CZ296718B6 - Univerzální systém pro paralelní detekci mutací vDNA - Google Patents

Abstract

Resení univerzálního systému pro paralelní detekci mutací v DNA se zabývá vytvorením jednoduché multiplexní metody pro amplifikaci a soucasné znacenímnoha úseku DNA obsahujících vybrané mutace v jediné reakci s pouzitím univerzálních primeru. Výbermutací je proveden na základe pouzití magnetických cástic s navázanou specifickou sekvencí pro vysetrovaný úsek DNA. Pouzitím mnoha techto cástic s ruznými sekvencemi lze takto amplifikovat a znacitneomezené mnozství úseku DNA pomocí jediného páruuniverzálních primeru. Tuto metodu lze napríklad vyuzít pro detekci bodových mutací pri vysetrení nekterých závazných patologických stavu.

Description

Oblast techniky

Toto řešení náleží do oblasti molekulární genetiky, analýzy nukleových kyselina diagnostiky některých onemocnění. Vynález je spojen s využitím běžných molekulárně genetických metod, využitých k provádění multiplexních vyšetření bodových mutací v DNA.

Dosavadní stav techniky

Detekce mutací na DNA lidského genomu

Z hlediska metodického přístupu k problematice detekce mutací je možné tuto oblast rozdělit na

- detekci definovaných mutací, jejichž nález je při konkrétním molekulárně genetickém vyšetření prokázán nebo vyloučen;

- mutační screening, tj. detekci všech, i nedefinovaných mutací vyskytujících se v určitém úseku řetězce DNA, tento způsob je zaměřen zvláště na málo frekventní mutace a na vyhledávání nových mutací.

Detekce mutací má u konkrétního pacienta velký klinický význam a je principem přímé diagnostiky, a to je prenatální, tak postnatální. Problematika detekce mutací je jedním z pilířů práce molekulárně genetické laboratoře v lékařské genetice.

Oblast vývoje nových detekčních systémů je v současnosti řešena na mnoha světových pracovištích za použití nejrůznějších molekulárně biologických metod. Cílem mnoha vývojových týmů je vyvinout detekční soupravu, jejíž použití by bylo co nejjednodušší, instrumentálně nenáročné a dostupné i pracovištím, která nemají molekulárně genetické zaměření, přitom spolehlivě prokazují přítomnost vytypovaných definovaných mutací.

Přímá molekulárně genetická diagnostika známých mutací

Provádí se jednodušeji než u neznámých mutací, protože víme, na kterou část kterého genu se zaměřit a je jen důležité zvolit nej lepší detekční metodu.

Téměř všechny metody, které se dnes používají, využívají techniky PCR [1], Pomocí PCR se namnoží úsek, o kterém víme, že může obsahovat mutaci a kterou nemůžeme dokázat několika základními způsoby:

Restrikční štěpení PCR produktu. Lze jej použít jen v těch případech, kdy mutace mění rozeznávací sekvenci pro některou restrikční endonukleázu (restrikční endonukleázy jsou enzymy, které štěpí řetězce DNA jen na místech určité sekvence, která je specifická pro daný enzym). Metoda nejjednodušší, ale nelze ji často aplikovat, protože většina mutací nemění restrikční místa.

Alelově specifická PCR: obměna běžného uspořádání PCR reakce, kdy se úsek DNA, pokud obsahuje mutaci, nenamnoží, nebo naopak [2,3,4],

Hybridizační metody, ve kterých se jako sondy používají krátké úseky DNA (oligonukleotidy). Pokud PCR produkt obsahuje mutaci, oligonukleotid není perfektně komplementární a při hybridizaci se nenaváže [5].

-1 CZ 296718 B6

Metody využívající FRET (fluorescence resonance energy transfer), prováděné v tzv. light cyklérech, které jsou sofistikovanou obměnou běžných cyklérů, kde se provádí PCR reakce [6].

Usek DNA, ve kterém se má prokázat přítomnost mutace, se amplifikuje pomocí běžné PCR reakce. K templátové DNA jsou však do reakční směsi ještě přidány dvě komplementární sondy, každá značená fluorescenční barvivém. Jedno barvivo absorbuje emisi viditelného záření a přitom předá část přijaté energie druhému barvivu na druhé sondě (energy transfer), která reaguje emisí záření o jiné vlnové délce. To vše za předpokladu, že obě sondy a tedy molekuly obou barviv jsou ve velmi těsné blízkosti. Pokud jsou obě sondy komplementární navázány na amplifikované DNA, dostávají se do takové molekulární vzdáleností, že po ozáření vzorku světlem jedné vlnové délky budou emitovat světlo jiné vlnové délky, jehož intenzita se měří. Pokud se ozáří vzorek, kde jsou obě sondy přítomny, ale nejsou ještě navázány na DNA, obě fluorescenční barviva jsou navzájem ve velké vzdálenosti a po ozáření nedojde k emisi světla.

Pokud se tedy k analyzovanému úseku DNA přidají obě sondy, budou se na DNA vázat a ozařování vzorku monochromatickým světlem určité barvy se tedy projeví emisí světla jiné barvy. Pokud se navíc ještě bude zvyšovat teplota tohoto vzorku, sonda, která je perfektně komplementární k nemutovanému úseku DNA, se bude odlučovat od DNA za nižší teploty, pokud tato DNA nese mutaci. Odlučování (tání DNA, DN melting) sondy bude následováno poklesem fluorescence vzorku, protože barviva obou sond se budou opět vzdalovat. V této metodě se měří závislost fluorescence vzorku na teplotě vzorku a výsledkem jsou křivky tání DNA (melting curves).

