JPWO2012039481A1 - 変異型dnaの検出法 - Google Patents
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Abstract
Description
(1)置換塩基、欠損塩基領域、若しくは挿入塩基領域を有する一本鎖DNA(変異型DNA)又は/及びそれに対応する野生型の一本鎖DNA(野生型DNA)を含有する試料と、両一本鎖DNAとハイブリダイズするプローブとを接触させて、変異型DNAとのハイブリッド体(変異型ハイブリッド体)又は/及び野生型DNAとのハイブリッド体(野生型ハイブリッド体)を形成させ、得られた変異型ハイブリッド体及び野生型ハイブリッド体の少なくとも一方はステム構造を有するものであり、
(2)得られた変異型ハイブリッド体又は/及び野生型ハイブリッド体を、ステム構造の有無又はステム構造の違いにより、電気泳動法で分離し、
(3)試料中の変異型DNAの有無を検出することを特徴とする、変異型DNAの検出方法に関する。
このように設計することにより、例えば野生型ハイブリッド体を形成した場合には、設計した通りのステム構造が形成され、一方、変異型ハイブリッド体においては、置換塩基とプローブ中の正常塩基と相補な塩基とが結合しないため、正常塩基と相補な1塩基を含むステム構造が形成されると考えられ、その結果、野生型のステム構造とは異なるものとなる。尚、上記のように、プローブ側にステム構造を有する場合、本発明に係るプローブ中のステム構造に該当する配列としては、例えばパリンドローム(回文)配列、又はパリンドローム配列を含む塩基配列、相補となる塩基をそれぞれ同数連結させた塩基配列(例えばAAAATTTT等)、又は相補となる塩基をそれぞれ同数連結させた塩基配列を含む塩基配列が好ましい。
(I-1)プローブ側にステム構造を有するハイブリッド体を形成する場合
(a)プローブが正常塩基と結合する場合
(b)プローブが置換塩基と結合する場合
(I-2)ゲノム側にステム構造を有するハイブリッド体を形成する場合
(a)プローブが正常塩基と結合する場合
(b)プローブが置換塩基と結合する場合
(II)変異型DNAが欠損塩基領域を有するDNAの場合
(II-1)プローブ側にステム構造を有するハイブリッド体を形成する場合
(a)少なくとも変異型ハイブリッド体がステム構造を形成する場合
(b)少なくとも野生型ハイブリッド体がステム構造を形成する場合
(II-2)ゲノム側にステム構造を有するハイブリッド体を形成する場合
(III)変異型DNAが挿入塩基領域を有するDNAの場合
(III-1)ゲノム側にステム構造を有するハイブリッド体を形成する場合
(a)少なくとも変異型ハイブリッド体がステム構造を形成する場合
(b)少なくとも野生型ハイブリッド体がステム構造を形成する場合:
(III-2)プローブ側にステム構造を有するDNAの場合
(a)少なくとも野生型ハイブリッド体がステム構造を形成する場合
(b)少なくとも変異型ハイブリッド体がステム構造を形成する場合
(IV)ステム構造を有する塩基鎖の反対側の鎖中に更にステム構造又はループ構造を形成する場合
(I-1)プローブ側にステム構造を有するハイブリッド体を形成する場合
変異型DNAが置換塩基を有するものであって、プローブがハイブリダイズした際に、プローブ側にステム構造を有するハイブリッド体を形成する場合、本発明に係るプローブは、例えば以下の構造を有するものが用いられる。
X'2〜X'4における結合手とは、塩基は存在せず、単に両隣の塩基と結合させている場合を表す。例えばX'2がアデニン(A)で、X'3が結合手で、X'4がグアニンの場合、X'2-X'3-X'4はA-Gを表す。以下、本発明における結合手とは、同じものを表す。
変異型DNAが置換塩基を有するものであってプローブ側にステム構造を有する場合について、更に、(a)プローブが正常塩基と相補な塩基を有する場合と(b) プローブが置換塩基と相補な塩基を有する場合とに分けて以下で説明する。
変異型DNAが置換塩基を有するものであって、プローブがハイブリダイズした際に、プローブが正常塩基と結合し、プローブ側にステム構造を有するハイブリッド体を形成する場合、該本発明に係るプローブは、例えば以下の構造を有するものが用いられる。
尚、上記変異型ハイブリッド体中のX'12〜X'14の何れか1つは正常塩基と相補な塩基であるため、X12〜X14中の置換塩基と塩基対を形成しない。そのため、プローブ側ステム配列と正常塩基と相補な塩基の間に塩基がある場合、その塩基については、ゲノム側塩基と相補な塩基であっても結合が不安定となり、塩基対を形成できなくなる。その結果、X'12〜X'14も塩基対を形成することができなくなる場合があり、このような塩基対を形成できなくなったものはステム配列と連結する。尚、この場合、これらの塩基は、ステム配列及び塩基対を形成できなくなった塩基の組合せによってはステム構造を形成するが、単なるループ構造となってもよい。例えば、下記図のように、X13が置換塩基(図中はMで表示)で、X'13が正常塩基と相補な塩基(図中はN'で表示)であった場合、X12とX'12は通常であれば塩基対を形成するが、両隣の塩基がゲノム側の塩基と塩基対を形成しないため、St P11 -X'12-N'( X'13)-は全て変異型DNAのゲノム側と塩基対を形成せずにこれらでステム構造を形成することとなる。
上記野生型ハイブリッド体においては、プローブで設計されたステム配列のみでステム構造を形成する。本発明の変異型DNAの検出方法においては、該野生型ハイブリッド体が少なくともステム構造を有するものとなるため、上記変異型ハイブリッド体がステム構造を有さないものであってもよい。尚、上記変異型ハイブリッド体がステム構造を有する場合であっても、該野生型ハイブリッド体とは異なるステム構造を有することとなる。
上記変異型DNAが置換塩基を有するものであって、プローブが正常塩基と相補な塩基を有し、プローブ側にステム構造を有するハイブリッド体を形成する場合の変異型ハイブリッド体と野生型ハイブリッド体の具体的な組合せとしては、例えば下記表のものが挙げられる。
変異型DNAが置換塩基を有するものであって、プローブがハイブリダイズした際に、プローブが置換塩基と結合し、プローブ側にステム構造を有するハイブリッド体を形成する場合、該本発明に係るプローブは、例えば以下の構造を有するものが用いられる。
該変異型ハイブリッド体においては、プローブで設計されたステム配列のみでステム構造を形成する。本発明の変異型DNAの検出方法においては、該変異型ハイブリッド体が少なくともステム構造を有するものとなるため、下記野生型ハイブリッド体がステム構造を有さないものであってもよい。尚、下記野生型ハイブリッド体がステム構造を有する場合であっても、該変異型ハイブリッド体とは異なるステム構造を有することとなる。
尚、上記野生型ハイブリッド体中のX'22〜X'24の何れか1つは置換塩基と相補な塩基であるため、Y22〜Y24の何れかの正常塩基とは塩基対を形成しない。その結果、ステム配列の構造の影響により、X'22〜X'24も塩基対を形成することができない場合があり、そのような塩基対を形成できないものはプローブ側ステム配列と連結する。尚、この場合、これらの塩基は、ステム配列及び塩基対を形成できなくなった塩基の組合せによってはステム構造を形成するが、単なるループ構造となってもよい。
上述の如き、変異型DNAが置換塩基を有するDNAであって、プローブ側にステム構造を有するハイブリッド体を形成する場合のハイブリッド体は、そのゲノム側に更にステム構造又はループ構造を形成するものも含む。その詳細については(IV)で記載する。
変異型DNAが置換塩基を有するものであって、プローブがハイブリダイズした際に、ゲノム側にステム構造を有するハイブリッド体を形成する場合、本発明に係るプローブは、例えば以下の構造を有するものが用いられる。
