JPWO2011108499A1

JPWO2011108499A1 - オーラプテン類縁化合物を有効成分とする骨芽細胞分化促進剤、骨形成促進用医薬組成物及び保健機能食品

Info

Publication number: JPWO2011108499A1
Application number: JP2012503135A
Authority: JP
Inventors: 済泰禹; 文香日比野; 米澤　貴之; 貴之米澤; みどり浅井; 俊明照屋; 炳允車; 和夫永井
Original assignee: ERINA Co Inc
Current assignee: ERINA Co Inc
Priority date: 2010-03-03
Filing date: 2011-02-28
Publication date: 2013-06-27
Also published as: WO2011108499A1; JP6334751B2; US8729279B2; US20130102796A1; KR20130050912A; KR101712927B1; JP2016128407A; JP2017105798A

Abstract

オーラプテン等のクマリン類化合物の新たな用途を提供する。安全性が高く、有効性の高い骨芽細胞分化促進剤、骨形成促進用医薬組成物及び保健機能食品等を提供する。本発明の一つの態様は、以下の式１：【化１】で表される精製されたクマリン化合物からなる骨芽細胞分化促進剤である。

Description

本発明は、柑橘類に含まれるオーラプテン又はその類縁化合物を有効成分とする骨芽細胞分化促進剤、それを含有する骨形成促進用医薬組成物、食品添加物及び保健機能食品等に関する。

種々の柑橘類に含まれる成分には、各種の生理活性の知られているものがある。クマリン類化合物の一種であるオーラプテンについては、抗がん活性、抗酸化活性、抗炎症作用、ＰＰＡＲアゴニスト活性、抗菌活性、抗血小板活性、抗リーシュマニア活性などの生理活性が知られており、オーラプテンの作用を利用したメタボリックシンドローム改善剤（特許文献１：再公表０７−１３２８９３号公報、特許文献２：再公表０６−０７７９７２号公報）、神経伝達障害の予防又は治療剤（特許文献３：特表２００８−５１７８７９号公報）、エプスタインバーウイルス早期抗原誘導抑制剤（特許文献４：特開平０９−１５７１６６号公報）などが提案されている。

また、柑橘類の成分であって骨芽細胞に対する分化促進作用を有するものとしては、ヘスペレチン（非特許文献１、２）、ナリンギン（非特許文献３）及びβ−クリプトキサンチン（非特許文献４）が報告されている。クマリン類化合物については、非特許文献５〜９に記載されている。

特開２００６−０８３１５１号公報（特許文献５）には、温州ミカンの果実・果皮抽出物を含有することを特徴とする骨粗鬆症予防及び改善組成物が記載されている。これは、β−クリプトキサンチン、ヘスペリジンの破骨細胞分化抑制による骨吸収抑制作用に基づくものである。

特開２００６−００８６２５号公報（特許文献６）には、日向夏ミカンの処理物を含有する骨代謝改善剤が記載されている。骨芽細胞に対する作用としては、増殖促進作用及びＩＬ−６産生促進作用が記載されているが、分化促進作用は記載されていない。

このように、オーラプテン及びその類縁化合物については、骨芽細胞に対する分化促進作用又は骨形成促進作用を報告した文献は見当たらない。

再公表０７−１３２８９３号公報再公表０６−０７７９７２号公報特表２００８−５１７８７９号公報特開平０９−１５７１６６号公報特開２００６−０８３１５１号公報特開２００６−００８６２５号公報

Cesar TB et al., J Nat Prod. 2009 Sep;72(9):1702-4. Tanaka T et al., Int J Cancer. 2010 Feb 15;126(4):830-40 Krishnan P et al., BMC Cancer. 2009 Jul 29;9:259 Soltani Fet al., Phytother Res. 2010 Jan;24(1):85-9 Murakami A, Forum Nutr. 2009;61:193-203. Epub 2009 Apr 7 Lapa Fda R, et al., Basic Clin Pharmacol Toxicol. 2009 Apr;104(4):306-15. Epub 2009 Mar 5 Prince M, et al., Toxicol Lett. 2009 Mar 28;185(3):180-6. Epub 2008 Dec 30 Tanaka T, et al., Nutr Cancer. 2008;60 Suppl 1:70-80 Nabekura T, et al., Eur J Pharmacol. 2008 Dec 14;600(1-3):45-9. Epub 2008 Oct 21

本発明は、オーラプテン及びその類縁クマリン類化合物の新たな用途を提供すること、また、安全性が高く、有効性の高い骨芽細胞分化促進剤、骨形成促進用医薬組成物及び保健機能食品等を提供することを目的とする。

本発明者らは、柑橘類に含まれるオーラプテン及びその類縁のクマリン類化合物に、骨芽細胞の分化を促進する作用があることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明によれば
下記の式１：

（式中、Ｒ１は、水素原子、水酸基、メトキシ基、メチル基、エチル基、プロピル基、カルボキシル基、カルボキシメチル基又はカルボキシエチル基；Ｒ２は、水素原子、水酸基、メトキシ基、メチル基、エチル基、プロピル基、カルボキシル基、カルボキシメチル基、カルボキシエチル基又はクマリニル基；Ｒ３は、水素原子、水酸基、メトキシ基、メチル基、エチル基、プロピル基、カルボキシル基、カルボキシメチル基又はカルボキシエチル基；Ｒ４は、水素原子、炭素数１〜１５の直鎖もしくは分岐鎖のアルキル基、アルケニル基、アルカジエニル基又はアルカトリエニル基をそれぞれ表す）
で表される精製されたクマリン類化合物からなる骨芽細胞分化促進剤が提供される。Ｒ４は、好ましくはイソブテニル基、プレニル基又はゲラニル基である。