Popsaná metoda vypadá na první pohled složitě, ale pomocí ní lze dobře detekovat mutace, které nemění restrikční místa a které lze jinak obtížně detekovat. Navíc je tato metoda instrumentální a umožňuje automaticky analyzovat větší počet vzorků najednou. Jak bylo uvedeno, provádí se v light cyklérech, kde je kombinováno provádění běžné PCR s ozařováním vzorků, měřením emitovaného světla a automatickým vyhodnocováním výsledku. Tato technologie se šířeji prosadila během posledních asi 10 let a dnes je už celkem běžně používána i v ČR nejen v detekci mutací, ale i pro „reál time PCR“ (kvantifikaci genetického materiálu v analyzovaném vzorku).

Detekce mutací na principu čipových technologií (synonyma: DNA chip-based assays, oligonucleotide arrays, oligonucleotide microchips). Na podložce o velmi malé ploše (většinou sklo) je zakotven buď soubor oligomerů (velikost souboru a délka oligomerů roste s postupujícím vývojem těchto technologií) ve formě „matice“, který po hybridizaci s PCR produktem zkoumaného úseku DNA vytváří specifický obraz [7,8,9].

Tento typ detekce je nejrychleji se vyvíjejícím, dokáže detekovat mutace na mnoha stovkách až tisících lokusů. Nevýhodou je zatím obrovská cena technologického vybavení i setů se zakotvenými sondami.

Přímá sekvence úseku DNA. Je metoda volby, má-li pracoviště k dispozici automatickou sekvenaci DNA. poskytuje nejpřímější důkaz přítomnosti mutace na DNA [10],

Uvedené metody jsou jen výsekem možností, jak prokázat mutaci nebo jinou odchylku v DNA. Vyjmenované metody se používají ve velkém množství obměn. Mimo ně existují další více či méně složité metody. Pro detekci některých frekvencích mutací u některých frekventních chorob existují komerčně dostupné soupravy, jejichž používání může být svěřeno i do rukou personálu, který nemá hlubší zkušenosti v molekulární genetice. K detekci málo frekventních mutací bez dostupných souprav je většinou zapotřebí, aby si vlastní metodu vypracovala zavedená molekulárně genetická laboratoř.

Přímá molekulárně genetická diagnostika neznámých mutací

Stejně jako u průkazu známých mutací je i zde většina metod založena na využití PCR techniky. Pokud nevíme, na kterém místě genu se mutace nachází, je nutné je nejprve celý gen prověřit na

-2CZ 296718 B6 obecnou přítomnost mutace, aniž bychom věděli, o jakou konkrétní mutaci se jedná. Tento mutační skríning je zaměřen většinou jen na kódující oblasti genu (exony), ačkoliv je známo, že i mutace v intronech může vyvolat vadný fenotyp jejích nositele (viz splicing). Provést mutační skríning znamená prověřit všechny exony genu nebo alespoň ty, ve kterých už byly mutace popsány a publikovány. Mutační skríning se provádí metodami, které jsou různě náročné a které poskytují různý stupeň záchytnosti mutací. Bohužel platí, že nejvíce záchytné metody jsou i nejnáročnější na provedení.

Mutační skríning se většinou provádí dvěma základními technikami: SSCP metodami (single strand conformation polymorphism) nebo DGGE metodami (denaturing gel gradient electrophoresis).

SSCP je metoda založená na rozdílné mobilitě jednořetězců DNA (single strand) s mutací a bez mutace po PCR amplifíkaci díky rozdílnému prostorovému uspořádání (conformation polymorphism) [11]. Amplifíkované vzorky se separují na standardním polyakrylamidovém gelu, což je běžná pomůcka molekulární genetiky. Praktické provádění SSCP není složité, ale některé mutace neodhalí. Uvádí se, že její záchytnost je kolem 70 %.

DGGE [12,13] je daleko pracnější a náročnější než SSCP, vyžaduje především dobrou laboratorní zkušenost personálu. DGGE poskytuje podstatně vyšší záchytnost výsledků než SSCP a blíží se až 100 %. Metoda je založena na rozdílném chování řetězců DNA s mutací a bez mutace v denaturačním gradientovém gelu, kde dojde k separaci řetězců DNA, které se liší byť i v jediné bázi.

Analogií DGGE je TGGE (temperature gel gradient electrophoresis), kde místo denaturačního gradientu se používá teplotní gradientu gelu.

Mimo SSCP a DGGE lze použít ještě jiné metody, které ale nedosahují jejích důležitosti a rozšíření.

Detekce mutací na principu čipových technologií na stejném principu jako u detekce známých mutací. Dokáže skrínovat mutace např. v celém genu. Nevýhodou je také zatím obrovská cena technologického vybavení i setů se zakotvenými sondami a tedy fakt, že jen málokteré geny jsou předmětem tak cíleného zájmu, aby se vyplatilo konstruovat matice se souborem sond pro daný gen.

Přímá sekvenace. Pokud je mutačním skríningem zjištěno, že v analyzované DNA je přítomna mutace nebo jiná odchylka, je nutné nález ještě verifikovat přímou sekvenací, která určí, o jakou mutaci se přesně jedná.

V hledání neznámých mutací v genu lze vynechat skrínovací metody a provést rovnou přímou sekvenací zkoumaných exonů. Je to rychlejší, ale díky ceně sekvenace daleko dražší způsob.

Multiplexicita reakcí

Lze konstatovat, že naprostá většina výše popsaných metod je více či méně monoplexní, respektive možnost multiplexicity je velmi omezená. Monoplexní systém znamená takový systém, ve kterém je detekována přítomnost pouze jediné mutace, respektive jediné oblasti s možnou mutací.