(1stSS31、2ndSS31は、それぞれ野生型DNA及び変異型DNAと相補な一本鎖の塩基配列を表し、X'31、X'32及びX'33は、それぞれ任意の塩基を表し、X'32は置換塩基に相補な塩基又は正常塩基に相補な塩基を表す。)
該ハイブリッド体においては、X'32が置換塩基に相補な塩基である場合、ゲノム側ステム配列がステム構造を形成し、X'32が正常塩基に相補な塩基である場合、ゲノム側ステム配列と置換塩基とが連結してステム構造又はループ構造を形成する。
該ハイブリッド体においては、X'32が正常塩基に相補な塩基である場合、ゲノム側ステム配列がステム構造を形成し、X'32が置換塩基に相補な塩基である場合、ゲノム側ステム配列と置換塩基とが連結してステム構造またはループ構造を形成する。
変異型DNAが置換塩基を有するものであって、プローブがハイブリダイズした際に、プローブが正常塩基と結合し、ゲノム側にステム構造を有するハイブリッド体を形成する場合、本発明に係るプローブは、例えば以下の構造を有するものが用いられる。
(1stSS41、2ndSS41は、それぞれ野生型DNA及び変異型DNAと相補な一本鎖の塩基配列を表し、X'41及びX'43は、それぞれ塩基を表し、N'41は正常塩基に相補な塩基を表す。)
該ハイブリッド体においては、ゲノム側ステム配列がステム構造を形成する。
変異型DNAが置換塩基を有するものであって、プローブがハイブリダイズした際に、プローブが置換塩基と結合し、ゲノム側にステム構造を有するハイブリッド体を形成する場合、本発明に係るプローブは、例えば以下の構造を有するものが用いられる。
(1stSS51、2ndSS51は、それぞれ野生型DNA及び変異型DNAと相補な一本鎖の塩基配列を表し、X'51及びX'53は、それぞれ塩基を表し、M'51は置換塩基に相補な塩基を表す。)
該ハイブリッド体においては、ゲノム側ステム配列がステム構造を形成する。
上記ハイブリッド体においては、N51はM'51と塩基対を形成できないため、St G51と連結してステム構造又はループ構造を形成する。
上述の如き、変異型DNAが置換塩基を有するDNAであって、ゲノム側にステム構造を有するハイブリッド体を形成する場合のハイブリッド体は、そのプローブ側に更にステム構造又はループ構造を形成するものも含む。その詳細については(IV)で記載する。
(II-1)プローブ側にステム構造を有するハイブリッド体を形成する場合
(a)少なくとも変異型ハイブリッド体がステム構造を形成する場合
変異型DNAが欠損塩基領域を有するものであって、プローブがハイブリダイズした際に、ステム構造がプローブ側に形成され、少なくとも変異型ハイブリッド体がステム構造を形成する場合、本発明に係るプローブは、例えば以下の構造を有するものが用いられる。
(1stSS211、2ndSS211は、それぞれ野生型DNA及び変異型DNAと相補な一本鎖の塩基配列を表し、X'211及びX'212はそれぞれ任意の塩基を表し、DM'は欠損塩基領域に相補な塩基配列であって、且つステム構造を形成する塩基配列を表す。)
上記欠損塩基領域とは、変異型DNAで欠損している、野生型DNA中の塩基領域を意味する。
上記ハイブリッド体は、プローブとゲノムが完全に塩基対を形成するため、ステム構造を形成しない。
変異型DNAが欠損塩基領域を有するものであって、プローブがハイブリダイズした際に、ステム構造がプローブ側に形成され、少なくとも野生型ハイブリッド体はステム構造を形成する(野生型ハイブリッド体が設計されたステム構造を形成する)場合、本発明に係るプローブは、例えば以下の構造を有するものが用いられる。
(1stSS221、2ndSS221は、それぞれ野生型DNA及び変異型DNAと相補な一本鎖の塩基配列を表し、X'221及びX'222はそれぞれ塩基を表す。DM'は欠損塩基領域に相補な塩基配列を表し、St P221はプローブ側ステム配列を表す。)
上記ハイブリッド体においては、DM'-StP221とStP221、即ち、欠損塩基領域に相補な塩基配列とプローブ側ステム配列が連結してステム構造又はループ構造を形成する。
上記ハイブリッド体においては、プローブ側ステム配列がステム構造を形成するため、上記ハイブリッド体はプローブで設計されたステム構造を有する。
上述の如き、変異型DNAが欠損塩基領域を有するDNAであって、プローブ側にステム構造を有するハイブリッド体を形成する場合のハイブリッド体は、そのゲノム側に更にステム構造又はループ構造を形成するものも含む。その詳細については(IV)で記載する。
変異型DNAが欠損塩基領域を有するものであって、プローブがハイブリダイズした際に、ステム構造がゲノム側に形成され、少なくとも野生型ハイブリッド体がステム構造を形成する場合、本発明に係るプローブは、例えば以下の構造を有するものが用いられる。
(1stSS231は、欠損塩基領域を含まない、欠損塩基の3'側と相補な一本鎖の塩基配列を表し、2ndSS231は、欠損塩基領域を含まない、欠損塩基の5'側と相補な一本鎖の塩基配列をそれぞれ表す。)
上記欠損塩基領域とは、変異型DNAで欠損している、野生型DNA中の塩基領域を意味する。
該プローブと変異型DNAをハイブリッドさせると、下記変異型ハイブリッド体が形成される。
上記ハイブリッド体は、プローブとゲノムが完全に塩基対を形成するため、ステム構造を形成しない。
上記プローブと野生型DNAをハイブリッドさせると、下記野生型ハイブリッド体が形成される。
上記ハイブリッド体に於いては、ゲノムDNA側において欠損塩基領域がステム構造を形成するため、該ハイブリッド体はステム構造を有する。
上述の如き、変異型DNAが欠損塩基領域を有するDNAであって、ゲノム側にステム構造を有するハイブリッド体を形成する場合のハイブリッド体は、そのプローブ側に更にステム構造又はループ構造を形成するものも含む。その詳細については(IV)で記載する。
(III-1)ゲノム側にステム構造を有するハイブリッド体を形成する場合
(a)少なくとも変異型ハイブリッド体がステム構造を形成する場合
変異型DNAが挿入塩基領域を有するものであって、プローブがハイブリダイズした際に、少なくとも変異型ハイブリッド体がゲノム側にステム構造を形成する場合、本発明に係るプローブは、例えば以下の構造を有するものが用いられる。
(1stSS311、2ndSS311は、それぞれ野生型DNA及び変異型DNAと相補な一本鎖の塩基配列を表し、X'311及びX'312はそれぞれ塩基を表す。)
該ハイブリッド体においては、挿入塩基領域配列がステム構造を形成する。
該ハイブリッド体においては、プローブとゲノムが完全に塩基対を形成するため、ステム構造を形成しない。
変異型DNAが挿入塩基領域を有するものであって、プローブがハイブリダイズした際に、ゲノム側にステム構造が形成され、少なくとも野生型ハイブリッド体がステム構造を形成する(野生型ハイブリッド体が設計されたステム構造を形成する)場合、本発明に係るプローブは、例えば以下の構造を有するものが用いられる。
(1stSS321、2ndSS321は、それぞれ野生型DNA及び変異型DNAと相補な一本鎖の塩基配列を表し、X'321及びX'322はそれぞれ塩基を表す。)
該ハイブリッド体においては、IM - StG321塩基鎖、即ち、挿入塩基領域とゲノム型ハイブリッド体が連結してステム構造又はループ構造を形成する。
該ハイブリッド体においては、ゲノム側ステム配列がステム構造を形成する。
上述の如き、変異型DNAが挿入塩基領域を有するDNAであって、ゲノム側にステム構造を有するハイブリッド体を形成する場合のハイブリッド体は、そのプローブ側に更にステム構造又はループ構造を形成するものも含む。その詳細については(IV)で記載する。
(a)少なくとも野性型ハイブリッド体がステム構造を形成する場合
