JPWO2015114817A1 - 環状ペプチドを有効成分とする骨吸収関連疾患の治療又は予防剤 - Google Patents

環状ペプチドを有効成分とする骨吸収関連疾患の治療又は予防剤 Download PDF

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Abstract

本発明の目的は、天然物起源で長期投与であり、効果の高い破骨細胞分化抑制剤を提供することである。また天然物起源で長期投与であり、効果の高い骨吸収関連疾患の予防および治療剤を提供することである。アマ由来の環状ペプチドが破骨細胞の分化に必要なＲＡＮＫＬシグナルを抑制し、骨髄ミエロイド系細胞から破骨細胞への分化を抑制することを見出した。それらの環状ペプチドを有効成分とすることで、骨粗鬆症などの骨吸収に関連した状態や疾患の予防や治療を目的とした飲食品や医薬品を提供することができる。

Description

本発明は、環状ペプチドを有効成分とする破骨細胞分化抑制剤、または骨吸収関連疾患の予防および治療剤に関する。
骨は身体の支持や内臓の保護、カルシウムの貯蔵などを担う重要な器官である。骨は骨芽細胞が産生するタイプＩコラーゲンを主とする骨基質タンパクにリン酸カルシウムが沈着した組織である。骨組織の成長・発達・構造や強度の維持には、骨を形成する骨芽細胞と吸収する破骨細胞とが重要な役割を果たしている。
骨芽細胞と破骨細胞はそれぞれ骨形成と骨吸収を担い、両者の繰り返しによって骨組織は維持されている。このようなリモデリングと呼ばれる相互調節機構において、骨芽細胞は骨吸収部位に誘導され、破骨細胞によって吸収された骨組織の修復を行う。このリモデリングサイクルは骨の伸張や修復に加えて、外力に抗う為の骨組織の層板構造の形成にも必要である。
骨芽細胞は間葉系幹細胞を由来とし、一方の破骨細胞は造血細胞から単球/マクロファージ系細胞を経て分化した細胞である。これら骨関連細胞はホルモンや炎症性サイトカイン、増殖因子などさまざまな因子の影響を受けている。
これまでの知見から、破骨細胞の前駆細胞は血液幹細胞由来のM-CSF依存的なミエロイド系細胞が主である。この前駆細胞は骨芽細胞と物理的に接触し、骨芽細胞の細胞膜上に発現するreceptor activator of nuclear factor kappa-B ligand (RANKL)による刺激を受け、破骨細胞へと分化する。つまり、破骨細胞への分化は骨芽細胞のRANKL発現によって制御されており、骨芽細胞にRANKL発現を促す物質としては、PGE２、 活性型VD３、IL-6、PTHなどが知られている。
破骨細胞と骨芽細胞のバランスが破綻すると骨量に変化が生じ、その結果として大理石骨病や骨粗鬆症が引き起こされる。大理石骨病は稀な疾患であることから、通常、骨代謝分野において問題となるのは、骨吸収の活性が骨形成活性を上回る場合、すなわち骨粗鬆症である。骨粗鬆症は、現在国内で約1000万人の患者が罹患していると言われている。また歯周病や関節炎なども異常な骨の破壊と密接に関連しており、骨吸収関連疾患は身近な疾患である。
加齢は骨量変化を起こす因子の一つである。成長期には骨形成が骨吸収を上回り骨量は増加するが、４０歳以後には骨形成より骨吸収が上回る。特に女性では閉経後に急激な骨量減少が起こり、高回転型の骨粗鬆症が高頻度に認められる。
近年高齢化社会が問題となっている中、高齢者のＱＯＬを維持・改善するために、さらなる骨粗鬆症の病態解析や新規治療法の確立が期待されている。
骨粗鬆症を予防あるいは治療する薬剤として、各種の化合物が研究され臨床使用されている。骨吸収の阻害、すなわち破骨細胞を阻害する骨粗鬆症治療薬としては、ビスホスホネート、エストロゲンアナログ、カルシトニン、活性型VD3、ビタミンＫ、イプリフラボンなどが知られている。例えば、ビスホスホネートは骨に対する作用が古くから知られ、その構造中にN（窒素）を含まない第1世代、構造中にNを含む第2、第3世代の化合物が医薬品として開発され、臨床使用されている。しかしながら、最近では長期投与による顎骨壊死などが問題視されている。
一方で、植物やその抽出物を有効成分とする骨粗鬆症の治療薬が報告されている。例えば、セリ科ペトロセリヌム属などのハーブ植物を用いた閉経後骨粗鬆症の予防又は治療剤（特許文献１）、ケルセチンまたはケルセチン誘導体を有効成分とする、破骨細胞分化抑制因子産生促進用組成物（特許文献２）などである。
特許第３４７９２２４号公報 特開２００７−１３７７７５号公報
本発明の目的は、天然物起源で長期投与が可能であり、効果の高い破骨細胞分化抑制剤を提供することである。
また本発明の目的は、天然物起源で長期投与が可能であり、効果の高い骨吸収関連疾患の予防および治療剤を提供することである。