V multiplexním provedení je paralelně detekována přítomnost více či možných mutací na více místech v jednom vzorku jedním vyšetřením.

Detekcí specifických, definovaných mutací se zabývá např. řešení patentu WO 9818965 (resp. US 6248518) využívající tzv. metodu „fluorescence resonance energy transfer“ nebo patentu WO 9723646 využívající komplex řetězců referenční a testované DNA sekvence pro stanovení odlišnosti vnukleových kyselinách pomocí značení Hollidayových struktur. Aplikace US 5601979

-3CZ 296718 B6 popisuje přípravu magnetické pevné fáze zejména pro syntézu oligonukleotidů a pro další využití takto funkcionalizovaných magnetických částic. Aplikace WO 9408047 naopak využívá enzymatickou metodu ligázové řetězové reakce pro detekci definovaných, známých mutací DNA. Naopak např. aplikace WO 0168919 se zabývá detekcí definovaných i neznámých mutací pomocí separace DNA v denaturačním gradientu. Nejbližší stav techniky pravděpodobně popisuje aplikace WO 9627680 (resp. US 6475721), jejímž předmětem řešení je sekvenčně specifická detekce nukleových kyselin na pevné fázi. Pevnou fázi se zde preferenčně uvažuje plocha. Jedná se tedy o metodu detekce podobnou, ne-li stejnou, jako je detekce na DNA čipech pomocí specifické hybridizace, což není předmětem námi předkládaného řešení. Dále je toto řešení založené na použití chemických analogů nukleových kyselin. Námi předkládané řešení nevyužívá (nenárokuje) použití chemických analogů nukleových kyselin a souvisí s řešením popsaných WO 9627680 (resp. US 6475721) pouze využitím sekvenčně specifické detekce. Naše řešení se zabývá mnohem komplexnější současnou detekcí s pre-amplifikací. Veškerá tato i podobná řešení jsou velmi náročná a předpokládají pre-amplifíkaci jednotlivých úseků DNA obsahujících mutaci(mutace). Tímto se řadí mezi ostatní metody ve kterých je multiplexicita, tj. možnost detekce mnoha různých mutací v jediném vyšetření, velmi omezená.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je nový, obecně použitelný detekční systém pro identifikaci definovaných mutací v lidské DNA jako prostředek pro post- i prenatální molekulárně genetickou diagnostiku chorob. Multiplexní detekce je založena na použití dvou univerzálních primerů pro amplifikaci jakéhokoliv úseku DNA nesoucího definovanou mutaci, určeného specifickou DNA sekvencí vázanou na magnetickou částicí.

Princip je založen na hybridizaci jedné části DNA sekvence MPG-0 (MPG oligonukleotid; univerzální oligonukleotidová sekvence C) (druhou část tvoří sekvence univerzálního primeru tzv. priming site - PS; univerzální oligonukleotidová sekvence A) vázané na magnetické částici k přilehlé oblasti zkoumaného úseku DNA ve 3' směru od místa s možným výskytem mutace (PMS - potential mutation site), enzymatickému prodloužení této sekvence pomocí polymerázy (např. Taq polymerázy nebo Klenow polymerázy) a tím k přepsání místa s mutací. Po denaturaci a separaci magnetických částic obsahujících PMS je na 3' konec této DNA enzymaticky nasyntetizována sekvence obsahující sekvenci jediné vybrané báze (dATP, dTTP, dGTP nebo dCTP) např. pomocí enzymu terminální transferázy. Následně se takto připravené sekvence, kterých může být neomezené množství (podle množství MPG-0 specifických pro různé mutace jsou amplifikovány pomocí PCR s univerzálními primery (PSP- PS primer tedy univerzální oligonukleotidová sekvence A a poly(dN) tedy univerzální oligonukleotidová sekvence B). Takováto směs specifických fragmentů obsahujících místa s vybranými mutacemi může být podrobena standardním způsobem detekce mutací např. hybridizaci na pevné fázi (DNA čipy apod.).

Podrobný popis po jednotlivých krocích (kroky 1 a 2 viz. Příloha 1, Obrázek 1; kroky 3 až 5 viz. Příloha 2, Obrázek 2):

1. Genomová DNA vyšetřovaného jedince je izolována a může být nespecificky naštěpena na kratší úseky (např. sonikací). Může být použita i DNA z jediné buňky.

2a. K přilehlé oblasti zkoumaného úseku DNA ve 3' směru od místa s možným výskytem mutace (PMS - potential mutation site) se syntetizuje oligonukleotid komplementární sekvencí. 5' oblast tohoto oligonukleotidu přechází v primovací úsek o délce 20-30 bází, na jehož 5' konci je aminoskupina, prostřednictvím niž se naváže na části MPG-LCA (magnetické části s alkylaminem navázaným přes spojovací můstek) a vytvoří tak komplex MPG-0 (MPG-oligonukleotid tedy univerzální oligonukleotidová sekvence A, je uměle zvolená sekvence společná pro všechny multiplexně použité MPG-0 částice, k níž se sestrojí primer pro PCR celého úseku tedy univerzální oligonukleotidová sekvence A (PSP-PS primer). Aby byla primovací sekvence univerzální

-4CZ 296718 B6 pro všechny MPG-O, je zapotřebí při její konstanci splnit zejména podmínku nepřítomnosti sekvence v lidské DNA a nepřítomnosti sekundárních struktur a to zejména na 3' konci.