変異型DNAが挿入塩基領域を有するものであって、プローブがハイブリダイズした際に、プローブ側にステム構造が形成され、少なくとも野生型ハイブリッド体はステム構造を形成する場合、本発明に係るプローブは、例えば以下の構造を有するものが用いられる。
(1stSS321、2ndSS321は、それぞれ野生型DNA及び変異型DNAと相補な一本鎖の塩基配列を表し、X'321及びX'322はそれぞれ任意の塩基を表し、IM'321は置換塩基領域と相補な塩基配列であって且つステム構造を形成する塩基配列を表す。)
該ハイブリッド体においては、プローブとゲノムが完全に塩基対を形成するため、ステム構造を形成しない。
該ハイブリッド体においては、挿入塩基領域と相補な塩基鎖がステム構造を形成する。
(b)少なくとも変異型ハイブリッド体がステム構造を形成する場合
変異型DNAが挿入塩基領域を有するものであって、プローブがハイブリダイズした際に、プローブ側にステム構造が形成され、少なくとも変異型ハイブリッド体がステム構造を形成する(変異型ハイブリッド体がステム構造を形成する)場合、本発明に係るプローブは、例えば以下の構造を有するものが用いられる。
(1stSS331、2ndSS331は、それぞれ野生型DNA及び変異型DNAと相補な一本鎖の塩基配列を表し、X'331及びX'332はそれぞれ任意の塩基を表し、IM'331は置換塩基領域と相補な塩基配列を表し、Stp331は、プローブ側ステム配列を表す。)
(1stSS331、2ndSS331、X'331、X'332、IM'331及びStp331は、上記と同じ。)
上記プローブと変異型DNAをハイブリッドさせると、下記変異型ハイブリッド体が形成される。
変異型ハイブリッド体
又は
該ハイブリッド体においては、プローブ中のプローブ側ステム配列がステム構造を形成するため、該ハイブリッド体はプローブで設計されたステム構造を有する。
上記変異型ハイブリッド体においては、プローブ側ステム配列と欠損塩基領域とが連結してステム構造又はループ構造を形成する。
上述の如き、変異型DNAが挿入塩基領域を有するDNAであって、プローブ側にステム構造を有するハイブリッド体を形成する場合のハイブリッド体は、そのゲノム側に更にステム構造又はループ構造を形成するものも含む。その詳細については下記(IV)で記載する。
上記(I)〜(III)で記載した本発明に係るハイブリッド体においては、ステム構造を有する配列の反対側の鎖に、即ち、ゲノム側にステム構造がある場合にはプローブ側にも、プローブ側にステム構造がある場合にはゲノム側にも、更にステム構造又はループ構造を形成させることにより、好ましくはステム構造を形成させることにより、変異型ハイブリッド体と野生型ハイブリッド体の分離精度を上げることができる。
その場合のプローブとしては、ゲノム側にステム構造を有する場合には、上記プローブの配列中に更に、ステム配列又はプローブを形成するための配列を挿入すればよく、プローブ側にステム構造を有する場合には、ゲノム中にステム構造又はループ構造を形成させるために、これらを形成する配列に対応する相補鎖をプローブから取り除けばよい。
(1stSS411、2ndSS411は、それぞれ野生型DNA及び変異型DNAと相補な一本鎖の塩基配列を表し、X'411及びX'412はそれぞれ塩基を表し、Stopはプローブ側ステム配列又はプローブ側にループ構造を形成する配列を表す。)
該ハイブリッド体においては、ゲノム側で挿入塩基領域配列がステム構造を形成し、プローブ側で、プローブ側ステム配列又はプローブ側にループ構造を形成する配列がステム構造又はループ構造を形成する。
該ハイブリッド体においては、プローブ側で、プローブ側ステム配列又はプローブ側にループ構造を形成する配列がステム構造又はループ構造を形成する。
本発明の変異DNAの検出方法は、
(1)置換塩基、欠損塩基領域、若しくは挿入塩基領域を有する一本鎖DNA(変異型DNA)又は/及びそれに対応する野生型の一本鎖DNA(野生型DNA)を含有する試料と、両一本鎖DNAとハイブリダイズするプローブとを接触させて、変異型DNAとのハイブリッド体(変異型ハイブリッド体)又は/及び野生型DNAとのハイブリッド体(野生型ハイブリッド体)を形成させ、
(2)得られた変異型ハイブリッド体又は/及び野生型ハイブリッド体とを電気泳動法により分離し、
(3)試料中の変異型DNAの有無を検出することによりなされる。
(1)大腸がん患者由来ヒトゲノムDNAの調製
大腸がん患者由来ヒトゲノムDNAはキアゲン社QIAamp DNA Mini Kitを用い、凍結したがん組織25mgをホモゲナイズ後、キットに添付のバファーを添加しさらにproteinaseKを加えて56℃で完全溶解しRNaseAで処理後、キットに添付のバッファーにより除タンパク後、遠心上清をキットに添付のスピン・カラムで抽出・精製し、そのうち50ngを鋳型材料として準備した。得られた精製ゲノムDNAを、次項(3)記載のPCR反応により増幅後、ミリポア社のモンタージュPCRにより精製した増幅DNAをサンプルDNAとし、プライマーKRAS-Rv[配列番号15]をシーケンスプライマーとして用い、後述の合成例1の(2)と同様の方法にてシーケンス確認を行い、KRAS遺伝子のコドン12上に一塩基置換変異(GTT)がある事を確認した。
(2)ステム型Loop-Hybrid反応(SLH反応)用プローブの作成
プローブが変異塩基と結合するように、且つハイブリッド体形成時にできるループがステム構造となるように設計した、下記プローブを、SLH反応用のプローブとして用いた(IN-1)。上記プライマーおよびプローブのオリゴ合成については、シグマジェノシス社の受託合成サービスを利用した。
aaggcctgctgaaaatgactgaatataaacttgtggtagttggagctggtatatatataggcgtaggcaagagtgccttgacgatacag [配列番号17])
尚、該プローブを用いた場合、下記ステム構造がプローブ上に形成されると考えられる。
(3)大腸がん患者由来ヒトゲノムDNA のSLH反応
上記(1)で調製した大腸がん患者由来ヒトゲノムDNAを試料として、アキュプライムTaqポリメラーゼ・システム(PCR反応用キット、インヴィトロジェン社製)を用いてPCR反応を行った。即ち、まず、キットに添付の製品プロトコールに従い、各10μMのプライマー(KRAS-Fw; aaggcctgctgaaaatgactg[配列番号16]とKRAS-Rv; ggtcctgcaccagtaatatgca[配列番号15])を2μLずつおよびキットに添付のPCR反応バッファー2μLを使用し、PCR用反応液20μLを調製した。その後、大腸がん患者由来ヒトゲノムDNA 25ngをPCR用反応液20μlに懸濁添加し、PCR用試料とした。尚、上記プライマーのオリゴ合成については、シグマジェノシス社の受託合成サービスを利用した。このPCR用試料を用い、MJ Research社のDNAサーマルサイクラー(DNA Engine PTC200)を使用して、下記の反応条件で36サイクル のPCR反応を行った。
熱変性 : 95℃、15 sec
アニーリング: 55℃、15 sec
重合反応 : 68℃、47 sec
反応終了後、PCR反応産物に対してSLHプローブ(ID.=IN-1;
aaggcctgctgaaaatgactgaatataaacttgtggtagttggagctggtatatatataggcgtaggcaagagtgccttgacgatacag [配列番号17]) を最終濃度200nMとなるように添加し、DNAサーマルサイクラー(DNA Engine PTC200、MJ Research社製)を使用して、下記の反応条件にて1サイクル反応を行った。
(SLH-reaction:)
PCR product 4.5 μl