式１の化合物としては、たとえば以下のものが挙げられる：
１．以下の式２で表されるオーラプテン（２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン，７−［［（２Ｅ）−３，７−ジメチル−２，６−オクタジエン−１−イル］オキシ］−；別名：７−（ゲラニルオキシ）クマリン）

２．以下の式３で表される化合物Ｐ０２Ｃ１０（２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン，７−［（３，７−ジメチル−２，６−オクタジエニル）オキシ］−４−メチル−，（Ｅ）−；別名：４−メチル−７−（ゲラニルオキシ）クマリン）

３．以下の式４で表される化合物Ｐ０２Ｄ１０（２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン，７−［（３，７−オクタジエン−１−イル）オキシ］−４−フェニル−）

４．以下の式５で表される化合物Ｐ０２Ｈ０８（２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン，７−［（３−メチル−２−ブテン−１−イル）オキシ］−；別名：７−（イソペンテニルオキシ）クマリン）

５．以下の式６で表される化合物Ｐ０３Ｇ１０（２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン，４−メチル−７−［（２−メチル−２−プロペン−１−イル）オキシ−）

６．以下の式７で表される化合物Ｐ０６Ｃ１１（２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン，６−ヒドロキシ−７−［（３−メチル−２−ブテン−１−イル）オキシ］−；別名：プレニレチン、又は７−Ｏ−プレニルエスクレチン）

７．以下の式８で表される化合物Ｐ１８Ｅ０３（２Ｈ−１−ベンゾピレン−３−酢酸，４−メチル−７−［（２−メチル−２−プロペン−１−イル）オキシ］−２−オキソ−，メチルエステル

８．以下の式９で表される化合物Ｐ１６Ｄ１１（［３，４’−ビ−２Ｈ−１−ベンゾピラン］−２，２’−ジオン，７’−ヒドロキシ−）：

また、本発明によれば、上記の骨芽細胞分化促進剤を有効成分として含有する骨形成促進用医薬組成物、上記の骨芽細胞分化促進剤を含有する保健機能食品及び食品添加物、この食品添加物を添加された飲食品も提供される。

本発明において使用される上記各化合物は、柑橘類等に多く含まれ、長期にわたって食経験があるものであり、非常に安全性が高い。また、いずれの化合物も容易に入手することができる。天然由来化合物としては、イソフラボン化合物のゲニステインに骨芽細胞分化促進作用があることが多数報告されているが（特開平１０−１１４６５３号公報等）、本発明において使用される上記各化合物は、ゲニステインよりも強い活性がある。
また、上記各化合物は、強力な骨形成促進作用が知られるサイトカインの骨形成因子（Bone morphogenetic protein 2；ＢＭＰ−２）に匹敵する強力な骨芽細胞分化促進作用を有する。ＢＭＰは強力な骨形成誘導作用があることから、多くの骨減少性疾患への応用が期待されるが、タンパク質であるために（１）製造に非常にコストがかかる、（２）安定性の問題や品質管理が難しい等の問題がある。これに対し、本発明において使用されるオーラプテン及び類縁クマリン化合物は、天然由来の低分子化合物であり、安定性も高いため、取り扱い・品質管理が容易であるうえ、低コストで製造することができる。したがって、ＢＭＰと同等の作用が得られうる本発明の骨芽細胞分化促進剤及び骨形成促進用医薬組成物等は、骨減少性疾患の予防や治療にきわめて有用である。

本発明の骨芽細胞分化促進剤及び骨形成促進用医薬組成物は、細胞の増殖及び生存に影響を与えずに分化を促進するものであり、ヒト及びヒト以外の動物の多くの骨減少性疾患（骨粗鬆症、関節リウマチ、歯周病、ページェット病、がんの骨転移等）の予防又は治療のための医薬組成物として利用することができる。また、骨欠損部位の骨形成・骨再生促進、インプラント歯埋入前処理としての歯槽骨形成・歯槽骨再生促進等のために利用することができる。さらに、骨、歯、関節等の損傷時に外科手術的に導入される器具に使用することもでき、インプラントへの含有、あるいはコーティングによる使用も可能である。
また、本発明の骨芽細胞分化促進剤は、食品添加物としても利用でき、骨強化機能を有する保健機能食品、飲食品、衛生用品（歯磨き粉等の医薬部外品も含む）等にも応用可能である。