Komerčně dostupné MPG částice (Magnetic Porous Glass) mají velikost 5 pm, průměr pórů 50 nm, povrch 60 m²/g. Jsou složeny z borosilikátu povlečeného oxidem železa, jsou superparamagnetické bez magnetické paměti, v 1 mg je obsaženo 4-6 x 10⁶ částic, k 1 mg částic je vázáno 20 nmol oligonukleotidu.

Komplex MPG-O dokáže z testované DNA (po denaturaci) vázat jen ty fragmenty, které obsahují zkoumaný úsek DNA (v jehož těsné blízkosti v 5' směru se nachází možné místo mutace PMS). Tyto hybridy [MPG-O + fragment DNA] jsou jednoduchou magnetickou separační procedurou odděleny od zbytku DNA.

2b. Po přidání polymerázy, pufru a směsi nukleotidtrifosfátů (dNTP) působí toto spojení mezi MPG-O a fragmentem DNA jako primer a dochází k elongaci oligonukleotidového řetězce ve směru 5'—>3' a takto je struktura zachycena DNA „přepisována“ včetně PMS do nově prodlužovaného řetězce vázaného na MPG částici. Nový útvar MPG-PO (MPG- prolonged oligonucleotide) takto nese informaci, je-li nebo není-li v přepsaném řetězci testované DNA přítomna mutace.

2c. Po denaturaci hybridu [MPG-PO + fragment DNA] a následné magnetické separační proceduře jsou odděleny a zachyceny pouze MPG-PO. Je-li k MPG-PO přidána např. terminální transferáza s přídavkem jednoho typu nukleotidtrifosfátů, je řetězec DNA prolongován ve směru 3' tvorbou ocásku polyX, kde X je jakýkoliv použitý nukleotid, za vzniku komplexu MPG-TPO (MPG- tailed prolonged oligonucleotide).

3. Komplex MPG-TPO se připojením definovaného ocásku na 3' konec stal amplifikovatelným jedním párem primerů, ačkoliv jednotlivé řetězce mají nestejnou délku a v případě multiplexního použití i nestejný původ. Amplifikace je provedena pomocí primerů poly(dN) tedy univerzální oligonukleotidové sekvence B a PSP (priming site primer) tedy univerzální oligonukleotidové sekvence A, z nichž nejméně PSP je značený (např. radioaktivně, fluorescenčně nebo biotinem). Produktem PCR reakce je vznik amplifíkovaných fragmentů nestejné délky, pocházejících z různých testovaných lokusů, které nesou příslušná PMS. PCR produkt je značený pro následnou detekci.

4. K detekci PMS míst v testované DNA se použije metody reverzní hybridizace. U reverzních hybridizace je PCR značený produkt nákladně hybridizován v jednom kroku s množstvím oligonukleotidových sond zakotvených na pevné fázi (např. jamka v destičce, spot na DNA čipu apod). Tyto sondy jsou komplementární k těsnému okolí PMS (PMSA - potential mutation site area) a jejich délka je 10-35 bází.

PCR produkt se naváže jen na ty sondy, ke kterým je zcela komplementární, naopak se neváže vůbec nebo jen velmi slabě (nespecificky) k sondám, které nejsou zcela komplementární, a to i jen v jediné bázi. V tomto případě vzniká mismatch, který je příčinou takové nestability vzniklého dvouřetězce, a vede kjeho opětnému rozpojení. Reverzní hybridizace pro detekci mutací v DNA je založena právě na tom, že hybridizují jen zcela komplementární řetězce.

Pro reverzní hybridizaci se zakotví na pevné fázi vždy dvojice příslušných oligonukleotidů, z nichž jeden bude komplementární k PMSA nenesoucímu mutaci (wild type) a druhý k PMSA s mutací. Pro experiment je nutná tuto dvojici doplnit kontrolním oligonukleotidem, který není ani komplementární k úseku s mutací ani kwild type, ale nese jinou bázi, než která je očekávaná v PMSA.

5. PCR produkt (z bodu 3) je použit jako sonda pro hybridizaci na pevné fázi (z bodu 4). Hybridizace je prováděna standardně. Značené produkty PCR reakce, které specificky hybridizují s elongovanými oligonukleotidovými sondami zakotvenými na pevné fázi, jsou detekovány příslušným systémem podle druhu značení (např. detekce fluorescence, detekce biotinu pomocí streptavidinu apod).

Podle toho, která sonda hybridizovala s PCR produktem, se usoudí na přítomnost nebo nepřítomnost testované mutace (popř. na heterozygotní stav).

Jak bylo zmíněno v části Dosavadní stav techniky, současné metody jsou spíše monoplexní a jejich využití pro detekci více míst s různými mutacemi předpokládá jejich současnou či paralelní amplifíkaci pomocí PCR. V tom případě však je potřeba pro každý vyšetřovaný úsek DNA obsahující vybranou mutaci navrhnout jiný pár primerů pro PCR. Ačkoliv existuje možnost multiplexní PCR, je to metoda velmi náročná a její optimalizace je zdlouhavá. Navíc maximální počet párů primerů použitých v jediné multiplexní PCR je sice teoreticky neomezený nicméně prakticky lze použít maximálně 20 párů primerů. Předmětem našeho vynálezu je způsob amplifíkace prakticky neomezeného množství úseků DNA a jejich následnou detekci hybridizaci.

Příklady provedení

DNA dárců

Odběr krve, popř. odběr sliznice dutiny ústní byl proveden od dobrovolných dárců.

DNA byla izolována z krve fenol-chloroformovou metodou podle obvyklých postupů nebo ze stěru podle běžných postupů.