SLH probe 0.5μl of 2μM stock
105℃ hot lid
95℃ 2 min
55℃ 0-30 sec
68℃ 4 min
4℃ pause
(4)SLH反応によるハイブリッド体の分離検出(マイクロチップ電気泳動)
上記(3)で得られた反応生成物を、Agilent2100バイオアナライザー・システム(アジレント社)を用いてマイクロチップ電気泳動方法に供した。本泳動方法では専用試薬であるAgilent DNA1000 Assayキット(アジレント社製)を使用し、キットに添付の製品プロトコールに従い、各反応生成物1.0μLをアプライした。また電気泳動後のピーク解析には、システムに付属のAgilent2100エキスパートソフトウェアを使用して、波形解析およびピーク移動度の算出を行った。
その結果を図1に示した。
ハイブリッド体形成時にループ構造が形成される、下記プローブを、LH反応用のプローブとして用いた(Del-7)。
LHプローブID.=Del-7;
aaggcctgctgaaaatgactgaatataaacttgtggtagttggagctggtggcgtaggcaagagtgccttgacgatacagct [配列番号18])
尚、該プローブを用いた場合、下記構造のループ構造がゲノムDNA上に形成されると考えられる。
上記プローブを用いた以外は、実施例1と同じ方法により、大腸がん患者由来ヒトゲノムDNAの測定を行った。その結果を図2に示す。
合成例1 KRAS遺伝子における変異型DNAと野生型DNAの配列を持つサンプルクローンの調製
KRAS遺伝子エクソン1のコドン12およびコドン13における一塩基置換は、コドン内の第一塩基および第二塩基それぞれの3種類の変異を合わせると12種類の変異が存在する。そこで、合成オリゴヌクレオチドを用いたoverlap extension PCR変異導入法(BioTechniques, Vol. 48, No. 6, June 2010, pp. 463-465)により、これらの変異を導入した野生型DNA配列をPCRにより増幅し、更に、その増幅産物をpGEM-T Vectorシステム(プロメガ社)を用いてプラスミドにクローニングし、これら12種類の変異型DNAと野生型の配列を持つサンプルクローンを得た。このクローニングの手順の詳細を以下に示す。
熱変性 : 94℃、20 sec
アニーリング : 55℃、20 sec
重合反応 : 72℃、20 sec。
これらの12種のPCR産物を1000倍に希釈後、変異の導入効率の精度を高めるために複製精度が最も高いポリメラーゼであるPwo SuperYield DNA Polymerase (Roche)を用いPCR反応をさらに行った。即ち、PCR反応液は10μM の変異導入用プライマー対12種のそれぞれについて各1μLと、キット添付の反応バッファー5μL、10mM dNTPs 1μLを使用し、1000倍に希釈した対応する前項の変異導入PCR産物を0.25μL加えて、 PCR用反応液50μLを調製した。このPCR用試料を用い、下記の反応条件で20サイクル のPCR反応を12種の変異導入PCR産物について行った。
熱変性 : 94℃、15sec
アニーリング : 55℃、30 sec
重合反応 : 68℃、20 sec。
これにより、コドン12またはコドン13に変異が導入された12種の高品位の変異導入PCR産物が得られた。
次に、目的とする最終PCR産物の上流部を含みかつ、上記の変異導入PCR産物と重複する部分をもつDNAを高精度PCRで増幅するために、正常ヒトゲノムDNAを鋳型とし、Pwo SuperYield DNA Polymerase (Roche)を用い、10μMのプライマー1203N; gtactggtggagtatttgatagtg [配列番号14]とプライマーR; ggtcctgcaccagtaatatgca[配列番号15]、各1μL、およびキットに添付のPCR反応バッファー5μLと10mMdNTPsを1μL使用し、正常ヒトゲノムDNA25ngをPCR用反応液50μlに懸濁添加し、PCR用試料とし、下記の反応条件で30サイクル のPCR反応を行った。
熱変性 : 94℃、15sec
アニーリング : 55℃、30 sec
重合反応 : 68℃、20 sec。
こうして得られた246bpの上流側用PCR産物(1203N,R)と、前段で得られた12種の変異導入PCR産物(162-175bp)のそれぞれを使用し、Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity (invitrogen)を用いてoverlap extension PCRを行った。反応液は、添付のPCR反応バッファー5μL、10mMdNTPsを1μL、50mM MgSO4を2μL使用し、上流側用PCR産物(1203N,R)と変異導入PCR産物の各1μLをPCR用反応液50μlに懸濁添加し、PCR用試料とし、下記の反応条件で2サイクル のPCR反応を行った。
熱変性 : 94℃、20sec
アニーリング : 50℃、30 sec
重合反応 : 68℃、20 sec。
このoverlap extension PCR反応終了後、10μMのプライマー1203N; gtactggtggagtatttgatagtg [配列番号14]と1204; catgaaaatggtcagagaaacc [配列番号1]を各1μL上記のPCR反応液に添加し、下記の反応条件で25サイクル のPCR反応を引き続き行った。
熱変性 : 94℃、20sec
アニーリング : 55℃、20 sec
重合反応 : 68℃、20 sec。
野生型に対応するPCR産物はPlatinum Taq DNA Polymerase High Fidelity (invitrogen)により10μMのプライマー1203Nと1204を各1μLと、添付のPCR反応バッファー5μL、10mMdNTPs1μL、50mM MgSO4を2μL使用し、正常ヒトゲノムDNA50ngを鋳型として、PCR用反応液50μlに懸濁添加し、下記の反応条件で30サイクル のPCR反応を行った。
熱変性 : 94℃、20sec
アニーリング : 55℃、20 sec
重合反応 : 68℃、20 sec。
これらの一連のPCR反応によって得られた287bpの12種の変異導入PCR産物と1種の野生型PCR産物をpGEM-T Vector System(Promega社) を用いてTAクロ−ニング法によりプラスミド・ベクターpGEM-T easyに挿入した。ライゲーション反応はキットに添付のRapid Ligation BufferとT4リガーゼを用いて室温で1時間行った。
その後、東洋紡社製E. coli JM109 Competent Cellsを用い、その製品プロトコールに従って、上記で得られた組み換えDNAを用いて42℃45secでE. coli JM109 Competent Cellsの形質転換を行った。その後、100μg/mlのアンピシリン、0.2 mM イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド(IPTG)、40μg/ml X-Galを含むLB-寒天培地に、得られた形質転換体を37℃で16時間プレート培養した。培養後、培地中の白色コロニーをピックアップし、目的のDNA断片を挿入した組み換えDNAが導入された、各クローンに対する形質転換体を得た。その後、QIAGEN社のプラスミド抽出キット(QIAprep Spin Miniprep)を用いて、DNAの抽出・精製までの工程を行った。
即ち、5mlの100μg/mlのアンピシリン含有LB液体培地で一夜増殖させた各クローンに対する形質転換体を遠心により集菌し、アルカリ法で溶菌後、酢酸カリウム酸性液で中和し、それらの遠心後の上清液からキットに添付の精製カラムによりプラスミッドDNAを精製した。