図１は、骨芽細胞の増殖に対する各化合物の効果を表す図である。試験した化合物は、パネルＡ＝オーラプテン（式２）、パネルＢ＝Ｐ０２Ｃ１０（式３）、パネルＣ＝Ｐ０２Ｃ１０（式４）、パネルＤ＝Ｐ０２Ｄ１０（式５）、パネルＥ＝Ｐ０２Ｈ０８（式６）、パネルＦ＝ＰＰ０６Ｃ１１（式７）、パネルＧ＝Ｐ１８Ｅ０３（式８）である。図２−１は、骨芽細胞の初期分化に対する各化合物の効果を表す図（パネルＡ〜Ｆ）である。試験した化合物は、パネルＡ＝オーラプテン（式２）、パネルＢ＝Ｐ０２Ｃ１０（式３）、パネルＣ＝Ｐ０２Ｃ１０（式４）、パネルＤ＝Ｐ０２Ｄ１０（式５）、パネルＥ＝Ｐ０２Ｈ０８（式６）、パネルＦ＝ＰＰ０６Ｃ１１（式７）、パネルＧ＝Ｐ１８Ｅ０３（式８）、パネルＨ＝Ｐ１６Ｄ１１（式９）である。各パネルにおいて、白いグラフは細胞生存率、黒いグラフはＡＬＰ活性をそれぞれ表す。コントロールと比較して、＊＊はｐ＜０．００５、＊はｐ＜０．０５の有意差を表す。図２−２は、骨芽細胞の初期分化に対する各化合物の効果を表す図（パネルＧ及びＨ）である。グラフの説明は図２−１と同様である。図３は、骨芽細胞の石灰化に対する各化合物の効果を表す図である。試験した化合物は、Ａ＝オーラプテン（式２）、Ｂ＝Ｐ０２Ｃ１０（式３）、Ｃ＝Ｐ０２Ｃ１０（式４）、Ｄ＝Ｐ０２Ｄ１０（式５）、Ｅ＝Ｐ０２Ｈ０８（式６）、Ｆ＝ＰＰ０６Ｃ１１（式７）、Ｇ＝Ｐ１８Ｅ０３（式８）、Ｈ＝Ｐ１６Ｄ１１（式９）である。図４は、オーラプテンとＢＭＰ−２との骨芽細胞分化促進作用の比較を示す図である。コントロール、ＢＭＰ−２、オーラプテンのそれぞれについて、白抜きグラフはコントロール（阻害剤なし）、斜線つきグラフはノギン添加、縦縞のグラフはドルソモルフィン添加の結果を表す。図５Ａは、オーラプテンの骨形成関連遺伝子（ＡＬＰ）の発現に対する作用を示す図である。図５Ａ〜図５Ｆの各パネルにおいて、「-」＝コントロール、「Ｂ」＝ＢＭＰ−２（５０ng/ml）処理、「Ａｕｒ」＝オーラプテン（３０μM）処理をそれぞれ表す。４日後のコントロールと比較して、＊＊＝ｐ＜０．００５、＊＊＊＝ｐ＜０．００１の有意差；７日後のコントロールと比較して、＃＝ｐ＜０．０５、＃＃＃＝ｐ＜０．００１の有意差；１０日後のコントロールと比較して、＋＝ｐ＜０．０５、＋＋＋＝ｐ＜０．００１の有意差を表す。図５Ｂは、オーラプテンの骨形成関連遺伝子（オステオカルシン）の発現に対する作用を示す図である。グラフの説明は図５Ａと同様である。図５Ｃは、オーラプテンの骨形成関連遺伝子（ランクス２（Ｒｕｎｘ２））の発現に対する作用を示す図である。グラフの説明は図５Ａと同様である。図５Ｄは、オーラプテンの骨形成関連遺伝子（オステリックス）の発現に対する作用を示す図である。グラフの説明は図５Ａと同様である。図５Ｅは、オーラプテンの骨形成関連遺伝子（ＢＭＰ−２の発現）に対する作用を示す図である。グラフの説明は図５Ａと同様である。図５Ｆは、オーラプテンの骨形成関連遺伝子（ＢＭＰ−４）の発現に対する作用を示す図である。グラフの説明は図５Ａと同様である。図６Ａは、オーラプテンのインビボでの骨形成促進作用（海綿骨塩量に対する効果）を示す図である。図６Ａ〜図６Ｄの各パネルにおいて、「Ｃｏｎ」＝コントロール、「ＡＵＲ」＝オーラプテン投与、「Ｓｈａｍ」＝偽手術、「ＯＶＸ」＝卵巣摘出手術をそれぞれ表す。３０日後の「Ｓｈａｍ」「Ｃｏｎ」と比較して、＃＝ｐ＜０．０５、＃＃＝ｐ＜０．００５の有意差を表す。３０日+３０日の「Ｓｈａｍ」「Ｃｏｎ」と比較して、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．００５の有意差を表す。図６Ｂは、オーラプテンのインビボでの骨形成促進作用（全骨塩量に対する効果）を示す図である。グラフの説明は図６Ａと同様である。図６Ｃは、オーラプテンのインビボでの骨形成促進作用（皮質外膜周囲長に対する効果）を示す図である。グラフの説明は図６Ａと同様である。図６Ｄは、オーラプテンのインビボでの骨形成促進作用（皮質内膜周囲長に対する効果）を示す図である。グラフの説明は図６Ａと同様である。図７−１は、破骨細胞の分化に対する各化合物の作用を表す図（パネルＡ〜Ｆ）である。試験した化合物は、パネルＡ＝オーラプテン（式２）、パネルＢ＝Ｐ０２Ｃ１０（式３）、パネルＣ＝Ｐ０２Ｃ１０（式４）、パネルＤ＝Ｐ０２Ｄ１０（式５）、パネルＥ＝Ｐ０２Ｈ０８（式６）、パネルＦ＝ＰＰ０６Ｃ１１（式７）、パネルＧ＝Ｐ１８Ｅ０３（式８）である。各パネルにおいて、白いグラフは細胞生存率、黒いグラフはＴＲＡＰ活性をそれぞれ表す。コントロールと比較して、＊＊はｐ＜０．００５、＊はｐ＜０．０５の有意差を表す。図７−２は、破骨細胞の分化に対する各化合物の作用を表す図（パネルＧ）である。グラフの説明は図７−１と同様である。