U DNA dárců byl dále zjišťován genotyp vybraných polymorfísmů.

Výběr vhodných RFLP polymorfismů, které simulují přítomnost nebo nepřítomnost mutace

Pro nedostupnost DNA dárců, kteří mají přesně definovanou bodovou mutaci, byla zvolena simulace mutace pomocí RFLP polymorfního místa, protože je snadno detekovatelné restrikční enzymy.

Byly vybrány takové publikované RFLP polymorfísmy, které měly uvedeny vysokou hodnotu heterozygozity (okolo 0,5) štěpnost dostupnou restrikční endonukleázou a publikované sekvenční okolí RFLP místa.

Jako vhodné vzhledem k uvedeným kritériím byly vybrány polymorfísmy:

-6CZ 296718 B6

Seznam vybraných polymorfismů	Zdroj
Název polymorfismů	Štěpící enzym	GDPID
ACP1	Taql	43755	[15]
DRD2/H	HincII	39812	[16]
DRD2/Ta	Taql	39812	[16]
DRD2/Tb	Taql	39812	[16]
DRD2/Td	Taql	39812	[16]
PAH	XmnI	37909	[17]
TGFA/R	Rsal	205164	[18]
TGFA/T	Taql	205164	[18]
DRD2/E	EcoRI	39812	[16]
F2	BamHI	39967	[19]

Testování genotypu DNA dárců u vybraných polymorfismů

V první fázi testování genotypu byl nalezen optimální PCR profil každého polymorfismů. Stanovení bylo prováděno v gradientovém cykléru při různých koncentracích hořčíku.

V druhé fázi práce byl PCR produkt podroben štěpení příslušnou RE. Porovnáním velikosti štěpných produktů s velikostním markérem byl stanoven genotyp u 7 vyšetřovaných DNA. Výsledné genotypy jsou uvedeny v příloze 3, tabulka 1.

Nespecifická fragmentace DNA

DNA bylo nutné podrobit nespecifické fragmentaci, která by zajistila její náhodné štěpení a poskytla fragmenty o velikosti cca 1000 bp (nejlépe v rozmezí 600 - 2000 bp).

Nespecifická fragmentace je popisována pomocí několika metod, většinou mechanických nebo pomocí ultrazvuku.

K mechanické fragmentaci nevedly tyto pokusy: mnohonásobná pasáž DNA tenkou jehlou; zahřívání v mikrovlnné troubě; dlouhodobé intenzivní míchání DNA na magnetické míchačce.

Nespecifickou fragmentaci se podařilo standardně a reprodukovatelně uskutečnit pouze sonikací vzorku (působením ultrazvuku). Byl použit přístroj Ikasonic U50 (Fisher) se sondou pro objem 500 μΐ. Byly testovány různé podmínky sonikace (nastavení cyklů, délka amplitudy a počet cyklů.

Změna nastavení cyklů a změna délky amplitudy nevedou k výrazným změnám ve fragmentaci DNA (ověřováno na 2% agarózovém gelu), zatímco počet cyklů ano.

Pro sonikací vzorků pro další použití bylo přijato toto schéma:

přístroj: Ikasonic U50 (Fisher), sonda: pro objem 500 μΐ, nastavení cyklů: 0,75, amplituda: 80%, počet cyklů: 20, objem sonikovaného vzorku: 400-500 μΐ (podle celkového množství vzorku).

Konstrukce sond pro reverzní hybridizaci

Byla konstruována sada oligonukleotidových sond (15, 17, 19, 22, 25 a 30-merů), které jsou komplementární k místu potenciální mutace a jeho těsnému okolí (PMSA). Tyto sondy byly připraveny ve dvojici: sonda s mutací a sonda bez mutace.

Dále byly konstruovány 3 kontrolní sondy pro kontrolu specifíty hybridizace a vlastní hybridizace.

Vázání sondy na MPG částici.

Na MPG částici byly navázány biotinylované oligomery (sondy), které se skládají ze 2 částí.:

- univerzální primovací sekvence PSa, která je stejná pro všechny polymorfismy a slouží k sestavení primeru pro PCR celého úseku DNA,

- specifické části „-M“, která je odlišná pro každý vyšetřovaný polymorfismus a slouží k zachycení odpovídajících fragmentů sonikované DNA. Tato zachycená DNA obsahuje úsek, v jehož těsné blízkosti se nachází polymorfní místo (tj. simulovaná mutace PMS).

Popis metody:

1. Najedno vázání bylo použito 60 μΐ suspenze částic (MPG Streptavidin 10 pg/pl). Po promytí v B/W purfu (přibližně 600 μΐ) byly částice odseparovány na magnetickém separátoru (provedeno 2x) a důkladně rozmíchány ve 400 μΐ B/W pufru,

2. odděleně bylo smícháno 5 μΐ sondy (500 pmolů) a 395 μΐ vody,

3. bylo smícháno 400 μΐ částic z kroku 1 + 400 μΐ sondy z kroku 2,

4. byla provedena inkubace za mírného pohybu přes noc při laboratorní teplotě, 5. druhý den byla suspenze 2-3 x promyta v B/W pufru,

6. důkladně rozmícháno ve 400 μΐ A/L pufru.

Zachytávání odpovídajících fragmentů DNA na MPG Částici

Pro následné kroky bylo třeba vychytat ze směsi fragmentů sonikované DNA pouze ty fragmenty, které obsahují oblast našeho zájmu, tj. PMSA. Důkaz zachycené DNA byl proveden PCR amplifikací s odpovídajícími primery pro každý jednotlivý polymorfismus.