(2)12種類の変異DNAと野生型DNAの配列の確認
次に、上記(1)でクローニングされた、12種類の変異DNAと野生型の配列を持つサンプルクローンを用いて、Big Dye Terminatorキット(アプライドバイオシステムズ社製)により、製品プロトコールに従って以下の手順でシークエンス解析を行った。
T7プロモータープライマー ;1μL(5pmol)
premix ;8μL
即ち、上記の混合物に、総量20μLとなるように脱イオン化滅菌水を加え、DNAサーマルサイクラー(DNA Engine PTC200、MJ Research社製)を使用して、下記の反応条件で30サイクルのシークエンス反応を行った。
得られたシークエンス反応産物をゲルろ過カラム(QIAGEN社製)で精製後、シークエンサー(BaseStation、MJ Research社製)を用いて機器付属の手順書に従い、候補配列すべてのシークエンス解読を完了した。その結果、コドン12又はコドン13において、下記表1及び2の12種類の変異型DNAと野生型DNAの配列を持つサンプルクローンが作製できた事を確認した。
(1)SLH反応
上記合成例1で調製した各サンプルクローンを試料として、アキュプライムTaqポリメラーゼ・システム(PCR反応用キット、インヴィトロジェン社製)を用いてPCR反応を行った。即ち、まず、キットに添付の製品プロトコールに従い、各10μMのプライマー(KRAS-Fw; aaggcctgctgaaaatgactg[配列番号16] とKRAS-Rv; ggtcctgcaccagtaatatgca[配列番号15])1.0μLおよびキットに添付のPCR反応バッファー2.0μLを使用し、PCR用反応液20.0μLを調製した。その後、各サンプルクローン 2pgをPCR用反応液20μlに懸濁添加し、PCR用試料とした。尚、上記プライマーおよびプローブのオリゴ合成については、シグマジェノシス社の受託合成サービスを利用した。このPCR用試料を用い、MJ Research社のDNAサーマルサイクラー(DNA Engine PTC200)を使用して、下記の反応条件で30サイクル のPCR反応を行った。
熱変性 : 95℃、15 sec
アニーリング : 55℃、15 sec
重合反応 : 68℃、47 sec
反応終了後、PCR反応産物に対してSLHプローブ(ID.=IN-1;
aaggcctgctgaaaatgactgaatataaacttgtggtagttggagctggtatatatataggcgtaggcaagagtgccttgacgatacag [配列番号17]) を最終濃度200nMとなるように添加し、DNAサーマルサイクラー(DNA Engine PTC200、MJ Research社製)を使用して、下記の反応条件にて1サイクル反応を行った。
(SLH-reaction:)
PCR product 4.5 μl
SLH probe 0.5μl of 2μM stock
105℃ hot lid
95℃ 2 min
55℃ 30 sec
68℃ 4 min
4℃ pause
(2)SLH反応によるハイブリッド体の分離検出(アクリルアミド重合ゲル電気泳動)
上記(1)で得られた各種SLH反応生成物のうち7種の変異型DNA(KR12_CG、KR12_TG、KR12_GA、KR12_GC、KR12_GT、KR13_CG及びKR13_TG)と野生型DNAを用いたものの1.5μlにゲル・ローディング・バッファー1.5μlをそれぞれ添加し、非変性10% ポリアクリルアミド・ゲルで電気泳動した。また分子量マーカーとしては、100 bp ladder for size marker(promega社製)1.5μlを使用して、同一ゲルにローディングし電気泳動を行った。ポリアクリルアミド・ゲルは7cm x 7cm のコンパクトゲル(コンパクトゲルC10L、アトー社製)を用い、トリス・グリシン緩衝液(37.5mM Tris , 288mM Glycine ) を泳動緩衝液として小型電気泳動装置( アトー社、AE-7300 コンパクトPAGE )で室温で泳動した。泳動後、サイバー・グリーンI ( タカラバイオ社、F0513) で10分間染色し、水洗後、レーザー・イメージング・スキャナー(アマシャム社、STORM 860)を用い励起波長450nm 、検出フィルター520LP で検出した。
尚、各ハイブリッド体予測されるステム構造は、以下の通りである。表中、小文字は、ゲノムDNAと相補になっていない塩基を表し、下線部は、ステム構造を形成していると考えられる配列である。
(3)結果
7種類の変異DNAと野生型の配列を持つサンプルクローンについて、SLH反応後に得られた電気泳動による実験結果を図3に示した。尚、図3中の1〜5レーンは、それぞれ、KR12_CG、KR12_TG、KR12_GA、KR12_GC、KR12_GTを用いた結果を、6〜7レーンは、それぞれKR13_CG, KR13_TGを用いた結果を表し、wtは野生型を用いた結果を表す。
実施例3 アクリルアミドゲル電気泳動法によるKRAS遺伝子の一塩基置換変異DNAの検出
(1)SLH反応
上記実施例2の(1)におけるSLHプローブ(ID.=IN-1)の代わりにSLHプローブ[ID.=IN-4:aaggcctgctgaaaatgactgaatataaacttgtggtagttggagctggttctgcagaaggtgtaggcaagagtgc
cttgacgatacag(配列番号22)]を用いた以外は、実施例2と同様の方法により、合成例1で調製した各サンプルクローンのSLH反応を行った。
(2)SLH反応によるハイブリッド体の分離検出(アクリルアミド重合ゲル電気泳動)
上記(1)で得られた各種SLH反応生成物として、12種の変異型DNAと野生型DNAを用いた以外は、上記実施例2の(2)と同様の方法により、SLH反応生成物のゲル電気泳動を行った。
(3)結果
12種類の変異DNAと野生型の配列を持つサンプルクローンについて、SLH反応後に得られた電気泳動による実験結果を図4に示した。尚、図3中の1〜6レーンは、それぞれ、KR13_AG、KR13_CG、KR13_TG、KR13_GA、KR13_GC、KR13_GTを用いた結果を、7〜12レーンは、それぞれKR13_CG, KR13_TGを用いた結果を表し、Wは野生型を用いた結果を表す。
実施例4 KRAS遺伝子における各種一塩基置換変異DNAの検出(マイクロチップ電気泳動法)
上記実施例2(1)で得られたSLH反応生成物を、Agilent2100バイオアナライザー・システム(アジレント社)を用いてマイクロチップ電気泳動方法に供した。本泳動方法では専用試薬であるAgilent DNA1000 Assayキット(アジレント社製)を使用し、キットに添付の製品プロトコールに従い、各反応生成物1.0μLをアプライした。また電気泳動後のピーク解析には、システムに付属のAgilent2100エキスパートソフトウェアを使用して、波形解析およびピーク移動度の算出を行った。
尚、KRAS遺伝子検査のように隣接したコドン(例えばコドン12と13)で変異が発生する場合、その両者の変異を検出する必要があったが、ループ構造のみを形成するプローブ(Del-7等)を用いた従来のループハイブリッド法では、隣接したコドンの変異全てを検出することはできなかった。しかし、図5の結果からも明らかな如く、本発明者らにより考案されたステム構造を有するハイブリッド体を用いる方法により、隣接したコドン12および13に発生し得る変異を同一の測定系にて精度よく検出する事が可能となる。
(1)ヒト血液由来ヒトゲノムDNA及びの調製
