で表される光学活性含フッ素アルキルクロロメチルアルコールを得る（本明細書において「工程１」と言う。）製造方法、そして、工程１の方法で光学活性含フッ素アルキルクロロメチルアルコールを製造し、該アルコールに対し塩基を作用させ、閉環反応によって式［３］で表される光学活性含フッ素アルキルエチレンオキシドを得る（本明細書において「工程２」と言う。）製造方法である。

さらに、工程２の方法で光学活性含フッ素アルキルエチレンオキシドを製造し、該エチレンオキシドを加水分解し、開環反応により式［４］で表される光学活性含フッ素アルキル−１，２−エタンジオールを得る（本明細書において「工程３」と言う。）製造方法も含め、以下にスキームとしてまとめる。

［工程１］
工程１について説明する。式［１］で表される含フッ素アルキルクロロメチルケトンは公知の化合物であり、従来技術を基に当業者が適宜調製してもよいし、市販されているものを用いてもよい。

式［１］で表される含フッ素アルキルクロロメチルケトンのうち、Ｒｆはフッ素原子を少なくとも１つ以上有する炭素数１〜６の直鎖または分岐鎖のフルオロアルキル基である。具体的な構造としては、トリフルオロメチル基、ペンタフルオロエチル基、ヘプタフルオロプロピル基、ノナフルオロブチル基、ジフルオロメチル基、１，１−ジフルオロエチル基、２，２−ジフルオロエチル基、１，１−ジフルオロプロピル基、２，２−ジフルオロプロピル基、３，３−ジフルオロプロピル基、１，１−ジフルオロブチル基、２，２−ジフルオロブチル基、３，３−ジフルオロブチル基、４，４−ジフルオロブチル基、モノフルオロメチル基、１−モノフルオロエチル基、２−モノフルオロエチル基、１−モノフルオロプロピル基、２−モノフルオロプロピル基、３−モノフルオロプロピル基、１−モノフルオロブチル基、２−モノフルオロブチル基、３−モノフルオロブチル基、４−モノフルオロブチル基が挙げられるが、その中でもトリフルオロメチル基、ペンタフルオロエチル基、ヘプタフルオロプロピル基、ノナフルオロブチル基、ジフルオロメチル基が好ましく、トリフルオロメチル基、ジフルオロメチル基が特に好ましい。

工程１の主たる反応は、含フッ素アルキルクロロメチルケトンに該ケトンを不斉還元する活性を有する微生物または該活性を有する酵素を作用させ、式［２］で表される光学活性含フッ素アルキルクロロメチルアルコールを得る反応である。この反応により光学活性含フッ素エチレンオキシドの中間体として利便性の高い含フッ素アルキルクロロメチルアルコールを得ることができる。

なお、式［１］で表される含フッ素アルキルクロロメチルケトンは、後述の実施例で示すように、当該ケトンに水もしくはアルコールが付加した、式［６］：

で表される含フッ素アルキルクロロメチルケトン水和体、及び式［７］

［式［６］または式［７］中、Ｒｆは式［１］に同じ。Ｒは炭素数１〜６の直鎖または分岐鎖のアルキル基を表す。］
で表されるアルコール付加体も同様に用いることができる。従って、これらの水和体及びアルコール付加体も本願請求項１に包合するものとして扱う。
式［７］中のＲは炭素数１〜６の直鎖または分岐鎖のアルキル基を表す。具体的にはメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、１−ブチル基、２−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、１−ペンチル基、２−ペンチル基、３−ペンチル基、２−メチル−１−ブチル基、２−メチル−２−ブチル基、３−メチル−１−ブチル基、３−メチル−２−ブチル基、ネオペンチル基、１−ヘキシル基、２−ヘキシル基、３−ヘキシル基、２−メチル−１−ペンチル基、３−メチル−１−ペンチル基、４−メチル−１−ペンチル基、２−メチル−２−ペンチル基、３−メチル−２−ペンチル基、４−メチル−２−ペンチル基、２−メチル−３−ペンチル基、３−メチル−３−ペンチル基、２，２−ジメチル−１−ブチル基、２，３−ジメチル−１−ブチル基、３，３−ジメチル−１−ブチル基、２，３−ジメチル−２−ブチル基、３，３−ジメチル−２−ブチル基、２−エチル−１−ブチル基、１−シクロプロピル基、１−シクロペンチル基、１−シクロヘキシル基が挙げられ、その中でもメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、１−ブチル基、２−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、１−ペンチル基、１−ヘキシル基、１−シクロヘキシル基を表し、その中でもメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、１−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、１−シクロヘキシル基が特に好ましい。

ここで用いる微生物は特に限定はされないが、細菌、酵母、糸状菌などから適宜選ぶことができ、例えば、クリプトコッカス・カルバタス（Cryptococcus curvatus）、ピキア・ファリノーサ（Pichia farinosa）、トルラスポーラ・デルブルエキィ (Torulaspora delbrueckii)、キャンディダ・カカオイ (Candida cacaoi)、ロドトルラ・ムシラギノサ (Rhodotorula mucilaginosa)、スポリディボラス・ジョンソニイ (Sporidibolus johnsonii)、トリコスポロン・キュタネウム (Trichosporon cutaneum) からなる群より選ばれる少なくとも１種が挙げられ、好ましくは、クリプトコッカス・カルバタス（Cryptococcus curvatus）、ピキア・ファリノーサ（Pichia farinosa）、キャンディダ・カカオイ (Candida cacaoi)、トリコスポロン・キュタネウム (Trichosporon cutaneum) からなる群より選ばれる少なくとも１種が挙げられ、より好ましくは、クリプトコッカス・カルバタス（Cryptococcus curvatus）、ピキア・ファリノーサ（Pichia farinosa）、トリコスポロン・キュタネウム (Trichosporon cutaneum) からなる群より選ばれる少なくとも１種が挙げられる。また、これらと同じ生物の種に属する微生物についても同等に用いることができる。

これらの微生物については、それぞれ下記表に示す受託番号を得て、独立行政法人製品評価技術基盤機構（〒151-0066 東京都渋谷区西原2-49-10）に寄託されている。これらの微生物は、他の微生物株保存機関にも相互に寄託されている場合があり、同様に利用することができる。なお、これらの微生物は一般に公開されているものであり、当業者が容易に入手できる。

本発明に用いる微生物としては、培養した菌体をそのまま用いることができるのは勿論、超音波やガラスビーズで破砕した菌体、アクリルアミド等で固定化した菌体、アセトンやグルタルアルデヒドなどの有機化合物で処理した菌体、アルミナ、シリカ、ゼオライト及び珪藻土等の無機担体に担持した菌体、該微生物より調製した無細胞抽出液も用いることができる。

微生物の菌体をそのまま用いた場合、菌体内に複数存在している、「相反する立体選択性を保有する還元酵素の相互作用」の影響で光学純度が中程度（４０〜７０％ｅｅ）となる場合もあるが、目的の酵素を精製して用いることで元の菌体が示す光学純度よりも高い光学純度を得ることも可能である。例えば、上記の光学活性体を与える微生物からアルコール脱水素酵素（可逆的にケトンを還元する酵素）、カルボニル還元酵素（不可逆的にケトンを還元する酵素）といった該反応を触媒する酵素を精製すればよく、該酵素の精製には、硫安分画、疎水クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどの一般的なタンパク質の精製方法が適用できる。また、該微生物よりクローニングした酵素の遺伝子を導入した遺伝子組換え体も同様に用いることができる。

酵素の単離源はスクリーニングで得られた微生物を対象とすることができ、該微生物が属する種、すなわちシロキクラゲ科、サッカロミケス科、ロドトルラ属、スポリディボラス属、トリコスポロン科の微生物から本発明の方法に用い得るアルコール脱水素酵素またはカルボニル還元酵素を得ることができる。

本発明の方法に用い得る酵素は、市販されているものも用いることができ、含フッ素アルキルクロロメチルケトンを基質に用いたスクリーニングを行うことで選抜することができる。市販されている酵素は、例えば、オリエンタル酵母工業株式会社の「アルコール脱水素酵素、酵母由来」、ユニチカ株式会社の「アルコール脱水素酵素（ＺＭ−ＡＤＨ、Zymomonas mobilis由来）」、株式会社ダイセルのChiralscreen(登録商標) OH E001（以下同じ）、E004、E007、E008、E039、E048、E052、E073、E077、E085、E094から選ばれる少なくとも１種が挙げられ、好ましくはE001、E007、E039、E085、E094より好ましくはE001、E039、E094である。また、当該酵素を発現する遺伝子組換え体も同様に用いることができる。

前記微生物の培養には、通常、微生物の培養に用いられる栄養成分を含む培地（固体培地または液体培地）が使用できるが、水溶性である含フッ素アルキルクロロメチルケトンの還元反応を行う場合には、液体培地が好ましい。培地は、炭素源としてグルコース、スクロース、マルトース、ラクトース、フルクトース、トレハロース、マンノース、マンニトール、デキストロース等の糖類、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、グリセロール等のアルコール類、クエン酸、グルタミン酸、リンゴ酸等の有機酸類が、そして窒素源としてアンモニア、アンモニウム塩、アミノ酸、ペプトン、ポリペプトン、カザミノ酸、尿素、酵母エキス、麦芽エキス、コーンスティープリカー等が用いられる。さらに、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム等の他の無機塩や、イノシトール、ニコチン酸等のビタミン類等、鉄、銅、マグネシウム、ホウ素、マンガン、モリブデン等の微量金属類等の培地組成が適宜添加できる。