Popis:

Najedno vychytávání bylo použito 200 μΐ komplexu MPG-sonda a 50 μΐ sonikované DNA.

1. 50 μΐ sonikované NA bylo smícháno s 50 μΐ pufru 2x HB. Byla provedena denaturace DNA při 96 °C - 5 minut, vzorky byly zchlazeny na ledu a přidány ke komplexu MPG-sonda po separaci na magnetickém separátoru.

2. Inkubace při 55 °C v hybridizačním inkubátoru.

3. Separace MPG, promytí 3x600 μΐ promývacího pufru WB.

4. Po třetím promytí bylo přidáno 100 μΐ pufru 2xHB.

-8CZ 296718 B6

Výsledkem zachytávání je 100 μΐ komplexu MPG-sonda-zachycená sonikovaná DNA.

Důkaz zachycené DNA MPG částicemi

Pro důkaz zachycené DNA MPG částicemi bylo provedeno PCR s primery pro odpovídající polymorfismus. PCR bylo provedeno v podmínkách, které se jevily jako optimální při stanovování genotypů u jednotlivých polymorfísmů. Jako kontrola byla použita příslušná sonikovaná DNA (bez zachycení).

Vlastní experiment

Vlastní experiment zahrnuje přepis PMS a jeho blízkého okolí do struktury MPG-TPO (MPGtailed prolonged oligonucleotide) a skládá se z prodloužení MPG-0 Klenow polymerázou do MPG-PO a jeho následného prodloužení terminální transferázou do výsledné struktury MPGTPO.

Vyplnění oblasti PMS a jeho blízkého okolí Klenowem - vznik MPG-PO

Ke komplexu MPG-sonda-zachycená DNA byl předán Klenowův fragment DNA polymerázy I, dochází k přepisu MPS a jeho blízkého okolí.

Bylo použito 100 μΐ komplexu [MPG - sonda-zachycená DNA]. K tomuto komplexu byla přidána směs vody, pufru lOx, dNTP a Klenow polymerázy I, dochází k přepisu PMSA. Byla provedena inkubace při 37 °C po dobu 10 minut.

Prodloužení MPG-PO terminální transferázou za vzniku MPG-TPO

Komplex [MPG- sonda - zachycená DNA - Klenow polymerázou prodloužená PMSA] byl prodloužen o poly-G pomocí terminální transferázy.

Provedena denaturace DNA (95 °C - 5 minut), separace MPG, promytí pufrem WB. Po přidání směsi vody, pufru lOx, CoCl₂, dGTP a TdT. Byla provedena inkubace při 37 °C po dobu 1 minuty, následovalo promytí pufrem WB. Výsledkem všech těchto operací je MPG-TPO.

Amplifikace vzniklé DNA

PCR byla prováděna v gradientovém cykléru při 3 různých teplotách - 45 °C, 54 °C a 60 °C, při 2 odlišných koncentracích hořčíku -1,5 mM a 3 mM a při 2 odlišných koncentracích templátové DNA - neředěné a ředěné 1:10. Jako primery by použit biotinylovaný oligonukleotid PSa a oligonukleotid C_t4. Tyto primery jsou komplementární k lokusům ohraničujícím experimentálně vzniklou DNA z obou stran. Optimální produkt (tj. významný pruh odpovídající velikosti po agarózové elektroforéze) byl použit pro hybridizaci se sondami zakotvenými na pevná fázi.

Hybridizace biotinylovaného produktu se sondami zakotvenými na pevné fázi polystyrénové 96jamkové destičky

Při hybridizaci biotinylovaného produktu se sondami zakotvenými na pevné fázi dochází k zachycení denaturovaného PCR produktu v případě, že sekvence sondy je komplementární k sekvenci PCR produktu. Čím vyšší stringence podmínek (teplota hybridizace, iontová síla pufru), tím více je zajištěna, že hybridizují jen perfektně komplementární a že během odmývání dochází kodmytí té DNA produktu, která se liší od sekvence DNA sondy zakotvené na membráně i v jediné bázi.

-9CZ 296718 B6

Detekce se provádí tetramethylbenzidinem (TMB). Při pozitivním výsledku jamka zmodrá po reakci bezbarvé TMB na modrý derivát. Odečítá se absorbance jednotlivých jamek při 450 nm.

Výsledky (viz příloha 3, tabulka 2)

Po provedení reakce byly vyhodnoceny získané hodnoty absorbancí jednotlivých vzorků s jednotlivými sondami (wt nebo MUT) u vyšetřovaných mutací. Hodnocení absorbancí bylo následující: hodnoty 0-150 - (-); 151-250 - (+/-); 251-999 - (+); 1000-1500 - (++); 1501-2000 (+++); 2001 a více - (++++). Reakce (-) a (+/-) byly hodnoceny jako negativní, reakce (+) a vyšší byly hodnoceny jako pozitivní. Výsledky plně korespondují s genotypy určenými pomocí restrikce (viz příloha 3, tabulka 1). Byla prokázána proveditelnost a možnost multiplexního určení deseti různých mutací bez jakékoliv interference.

Přehled obrazové dokumentace:

Příloha 1: První část schématu podstaty vynálezu a provedení experimentů.

Příloha 2: Druhá část podstaty vynálezu a provedení experimentů:

Příloha 3: Tabulka 1 - výsledky určení genotypu vybraných vyšetřovaných DNA jednotlivých dárců; tabulka 2 - výsledky provedení experimentu podle popisu.