上記課題を解決すべく、本発明者らは副作用の心配がない天然物質を候補物質として探索した結果、アマ由来の環状ペプチドが破骨細胞の分化に必要なRANKLシグナルを抑制し、骨髄ミエロイド系細胞から破骨細胞への分化を抑制することを見出した。また、それらの成分は毒性が低く、食品や医薬品への応用も可能であることが明らかとなった。これらの知見から、アマ由来の環状ペプチドを有効成分とすることで、骨粗鬆症などの骨吸収に関連した状態や疾患の予防や治療を目的とした飲食品や医薬品を提供することができることを見いだし、本発明を完成した。
すなわち本発明を例示すれば、次の［１］〜［１３］である。
[１] アマ由来の環状ペプチドを有効成分として含む破骨細胞分化抑制剤。
[２] ８または９アミノ酸からなる環状ペプチドの一種以上をとして含む破骨細胞分化抑制剤。
[３] 有効成分が、
cyclo (-Pro-Pro-Phe-Phe-Leu-Ile-Ile-Leu-Val-)、
cyclo (-Pro-Pro-Phe-Phe-Val-Ile-Met-Leu-Ile-)、
cyclo (-Pro-Pro-Phe-Phe-Val-Ile-Mso-Leu-Ile-)、
cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Ile-Mso-Leu-Leu-)、
cyclo (-Pro-Leu-Phe-Ile-Mso-Leu-Val-Phe-)、
cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Val-Mso-Leu-Mso-)、
cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Ile-Mso-Leu-Mso-)、
cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Ile-Mso-Leu-Met-)、
cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Val-Met-Leu-Mso-)、
cyclo (-Pro-Leu-Phe-Ile-Msn-Leu-Val-Phe-)、
cyclo (-Pro-Pro-Phe-Phe-Val-Ile-Msn-Leu-Ile-)、
cyclo (-Pro-Leu-Phe-Ile-Met-Leu-Val-Phe-)、
cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Val-Met-Leu-Met-)、
cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Val-Mso-Leu-Met-)、
cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Ile-Met-Leu-Met-)、および
cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Ile-Met-Leu-Mso-)
からなる群から選択される環状ペプチドの一種以上である、[２]記載の破骨細胞分化抑制剤。
[４] 有効成分が
cyclo-(Pro-Pro-Phe-Phe-Leu-Ile-Ile-Leu-Val)、
cyclo-(Pro-Phe-Phe-Trp-Ile-Mso-Leu-Leu)、
cyclo-(Pro-Phe-Phe-Trp-Val-Mso-Leu-Mso)、
cyclo-(Pro-Phe-Phe-Trp-Val-Met-Leu-Mso)、および
cyclo-(Pro-Leu-Phe-Ile-Msn-Leu-Val-Phe)からなる群から選択される環状ペプチドの一種以上である、[３]記載の破骨細胞分化抑制剤。
[５] 有効成分がcyclo-(Pro-Leu-Phe-Ile-Msn-Leu-Val-Phe)である、[４]記載の破骨細胞分化抑制剤。
[６] アマ由来の環状ペプチドを有効成分として含む骨吸収関連疾患の予防または治療剤。
[７] ８または９アミノ酸からなる環状ペプチドの一種以上を有効成分として含む骨吸収関連疾患の予防または治療剤。
[８] 有効成分が、cyclo (-Pro-Pro-Phe-Phe-Leu-Ile-Ile-Leu-Val-)、
cyclo (-Pro-Pro-Phe-Phe-Val-Ile-Met-Leu-Ile-)、
cyclo (-Pro-Pro-Phe-Phe-Val-Ile-Mso-Leu-Ile-)、
cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Ile-Mso-Leu-Leu-)、