これらの炭素源、窒素源、無機塩のうち、炭素源については微生物が十分に増殖する量且つ増殖を阻害しない量を加えることが好ましく、通常、培地１Ｌに対して５〜８０ｇ、好ましくは１０〜４０ｇ加える。窒素源についても同様で、微生物が十分に増殖する量且つ増殖を阻害しない量を加えることが好ましく、通常、培地１Ｌに対して５〜６０ｇ、好ましくは１０〜５０ｇ、栄養源としての無機塩については微生物の増殖に必要な元素を加える必要があるが、高い濃度の場合には増殖が阻害されるため、通常、培地１Ｌに対して０．００１〜１０ｇ加える。なお、これらは微生物に応じて複数の種類を組み合わせて使用することができる。

培地におけるｐＨは微生物の増殖に好適な範囲で調整する必要があり、通常４．０〜１０．０、好ましくは６．０〜９．０で行う。培養における温度範囲は微生物の増殖に好適な範囲で調整する必要があり、通常１０〜５０℃、好ましくは２０〜４０℃で行う。培養中は培地に空気を通気する必要があり、好ましくは０．３〜４ｖｖｍ（「ｖｖｍ」は１分間当たりの培地体積に対する通気量を意味する。「ｖｏｌｕｍｅ／ｖｏｌｕｍｅ／ｍｉｎｕｔｅ」の略である。）、より好ましくは０．５〜２ｖｖｍで行う。酸素の要求量が多い微生物に対しては、酸素発生器等を用いて、酸素濃度を高めた空気を通気してもよい。また、試験管やフラスコ等の任意の通気量を設定し難い器具については、該器具の容積に対して培地量を２０％以下に設定し、綿栓やシリコン栓等の通気栓を取り付ければよい。培養を円滑に進めるためには培地を攪拌することが好ましく、培養槽の場合には該装置の攪拌能力の好ましくは１０〜１００％、より好ましくは２０〜９０％で行う。一方、試験管やフラスコ等の小規模な器具の場合には振盪機を用いて行うのがよく、好ましくは５０〜３００ｒｐｍ、より好ましくは１００〜２８０ｒｐｍで行う。培養時間は微生物の増殖が収束する時間であればよく、６〜７２時間、好ましくは１２〜４８時間で行う。

基質である含フッ素アルキルクロロメチルケトンに前記微生物を作用させるには、通常、微生物を培養した懸濁液をそのまま反応に使用することができる。培養中に生じる成分が還元反応に悪影響を与える場合には、遠心分離等の操作で培養液から菌体を１度回収して得られた菌体（静止菌体）を用いて再び懸濁液を調製して反応に使用してもよい。また、培養した微生物菌体の細胞を破砕等して得られたものや、培養した微生物菌体から調製した酵素などの、各種細胞抽出物も反応に使用することもできる。他方、基質である含フッ素アルキルクロロメチルケトンに前記酵素（精製酵素）を作用させる場合には、該酵素を溶解させた緩衝液中で行うことができる。本反応は還元反応であることから、弱酸性の緩衝液が好ましく、リン酸ナトリウム緩衝液、リン酸カリウム緩衝液、クエン酸ナトリウム緩衝液、クエン酸カリウム緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、酢酸カリウム緩衝液が挙げられる。

前記微生物を用いた反応を効率的に進めるには、これらの懸濁液中の菌体の密度を高める必要があるが、密度が高過ぎると自己溶解酵素の産生や終末代謝産物の蓄積等により反応が阻害される場合があるため、通常１０⁶〜１０¹²ｃｆｕ／ｍｌ（「ｃｆｕ」は寒天培地上に形成されるコロニーの数を意味する、ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔｓ）、好ましくは１０⁷〜１０¹¹ｃｆｕ／ｍｌ、より好ましくは１０⁸〜１０¹⁰ｃｆｕ／ｍｌで行う。他方、前記酵素を用いた反応を効率的に進めるためには、緩衝液中の酵素の濃度を高める必要があるが、酵素を使用しすぎると経済的ではないため、好ましくは０．０１〜２０ｇ／Ｌ、より好ましくは０．１〜１０ｇの範囲で使用する。

これらの懸濁液または緩衝液への含フッ素アルキルクロロメチルケトンの添加において、該ケトンの濃度は、還元反応が円滑に進み且つ微生物または酵素の活性に悪影響を与えない濃度を維持することが好ましい。該ケトンの濃度は、２０％（ｗ／ｖ）より高い場合、微生物が死滅したり、酵素が変性したりすることがあるため、この数値以下の濃度、すなわち、通常０．０１〜１５％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．０５〜１０％（ｗ／ｖ）で行う。該ケトン濃度算出の容量の根拠は、例えば、後述する実施例１では蒸気滅菌前の試験管に分注した培養液量を、後述する実施例７では培養後の微生物の懸濁液総量を、目安として考えればよい。

基質である含フッ素アルキルクロロメチルケトンに前記微生物または酵素を作用させる際の温度（すなわち反応温度）は、該微生物または酵素に好適な範囲を維持する必要があり、通常５〜６０℃、好ましくは１５〜５０℃、より好ましくは１５〜３８℃である。また、上記作用させる際のｐＨ（すなわち反応時のｐＨ）も、好適な範囲を維持する必要があり、通常４．０〜８．０、好ましくは５．５〜８．０、より好ましくは５．５〜７．０である。

微生物懸濁液または酵素緩衝液が静置状態にあると反応効率が低下するため、反応時は反応液を攪拌しながら行う。また、反応時は無通気で行うことができるが、必要に応じて通気を行ってもよい。その際、通気量が多過ぎる場合には含フッ素アルキルクロロメチルケトン及び光学活性含フッ素アルキルクロロメチルアルコールが系外に気体として飛散するおそれがあるため、通気量は、０．３ｖｖｍ以下が好ましく、より好ましくは０．１ｖｖｍ以下である。反応時間は、目的物の生成具合によって決定すればよく、通常６〜３１２時間である。

本発明では、還元反応に利用される補酵素ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ（水素供与体）は、補酵素再生酵素（グルコース脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、グリセロール脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、以下同じ）により補酵素ＮＡＤ（Ｐ）から再生することができ、微生物での反応では微生物が本来持つ補酵素再生酵素、組換え体については所望の遺伝子を組み込むことで発現する補酵素再生酵素を用いることができる。補酵素再生酵素の基質として、各酵素に対応する基質を添加する必要があり、グルコース、ギ酸、グリセロールまたはアルコールを添加しながら行う。補酵素ＮＡＤ（Ｐ）Ｈは市販されているものを別途加えて還元反応を行うことも可能であるが、非常に高価なため経済的ではない。本発明のように補酵素ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを外部から新たに加えることなく、補酵素再生酵素により再生させることで、１菌体（１酵素）当たりの還元回数が増え、経済的に且つ高い生産性で目的物を製造することができる。

生成した光学活性含フッ素アルキルクロロメチルアルコールを反応終了液（反応終了後の不純物などを含む混合液）から回収するには、蒸留や有機溶媒による抽出、固相抽出等の有機合成における一般的な単離方法が採用できる。特に、本化合物は反応終了液、または必要に応じてろ過により菌体を取り除いた後の濾液から直接、蒸留に付すことで粗生成物を水溶液として簡便に且つ収率良く回収することができる点は従来技術と比較しても非常に有用である。得られた粗生成物の水溶液は、必要に応じて、脱水、活性炭、分別蒸留、カラムクロマトグラフィー等の精製操作を行うことができるが、直接粗体のまま次の工程の光学活性含フッ素アルキルエチレンオキシドの合成に使用できる点も工業的な観点から望ましい態様の一つである。
粗生成物を精製する方法としては、特に有機溶媒による抽出とそれに続く分別蒸留が好ましい。有機溶媒としては、エーテル系溶媒、エステル系溶媒、ハロゲン系溶媒、脂肪族炭化水素系溶媒、芳香族炭化水素系溶媒などが採用できる。具体的にはジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル、メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル、シクロペンチルメチルエーテル、テトラヒドロフラン、２−メチルテトラヒドロフラン、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ｔ−ブチル、塩化メチレン、クロロホルム、１，２−ジクロロエタン、ｎ−ヘキサン、シクロヘキサン、ｎ−ヘプタン、ｎ−ノナン、ｎ−オクタン、トルエン、キシレン等が挙げられ、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル、テトラヒドロフラン、２−メチルテトラヒドロフラン、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、塩化メチレン、クロロホルム、１，２−ジクロロエタン、ｎ−ヘキサン、シクロヘキサン、ｎ−ヘプタン、トルエンが好ましく、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル、２−メチルテトラヒドロフラン、酢酸エチル、塩化メチレン、クロロホルム、ｎ−ヘキサン、トルエンが特に好ましい。これらの溶媒を単独若しくは組み合わせて使用しても良い。
また、反応終了液から菌体を取り除いた後の濾液を直接、上記で示した有機溶媒を用いることにより抽出し、それに対し濃縮を行うことにより光学活性含フッ素アルキルクロロメチルアルコールを回収することも出来る。
［工程２］
次に、工程２について説明する。工程２は、前記工程で製造した式［２］で表される光学活性含フッ素アルキルクロロメチルアルコールを原料とし、該アルコールに塩基を作用させることで、式［３］で表される光学活性含フッ素アルキルエチレンオキシドを得る工程である。ここで塩基を作用させ、閉環することにより、光学純度を低下させることなく、光学活性含フッ素アルキルエチレンオキシドに誘導することが可能である。