Použité zkratky:

MPG	Magnetic Porous Glass (magnetické částice).
MPG-O	MPG-oligonucleotide (mag. částice-oligonukleotid tedy univerzální oligonukleotidová sekvence C).
MPG-PO	MPG-prolonged oligonucleotide (mag. částice-oligonukleotid po prolongaci Klenow polymerázou).
MPG-TPO	MPG-tailed prolonged oligonucleotide (mag. částice-oligonukleotid po prolongaci Klenow polymerázou a další prolongaci terminální transferázou).
PS	priming site (primovací místo).
PSP	priming site primer (primer k primovacímu místu tedy univerzální oligonukleotidová sekvence A).
PMS	potential mutation site (místo potenciální mutace).
PMSA	potential mutation site area (oblast okolo místa potenciální mutace).
SSCP	Single strand conformation polymorphism (metoda pro detekci neznámých mutací na základě polymorfismu konformací jednořetězcových DNA).
DGGE	denaturing gradient gel electrophoresis (metoda pro detekci neznámých mutací na základě denaturace v gelu s gradientem denaturantu).
DNA	deoxyribonukleová kyselina.
TGGE	temperature gradient gel electrophoresis (metoda pro detekci neznámých mutací na základě denaturace v gelu s teplotním gradientem).

- 10CZ 296718 B6

FRET	fluorescence resonance energy transfer (převod fluorescenční resonanční energie nesvítivých přechodem).
dNTP	jakýkoliv deoxyribonukleotid trifosfát (dATP, dTTP, dGTP a dCTP).

dA, T, G, CTP adenin, thymin, guanin a cytosin deoxyribonukleotid trifosfát.

RE	restrikční enzym.
RFLP	restriction fragment length polymorphism (polymorfísmus délky restrikčních fragmentů).
TdT	terminální deoxyribonukleotid transferáza enzym.
TMB	tetramethylbenzidin.
bp	base pairs (párů bází).
MPG-LCA	magnetic porous glass-long chain alkylamine (magnetické částice z porézního skla s navázanou skupinou alkylaminu s dlouhým řetězcem).
MUT	mutace; většinou označení mutované alely.
WT	wild type (nemutovaná sekvence); většinou označení nemutované („zdravé“) alely.

Průmyslová využitelnost

Tento navržený systém je obecně použitelný jako pre-amplifikaění krok k jakémukoliv detekčnímu systému pro identifikaci definovaných mutací v lidské DNA jako prostředek pro post- i prenatální molekulárně genetické diagnostiku vzorových dědičných chorob.

Tento multiplexní systém lze využít jako součást detekčních souprav s techniky poměrně jednoduchým použitím které nevyžaduje specializované molekulárně genetické laboratorní vybavení a hluboké znalosti oboru. Systém je využitelný při skreeningovém testování mnoha mutací při diagnostice závažných onemocnění.

Reference:

[1] Mullis, K.B., Faloona F.A. 1987. Specifíc synthesis of DNA in vitro via a polymerase catalyzed chain reaction. Methods Enzymol. 155:335-350 [2] Sarkar, G., Cassady, J., Bottema, C.D.K., Sommer, S.S. 1990. Characterization of polymerase chain reaction amplification of specifíc alleles. Anal. Biochem. 186:64—68 [3] Wu, D.Y., Ugozzoli, L., Pal, B.K. Wallace, R.B., 1989, Allele specifíc enzymatic amplification of β-globin genomic DNA for diagnosis of sicle cell anemia. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 865: 2757-2760 [4] Glisic, S., Alavantic, D. 1996. A simple PCR method for detection of defined point mutations. Trends in Genet. 12:391-392

-11 CZ 296718 B6 [5] Kawasaki, E., Saiki, R., Erlich, H. 1993. Genetic analysis using polymerase chám reactionamplified DNA and immobilized oligonucleotide probes: Reverse dot-blot typing. Methods Enzymol., 218, 369-381 [6] Winter, S., Kirschstein, S., Miller, D.P. 1999. Molecular dynamics of labeled oligonucleotide probes ušed for the detection of point mutations in DNA. Nucleosides Nucleotides 18:411-23 [7] Nilsson, P., Persson, B., Larsson, A., Uhlen, M., Nygren, P.A. 1997. Detection of mutations in PCR products from clinical samples by surface plasmon resonance. J. Mol. Recognit. 10:7-17 [8] 0'Donnell-Maloney, M.J., Little, D.P. 1996. Microfabrication and array technologies for DNA sequencing and diagnostics. Genet. Anal. 13:151-157 [9] Hacia, J. G., brody, L.C., Chee, M.S. et al. 1996. Detection of heterozygous mutations in BRCA1 using high density oligonucleotide arrays and two-colour Fluorescence analysis. Nat. Genet. 14:441 447 [10] McCabe, P.C. 1991. Production of single-stranded DNA by assymetric PCR. In: PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Innis et al., eds., Academie Press, lne., San Diego [11] Orita, M., Suzuki, Y., Sekyia, T., Hayashi, K. 1989. Rapid and sensitive detection of point mutations and DNA polymorphisms using the polymerase chain reaction Genomics 5: 874879 [12] Myers, R.M., Lumelsky, N., Lerman, L.S., Maniatis, T. 1985. Detection of single base substitutions in total genomic DNA Nátuře (London) 313: 495-498 [13] Myers, R.M., Maniatis, T., Lerman, L.S., 1985. Detection and localization of single base changes by denaturing gradient gel electrophoresis. Methods Enzymol. 155:500-527 [14] Rolfs, A., Schuller, I., Finckh, U., Weber-Rolfs, I. 1992. Detection of single base changes using PCR. In: Clinical diagnostics and research, Springer—Verlag Berlin Heidelberg [15] Sensabaugh, G.F., Lazaruk, K.A. 1993. A Taql site identifíes the *A allele et the ÁCP1 locus. Hum. Mol. Genet. 2:1079 [16] Grandy, D.K., Zhang. Y., Civelli, O. 1993. PCR detection of the TaqA RFLP at the DRD2 locus. Hum. Mol. Genet. 2:2197 [17] Goltsov, A.A., Eisensmith, R.C., Woo, S.L. 1992. Detection of the XmnI RFLP at the human PAH locus byl PCR. Nucleic Acids Res. 20:927 [18] Qian, J.F., Feingold, J., Stolí, C., May, E. 1993. Transforming growth factor-alpha: characterization of the BamHI, Rsal, and Taql polymorphic regions. Am. J. Hum. Genet. 53:16875 [19] Iwahana, H., Mizusawa, N., Yoshimoto, K., Itakura, M. 1992. Detection of a new polymorphism of the human prothrombin (F2) gene by combination of PASA and mutated primermediated PCR-RFLP. Hum. Genet. 90:325-6