本発明の骨芽細胞分化促進剤は、有効成分として、少なくとも一種の式１の化合物：

（式中、Ｒ１〜Ｒ４はそれぞれ上記と同じである）
を含有する。

これらの化合物は、広い範囲の柑橘類に含まれていることが知られている。特に、オーラプテンについては多数の報告がされており、たとえば、J. Agric. Food Chem. 2000 May;48(5):1763-9には、７７種の柑橘類についてのオーラプテン含有量が記載されている。柑橘類の皮には（〜１．５mg/g乾燥重量）、果実には(〜０．５mg/kg乾燥重量)程度含まれ、ハッサク（C. hassaku）、ナルト（C. medioglobosa）、ナツダイダイ（C. natsudaidai）、ヒョウカン（C. ampullacea）、ヘンカミカン（C. pseudo-aurantium）、イチャンレモン（C. wilsonii）等にも多く含まれている。また、オーラプテンは、市販のグレープフルーツジュース（０．１１〜０．１４mg/100g）、マーマレード（０．３５〜０．３８mg/100g）などの柑橘類加工品にも含まれていることが知られている。

したがって、本発明で使用されるクマリン類化合物は、このような柑橘類又は柑橘類加工品から公知の方法で単離・精製してもよく、合成法により製造してもよい。式２〜式９で表される化合物は、いずれも精製品が市販されており、これらを使用してもよい。

これらの化合物のうち、式２（オーラプテン）、式３、式５、式６又は式９で表される化合物は好ましく、最も好ましいのは式２、式３又は式９で表される化合物である。

本発明の骨芽細胞分化促進剤は、有効成分である上記の化合物を少なくとも一種含むが、場合によっては二種以上を混合して用いてもよい。骨芽細胞分化促進剤は、医薬組成物等の製造に使用することができるほか、たとえば、培養液に添加して培養骨芽細胞に与えて分化を促進させ、被験化合物が分化抑制能を有するかどうかのスクリーニング実験や、細胞に添加して培養することで、その細胞が骨芽細胞への分化能を有するかを検定する試験などに利用することができる。また、様々な骨芽細胞機能を解析するため、あるいは生体外で骨再生を誘導するために、効率的に骨芽細胞を誘導するための補助剤などとして用いることもできる。

本発明の骨形成促進用医薬組成物は、本発明の骨芽細胞分化促進剤を必須成分とするが、生理学的又は薬学的に許容され得る添加剤として、製剤技術の分野において公知の種々の成分（たとえば賦形剤、崩壊剤、滑沢剤等）を付加的に含有することができる。たとえば、賦形剤としては、乳糖、ショ糖、グルコース、ソルビトール、ラクチトール；コーンスターチ、ポテトスターチ、結晶セルロース；軽質シリカゲル、ケイ酸アルミニウム、メタ珪酸アルミン酸マグネシウム、リン酸水素カルシウムなどが挙げられる。また、崩壊剤としては、上記のようなデンプン類や、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ポリビニルピロリドンなどがある。また、滑沢剤としては、ショ糖脂肪酸エステル、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウムなどが挙げられる。

さらに、本発明の医薬組成物には、公知の他の薬学的有効成分をも含有させることができる。たとえば、骨減少性疾患に有効であることが公知の成分（骨形成促進剤及び骨吸収抑制剤等）をさらに含有させてもよい。これらの成分としては、たとえば、カルシウム製剤、ビタミンＤ製剤、ビタミンＫ製剤、副甲状腺ホルモン、エストロゲン製剤類、ビスホスホネート類、イプリフラボン類、フッ素化合物、プロスタグランディン類、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ−β）、インスリン様成長因子−１及び−２（ＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、骨形成因子（ＢＭＰ）などが挙げられる。

本発明の医薬組成物は、製剤学の技術分野において公知の方法にしたがって、製剤化し、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、散剤、外用剤、スプレー剤、フィルム製剤、注射剤等の所望の剤型の医薬組成物とすることができる。たとえば、骨基質のコラーゲン、リン酸カルシウムやポリエチレングリコール共重合体などの適当な担体（人工骨）に混ぜて、適当な形に成形したもの、インプラント歯に混ぜたり、コーティングしたりしたもの等も企図される。

本発明の医薬組成物の投与対象となるのは、ヒトをはじめとして、ヒト以外の哺乳類、鳥類、魚類などの種々の動物である。適用対象としては、各種の骨減少性疾患（骨粗鬆症、関節リウマチ、歯周病、ページェット病、がんの骨転移等）の予防及び治療、骨・歯・関節等の損傷又は欠損部位の骨形成・骨再生促進、インプラント歯埋入前処理としての歯槽骨形成・歯槽骨再生促進等が挙げられる。