本工程で使用する塩基は無機塩基または有機塩基が挙げられる。無機塩基としては、アルカリ金属水素化物、アルカリ土類金属水素化物、アルカリ金属水酸化物、アルカリ土類金属水酸化物、アルカリ金属炭酸塩、アルカリ土類金属炭酸塩、アルカリ金属炭酸水素塩又はアルカリ土類金属炭酸水素塩、アルカリ金属アミド、アルカリ金属等が挙げられる。
中でも、アルカリ金属水素化物、アルカリ金属水酸化物、アルカリ金属炭酸塩、アルカリ土類金属炭酸塩、アルカリ金属炭酸水素塩又はアルカリ土類金属炭酸水素塩が好ましく、アルカリ金属水素化物、アルカリ金属炭酸塩、アルカリ土類金属炭酸塩またはアルカリ金属炭酸水素塩が特に好ましい。
具体的には水素化リチウム、水素化ナトリウム、水素化カリウム、水素化ルビジウム、水素化セシウム、水素化マグネシウム、水素化カルシウム、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化ルビジウム、水酸化セシウム、水酸化マグネシウム、水酸化カルシウム、炭酸リチウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸ルビジウム、炭酸セシウム、炭酸マグネシウム、炭酸カルシウム、炭酸水素リチウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素ルビジウム、炭酸水素セシウム、炭酸水素マグネシウム、炭酸水素カルシウム、ナトリウムアミド、カリウムアミド、ナトリウム、カリウムが挙げられ、中でも水素化リチウム、水素化ナトリウム、水素化カリウム、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化ルビジウム、水酸化セシウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸ルビジウム、炭酸セシウム、炭酸カルシウム、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素ルビジウム、炭酸水素セシウム、炭酸水素マグネシウム、炭酸水素カルシウムが好ましく、水素化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム、炭酸セシウム、炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素セシウムが特に好ましい。これらは、1種類を単独で、または２種類以上を組み合わせて使用することもできる。

一方、有機塩基としては、ピリジン類、トリアルキルアミン類、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアニリン類等が挙げられるが、ピリジン類、トリアルキルアミン類が好ましい。具体的には、ピリジン、メチルピリジン、エチルピリジン、ジメチルピリジン、メチルエチルピリジン、ジエチルピリジン、トリメチルピリジン、ジメチルアミノピリジン、２，２'−ビピリジル、４−ジメチルアミノピリジン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、トリブチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリンが挙げられ、中でもピリジン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリブチルアミン、ジイソプロピルエチルアミンが特に好ましい。これらは、1種類を単独で、または２種類以上を組み合わせて使用することもできる。また、これらの有機塩基と無機塩基の２種類以上を組み合わせて使用することもできる。

塩基の使用量は、一般式［２］で示される含フッ素アルキルクロロメチルアルコールに対して０．１モル以上を用いればよく、０．２から２０モルが好ましく、０．３から１０モルが特に好ましい。

反応溶媒としては、水の他に、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン等の脂肪族炭化水素系、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素系、塩化メチレン、１，２−ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素系、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジイソプロピルエーテル、テトラヒドロフラン、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、１，２−ジメトキシエタン、ジグリム等のエーテル系、酢酸エチル、酢酸ｎ−ブチル等のエステル系、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン等のアミド系、アセトニトリル、プロピオニトリル等のニトリル系、ジメチルスルホキシド等が挙げられる。その中でも、水、ｎ−ヘプタン、トルエン、塩化メチレン、テトラヒドロフラン、１，２−ジメトキシエタン、ジグリム、酢酸エチル、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、アセトニトリル及びジメチルスルホキシドが好ましい。これらの反応溶媒は単独でまたは組み合わせて用いることができる。また、本発明においては無溶媒で行うこともできる。

反応溶媒の使用量は、一般式［２］で示される含フッ素アルキルクロロメチルアルコール１モルに対して０．０１Ｌ以上を用いればよく、０．０３から１０Ｌが好ましく、０．０５から７Ｌが特に好ましい。

反応時間は、７２時間以内の範囲で行えばよく、原料基質及び反応条件により異なるため、ガスクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、核磁気共鳴等の分析手段により反応の進行状況を追跡し、原料基質が殆ど消失した時点を終点とすることが好ましい。

反応温度は好ましくは−３０〜１２０℃の範囲で行えばよく、通常は−２０〜１００℃が好ましく、特に−１０〜８０℃がより好ましい。本発明では、すべての試剤を同時に混合し反応を開始してもよいが、発熱反応のために氷冷しながら含フッ素アルキルクロロメチルアルコールに対して塩基をゆっくり添加する方法、またはその逆の滴下方法を採用することで、好ましい温度範囲を維持できることから、好ましい態様の一つである。温度が高すぎる場合、系内で発生した光学活性含フッ素アルキルエチレンオキシドが系外に飛散するため、それを冷却器で捕集しながら反応を行えば良い。

得られた光学活性含フッ素アルキルエチレンオキシドを反応終了液（反応終了後の不純物などを含む混合液）から回収するには、ろ過や蒸留や有機溶媒による抽出等の有機合成における一般的な単離方法が採用できる。ここで工程１で蒸留操作により光学活性含フッ素アルキルクロロメチルアルコールを回収したものを本工程の出発原料として用いる方法は、不純物が少なく、副反応が抑制できるので好ましい態様の一つである。抽出する際の溶媒としては、該エチレンオキシドと反応しないものが好ましく、ｎ−ヘプタン、ｎ−ヘキサン等の脂肪族炭化水素系、ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素系、塩化メチレン、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素系、ジエチルエーテル、ｔ−ブチルメチルエーテル等のエーテル系、酢酸エチル、酢酸メチル、酢酸ブチル等のエステル系溶媒等が挙げられる。そのような単離方法の中でも、反応後に、必要に応じてろ過にて固形分を取り除いた後に反応液を直接蒸留することにより目的物を取り出す作業が簡便であり工業的に望ましい。
［工程３］
次に、工程３について説明する。本発明では、工程１〜工程２を経ることにより、目的化合物である光学活性含フッ素アルキルエチレンオキシドを得ることができるが、本工程では、該エチレンオキシドを加水分解することで開環し、光学活性化合物である下記式［４］：

［式中、＊は不斉原子を表す。Ｒｆは式［１］に同じ。］
で表される光学活性含フッ素アルキル−１，２−エタンジオールに簡便に誘導できる。

該エチレンオキシドは加水分解することで開環するが、無機塩基、有機塩基、無機酸や有機酸を加えることで反応を加速することもできる。無機塩基としては、アルカリ金属水素化物、アルカリ土類金属水素化物、アルカリ金属水酸化物、アルカリ土類金属水酸化物、アルカリ金属炭酸塩、アルカリ土類金属炭酸塩、アルカリ金属炭酸水素塩、アルカリ土類金属炭酸水素塩、アルカリ金属アミドまたはアルカリ金属等が挙げられる。
中でも、アルカリ金属水素化物、アルカリ金属水酸化物、アルカリ金属炭酸塩、アルカリ土類金属炭酸塩、アルカリ金属炭酸水素塩またはアルカリ土類金属炭酸水素塩が好ましく、アルカリ金属水素化物、アルカリ金属水酸化物、アルカリ金属炭酸塩、アルカリ土類金属炭酸塩またはアルカリ金属炭酸水素塩が特に好ましい。
具体的には水素化リチウム、水素化ナトリウム、水素化カリウム、水素化ルビジウム、水素化セシウム、水素化マグネシウム、水素化カルシウム、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化ルビジウム、水酸化セシウム、水酸化マグネシウム、水酸化カルシウム、炭酸リチウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸ルビジウム、炭酸セシウム、炭酸マグネシウム、炭酸カルシウム、炭酸水素リチウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素ルビジウム、炭酸水素セシウム、炭酸水素マグネシウム、炭酸水素カルシウム、ナトリウムアミド、カリウムアミド、ナトリウム、カリウムが挙げられ、中でも水素化リチウム、水素化ナトリウム、水素化カリウム、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化ルビジウム、水酸化セシウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸ルビジウム、炭酸セシウム、炭酸カルシウム、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素ルビジウム、炭酸水素セシウム、炭酸水素マグネシウム、炭酸水素カルシウムが好ましく、水素化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、炭酸カリウム、炭酸セシウム、炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素セシウムが特に好ましい。
これらは、1種類を単独で、または２種類以上を組み合わせて使用することもできる。
有機塩基としては、ピリジン類、トリアルキルアミン類、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアニリン類等が挙げられるが、中でもピリジン類、トリアルキルアミン類が好ましい。具体的には、ピリジン、メチルピリジン、エチルピリジン、ジメチルピリジン（ルチジン）、メチルエチルピリジン、ジエチルピリジン、トリメチルピリジン（コリジン）、ジメチルアミノピリジン、２，２'−ビピリジル、４−ジメチルアミノピリジン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、及びトリブチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、またはＮ，Ｎ−ジエチルアニリン等が挙げられる。中でもピリジン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリブチルアミンが好ましい。これらは、1種類を単独で、または２種類以上を組み合わせて使用することもできる。また、これらの有機塩基と無機塩基の２種類以上を組み合わせて使用することもできる。
酸は、無機酸として、塩酸、硫酸、リン酸、硝酸、ホウ酸等が挙げられる。有機酸として、酢酸、クエン酸、ギ酸、乳酸、シュウ酸、酒石酸、メタンスルホン酸等が挙げられる。中でも入手の容易さやコストの面、取り扱いやすさの点で、塩酸、硫酸が好ましく、これらは、１種類を単独で、または２種類以上を組み合わせて使用することもできる。