ヒト血液に由来するサンプルを複数準備し、ヒト・ゲノムDNAをキアゲン社QIAamp DNA Blood Midi Kitに従い全血2mlをproteinaseKで70℃10分処理後エタノールを添加し、遠心後の上清をQIAmp Midi カラムで抽出・精製した。そのうちの50ngを鋳型材料として準備し、合成例1(2)と同様の方法にてシーケンス確認を行った。その中から、野生型DNA(TA6)のホモ、野生型DNA(TA6)と変異型DNA(TA7;野生型DNAにTAが挿入されたDNA)のヘテロ、変異型DNA(TA7)のホモの3種の検体を得て、試料とした。
野生型DNA(TA6)のプロモータ部の塩基配列; TATATATATATA
変異型DNA(TA7)のプロモータ部の塩基配列; TATATATATATATA
(2)SLH反応用プローブの作成
ハイブリッド体形成時にゲノム配列上にステム構造が形成されるように設計した、下記プローブを、SLH反応用のプローブとして用いた(UGT1Adel-12F)。
ctttgtggactgacagctttttatagtcacgtgacacagtcaaacattaacttggtgtatcgattggtttttgatataagtaggagagggcgaac [配列番号21])
尚、該プローブを用いた場合、目的とするゲノム配列より増幅されたDNA増幅断片上に下記構造のステム構造が形成されると考えられる。
野生型DNA(TA6)を用いた場合:
変異型DNA(TA7)を用いた場合:
(3)SLH反応
上記(1)で調製した3種のサンプルを用いて、アキュプライムTaqポリメラーゼ・システム(PCR反応用キット、インヴィトロジェン社製)でPCR反応を行った。即ち、まず、キットに添付の製品プロトコールに従い、各10μMのプライマー( ctttgtggactgacagctttttatag [配列番号19]とgctgccatccactgggatc[配列番号20] )を1.0μLずつおよびキットに添付のPCR反応バッファー2.0μLを使用し、PCR用反応液20.0μLを調製した。その後、正常ヒト血液由来ヒトゲノムDNA 1ngをPCR用反応液20μlに懸濁添加し、PCR用試料とした。尚、上記プライマーおよびプローブのオリゴ合成については、シグマジェノシス社の受託合成サービスを利用した。このPCR用試料を用い、MJ Research社のDNAサーマルサイクラー(DNA Engine PTC200)を使用して、下記の反応条件で36サイクルのPCR反応を行った。
熱変性 : 95℃、15 sec
アニーリング: 55℃、15 sec
重合反応 : 68℃、47 sec
反応終了後、SLHプローブID.= UGT1Adel-12F を最終濃度200nMとなるように添加し、MJ Research社のDNAサーマルサイクラー(DNA Engine PTC200)を使用して、下記の反応条件にて1サイクル反応を行った。
(SLH-reaction:)
PCR product 4.5 μl
SLH probe 0.5μl of 2μM stock
105℃ hot lid
95℃ 2 min
55℃ 30 sec
68℃ 4 min
4℃ pause
(4)SLH反応によるハイブリッド体の分離検出(マイクロチップ電気泳動)
上記(3)で得られたSLH反応生成物(ハイブリッド体)を、Agilent2100バイオアナライザー・システム(アジレント社)を用いてマイクロチップ電気泳動方法に供した。本泳動方法では専用試薬であるAgilent DNA1000 Assayキット(アジレント社製)を使用し、キットに添付の製品プロトコールに従い、各反応生成物1.0μLをアプライした。また電気泳動後のピーク解析には、システムに付属のAgilent2100エキスパートソフトウェアを使用して、波形解析およびピーク移動度の算出を行った。
(1)UGT1A1遺伝子における変異型DNAと野生型DNAの配列を持つサンプルDNAの調製
200人のサンプルを用いてスクリーニングし、野生型DNA(TA6)、並びに、野生型(TA6)に対して*28座位がヘテロ接合型のアリルを持つ、変異型DNA(TA5)(野生型DNAからTAが欠損しているDNA)、(TA7)(野生型DNAにTAが挿入されたDNA)及び(TA8)(野生型DNAにTATAが挿入されたDNA)を得、サンプルDNAとした。尚、野生型DNA(TA6)、変異型DNA(TA5)、変異型DNA(TA7)及び変異型DNA(TA8)の各プロモータ部の塩基配列は以下の通りである。
野生型DNA(TA6): TATATATATATA
変異型DNA(TA5): TATATATATA
変異型DNA(TA7): TATATATATATATA
変異型DNA(TA8): TATATATATATATATA
具体的には、以下の如く行った。即ち、*28座位がヘテロ接合型のアリルを持つ200人のサンプルより得られた各ゲノムDNAサンプル(5ng)をAccuprimeTaqを使用してPCR反応を行った(PCR反応条件:95℃、15sec、55℃、15sec、68℃、47secで36サイクル)。得られたPCR増幅産物をTOPO(R)TAクローニングシステム(Invitrogen社)を使用してTAクローニングベクターpCR2.1TOPOに組み込み、エレクトロポレーションで大腸菌One Shot(R) TOP10(Invitrogen社)に導入した。その後、カナマイシン(25ng/ml)を含むLB寒天培地で37℃18時間培養し、抗生物質耐性を指標として選択して得たコロニーをランダムにクローン化した。
各コロニーの大腸菌の1白金耳を、25ng/mlのアンピシリンを含む液体LB培地50μLで2〜4時間37℃培養し遠心した。遠心後の菌体沈査に対しクローンチェッカー(Invitrogen)のグリーン液8μLを加えて浮遊させたのち、98℃ 30秒で菌からDNAを遊離させた。このDNA液を100μLの蒸留水に分散させたものをtempliphi(GE healthcare)で増幅後、サンガー法でplasmid DNAの配列を決定した。このスクリーニングにより、野生型DNA(TA6)、変異型DNA(TA5)、変異型DNA(TA7)及び変異型DNA(TA8)を得、これらをサンプルDNAとした。
ハイブリッド体形成時にゲノム配列上にステム構造が形成し得るように設計した、下記プローブ(UGT1Adel-8F)を合成した。
ctttgtggactgacagctttttatagtcacgtgacacagtcaaacattaacttggtgtatcgattggtttttgatatatataagtaggagagggcgaac [配列番号23]
サイバー・グリーンI(SYBRGreenI)の蛍光検出によりハイブリッド体を測定する場合には、該プローブ(以下、プローブ1と略記する)をSLH反応用のプローブとして用いた。また、Cy5の蛍光検出用によりハイブリッド体を測定する場合には、該プローブ配列の5'末端をCy5で蛍光修飾したもの(以下、プローブ2と略記する)をSLH反応用のプローブとして用いた。尚、蛍光修飾には、シグマジェノシス社の受託合成サービスを利用した。
上記プローブ1及び2を用いた場合、目的とするゲノム配列より増幅されたDNA増幅断片のゲノム側に下記構造のステム構造が形成されると考えられる。
変異型DNA(TA5)を用いた場合:
野生型DNA(TA6)を用いた場合:
変異型DNA(TA7)を用いた場合:
変異型DNA(TA8)を用いた場合:
上記(1)で調製した4種のサンプルDNAを用いて、それぞれについて、アキュプライムTaqポリメラーゼ・システム(PCR反応用キット、インヴィトロジェン社製)でPCR反応を行った。