本発明の医薬組成物の投与経路は、公知のいずれの経路であってもよい。たとえば経口、経皮、注射、経腸、直腸内等の任意の経路を選択することができる。また、手術で骨基質とともに埋入するような経路も可能である。好ましくは経口投与である。

本発明の医薬組成物の効果的な投与量は、投与される対象の種類や年齢、体重、身体的な状態等によって異なり、それらに応じて各々に適した量で投与することができる。哺乳類に対して投与する場合、例えば、０．０００１〜１,０００mg/kg/日、好ましくは０．００１〜１００mg/kg/日とすることができる。ヒトに投与する場合、一般的には、有効成分量として、一日あたり０．００１mg〜５，０００mg、望ましくは０．０１mg〜５００mgの量である。このような一日あたりの用量を一度に又は分割して、投与することができる。

また、本発明の医薬組成物は、他の薬剤と併用してもよい。

また、本発明の骨芽細胞分化促進剤は、食品添加物とすることができる。食品添加物としては、本発明の骨芽細胞分化促進剤に加えて、食用に適する公知の他の成分を含有させることができる。このような食品添加物は、飲食品の機能性を改善するために飲料又は食品（飲食品）に添加することができる。このような食品添加物及び飲食品の製造方法は、各技術分野の当業者には公知である。また、本発明の骨芽細胞分化促進剤は、歯磨き粉等の医薬部外品、衛生用品の成分として、これらに含有させて利用することができる。

実施例においては、以下の試薬等を使用した。
オーラプテンは、和光純薬工業（株）（Lkt Labs. Inc）より購入した。その他の被検化合物は、すべて住商ファーマインターナショナル（株）より購入した。ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞（マウス胎児頭蓋骨由来前骨芽細胞株、cell番号RCB1126）は、RIKEN Cell Bankより購入した。また、α−最少必須培地（α-minimum essential medium；α−ＭＥＭ）は、INVITROGEN社（カタログ番号11900-024）より購入した。その他の試薬は和光純薬工業（株）又はSIGMA社より購入した。９６ウェルマイクロプレートは、Nunc社（カタログ番号161093）より購入した。

１．骨芽細胞の増殖に対するオーラプテンの効果
骨芽細胞の増殖に対する効果を、以下のようにして調べた。
ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞をα−ＭＥＭに縣濁して、９６ウェルマイクロプレートの各ウェルに、２×１０^３ cells/wellとなるようにまいた。３７℃、５％ＣＯ_２条件で１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）含有α−ＭＥＭにて一晩培養後、培養液を、１、３、１０又は３０μMの各濃度の化合物を含む１０％ＦＢＳ含有α−ＭＥＭに交換して３日間培養した。同量の溶媒のみを含む培養液を用いて同様に培養したものをコントロール（対照）とした。

培養終了２時間前に、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide；ＭＴＴ）(５mg/ml、ＰＢＳ中)を培養液の１／１０量添加した。２時間培養後、培地を除去し、生細胞により生成されたホルマザン色素をＤＭＳＯに溶解してプレートリーダーにて５７０nm（参照波長６３０nm）の吸光度を測定した。コントロールを１００とした時の値を計算して相対的な細胞数を算出した（４ウェル以上の平均プラスマイナス標準偏差；以下も同様）。

結果を、図１に示す。オーラプテンをはじめとして、試験したいずれのクマリン類化合物での処理によっても、マウス前骨芽細胞株であるＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞数にほとんど変化が見られなかった。このことは、オーラプテン及び類縁クマリン類化合物は、骨芽細胞の増殖には大きく影響しないことを示す。

２．骨芽細胞の初期分化に対する効果
マウス前骨芽細胞株であるＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞をα−ＭＥＭに縣濁して、９６ウェルマイクロプレートの各ウェルに、５×１０^３ cells/wellとなるようにまいた。３７℃、５％ＣＯ_２条件で１０％ＦＢＳ含有α−ＭＥＭにて２日間前培養後、培養液を、１、３、１０、３０又は１００μMの各濃度の化合物を含む１０％ＦＢＳ含有α−ＭＥＭに交換して６日間培養した。培養期間中、培養液は３日に一度交換した。クマリン類化合物を含まない培養液を用いて同様に培養したものをコントロール（対照）とした。

上記と同じ方法により、培養終了時に、ＭＴＴ試薬を用いて細胞数を測定し、コントロールを１００とした時の値を算出した。

また、骨芽細胞の初期の分化マーカー酵素であるアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）の活性を以下のようにして測定した。培養終了後、冷メタノールで細胞を固定してディッシュを乾燥させ、６．７mMのｐ−ニトロフェニルリン酸を基質とし、２mMの塩化マグネシウム及び１００mMのトリス−塩酸を含むｐＨ８．５の緩衝液を各ウェルに１００μlずつ入れて、３７℃にて、３０分反応させた。次に、１００μlの０．１Ｎ水酸化ナトリウムを加えて反応を停止させた後、プレートリーダーにて４０５nmの吸光度を測定し、その吸光度をＡＬＰ活性とした。コントロールを１００とした時の値を算出した。