塩基や酸の使用量は、一般式［３］で示される含フッ素アルキルエチレンオキシドに対して０．０１モル以上を用いればよく、０．０２から２０モルが好ましく、０．０３から１０モルが特に好ましい。

水の使用量は、一般式［３］で示される含フッ素アルキルエチレンオキシドに対して０．５モル以上を用いればよく、０．７モル以上が好ましく、０．９モル以上が特に好ましい。

反応溶媒としては、水の他にｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン等の脂肪族炭化水素系、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素系、塩化メチレン、クロロホルム、１，２−ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素系、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジイソプロピルエーテル、テトラヒドロフラン、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル等のエーテル系、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ｎ−ブチル等のエステル系、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン等のアミド系、アセトニトリル、プロピオニトリル等のニトリル系、ジメチルスルホキシド等が挙げられる。その中でも、ｎ−ヘプタン、トルエン、塩化メチレン、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、水、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル及びジメチルスルホキシドが好ましい。これらの反応溶媒は単独でまたは組み合わせて用いることができる。また、本発明においては無溶媒で行うこともできる。

反応溶媒の使用量は、一般式［３］で示される含フッ素アルキルエチレンオキシド１モルに対して０．０１Ｌ以上を用いればよく、０．０３から１０Ｌが好ましく、０．０５から７Ｌが特に好ましい。

反応時間は、７２時間以内の範囲で行えばよく、原料基質及び反応条件により異なるため、ガスクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、核磁気共鳴等の分析手段により反応の進行状況を追跡し、原料基質が殆ど消失した時点を終点とすることが好ましい。

反応温度は好ましくは−３０〜１５０℃の範囲で行えばよく、通常は０〜１２０℃が好ましく、特に１０〜１００℃がより好ましい。本発明では、すべての試剤を同時に混合し反応を開始してもよいが、工程２と同様にこの反応も発熱反応のために、内温を適切な温度に保ちつつ、含フッ素アルキルエチレンオキシドに対して酸や塩基をゆっくり添加する方法、またはその逆の滴下方法を採用することで好ましい温度範囲を維持できることから、好ましい態様の一つである。

得られた光学活性含フッ素アルキル−１，２−エタンジオールを反応終了液（反応終了後の不純物などを含む混合液）から回収するには、ろ過や蒸留や有機溶媒による抽出等の有機合成における一般的な単離方法が採用できる。抽出する際には、溶媒として、ｎ−ヘプタン、ｎ−ヘキサン等の脂肪族炭化水素系、ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素系、塩化メチレン、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素系、テトラヒドロフラン、２−メチルテトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、ｔ−ブチルメチルエーテル、シクロペンチルメチルエーテル等のエーテル系、酢酸エチル、酢酸メチル、酢酸ブチル等のエステル系、ｎ−ブタノール、ｎ−ペンタノール、ｎ−ヘキサノールなどの水と混和しないアルコール系溶媒等が挙げられ、その中でも、テトラヒドロフラン、２−メチルテトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、ｔ−ブチルメチルエーテル、シクロペンチルメチルエーテル、ｎ−ブタノール、ｎ−ペンタノールが好ましい。目的物を抽出液や反応終了液から減圧蒸留により抜出を行う場合で、フラクションに水が混入する場合は、得たフラクションをディーンスターク装置などにより脱水して高純度の目的物を得る方法はこの工程の好ましい形態の１つである。

ところで、本工程を行うにあたり、工程２の後処理を行わずに、連続的に工程３を実施することができる。具体的には、工程２が終了した後、得られた含フッ素アルキルエチレンオキシドを単離せずに工程２の反応終了液に工程３に必要な試剤を加えることにより、光学活性含フッ素アルキル−１，２−エタンジオールを得ることができる。

また、工程２を実施するにあたり、工程２の目的物である光学活性含フッ素アルキルエチレンオキシドの他に、該オキシドが加水分解された化合物である、光学活性含フッ素アルキル−１，２−エタンジオール（本工程の目的物）が反応系内に生成することがある。

この場合、本工程における光学活性含フッ素アルキル−１，２−エタンジオールを製造することを目的とする場合は、工程２で光学活性含フッ素アルキルエチレンオキシドと光学活性含フッ素アルキル−１，２−エタンジオールとの混合物を製造し、続いて精製操作を行うことで、工程３の目的化合物である光学活性含フッ素アルキル−１，２−エタンジオールを製造することが可能である（例えば後述の実施例８参照）。

この精製操作で分離した光学活性含フッ素アルキルエチレンオキシドは、工程３における出発原料として別途再利用することもできる。このことは本発明における好ましい実施態様の一つである。
含フッ素アルキルクロロメチルアルコールから直接、光学活性含フッ素アルキル−１，２−エタンジオールを得るための最も好ましい形態としては、水存在下で工程２と工程３で共通する有機塩基や無機塩基の試剤を一度に使用することであり、特に無機塩基を使用することにより効率的に光学活性含フッ素アルキル−１，２−エタンジオールに誘導することが出来る。 後処理についても、工程３で記載した処理を同様に行うことにより高純度の光学活性含フッ素アルキル−１，２−エタンジオールを製造することが出来る。

本発明の方法は、含フッ素アルキルクロロメチルケトンを出発原料とし、好適な反応条件を適用することで、光学活性含フッ素アルキルエチレンオキシドの前駆体として利便性が高い光学活性含フッ素アルキルクロロメチルアルコールを大量に製造することが可能であり、続いて、該アルコールに塩基を作用させることで簡便に光学活性含フッ素アルキルエチレンオキシドへ誘導できる。工業的な製造方法として優位性が高い。

なお、実用的にも採用できる光学純度として、４０％ｅｅ以上、特に好ましくは８０％ｅｅ以上で得ることができる。本化合物は反応性が高く、光学活性含フッ素有機化合物を合成する中間体として大変有用である。また、化合物の光学純度はカラムクロマトグラフィーを用いた光学分割や再結晶法などで向上することもできる。
［実施例］
次に実施例を示すが、本発明は以下の実施例によって限定されるものではない。

［３−クロロ−１，１−ジフルオロ−２−プロパノン水和体に対する微生物の反応性調査（スクリーニング）結果］
蒸留水１０００ｍｌ、ポリペプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウム１０ｇの組成からなる液体培地を調製し、試験管（φ１．６ｃｍ×１５ｃｍ）に５ｍｌずつ分注し、下記表３に示す各微生物を接種し、２８℃、１６０ｓｐｍで４８〜７２時間の培養を行った。培養終了後、９０ｗｔ％の３−クロロメ−１，１−ジフルオロ−２−プロパノン水和体を１．０％ｗｔ／ｖ、グルコースを０．１ｍｏｌ／Ｌとなるように添加し、２８℃、１６０ｒｐｍで還元反応を４８時間行った。反応後の変換率の測定は、¹⁹Ｆ−ＮＭＲの内部標準法により行い（以下、すべての化合物で同じ）、１−クロロ−３，３−ジフルオロイソプロピルアルコールの光学純度の測定は、反応液に酢酸エチルを加えて混合し、該アルコールを有機層に抽出し、後述するキラルカラムを用いたガスクロマトグラフィー法により分析した（以下、同じ）。用いた微生物ごとの変換率及び光学純度の測定結果を下記表３に示した。

このように、微生物を用いた不斉還元反応で、光学活性１−クロロ−３，３−ジフルオロイソプロピルアルコールを得ることができた。本スクリーニングで使用した菌株については、高いもので６８．８％ｅｅの光学純度であったが、スクリーニングの幅を広げることでより高い光学純度を与える菌株を見出すことができる。また、高い立体選択性を示した菌株より酵素を精製することで、高い光学純度を与える酵素を単離することもできる。
［光学活性１−クロロ−３，３−ジフルオロイソプロピルアルコールの光学純度の分析条件］
１−クロロ−３，３−ジフルオロイソプロピルアルコールに対して、無水酢酸１．２当量、ピリジン１．２当量を反応させ、アセトキシ体に誘導し、分析試料とした。ガスクロマトグラフィーのカラムにはアジレント・テクノロジー社製のＣｙｃｌｏｓｉｌ−Ｂ（０．２５ｍｍ×３０ｍ×０．２５μｍ）を用い、キャリアガスは窒素、圧力は１６３ｋＰａ、カラム温度は６０〜９０℃（１℃／ｍｉｎ）〜１５０℃（１０℃／ｍｉｎ）、気化室・検出器（ＦＩＤ）温度は２３０℃の分析条件で得られるピークの面積により光学純度を算出した。それぞれのエナンチオマーの保持時間は、Ｒ体が１５．７ｍｉｎ、Ｓ体が１６．４ｍｉｎであった。立体配置は、光学活性１−クロロ−３，３−ジフルオロイソプロピルアルコールに４８％ＮａＯＨを作用させ光学活性２，２−ジフルオロエチレンオキシドに誘導した後に、２０％Ｈ₂ＳＯ₄を作用させ、公知の化合物の光学活性３，３−ジフルオロ−１，２−プロパンジオールに誘導して決定した（後述するが、光学純度は維持される）。
［比較例１］
［３−ブロモ−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノン水和体に対する微生物の反応性調査（スクリーニング）］
実施例１と同様の方法で、微生物による３−ブロモ−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノン水和体の還元反応を実施し、表４に結果を記した。目的とする光学活性１−ブロモ−３，３，３−トリフルオロイソプロピルアルコールは生成しておらず、反応後の化合物を同定したところ、１，１，１−トリフルオロ−３−ヒドロキシ−２−プロパノン及び３，３，３−トリフルオロ−１，２−プロパンジオールであった。本化合物の臭素原子が水中で脱離することから、生体触媒による基質としては採用できないことが分かった。
なお、化学的に調製した光学活性体を用いた光学純度の測定方法を後述する。