Claims (8)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Metoda pro detekci jedné nebo více specifických cílových nukleotidových sekvencí, které se liší od ostatních nukleotidových sekvencí přítomných ve vzorku jedinou nebo více jednonukleotidovými změnami, inzercemi a/nebo delecemi, vyznačující se tím, že použitá reakční směs obsahuje univerzální oligonukleotidovou sekvencí A, univerzální oligonukleotidovou sekvenci B, a jednu nebo více oligonukleotidových sekvencí C, kdy oligonukleotidová sekvence C je navázána na magnetickou částici a váže se komplementárně ke specifické cílové sekvenci vzorku ve vzdálenosti 5 až 200 bází od místa obsahujícího jedinou nebo více jednonukleotidových změn, inzercí a/nebo deleci, a enzymaticky se prodlouží takto hybridizované DNA sekvence C DNA polymerázou tak, že dojde k přepsání specifické cílové sekvence obsahující jedinou nebo více jednonukleotidových změn, inzercí a/nebo deleci, a enzymaticky se připojí homopolymemí sekvence jediné báze na 3' konec prodloužené DNA sekvence C, kdy touto bází je adenin, thymin, guanosin nebo cytosin, kdy tato sekvence je komplementární k univerzální oligonukleotidové sekvenci B, a magneticky se oddělí jedna nebo více takto přepsaných sekvencí navázaných na magnetických částicích, a amplifikuje se takto vytvořená jedna nebo více sekvencí obsahujících specifické cílové nukleotidové sekvence obsahující jedinou nebo více jednonukleotidových změn, inzercí a/nebo deleci navázaných na magnetických částicích pomocí polymerázové řetězové reakce s použitím univerzální oligonukleotidové sekvence A a univerzální oligonukleotidové sekvence B jako primerů, a provede se detekce pomocí hybridizace s oligonukleotidovými sekvencemi komplementárními k jedné nebo více specifickým cílovým nukleotidovým sekvencím obsahující jedinou nebo více jednonukleotidových změn, inzercí a/nebo deleci.
2. 2. Metoda podle nároku 1, kdy univerzální oligonukleotidová sekvence A je sekvence o délce 15 až 30 bází, která netvoří sekundární struktury, zejména na svém 3' konci.
3. 3. Metoda podle nároku 1, kdy univerzální oligonukleotidová sekvence B je sekvence o délce 10 až 50 bází skládající se vždy z homopolymemí sekvence jediné báze, kdy touto bází je adenin nebo thymin nebo guanosin nebo cytosin.
4. 4. Metoda podle nároku 1, kdy univerzální oligonukleotidová sekvence C je sekvence o délce 10 až 150 bází skládající se vždy z části sekvence univerzální oligonukleotidové sekvence A podle nároku 2 a části sekvence specifické pro cílovou nukleotidovou sekvenci obsahující jedinou nebo více jednonukleotidových změn, inzercí a/nebo deleci.

   -13 CZ 296718 B6
5. 5. Metoda podle nároku 1, kdy postup detekce pomocí hybridizace s oligonukleotidovými sekvencemi komplementárními k jedné nebo více specifickým cílovým nukleotidovým sekvencím obsahující jedinou nebo více jednonukleotidových změn, inzercí a/nebo delecí se vyznačuje tím, že se použije jedna nebo více specifických oligonukleotidových sekvencí navázaných na definované pozice pevné fáze, kdy po nanesení produktu polymerázové řetězové reakce podle nároku 1 na pevnou fázi za podmínek umožňujících sekvenčně specifickou hybridizaci produktu s oligonukleotidovými sekvencemi navázanými na pevné fázi dojde k hybridizaci pouze v místech oligonukleotidových sekvencí komplementárních k sekvencím přítomným v produktu a indukující tedy přítomnost dané specifické cílové nukleotidové sekvence obsahující jedinou nebo více jednonukleotidových změn, inzercí a/nebo delecí ve vzorku.
6. 6. Metoda podle nároku 1, kdy vzorkem se rozumí izolovaná DNA z jediné nebo více buněk a kdy tato DNA může být intaktní nebo nespecificky částečně naštěpená, například sonikací či jinak.
7. 7. Metoda podle nároku 1, kdy univerzální oligonukleotidová sekvence A a/nebo univerzální oligonukleotidová sekvence B obsahuje navázanou jakoukoliv chemickou strukturu, kterou lze snadno detekovat, například molekulu biotinu, fluoresceinu a jiné.
8. 8. Metoda podle nároku 1 pro detekci bodových mutací in vitro při diagnostice lidských, zvířecích či rostlinných chorobných stavů.