結果を図２−１及び図２−２に示す。オーラプテンなどのいずれのクマリン類化合物処理によっても、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１の細胞生存率にはほとんど影響が見られなかったが（図２、各パネルの白いグラフ）、ＡＬＰ活性は濃度依存的に亢進した（図２、各パネルの黒いグラフ）。このことは、オーラプテンなどのクマリン類化合物は、細胞数に影響することなく、骨芽細胞の初期分化を促進することを示す。

３．骨芽細胞の石灰化に対する効果
ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞をα−ＭＥＭに縣濁して、９６ウェルマイクロプレートの各ウェルに、５×１０^３ cells/wellとなるようにまき、３７℃、５％ＣＯ_２条件で１０％ＦＢＳ含有α−ＭＥＭにて２日間前培養した。その後、培養液を１、３、１０又は３０μMの各濃度の各化合物、及び５０μg/ml アスコルビン酸及び１０mM β−グリセロリン酸を含む１０％ＦＢＳ含有α−ＭＥＭに交換して１０日間培養した。培養期間中、培養液は３ないし４日に一度交換した。

培養終了後、７０％エタノールで細胞を固定してディッシュを乾燥させ、１％アリザリンレッドＳ溶液にて、沈着したカルシウムを染色した。染色したプレートの画像を、スキャナーを用いて取得した。また、肉眼で染色の程度（石灰化の程度）を評価した。

結果を、図３及び表１に表す。

骨芽細胞は、分化が進むと骨の基質タンパク質を産生し、さらにカルシウムを沈着して石灰化を引き起こす。石灰化部位は、カルシウムを染色するアリザリンレッド染色により赤色に染色される。マウス前骨芽細胞株であるＭＣ３Ｔ３−Ｅ１をオーラプテンなどのクマリン類化合物で処理すると、赤色に染色される石灰化部位が、コントロールと比較して著しく増大した。このことは、オーラプテンなどクマリン類化合物が、骨芽細胞による石灰化も亢進させ、骨芽細胞の後期分化も促進することを示す。

４．ＢＭＰ−２の作用との比較及びＢＭＰシグナル阻害剤の効果
上記（「２．骨芽細胞の初期分化に対する効果」）と基本的に同様にして、公知の骨芽細胞分化促進剤である骨形成因子（ＢＭＰ−２）の作用との比較及びＢＭＰ阻害剤であるノギン（Noggin）、ドルソモルフィン（Dorsomorphin）による阻害作用を調べた。
ＢＭＰ−２は２５ng/ml、オーラプテンは３０μMで添加し、サンプル添加時にＢＭＰの阻害剤であるノギン１０ng/ml又はＩ型ＢＭＰレセプター（ＡＬＫ）の阻害剤であるドルソモルフィン１μM（上記濃度はいずれも最終濃度）存在下又は非存在下で６日間培養し、上記と同様にＡＬＰ活性を測定した。ＢＭＰ−２、ノギン、ドルソモルフィンはいずれも和光純薬工業（株）より購入した。

結果を図４に表す。
ＢＭＰは、強力な骨形成促進因子と知られるサイトカインである。オーラプテン(３０μM)処理によって、ＢＭＰ−２(２５ng/ml)と同等又はそれ以上のＡＬＰ活性促進作用が認められた（図４）。このことは、オーラプテンはＢＭＰ−２に匹敵する強力な骨芽細胞分化促進作用を持つことを示す。

また、オーラプテンによるＡＬＰ活性促進作用は、ＢＭＰ−２によるＡＬＰ活性促進作用に対する作用と同様に、ＢＭＰの阻害剤であるノギン（１０ng/ml）及びＩ型ＢＭＰレセプター（ＡＬＫ）の阻害剤であるドルソモルフィン（１μM）によって打ち消された。このことは、オーラプテンのＡＬＰ活性促進作用（骨芽細胞分化促進作用）に、ＢＭＰが関与していることを示す。

以上の結果によれば、オーラプテンなどのクマリン類化合物は、細胞の増殖に影響することなく、骨芽細胞の初期から後期の分化を促進し、さらに石灰化も亢進させることから、骨形成促進作用があると考えられる。
したがって、天然由来の低分子化合物であって安全性・安定性も高いうえ、ＢＭＰと同等の作用が得られうる本発明の骨芽細胞分化促進剤及び骨形成促進用医薬組成物等は、骨減少性の多くの疾患、例えば、骨粗鬆症、関節リウマチ、歯周病、ページェット病、がんの骨転移等の予防や治療に有用な作用を示すことが期待でき、きわめて有用である。

５．骨芽細胞分化に関わる各種遺伝子の発現に対する作用
骨芽細胞分化に関わる各種遺伝子の発現に対する作用を、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法にて解析した。

ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を６ウェルプレート（Greiner）の各ウェルに１．５×１０^５ cells/wellとなるようにまき、上記と同様に培養した。コンフルエントになった後に、培養液をオーラプテン（３０μM）又はＢＭＰ−２（５０ng/ml）を含む培養液に交換して、０〜１４日間培養した。培養後、培地を除去し、ＰＢＳで洗浄した。その後、商品名「ＩＳＯＧＥＮ」(和光純薬工業)を１ml/wellの量で加えて細胞を回収した。ＲＮＡ精製は、「ＩＳＯＧＥＮ」の添付文書に記載の手順に従って行った。