［光学活性１−ブロモ−３，３，３−トリフルオロイソプロピルアルコールの光学純度の分析条件］
１−ブロモ−３，３，３−トリフルオロイソプロピルアルコールに対して、無水トリフルオロ酢酸１．２当量、ピリジン１．２当量を反応させ、トリフルオロアセトキシ体に誘導し、分析試料とした。ガスクロマトグラフィーのカラムにはＢＧＢ Ａｎａｌｙｔｉｋ ＡＧ社製のＢＧＢ−１７４（０．２５ｍｍ×３０ｍ×０．２５μｍ）を用い、キャリアガスは窒素、圧力は１６３ｋＰａ、カラム温度は６０〜９０℃（１℃／ｍｉｎ）〜１５０℃（１０℃／ｍｉｎ）、気化室・検出器（ＦＩＤ）温度は２３０℃の分析条件で得られるピークの面積により光学純度を算出した。それぞれのエナンチオマーの保持時間は、Ｒ体が１２．９ｍｉｎ、Ｓ体が１３．２ｍｉｎであった。

［Pichia farinosa NBRC 0462菌株からの酵素の粗精製］
Pichia farinosa NBRC 0462菌株を、蒸留水１０００ｍｌ、ポリペプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウム１０ｇの組成からなる試験管（φ１．６ｃｍ×１５ｃｍ）に調製された５ｍｌの液体培地で前培養を行った。この培養液を、容量５Ｌの培養槽（（株）丸菱バイオエンジ製、ＭＤＮ型５Ｌ（Ｓ））に調製された蒸留水２５００ｍｌ、グルコース２５ｇ、ペプトン１２．５ｇ、酵母エキス７．５ｇ、麦芽エキス７．５ｇ、リン酸二水素カリウム７．５ｇ、リン酸水素二カリウム５．０ｇの組成からなる高圧蒸気滅菌後の液体培地に投入した。温度３０℃、通気１．２５Ｌ／ｍｉｎ、攪拌翼回転数４００ ｒｐｍで培養を行い、培養中のｐＨは４２．５％リン酸と１４％アンモニア水を用いてｐＨ６．５に調整した。培養後の培養液を回収し、５００ｍｌ容の遠沈管を用いて、遠心分離により菌体を回収した。回収した湿菌体に０．２ＭのｐＨ７．０のリン酸緩衝液を１００ｍｌ加え、懸濁液を調製した。ビーズ式細胞破砕装置（ＢｉｏＳｐｅｃ社製、ビードビーター）を用いて、懸濁液中の細胞を破砕し、ガラスビースを除去後、２０，０００×ｇ、３０分間の遠心分離を行い、無細胞抽出液を調製した。この無細胞抽出液１ｍｌに３−クロロ−１，１−ジフルオロ−２−プロパノン水和体を１％ｗｔ／ｖ、２Ｍグルコースを２５０μＬ添加し、３０℃で還元反応を２４時間行った。反応後の変換率は１００％、光学純度は６２．０％ｅｅ（Ｒ）であった。

［３−クロロ−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノン水和体及び３−クロロ−１，１−ジフルオロ−２−プロパノン水和体に対する市販のアルコール脱水素酵素の反応性の調査（スクリーニング）結果］
１ｍｌの２００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５、２０６ｍＭ ギ酸ナトリウム、２２２ｍＭ グルコース、５ｍＭ ＮＡＤ⁺、（ＮＡＤ⁺:ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸化型、以下同じ）５ｍＭ ＮＡＤＰ⁺（ＮＡＤ⁺:ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸酸化型、以下同じ）に３−クロロ−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノン水和体または３−クロロ−１，１−ジフルオロ−２−プロパノン水和体を１重量％になるように添加し、下記表５と表６の「酵素名」に示す株式会社ダイセルのChiralscreen(登録商標) OH（アルコール脱水素酵素）を、それぞれ５ｍｇ加えてマグネチックスターラーで攪拌しながら２５℃で２日間反応させた。１−クロロ−３，３，３−トリフルオロイソプロピルアルコールの光学純度は酢酸エチルで抽出し、後述するキラルカラムを用いたガスクロマトグラフィー法により測定した。それぞれ反応後の変換率と光学純度を測定し、下記表５と表６にそれぞれ示した。光学活性１−クロロ−３，３，３−トリフルオロイソプロピルアルコールの光学純度は、光学活性２−トリフルオロメチルエチレンオキシドに誘導し、後述の分析条件で分析した。

このように、精製酵素を用いた場合でも目的の光学活性体を得ることができ、スクリーニングの幅を広げることでより高い光学純度を与える精製酵素を見出すこともできる。
［光学活性１−クロロ−３，３，３−トリフルオロイソプロピルアルコールの光学純度の分析条件］
１−クロロ−３，３，３−トリフルオロイソプロピルアルコールに対して、無水トリフルオロ酢酸１．２当量、ピリジン１．２当量を反応させ、トリフルオロアセトキシ体に誘導し、分析試料とした。ガスクロマトグラフィーのカラムにはＢＧＢ Ａｎａｌｙｔｉｋ ＡＧ社製のＢＧＢ−１７４（０．２５ｍｍ×３０ｍ×０．２５μｍ）を用い、キャリアガスは窒素、圧力は１６３ｋＰａ、カラム温度は６０〜９０℃（１℃／ｍｉｎ）〜１５０℃（１０℃／ｍｉｎ）、気化室・検出器（ＦＩＤ）温度は２３０℃の分析条件で得られるピークの面積により光学純度を算出した。それぞれのエナンチオマーの保持時間は、Ｒ体が１３．４ｍｉｎ、Ｓ体が１３．７ｍｉｎであった。
［比較例２］
実施例３と同様の方法で、下記表７と表８の「酵素名」に示す株式会社ダイセルのChiralscreen(登録商標) OH（アルコール脱水素酵素）の、３−クロロ−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノン水和体または３−クロロ−１，１−ジフルオロ−２−プロパノン水和体に対する反応性を評価し、下記表７と表８にそれぞれの結果を示した。

［アルコール脱水素酵素を発現する遺伝子組換え大腸菌による（Ｒ）−１−クロロ−３，３−ジフルオロイソプロピルアルコールの製造］
前培養の培地として、蒸留水１０００ｍｌ、ポリペプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウム１０ｇの組成からなる液体培地を調製し、試験管（φ１．６ｃｍ×１５ｃｍ）に５ｍｌずつ分注し、１２１℃で１５分間の蒸気滅菌を行った。この液体培地に、株式会社ダイセルのChiralscreen (登録商標) OH E039のアルコール脱水素酵素を大量発現する遺伝子組換え大腸菌を白金時で無菌的に接種し、３０℃、１６０ｓｐｍで一晩培養を行い、波長６００ｎｍでの光学濃度（ＯＤ６００）８．２の前培養液を得た。

本培養の培地として、蒸留水２５００ｍｌに酵母エキス、グルタミン酸ナトリウム、グルコース、ラクトース、無機塩類、消泡剤からなる液体培地を調製し、容量５Ｌの培養槽（（株）丸菱バイオエンジ製、ＭＤＮ型５Ｌ（Ｓ））に張り込み、１２１℃で３０分間の蒸気滅菌を行った。この培養槽に前培養液を無菌的に５ｍｌ接種し、３０℃、通気０．５ｖｖｍ、攪拌しながら４０時間培養し、光学濃度（ＯＤ６００）２４の懸濁液を調製した。培養時のｐＨは２０％炭酸ナトリウム水溶液、４２．５％リン酸水溶液を用いてｐＨ７．０付近に調整した。培養終了後、通気を０ｖｖｍに変更し、培養液に対して８０％ｗｔ／ｗｔの３−クロロ−１，１−ジフルオロ−２−プロパノン水和体を６．２５％ｗｔ／ｖ（１５６．２５ｇ、含量として１２５．０ｇ、８５３ｍｍｏｌ）添加し、ギ酸脱水素酵素により補酵素の再生を行いながら２０℃、ｐＨ６．２で還元反応を２４時間行った。反応後の変換率は９６％、光学純度は８３．０％ｅｅ（Ｒ）であった。

反応後の培養液から減圧蒸留（内圧１９．２ｋＰａ、蒸気温度５７〜６１℃）により８０ｇ（６１３ｍｍｏｌ）の（Ｒ）−１−クロロ−３，３−ジフルオロイソプロピルアルコールを含む水溶液を４４３ｇ回収した。収率は７２％となった。