cyclo (-Pro-Leu-Phe-Ile-Mso-Leu-Val-Phe-)、
cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Val-Mso-Leu-Mso-)、
cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Ile-Mso-Leu-Mso-)、
cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Ile-Mso-Leu-Met-)、
cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Val-Met-Leu-Mso-)、
cyclo (-Pro-Leu-Phe-Ile-Msn-Leu-Val-Phe-)、
cyclo (-Pro-Pro-Phe-Phe-Val-Ile-Msn-Leu-Ile-)、
cyclo (-Pro-Leu-Phe-Ile-Met-Leu-Val-Phe-)、
cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Val-Met-Leu-Met-)、
cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Val-Mso-Leu-Met-)、
cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Ile-Met-Leu-Met-)、および
cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Ile-Met-Leu-Mso-)
からなる群から選択される環状ペプチドの一種以上である、[７]記載の骨吸収関連疾患の予防または治療剤。
[９] 有効成分が
cyclo-(Pro-Pro-Phe-Phe-Leu-Ile-Ile-Leu-Val)、
cyclo-(Pro-Phe-Phe-Trp-Ile-Mso-Leu-Leu)、
cyclo-(Pro-Phe-Phe-Trp-Val-Mso-Leu-Mso)、
cyclo-(Pro-Phe-Phe-Trp-Val-Met-Leu-Mso)、および
cyclo-(Pro-Leu-Phe-Ile-Msn-Leu-Val-Phe)からなる群から選択される環状ペプチドの一種以上である、[８]記載の骨吸収関連疾患の予防または治療剤。
[１０] 有効成分がcyclo-(Pro-Leu-Phe-Ile-Msn-Leu-Val-Phe)である、[９]記載の骨吸収関連疾患の予防または治療剤。
[１１] 骨吸収関連疾患が骨粗鬆症である、[６]〜[１０]のいずれかに記載の骨吸収関連疾患の予防または治療剤。
[１２] 飲食料の形態である、[１]〜[１１]のいずれかに記載の剤。
[１３] 医薬組成物の形態である、[１]〜[１１]のいずれかに記載の剤。
環状ペプチドを有効成分として含有させることにより、破骨細胞分化抑制効果を発揮する。そして、RANKLよって誘導される破骨細胞分化過程においてc-fosの発現から破骨細胞のマスター転写因子NFATc1の発現に至るシグナルを阻害することにより、破骨細胞分化を効果的に抑制する。
本発明の破骨細胞分化抑制剤により、骨吸収疾患、主に骨粗鬆症や大腿頸部骨折の予防または治療に有用な組成物を提供することが可能となる。また、本発明により、骨吸収関連疾患である関節リウマチ、糖尿病、慢性腎不全などのリン代謝異常における骨量減少や骨強度低下、さらには多発性骨髄腫、悪性リンパ腫、家族性骨ページェット病あるいは歯周病への治療効果が期待される。
また、本発明の破骨細胞分化抑制剤は、天然成分を有効成分とするため、安全性が高く、有用である。
以下、本発明の実施の形態について、詳細に説明する。
本発明は、アマ（亜麻、学名：Linum usitatissimum）に含まれる環状ペプチドを有効成分として含有する破骨細胞形成抑制剤に関する。また、本発明は、アマに含まれる環状ペプチドを有効成分として含有する骨吸収関連疾患の予防および治療剤に関する。
有効成分
環状ペプチドは抗腫瘍活性、抗菌活性、免疫抑制作用など多様な生理活性を有し、医薬品開発において注目されている化合物である。これら環状ペプチドは海洋生物由来、あるいは菌類の二次代謝産物由来のものが多いのに対し、高等植物由来のものは報告例が少ない。
本発明では、アマに含まれる環状ペプチドを用いて完成させたが、同一または類似の構造を有する環状ペプチドであれば、その由来は問わない。これらの環状ペプチドは、アマ等の天然材料から溶媒抽出によって、または化学合成もしくは酵素合成によっても得ることができる。