即ち、まず、キットに添付の製品プロトコールに従い、各10μMのプライマー( ctttgtggactgacagctttttatag [配列番号19] とgctgccatccactgggatc [配列番号20] )を1.0μLずつおよびキットに添付のPCR反応バッファー2.0μLを使用し、PCR用反応液20.0μLを調製した。その後、サンプルDNA 1ngをPCR用反応液20μlに懸濁添加し、PCR用試料とした。尚、上記プライマーのオリゴ合成については、シグマジェノシス社の受託合成サービスを利用した。このPCR用試料を用い、MJ Research社のDNAサーマルサイクラー(DNA Engine PTC200)を使用して、下記の反応条件で36サイクル のPCR反応を行った。
PCR反応条件:
熱変性 : 95℃、15 sec
アニーリング: 55℃、15 sec
重合反応 : 68℃、47 sec
反応終了後、得られた4種類のPCR産物それぞれに、SLHプローブ1を最終濃度200nMとなるように添加し、MJ Research社のDNAサーマルサイクラー(DNA Engine PTC200)を使用して、下記の反応条件にてSLH反応を1サイクル行った。
(SLH反応:)
PCR product 4.5 μl
SLH probe 0.5μl of 2μM stock
105℃ hot lid
95℃ 2 min
55℃ 30 sec
68℃ 4 min
4℃ pause
また、同様にして、得られた4種類のPCR産物それぞれに、SLHプローブ2を最終濃度200nMとなるように添加して、上述の条件でSLH反応を1サイクル行った。
上記(3)でSLHプローブ1を用いて得られたSLH反応生成物(ハイブリッド体)4サンプル各1.5μlにゲル・ローディング・バッファー1.5μlをそれぞれ添加し、非変性10% ポリアクリルアミド・ゲルで電気泳動した。また分子量マーカーとしては、100 bp ladder for size marker(promega社製)1.5μlを使用して、同一ゲルにローディングし電気泳動を行った。ポリアクリルアミド・ゲルは7cm x 7cm のコンパクトゲル(コンパクトゲルC10L、アトー社製)を用い、トリス・グリシン緩衝液(37.5mM Tris , 288mM Glycine ) を泳動緩衝液として小型電気泳動装置( アトー社、AE-7300 コンパクトPAGE )で室温で泳動した。
泳動後、サイバー・グリーンI ( タカラバイオ社、F0513) で10分間染色し、水洗後、レーザー・イメージング・スキャナー(アマシャム社、STORM 860)を用いて検出を行った。この際、サイバー・グリーンIの蛍光検出には励起波長450nm 、検出フィルター520LP を使用した。得られた結果を図7の左図に示した。尚、レーン1は変異型DNA(TA5)を用いた結果を、レーン2は変異型DNA(TA6)を用いた結果を、レーン3は変異型DNA(TA7)を用いた結果を、レーン4は変異型DNA(TA8)を用いた結果をそれぞれ表す。
また、同様に、上記(3)でSLHプローブ2を用いて得られたSLH反応生成物(ハイブリッド体)4サンプル各1.5μlを用いて、上記方法と同じ方法により電気泳動した後、そのまま蛍光検出(励起波長635nm 、検出フィルター650LP)を行った。得られた結果を図7の右図に示した。尚、レーン1は変異型DNA(TA5)を用いた結果を、レーン2は変異型DNA(TA6)を用いた結果を、レーン3は変異型DNA(TA7)を用いた結果を、レーン4は変異型DNA(TA8)を用いた結果をそれぞれ表す。
また、図7の結果から明らかな如く、本発明の方法によれば、野生型(TA6)、変異型(TA5)、(TA7)、(TA8)それぞれのLHバンドが異なる位置で検出されるため、一度の泳動でこれらを検出できることも判った。
(1)ヒト血液由来ヒトゲノムDNA及びその調製
ヒト全血2ml を、QIAamp DNA Blood Midi Kit(キアゲン社)を使用してproteinaseKで70℃10分処理した。その後エタノールを添加して、遠心後の上清をQIAmp Midi カラムで抽出・精製したものをサンプルDNAとした。
そのうちの50ngを鋳型材料として準備し、合成例1と同様の方法にてシーケンス確認を行った。その結果、野生型DNA(TA6)と変異型DNA(TA7)を有するヘテロの検体であることを確認した。
野生型DNA(TA6)のプロモータ部の塩基配列; TATATATATATA
変異型DNA(TA7)のプロモータ部の塩基配列; TATATATATATATA
実施例6(2)で記載したものと同じものを使用した。即ち、サイバー・グリーンI(SYBRGreenI)の蛍光検出用にはプローブ1を、Cy5の蛍光検出用にはプローブ2を使用した。
尚、該プローブを用いた場合、目的とするゲノム配列より増幅されたDNA増幅断片上に下記構造のステム構造が形成されると考えられる。
野生型DNA(TA6)を用いた場合:
変異型DNA(TA7)を用いた場合:
上記(1)で調製したサンプルDNAを用いて、実施例6(3)記載のPCR反応と同様にPCR反応を行った。
反応終了後、得られたPCR産物に、SLHプローブ1 を最終濃度200nMとなるように添加し、MJ Research社のDNAサーマルサイクラー(DNA Engine PTC200)を使用して、下記の反応条件にて1−4サイクルでの反応を行った。
(SLH-reaction:)
PCR product 4.5 μl
SLH probe 0.5μl of 2μM stock
105℃ hot lid
95℃ 2 min
55℃ 30 sec
68℃ 4 min
また、同様にして、得られたPCR産物に、SLHプローブ2を最終濃度200nMとなるように添加して、上述の条件でSLH反応を1〜4サイクル行った。
上記(3)でSLHプローブ1を用いて得られた、1〜4サイクルのSLH反応を行ったSLH反応生成物(ハイブリッド体)とPCR反応産物(SLH反応0サイクル)を準備し、各1.5μlそれぞれにゲル・ローディング・バッファー1.5μlを添加し、非変性10% ポリアクリルアミド・ゲルで電気泳動した。分子量マーカーとしては、100 bp ladder for size marker(promega社製)1.5μlを使用して、同一ゲルにローディングし電気泳動を行った。ポリアクリルアミド・ゲルは7cm x 7cm のコンパクトゲル(コンパクトゲルC10L、アトー社製)を用い、トリス・グリシン緩衝液(37.5mM Tris , 288mM Glycine )を泳動緩衝液として小型電気泳動装置( アトー社、AE-7300 コンパクトPAGE )で室温で泳動した。泳動後、サイバー・グリーンI ( タカラバイオ社、F0513) で10分間染色し、水洗後、レーザー・イメージング・スキャナー(アマシャム社、STORM 860)を用いての検出を行った。この際、サイバー・グリーンIの蛍光検出には励起波長450nm 、検出フィルター520LP を使用した。得られた結果を図8の右図に示した。尚、レーン0はPCR反応産物を用いた結果を、レーン1〜4はそれぞSLH反応を1〜4サイクル行った結果をそれぞれ表す。
また、同様に、上記(3)でSLHプローブ2を用いて得られた、1〜4サイクルのSLH反応を行ったSLH反応生成物(ハイブリッド体)とPCR反応産物(SLH反応0サイクル)を準備し、上記方法と同じ方法により電気泳動した後、そのまま蛍光検出(励起波長635nm 、検出フィルター650LP)を行った。得られた結果を図8の左図に示した。尚、レーン0はPCR反応産物を用いた結果を、レーン1〜4はそれぞSLH反応を1〜4サイクル行った結果をそれぞれ表す。
このように、上記結果から明らかな如く、LH反応のサイクル数を増やすことでループハイブリッド量を増加することが判った。これは、ループハイブリッド形成率が低い系で有効であり、特に、3〜4回行うことで効率よくハイブリッド体が得られることが判った。尚、図中では示していないが、5回のLHサイクルの結果は4回の時とほぼ同じ結果であった。
実施例8 TOMM40遺伝子配列中のpoly-T鎖長多型の検出(両側にステム構造を有するハイブリッド体による分離検出)