［（Ｓ）−２−ジフルオロメチルエチレンオキシドの製造］
実施例４で回収した（Ｒ）−１−クロロ−３，３−ジフルオロイソプロピルアルコール水溶液から該アルコールの含量が３０ｇ（２３０ｍｍｏｌ）となるように水溶液を一部取り出し（１６６ｇ）、氷冷しながら、４８％水酸化ナトリウム水溶液１．０当量を滴下した。滴下は内部の温度を確認しながら、０〜３℃を維持するように行った。滴下後、１℃で１２０分間攪拌し、閉環反応を実施した。反応後、蒸留により蒸気温度５０〜７０℃（大気圧）で抜き出しを行い、（Ｓ）−２−ジフルオロメチルエチレンオキシドを１７ｇ（１８２ｍｍｏｌ）回収し、後述の分析条件で光学純度を分析したところ８３．１％ｅｅであった。収率は７９％となった。
［光学活性２−ジフルオロメチルエチレンオキシドの光学純度の分析条件］
２−ジフルオロメチルエチレンオキシドに対して、２−ナフタレンチオールを１．１当量、トリエチルアミンを１．１当量添加し、スルフィドに誘導し、分析試料とした。高速液体クロマトグラフィーのカラムにはダイセル社製のＣＨＩＲＡＬＣＥＬ ＯＤ−Ｈ（４．６ｍｍ×２５ｃｍ、粒子径５μｍ）を用い、移動相はヘキサン／ＩＰＡ＝９５／５、流速０．７ｍｌ、カラム温度１５℃、検出波長２３０ｎｍで得られるピークの面積により光学純度を算出した。それぞれのエナンチオマーの保持時間は、Ｒ体が２４．２ｍｉｎ、Ｓ体が２７．４ｍｉｎであった。

［（Ｓ）−３，３−ジフルオロ−１，２−プロパンジオールの製造］
実施例５で得た（Ｓ）−２−ジフルオロメチルエチレンオキシド１７ｇ（１８２ｍｍｏｌ）に２０％硫酸水溶液を０．２当量添加し、５０℃で８時間攪拌を行った。反応後は、水酸化ナトリウムで溶液のｐＨを５に調整を行い、ろ過により無機塩を取り除いた後に、減圧蒸留（内圧１．５ｋＰａ、蒸気温度８０〜８１℃）で抜き出しを行い、得られたフラクションの水分を測定したところ、４．２％であった。ここにトルエン２０ｍｌを加えて、ディーンスターク装置を用いて還流脱水を５時間行った。釜残は生成物とトルエンが二層分離しているため、トルエンを分離させることにより、１７ｇ（１５２ｍｍｏｌ）の（Ｓ）−３，３−ジフルオロ−１，２−プロパンジオールを得た。また、後述の分析条件で光学純度を分析したところ８３．１％ｅｅであった。水分値は０．３％であり、収率は８４％となった。
［光学活性３，３−ジフルオロ−１，２−プロパンジオールの光学純度の分析条件］
３，３−ジフルオロ−１，２−プロパンジオールに対して、無水酢酸２．５当量、ピリジン２．５当量を反応させ、ジアセトキシ体に誘導し、分析試料とした。ガスクロマトグラフィーのカラムにはアジレント・テクノロジー社製のＣｙｃｌｏｓｉｌ−Ｂ（０．２５ｍｍ×３０ｍ×０．２５μｍ）を用い、キャリアガスは窒素、圧力は１６３ｋＰａ、カラム温度は５０℃（５ｍｉｎ）、５０〜１５０℃（５℃／ｍｉｎ）、１５０℃（１５ｍｉｎ）、気化室・検出器（ＦＩＤ）温度は２３０℃の分析条件で得られるピークの面積により光学純度を算出した。それぞれのエナンチオマーの保持時間は、Ｒ体が１６．３ｍｉｎ、Ｓ体が１７．２ｍｉｎであった。立体配置は公知の情報を元に決定した。

［（Ｓ）−３，３−ジフルオロ−１，２−プロパンジオールの製造］
実施例４で調製した（Ｒ）−１−クロロ−３，３−ジフルオロイソプロピルアルコールが含まれる水溶液から該アルコールの含量が２５ｇ（１９２ｍｍｏｌ）となるように水溶液を一部取り出し（１３９ｇ）、氷冷しながら、４８％水酸化ナトリウム水溶液１．０当量を滴下した。滴下は内部の温度を確認しながら、０〜３℃を維持するように行った。滴下後、１℃で１２０分間攪拌し、その後、３０ｍＬの２−メチルテトラヒドロフランで３回抽出を行うことで、（Ｓ）−２−ジフルオロメチルエチレンオキシドを１４ｇ含む２−メチルテトラヒドロフラン溶液を得た。この溶液に２０％硫酸水溶液を０．２当量添加し、６０℃で７時間攪拌を行った。
反応後は、水酸化ナトリウムで溶液のｐＨを５に調整を行い、ろ過により無機塩を取り除いた後に、減圧蒸留（内圧１．５ｋＰａ、蒸気温度８０〜８１℃）を行うことにより、１４ｇ（１２５ｍｍｏｌ）の（Ｓ）−３，３−ジフルオロ−１，２−プロパンジオールを得た。また、前述の分析条件で光学純度を分析したところ８３．２％ｅｅであった。収率は６５％となった。

［（Ｓ）−３，３−ジフルオロ−１，２−プロパンジオールの製造］
実施例４で調製した１３ｇ（１００ｍｍｏｌ）の（Ｒ）−１−クロロ−３，３−ジフルオロイソプロピルアルコールが含まれる水溶液（７２ｇ）を氷冷しながら、４８％水酸化ナトリウム水溶液１．５当量を滴下した。滴下は内部の温度を確認しながら、０〜３℃を維持するように行った。滴下後、１℃で１２時間攪拌することにより、生成物の（Ｓ）−２−ジフルオロメチルエチレンオキシドと（Ｓ）−３，３−ジフルオロ−１，２−プロパンジオールの比率は２１：７９となった。反応後は、生成物をメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルで抽出を行い、減圧蒸留することにより４ｇ（３６ｍｍｏｌ）の（Ｓ）−３，３−ジフルオロ−１，２−プロパンジオールを得た。収率は３６％となった。
また、前述の分析条件で光学純度を分析したところ８３．０％ｅｅであった。

［（Ｓ）−２−トリフルオロメチルエチレンオキシドの製造］
前述のスクリーニング条件で３−クロロ−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノン水和体にTrichosporon cutaneum NBRC 1198菌株を作用させ、６１．０％ｅｅの（Ｒ）−１−クロロ−３，３，３−トリフルオロイソプロピルアルコールを与えることを確認した。

イオン交換水２０００ ｍｌ、グルコース６０ｇ、ペプトン３０ｇ、酵母エキス５０ｇ、リン酸二水素カリウム４．８ｇ、リン酸水素二カリウム２．５ｇの組成からなる液体培地を調製し、容量５Ｌの発酵槽（（株）丸菱バイオエンジ製、ＭＤＮ型５Ｌ（Ｓ））に張り込み、１２１℃で６０分間の蒸気滅菌を行った。この液体培地に同じ組成の液体培地５０ｍｌを張り込んだ３００ｍｌ容のバッフル付き三角フラスコで前培養を行ったTrichosporon cutaneum NBRC 1198菌株（個別に光学純度を評価、６１．５％ｅｅ）の２．０×１０⁹ｃｆｕ／ｍｌの懸濁液を５０ｍｌ接種し、３０℃、通気１ｖｖｍ、攪拌翼回転数５００ｒｐｍで２４時間培養し、５．２×１０⁹ｃｆｕ／ｍｌ（湿菌重として９２ｇ／Ｌ）の懸濁液を調製した。この時のｐＨの調整は２０％ｗｔ／ｗｔ炭酸ナトリウム水溶液を用いて行い、６．５に調整した。培養終了後、通気を止め、攪拌翼回転数を５０ｒｐｍに変更し、別容器に準備した３００ｍｌのイオン交換水に３−クロロ−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノン１２５ｇ（８５３ｍｍｏｌ）、グルコース２００ｇを水和、溶解させたものをオンラインの糖濃度センサー（オンラインバイオセンサ ＢＦ−４１０、（株）バイオット製）を用いて、グルコース濃度を２％に維持する様にコンピュータプログラムで自動的に懸濁液に添加した。微生物による基質の還元は２４時間おきにモニタリングし、１４４時間後に変換率が８６．３％となっていることを確認して反応を終了した。

反応終了後の反応液から生成した（Ｒ）−１−クロロ−３，３，３−トリフルオロイソプロピルアルコールを回収するため、減圧条件にて蒸留を行った。留出液を５８８ｍｌ回収し、水溶液中に¹⁹Ｆ−ＮＭＲの内部標準法により５４．５ｇ（３６７ｍｍｏｌ）の（Ｒ）−１−クロロ−３，３，３−トリフルオロイソプロピルアルコールが含まれていることを確認した。前述の分析条件により光学純度を測定し、６０．９％ｅｅ（Ｒ体）であった。収率は４３％となった。