２μgの精製ＲＮＡから、商品名「PrimeScript RT-PCR Kit」(TaKaRa)を用いて添付文書に記載の手順に従って逆転写反応を行い、ｃＤＮＡサンプルを作製した。

リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、商品名「FastStart Universal SYBR Green Master (Rox)」(Roche)を用い、添付文書に記載の手順に従って、５０℃で２分、９５℃で１０分の処理の後、（９５℃で１５秒、６０℃で１分）×５０サイクルの条件にて、行った。商品名「ABI PRISM 7300 sequence detection system」（Applied Biosystems）にて解析した。

用いたプライマーは、以下の表２に記載のとおりであった。

内因性コントロール遺伝子としてβ‐アクチンを用いて、比較Ｃｔ法により、以下のようにデータ解析を行った。
ΔＣｔ＝（標的遺伝子のＣｔ）−（内因性コントロール遺伝子のＣｔ）
ΔΔＣｔ＝（目的サンプルのΔＣｔ）−（対照サンプルのΔＣｔ）
対照サンプルに対する目的サンプルの標的遺伝子の相対的発現量＝２^{（−ΔΔＣｔ）}

結果を、図５Ａ〜図５Ｆに示す。
（１）骨芽細胞分化のマーカー遺伝子の発現
ポジティブコントロールであるＢＭＰ−２処理（「Ｂ」）と同様に、オーラプテン処理（「Ａｕｒ」）によって、骨芽細胞の初期の分化マーカーとして知られるＡＬＰ、及び後期の分化マーカーとして知られるマウスオステオカルシン（Osteocalcin）の遺伝子の発現がいずれもコントロール（「-」）と比較して増加した（図５Ａ、図５Ｂ）。

（２）骨芽細胞分化に重要な転写因子の発現
ノックアウトマウスを用いた解析等から、転写因子であるＲｕｎｘ２及びオステリックス（Osterix）が骨芽細胞分化に重要な役割を果たすことが知られている。ポジティブコントロールであるＢＭＰ−２処理（「Ｂ」）と同様に、オーラプテン処理（「Ａｕｒ」）によって、Ｒｕｎｘ２及びオステリックスの遺伝子の発現がいずれもコントロール（「-」）と比較して増加した（図５Ｃ、図５Ｄ）。

（３）ＢＭＰ遺伝子の発現
ＢＭＰ類は強力な骨芽細胞分化促進サイトカインであり、種々の化合物による骨芽細胞分化促進作用に、ＢＭＰ類の発現が関与しているとの報告がある。オーラプテン処理によって、ＢＭＰ−２及びＢＭＰ−４の遺伝子の発現がいずれもコントロール（「-」）と比較して増加した（図５Ｅ、図５Ｆ）。

以上の結果から、オーラプテンは骨芽細胞に特徴的なＡＬＰやオステオカルシンの発現を、遺伝子レベルにおいても増加させることが示された。また、オーラプテンは、骨芽細胞分化に重要な転写因子であるＲｕｎｘ２及びオステリックスの遺伝子発現を増加させた。さらに、オーラプテンは、骨芽細胞分化を強力に促進するサイトカインであるＢＭＰ−２及びＢＭＰ−４の遺伝子発現を増加させた。これらのことから、オーラプテンはＢＭＰ類の産生誘導を介して、Ｒｕｎｘ２及びオステリックスの発現を亢進させ、骨芽細胞分化を促進することが示された。

６．インビボでの骨形成促進効果
卵巣摘出による閉経後骨粗鬆症モデルマウスを作製し、骨量が低下したマウスに対して被検化合物を投与し、骨形成に対する生体レベルにおける作用を検討した。

中部科学資材株式会社よりＳｌｃ；ｄｄＹマウス（４週齢、雌）を購入し、２日後、ネンブタール麻酔下で卵巣摘出手術（「ＯＶＸ」）、又は偽手術（「Ｓｈａｍ」）を行った。骨吸収を進行させ骨量を減少させるため１ヶ月間飼育した後、各群の一部（ＯＶＸ：Ｎ＝５、Ｓｈａｍ：Ｎ＝３）のマウスを屠殺し、大腿骨を採取した。残りの卵巣摘出手術（「ＯＶＸ」）群マウスを、溶媒のみ投与群（「ＯＶＸ−Ｃｏｎ」：Ｎ＝６）及びオーラプテン投与群（５０mg/kg/day、経口投与、「ＯＶＸ−ＡＵＲ」：Ｎ＝６）群に分け、偽手術群（Ｓｈａｍ−Ｃｏｎ：Ｎ＝６）とともにさらに1ヶ月間飼育後、マウスを屠殺し、大腿骨を採取した。
採取した大腿骨について、ｐＱＣＴ（peripheral Quantitative Computed Tomography ）骨密度測定装置（商品名「XCT Research SA+」、STRATEC社製）によって骨塩量等の測定を行った。

結果を、図６Ａ〜図６Ｄに示す。
卵巣摘出手術（「ＯＶＸ」）群の１ヶ月後（「３０days」）の海綿骨塩量（図６Ａ）及び全骨塩量（図６Ｂ）は、偽手術（「Ｓｈａｍ」）群と比較して有意に低下した。その後、１ヶ月間（「３０+３０days」）オーラプテンを投与した群（「ＯＶＸ−ＡＵＲ」）は、卵巣摘出手術後溶媒のみを投与した群（「ＯＶＸ−Ｃｏｎ」）と比較して、海綿骨塩量（図６Ａ）及び全骨塩量（図６Ｂ）が高い傾向が認められた。