(1)TOMM40遺伝子のrs10524523マーカー配列における様々なpoly-T鎖長多型に対応させたpoly-T固定鎖長を持つサンプルDNAの合成
TOMM40遺伝子におけるpoly-T鎖長多型(rs10524523)のモデル塩基配列として、下記表3中の5種類のサンプルDNAを合成した。尚、表中Poly-Tは、poly-Aの鎖長を表す。
(2)SLH反応用プローブの作成
ターゲット配列とのハイブリッド体形成時に、ゲノム配列上のpoly-T鎖長の塩基数を反映したループ構造をとり、なおかつSLH反応用プローブ上にステム構造をとるように設計した、下記プローブ(cy5delTINGC)を合成した。
gacctcaagctgtcctcttgccccagccctccaaagcattgggattactggcatgagccattgcatctggacgcgcgtagatggggtctcaccatg [配列番号30]
また、Cy5の蛍光検出用によりハイブリッド体を測定するために、該プローブ配列の5'末端をCy5で蛍光修飾したものをSLH反応用のプローブとして用いた。尚、蛍光修飾には、シグマジェノシス社の受託合成サービスを利用した。
該プローブを用いた場合、目的とするゲノム配列とのハイブリッド体形成により下記構造のステム・ループ構造が形成されると考えられる。尚、図中の(N)はpoly-T多型の鎖長によって異なる値をとる。
(3)SLH反応
上記(1)で調製した5種のサンプルDNAそれぞれを鋳型DNAとし、SLH用プローブとして上記cy5delTINGCを用いて、SLH反応を4サイクル行った。
即ち、5μMの各サンプルDNA 1.0μL(反応溶液中の濃度として500nM)に対して、2μMのSLHプローブを1.0μL(反応溶液中の濃度として200nM)をそれぞれ添加した後、アキュプライムTaqポリメラーゼ・High Fidelity(インヴィトロジェン社製) 0.04μLならびに製品付属の10x bufferを1.0μLおよびddH2O 2.96μLをそれぞれ添加して、5種の反応溶液10μLをそれぞれ調製した。次に、MJ Research社のDNAサーマルサイクラー(DNA Engine PTC200)を使用して、5種の反応溶液を用いて下記の反応条件にてSLH反応を4サイクル行った。
(SLH反応サイクル条件)
105℃ hot lid
95℃ 2 min
55℃ 15 sec
68℃ 4 min
(4)SLH反応によるハイブリッド体の分離検出(アクリルアミド重合ゲル電気泳動)
上記(3)でSLHプローブを用いて得たSLH反応生成物(ハイブリッド産物)5種各1.5μlにゲル・ローディング・バッファー1.5μlをそれぞれ添加し、非変性10% ポリアクリルアミド・ゲルで電気泳動した。また分子量マーカーとしては、100 bp ladder for size marker(promega社製)1.5μlを使用して、同一ゲルにローディングし電気泳動を行った。ポリアクリルアミド・ゲルは6cm x 6cm のC・PAGEL(C10L、アトー社製)を用い、トリス・グリシン緩衝液(37.5mM Tris , 288mM Glycine ) を泳動緩衝液として小型電気泳動装置( アトー社、AE-7300 コンパクトPAGE )で室温で泳動した。
泳動後、レーザー・イメージング・スキャナー(アマシャム社、STORM 860)を用いて蛍光検出(励起波長635nm 、検出フィルター650LP)を行った。得られた結果を図9に示した。
図9の結果から明らかな如く、上記のcy5delTINGCプローブを用いて、本発明により得られたSLH反応産物をアクリルアミド重合ゲル電気泳動で分離・検出した結果、5塩基ずつ鎖長の異なるpoly-T配列を含む各サンプルDNAの識別検出が可能である事が示された。なお、本実験結果より、各サンプル間での識別能が非常に高い事がわかったため、poly-T配列長における2塩基あるいは1塩基の差であっても十分に識別検出できると考えられた。ここで、TOMM40遺伝子多型に係る診断技術の臨床的意義を考えた場合、poly-T配列鎖長が11〜16塩基の場合にはアルツハイマー病発症の低リスク群とされ、19〜39塩基の場合には高リスク群として識別・区分される(The Pharmacogenomics Journal (2010) 10, 375-384)。従って、本実施例で示した結果は、診断技術として求められる基準をクリアし得る性能を示唆しているものである。
また、Mono-および、di-あるいはtri-ヌクレオチドリピートの多型解析については、従来技術であるダイレクト・シークエンス法での対応が困難である場合が多いため、本発明による簡便で高精度な測定技術の有用性は非常に高いと言える。
Claims (22)
- プローブを用いた変異型DNAの検出方法であって、
(1)置換塩基、欠損塩基領域、若しくは挿入塩基領域を有する一本鎖DNA(変異型DNA)又は/及びそれに対応する野生型の一本鎖DNA(野生型DNA)を含有する試料と、両一本鎖DNAとハイブリダイズするプローブとを接触させて、変異型DNAとのハイブリッド体(変異型ハイブリッド体)又は/及び野生型DNAとのハイブリッド体(野生型ハイブリッド体)を形成させ、得られた変異型ハイブリッド体及び野生型ハイブリッド体の少なくとも一方はステム構造を有するものであり、
(2)得られた変異型ハイブリッド体又は/及び野生型ハイブリッド体を、ステム構造の有無又はステム構造の違いにより、電気泳動法で分離し、
(3)試料中の変異型DNAの有無を検出することを特徴とする、変異型DNAの検出方法。 - 変異型DNAが置換塩基を有する一本鎖DNAである、請求項1記載の検出方法。
- 変異型ハイブリッド体及び野生型ハイブリッド体の少なくとも一方は、プローブ側にステム構造を有するものである、請求項2記載の検出方法。
- 変異型ハイブリッド体及び野生型ハイブリッド体が、更に、ゲノムDNA側にループ構造又はステム構造を有する、請求項3記載の検出方法。
- 変異型ハイブリッド体及び野生型ハイブリッド体の少なくとも一方は、ゲノムDNA側にステム構造を有するものである、請求項2記載の検出方法。
- 変異型ハイブリッド体及び野生型ハイブリッド体が、更に、プローブ側にループ構造又はステム構造を有する、請求項6記載の検出方法。
- 変異型DNAが欠損塩基領域を有する一本鎖DNAである、請求項1記載の検出方法。
- 変異型ハイブリッド体及び野生型ハイブリッド体の少なくとも一方は、プローブ側にステム構造を有するものである、請求項9記載の検出方法。
- 変異型ハイブリッド体及び野生型ハイブリッド体が、更に、ゲノムDNA側にループ構造又はステム構造を有する、請求項10記載の検出方法。
- 欠損塩基がステム構造を形成し得るものであって、野生型ハイブリッド体が、ゲノムDNA側にステム構造を有するものである、請求項9記載の検出方法。
- 変異型ハイブリッド体及び野生型ハイブリッド体が、更に、プローブ側にループ構造又はステム構造を有する、請求項13記載の検出方法。
- 変異型DNAが挿入塩基領域を有する一本鎖DNAである、請求項1記載の検出方法。
- 変異型ハイブリッド体及び野生型ハイブリッド体の少なくとも一方は、ゲノムDNA側にステム構造を有するものである、請求項16記載の検出方法。
- 変異型ハイブリッド体及び野生型ハイブリッド体が、更に、プローブ側にループ構造又はステム構造を有する、請求項17記載の検出方法。
- 変異型ハイブリッド体及び野生型ハイブリッド体の少なくとも一方は、プローブ側にステム構造を有するものである、請求項16記載の検出方法。
- 変異型ハイブリッド体及び野生型ハイブリッド体が、更に、ゲノムDNA側にループ構造又はステム構造を有する、請求項20記載の検出方法。
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