この（Ｒ）−１−クロロ−３，３，３−トリフルオロイソプロピルアルコールが含まれる水溶液を氷冷しながら４８％水酸化ナトリウム水溶液１．５当量を滴下した。滴下は内部の温度を確認しながら、０℃を維持するように行った。滴下後、０℃で１２０分間攪拌し、閉環反応を実施した。反応後、２−メチルテトラヒドロフランにより抽出を行い、有機層をロータリーエバポレーターで濃縮することにより、生成した（Ｓ）−２−トリフルオロメチルエチレンオキシドを３９ｇ回収し、後述の分析条件で光学純度を分析したところ６０．８％ｅｅ（Ｓ）であった。含量として２３ｇ（２０６ｍｍｏｌ）含まれており、収率は５６％となった。
［キラルカラムを用いた高速液体クロマトグラフィー法による光学活性２−トリフルオロメチルエチレンオキシドの光学純度の分析条件］
２−トリフルオロメチルエチレンオキシドに対して、２−ナフタレンチオールを１．１当量、トリエチルアミンを１．１当量添加し、スルフィドに誘導し、分析試料とした。高速液体クロマトグラフィーのカラムにはダイセル社製のCHIRALCEL OD-H（４．６ｍｍ×２５ｃｍ、粒子径５μｍ）を用い、移動相はヘキサン／ＩＰＡ ＝ ９５／５、流速０．７ｍｌ、カラム温度１５℃、検出波長２３０ｎｍで得られるピークの面積により光学純度を算出した。それぞれのエナンチオマーの保持時間は、Ｒ体が１６．１ｍｉｎ、Ｓ体が１８．２ｍｉｎであった。

［（Ｓ）−３，３，３−トリフルオロ−１，２−プロパンジオールの製造］
実施例９で調製した（Ｓ）−２−トリフルオロメチルエチレンオキシド溶液から該エチレンオキシドの含量が１０ｇ（８９ｍｍｏｌ）となるように溶液を一部取り出し、２０％硫酸水溶液を０．２当量添加し、（Ｓ）−３，３，３−トリフルオロ−１，２−プロパンジオールに誘導した。生成した（Ｓ）−３，３，３−トリフルオロ−１，２−プロパンジオールを後述の分析条件で光学純度を分析したところ６１．０％ｅｅであった。
［光学活性３，３，３−トリフルオロ−１，２−プロパンジオールの光学純度の分析条件］
３，３，３−トリフルオロ−１，２−プロパンジオールに対して、無水酢酸２．５当量、ピリジン２．５当量を反応させ、ジアセトキシ体に誘導し、分析試料とした。ガスクロマトグラフィーのカラムにはアジレント・テクノロジー社製のＣｙｃｌｏｓｉｌ−Ｂ（０．２５ｍｍ×３０ｍ×０．２５μｍ）を用い、キャリアガスは窒素、圧力は１６３ｋＰａ、カラム温度は５０℃（５ｍｉｎ）、５０〜１５０℃（５℃／ｍｉｎ）、１５０℃（１５ｍｉｎ）、気化室・検出器（ＦＩＤ）温度は２３０℃の分析条件で得られるピークの面積により光学純度を算出した。それぞれのエナンチオマーの保持時間は、Ｒ体が１１．３ｍｉｎ、Ｓ体が１２．２ｍｉｎであった。

［アルコール脱水素酵素を発現する遺伝子組換え大腸菌による（Ｓ）−１−クロロ−３，３−ジフルオロイソプロピルアルコールの製造］
前培養の培地として、蒸留水１０００ｍｌ、ポリペプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウム１０ｇの組成からなる液体培地を調製し、試験管（φ１．６ｃｍ×１５ｃｍ）に５ｍｌずつ分注し、１２１℃で１５分間の蒸気滅菌を行った。この液体培地に、株式会社ダイセルのChiralscreen (登録商標) OH E094のアルコール脱水素酵素を大量発現する遺伝子組換え大腸菌を白金時で無菌的に接種し、３０℃、１６０ｓｐｍで一晩培養を行い、波長６００ｎｍでの光学濃度（ＯＤ６００）6.4の前培養液を得た。

本培養の培地として、蒸留水２５００ｍｌに酵母エキス、グルタミン酸ナトリウム、グルコース、ラクトース、無機塩類、消泡剤からなる液体培地を調製し、容量５Ｌの培養槽（（株）丸菱バイオエンジ製、ＭＤＮ型５Ｌ（Ｓ））に張り込み、１２１℃で３０分間の蒸気滅菌を行った。この培養槽に前培養液を無菌的に５ｍｌ接種し、３０℃、通気０．５ｖｖｍ、攪拌しながら４０時間培養し、光学濃度（ＯＤ６００）２２の懸濁液を調製した。培養時のｐＨは２０％炭酸ナトリウム水溶液、４２．５％リン酸水溶液を用いてｐＨ７．０付近に調整した。培養終了後、通気を０ｖｖｍに変更し、培養液に対して９０％ｗｔ／ｗｔの３−クロロ−１，１−ジフルオロ−２−プロパノン水和体を６．２５％ｗｔ／ｖ（１５６．２５ｇ、含量として１４０．６ｇ、９６０ｍｍｏｌ）添加し、グルコース脱水素酵素により補酵素の再生を行いながら３０℃、ｐＨ６．０で還元反応を２４時間行った。反応後の変換率９９％光学純度は８９．２％ｅｅ（Ｓ）であった。

反応後の培養液から減圧蒸留（内圧１９．２ｋＰａ、蒸気温度５７〜６１℃）により８５ｇ（６５１ｍｍｏｌ）の（Ｓ）−１−クロロ−３，３−ジフルオロイソプロピルアルコールを含む水溶液を５２６ｇ回収した。収率は６８％となった。

［（Ｒ）−２−ジフルオロメチルエチレンオキシドの製造］
実施例１１で回収した８５ｇの（Ｓ）−１−クロロ−３，３−ジフルオロイソプロピルアルコール水溶液（含量として１４ｇ、１０５ｍｍｏｌ）を氷冷しながら、４８％水酸化ナトリウム水溶液１．０当量を滴下した。滴下は内部の温度を確認しながら、０〜３℃を維持するように行った。滴下後、１℃で１２０分間攪拌し、閉環反応を実施した。反応後、蒸留により蒸気温度５０〜７０℃（大気圧）で、生成した（Ｒ）−２−ジフルオロメチルエチレンオキシドを４９ｇ回収した。¹⁹Ｆ−ＮＭＲの内部標準法により生成物の含量は８ｇ（８５ｍｍｏｌ）であり、収率は８１％となった。前述の分析条件で光学純度を分析したところ８９．１％ｅｅであった。

［（Ｒ）−３，３−ジフルオロ−１，２−プロパンジオールの製造］
実施例１２で調製した４９ｇの（Ｒ）−２−ジフルオロメチルエチレンオキシド水溶液（含量として８ｇ、８５ｍｍｏｌ）に２０％硫酸水溶液を０．２当量添加し、６０℃で７時間攪拌を行った。反応後は、水酸化ナトリウムで溶液のｐＨを５に調整を行い、ろ過により無機塩を取り除いた後に、減圧蒸留（内圧１．５ｋＰａ、蒸気温度８０〜８１℃）を行うことにより、４６ｇの（Ｒ）−３，３−ジフルオロ−１，２−プロパンジオール溶液を回収し、¹⁹Ｆ−ＮＭＲの内部標準法により生成物の含量は７ｇ（６６ｍｍｏｌ）であり、収率は７８％となった。また、前述の分析条件で光学純度を分析したところ８９．２％ｅｅであった。

［アルコール脱水素酵素を発現する遺伝子組換え大腸菌による（Ｓ）−１−クロロ−３，３−ジフルオロイソプロピルアルコールの製造］
前培養の培地として、蒸留水１０００ｍｌ、ポリペプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウム１０ｇの組成からなる液体培地を調製し、試験管（φ１．６ｃｍ×１５ｃｍ）に５ｍｌずつ分注し、１２１℃で１５分間の蒸気滅菌を行った。この液体培地に、株式会社ダイセルのChiralscreen (登録商標) OH E094のアルコール脱水素酵素を大量発現する遺伝子組換え大腸菌を白金時で無菌的に接種し、３０℃、１６０ｓｐｍで一晩培養を行い、波長６００ｎｍでの光学濃度（ＯＤ６００）７．２の前培養液を得た。
本培養の培地として、蒸留水２５００ｍｌに酵母エキス、グルタミン酸ナトリウム、グルコース、ラクトース、無機塩類、消泡剤からなる液体培地を調製し、容量５Ｌの培養槽（（株）丸菱バイオエンジ製、ＭＤＮ型５Ｌ（Ｓ））に張り込み、１２１℃で３０分間の蒸気滅菌を行った。この培養槽に前培養液を無菌的に５ｍｌ接種し、３０℃、通気０．５ｖｖｍ、攪拌しながら４０時間培養し、光学濃度（ＯＤ６００）２３の懸濁液を調製した。培養時のｐＨは２０％炭酸ナトリウム水溶液、４２．５％リン酸水溶液を用いてｐＨ７．０付近に調整した。培養終了後、通気を０ｖｖｍに変更し、培養液に対して９３％ｗｔ／ｗｔの３−クロロ−１，１−ジフルオロ−２−プロパノン水和体を６．２５％ｗｔ／ｖ（１５１．２ｇ、含量として１４０．６ｇ、９６０ｍｍｏｌ）添加し、グルコース脱水素酵素により補酵素の再生を行いながら３０℃、ｐＨ６．０で還元反応を２４時間行った。反応後の変換率９９％光学純度は９０．７％ｅｅ（Ｓ）であった。
反応後の培養液に対して塩化カルシウム二水和物（３６ｇ）を加えてから減圧蒸留（内圧１９．２ｋＰａ、蒸気温度５７〜６１℃）により（Ｓ）−１−クロロ−３，３−ジフルオロイソプロピルアルコールを含む水溶液を４６７ｇ回収した。回収した水溶液にメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル４５０ｍｌを加えて撹拌することにより抽出を行った。二層分離を行い、水層に再びメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル４５０ｍｌを加えて抽出し、合わせた有機層の濃縮を行いメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルを留去した（内圧２３ｋＰａ）。残渣は、（Ｓ）−１−クロロ−３，３−ジフルオロイソプロピルアルコール（７４ｇ、５６３ｍｍｏｌ、９０．６％ｅｅ）を含む、７３．５ｗｔ％メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル溶液１００ｇとなり、収率は５９％であった。