皮質骨外膜周囲長は骨形成の指標として、また、皮質骨内膜周囲長は骨吸収の指標として知られる。オーラプテンを投与した群（「ＯＶＸ−ＡＵＲ」）では、皮質骨外膜周囲長（図６Ｃ）及び皮質骨内膜周囲長（図６Ｄ）のいずれも、溶媒のみを投与した群（「ＯＶＸ−Ｃｏｎ」）と比較して、長い傾向を示した（「３０+３０days」）。このことから、オーラプテン投与により、骨形成及び骨吸収ともに亢進していると考えられ、オーラプテン投与による海綿骨塩量及び全骨塩量の増加は、骨吸収抑制作用によるものではなく、骨形成促進作用によるものであることが示された。したがって、オーラプテンは生体レベルにおいても骨芽細胞分化を促進し、骨形成を促進すると考えられる。

７．破骨細胞の分化に対する作用
骨吸収に対する作用を明らかにするために、骨吸収を担う細胞である破骨細胞の分化に対する作用を検討した。

ＲＡＷ２６４細胞（マウス単球／マクロファージ系細胞株、セル番号RCB0535）は、RIKEN Cell Bankより購入した。破骨細胞分化誘導因子（ＲＡＮＫＬ）は和光純薬工業より入手した。その他は上記と同じものを使用した。

ＲＡＷ２６４細胞をα−ＭＥＭに懸濁して９６ウェルマイクロプレートに３×１０^３cells/wellとなるようにまき、各濃度の本発明の化合物と破骨細胞分化誘導因子（ＲＡＮＫＬ）を５０ng/mlとなるように加えて、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベータ中にて３日間培養した。培養後、１０％ホルマリン溶液で細胞を固定し、１００％エタノールにて再固定した。
ディッシュを乾燥後、分化の指標として、破骨細胞のマーカー酵素である酒石酸耐性酸ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）の活性を以下のように測定した。

ＴＲＡＰ活性の測定には、３．７mMのｐ−ニトロフェニルリン酸を基質として含み、１０mM酒石酸及び５０mMクエン酸を含有するｐＨ４．６の緩衝液を使用した。この緩衝液を、上記９６ウェルマイクロプレートの各ウェルに１００μlずつ入れ、３７℃で３０分間反応させた。その後、１００μlの０．１Ｎ水酸化ナトリウムを加えて反応を停止させ、プレートリーダーにて４０５nmの吸光度を測定した。各吸光度をＴＲＡＰ活性として、コントロールを１００とした時の値を示した。
また、同様に培養後、ＭＴＴ試薬を用いて定法により細胞数を測定し、コントロールを１００とした時の値を示した。

結果を図７−１及び図７−２に示す。オーラプテンをはじめとして、試験したいずれのクマリン類化合物での処理によっても、細胞数に大きな影響は認められなかった。また、破骨細胞分化の指標であるＴＲＡＰ活性に対しても、特異的な作用は認められなかった。この結果は、オーラプテン及び類縁クマリン類化合物は、破骨細胞の分化には影響しないことを示し、オーラプテン及び類縁クマリン類化合物が骨吸収に対しては作用しないことが示された。したがって、この結果からも、動物モデルにおける作用は、骨吸収の抑制ではなく、骨形成を促進した結果であることが支持される。

この出願は、平成２２年３月３日出願の日本特許出願、特願２０１０−０４６９９９に基づくものであり、特願２０１０−０４６９９９の明細書及び特許請求の範囲に記載された内容は、すべてこの出願明細書に包含される。

Claims

以下の式１：

（式中、Ｒ１は、水素原子、水酸基、メトキシ基、メチル基、エチル基、プロピル基、カルボキシル基、カルボキシメチル基又はカルボキシエチル基；Ｒ２は、水素原子、水酸基、メトキシ基、メチル基、エチル基、プロピル基、カルボキシル基、カルボキシメチル基、カルボキシエチル基又はクマリニル基；Ｒ３は、水素原子、水酸基、メトキシ基、メチル基、エチル基、プロピル基、カルボキシル基、カルボキシメチル基又はカルボキシエチル基；Ｒ４は、水素原子、炭素数１〜１５の直鎖もしくは分岐鎖のアルキル基、アルケニル基、アルカジエニル基又はアルカトリエニル基をそれぞれ表す）
で表される精製されたオーラプテン又はその類縁クマリン化合物からなる骨芽細胞分化促進剤。
式１で表される化合物が、以下の式２〜９：

のいずれかで表される化合物である、請求項１記載の骨芽細胞分化促進剤。
以下の式２、３、５、６又は９：

のいずれかで表される化合物からなる、請求項１記載の骨芽細胞分化促進剤。
請求項１〜３のいずれか１項記載の骨芽細胞分化促進剤を有効成分として含有する骨形成促進用医薬組成物。
請求項１〜３のいずれか１項記載の骨芽細胞分化促進剤を含有する食品添加物。
請求項５記載の食品添加物を添加された飲食品。
請求項１〜３のいずれか１項記載の骨芽細胞分化促進剤を含有する保健機能食品。