［（Ｒ）−２−ジフルオロメチルエチレンオキシドの製造］
実施例１４で得た９．０ｇの（Ｓ）−１−クロロ−３，３−ジフルオロイソプロピルアルコールの７３．５ｗｔ％メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル溶液（含量として６．６ｇ、０．０５０ｍｍｏｌ）を、炭酸カリウム（８．３ｇ、０．０６０ｍｍｏｌ）とジグリム（２５ｍｌ）の溶液に室温で滴下した。滴下後、内温を４０℃に保ち２１時間攪拌した。反応後は吸引ろ過により無機塩の除去を行い、濾液を減圧蒸留（内圧４３ｋＰａ、蒸気温度４７℃）により（Ｒ）−２−ジフルオロメチルエチレンオキシドが７．１ｇ（５１．４ｗｔ％、０．０３９ｍｏｌ）、収率７８％で得られた。前述の分析条件で光学純度を分析したところ９０．６％ｅｅであった。

［（Ｒ）−３，３−ジフルオロ−１，２−プロパンジオールの製造］
実施例１４で得た１７．７ｇの（Ｓ）−１−クロロ−３，３−ジフルオロイソプロピルアルコールの７３．５ｗｔ％メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル溶液（含量として１３．０ｇ、０．１０ｍｍｏｌ）を、４８ｗｔ％の炭酸カリウム水溶液（３７．５ｇ、０．１３ｍｍｏｌ）に室温で滴下した。そのまま６０℃のバス中で５時間反応を行うことにより変換率は９９％となった。反応後は氷冷下で冷却を行ったのちに吸引ろ過を行い、無機塩の除去を行った。濾液をＴＨＦ２０ｍｌで抽出を行い、分離した水層はさらにＴＨＦ２０ｍｌで抽出した。合計で３回抽出を行い、合わせた有機層を減圧蒸留（内圧３．０ｋＰａ、蒸気温度８７℃）により（Ｒ）−３，３−ジフルオロ−１，２−プロパンジオールが９．９ｇ、０．０８８ｍｏｌ、収率８８％で得られた。純度をガスクロマトグラフィーで測定すると、９９．３％であった。前述の分析条件で光学純度を分析したところ９０．６％ｅｅであった。
［参考例１］
［化学触媒を用いた３−クロロ−１，１−ジフルオロ−２−プロパノン水和体の還元反応］
アルゴンガス雰囲気下、２０ｍＬのオートクレーブにルテニウム錯体（０．００８ｍｍｏｌ、基質／触媒比 ７００）、ギ酸カリウム（０．９６７ｇ、１１．５ｍｍｏｌ）、臭化テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＢ）（０．１８１ｇ、０．５６ｍｍｏｌ）、水（０．５６ｍＬ）、ギ酸（０．６３ｍＬ、１６．７ｍｍｏｌ、使用ケトンに対し０．３当量）及び３−クロロ−１，１−ジフルオロ−２−プロパノン水和体（５．６ｍｍｏｌ）を仕込んだ。容器を密閉して３０℃で２１時間攪拌した。用いたルテニウム錯体ごとの変換率及び光学純度の測定結果を下記の表９に示した。

（上記式中、左からRuCl［(S,S)-Tsdpen］(mesitylene)、RuCl［(S,S)-Tsdpen］(p-cymene)、RuCl［(S,S)-Fsdpen］(p-cymene)、(S,S)-Ts-DENEBの構造を示す。なお、Phはフェニル基を、Tsはパラトルエンスルホニル基を表す。）
このように、化学触媒を用いた不斉還元反応では、１−クロロ−３，３−ジフルオロイソプロピルアルコールの光学純度は低い結果となった。

本発明の製造方法の対象である光学活性含フッ素アルキルエチレンオキシドは、医農薬中間体として利用できる。

Claims (17)

1. 式［１］：
   

   

   ［式中、Ｒｆはフッ素原子を少なくとも１つ以上有する炭素数１〜６の直鎖または分岐鎖のフルオロアルキル基を表す。］
   で表される含フッ素アルキルクロロメチルケトンに、該ケトンを不斉還元する活性を有する微生物または該活性を有する酵素を作用させる工程を含む、式［２］：
   

   

   ［式中、＊は不斉原子を表す。Ｒｆは式［１］に同じ。］
   で表される光学活性含フッ素アルキルクロロメチルアルコールの製造方法。
2. 式［１］で表される含フッ素アルキルクロロメチルケトンにおけるＲｆが、トリフルオロメチル（ＣＦ₃）基またはジフルオロメチル（ＣＦ₂Ｈ）基である、請求項１に記載の製造方法。
3. 前記微生物が、クリプトコッカス・カルバタス（Cryptococcus curvatus）、ピキア・ファリノーサ（Pichia farinosa）、トルラスポーラ・デルブルエキィ (Torulaspora delbrueckii)、キャンディダ・カカオイ (Candida cacaoi)、ロドトルラ・ムシラギノサ (Rhodotorula mucilaginosa)、スポリディボラス・ジョンソニイ (Sporidibolus johnsonii)、及びトリコスポロン・キュタネウム (Trichosporon cutaneum) からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１または２に記載の製造方法。
4. 前記微生物が、下記に示す受託番号を有する微生物であることを特徴とする、請求項３に記載の製造方法。
   

   
5. 前記酵素がアルコール脱水素酵素またはカルボニル還元酵素であることを特徴とする、請求項１または２に記載の製造方法。
6. アルコール脱水素酵素またはカルボニル還元酵素がシロキクラゲ科、サッカロミケス科、ロドトルラ属、スポリディボラス属、トリコスポロン科の微生物、該処理物、該培養液、及び／または、該微生物から得られる酵素であることを特徴とする、請求項５に記載の製造方法。
7. 前記反応における温度（反応温度）が、５〜６０℃であることを特徴とする、請求項１乃至６の何れかに記載の製造方法。
8. 前記反応におけるｐＨ（反応時におけるｐＨ）が、４．０〜８．０の範囲であることを特徴とする、請求項１乃至７の何れかに記載の製造方法。
9. 前記反応終了後に得られる光学活性含フッ素アルコールと、不純物とを含む混合液を蒸留することにより、該混合液から不純物を分離し、光学活性含フッ素アルコールを精製する工程を含む、請求項１乃至８の何れかに記載の製造方法。
10. 請求項１乃至９の何れかの方法で式［２］で表される光学活性含フッ素アルキルクロロメチルアルコールを製造し、次いで、該アルコールに塩基を作用させることを特徴とする、式［３］：
    

    

    ［式中、＊は不斉原子を表す。Ｒｆは請求項１における式［１］に同じ。］
    で表される光学活性含フッ素アルキルエチレンオキシドの製造方法。
11. 塩基がアルカリ金属水素化物、アルカリ土類金属水素化物、アルカリ金属水酸化物、アルカリ土類金属水酸化物、アルカリ金属炭酸塩、アルカリ土類金属炭酸塩、アルカリ金属炭酸水素塩、及びアルカリ土類金属炭酸水素塩からなる群より選ばれる少なくとも一つである、請求項１０に記載の製造方法。
12. 前記光学活性含フッ素アルキルエチレンオキシドを加水分解することにより、式［４］：
    

    

    ［式中、＊は不斉原子を表す。Ｒｆは請求項１における式［１］に同じ。］
    で表される含フッ素アルキル−１，２−エタンジオールに誘導する工程を更に含む、請求項１０または請求項１１に記載の製造方法。
13. 加水分解が、酸または塩基を作用させることにより行う、請求項１２に記載の方法。
14. 含フッ素アルキル−１，２−エタンジオールに誘導する工程において、用いる塩基がアルカリ金属水素化物、アルカリ土類金属水素化物、アルカリ金属水酸化物、アルカリ土類金属水酸化物、アルカリ金属炭酸塩、アルカリ土類金属炭酸塩、アルカリ金属炭酸水素塩、及びアルカリ土類金属炭酸水素塩からなる群より選ばれる少なくとも一つの塩基性化合物の存在下で行う、請求項１３に記載の製造方法。
15. 含フッ素アルキル−１，２−エタンジオールに誘導する工程を、前記反応で得られた光学活性含フッ素アルキルエチレンオキシドを単離することなく、そのまま加水分解することにより行う、請求項１２乃至１４の何れかに記載の製造方法。
16. 式：
    

    

    ［式中、＊は不斉原子を表す。］
    で表される光学活性１−クロロ−３，３−ジフルオロイソプロピルアルコール。
17. 式：
    

    

    ［式中、＊は不斉原子を表す。］
    で表される光学活性２−ジフルオロメチルエチレンオキシド。