アマに含まれる環状ペプチドが有効成分であることから、アマ抽出物を破骨細胞形成抑制剤や骨吸収関連疾患の予防または治療剤として用いることができる。
有効成分である環状ペプチドは、８または９アミノ酸からなる環状ペプチドである。構成アミノ酸の種類は問わないが、好ましい例としては以下を挙げることができる：
cyclo (-Pro-Pro-Phe-Phe-Leu-Ile-Ile-Leu-Val-)、
cyclo (-Pro-Pro-Phe-Phe-Val-Ile-Met-Leu-Ile-)、
cyclo (-Pro-Pro-Phe-Phe-Val-Ile-Mso-Leu-Ile-)、
cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Ile-Mso-Leu-Leu-)、
cyclo (-Pro-Leu-Phe-Ile-Mso-Leu-Val-Phe-)、
cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Val-Mso-Leu-Mso-)、
cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Ile-Mso-Leu-Mso-)、
cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Ile-Mso-Leu-Met-)、
cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Val-Met-Leu-Mso-)、
cyclo (-Pro-Leu-Phe-Ile-Msn-Leu-Val-Phe-)、
cyclo (-Pro-Pro-Phe-Phe-Val-Ile-Msn-Leu-Ile-)、
cyclo (-Pro-Leu-Phe-Ile-Met-Leu-Val-Phe-)、
cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Val-Met-Leu-Met-)、
cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Val-Mso-Leu-Met-)、
cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Ile-Met-Leu-Met-)、および
cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Ile-Met-Leu-Mso-)。
特に好ましくは以下である：
cyclo-(Pro-Pro-Phe-Phe-Leu-Ile-Ile-Leu-Val)、cyclo-(Pro-Phe-Phe-Trp-Ile-Mso-Leu-Leu)、cyclo-(Pro-Phe-Phe-Trp-Val-Mso-Leu-Mso)、cyclo-(Pro-Phe-Phe-Trp-Val-Met-Leu-Mso)、または
cyclo-(Pro-Leu-Phe-Ile-Msn-Leu-Val-Phe)。
これらは、単独でも組み合わせても用いることができる。また、これら環状ペプチドの誘導体であって、所望の活性を有するものも有効成分として用いることができる。
アマ（亜麻、学名：Linum usitatissimum）は、アマ科の一年草で比較的寒い地方で栽培される。茎の繊維はリンネル（リネン）製品となる。アマはアサと間違えられることがあるが、アサよりも柔らかくかつ強靭で通気性・吸湿性に優れて肌触りが良いことから織られて高級な衣類などになる。本植物は中央アジア原産で、世界各地で栽培されている。
成熟種子を乾燥したものを亜麻仁といい、種子を圧搾、またはつぶして溶媒で抽出することで得られる亜麻仁油（linseed oil / flaxseed oil）は、ω−３脂肪酸であるα-リノレン酸をはじめとする不飽和脂肪酸に富み、食用、サプリメントとして販売されている。亜麻仁油は、黄色っぽい乾性油（空気に触れると固まる油）であり、沸騰させたアマニ油は重合、酸化し、油絵具のバインダーや木製品の仕上げなどに「オイルフィニッシュワニス」として用いられる。
抽出原料としての天然材料は、種子をそのまま用いてもよいし、粉砕して用いてもよい。抽出に用いる溶媒は、有機溶媒、水、またはこれらの混合物などを用いることができる。得られた抽出液は、適切な分離用担体を用いて、分離・精製することができる。分離用担体としては、上記の環状ペプチドを吸着し、適切な分離用溶媒によって分離することができるものであれば、いずれをも用いることができる。例えば、スチレン系やデキストラン系の合成吸着剤を用いて分離・精製することができる。このような分離用担体に上記の抽出液を負荷したのち、適切な溶媒を用いて、上記の環状ペプチドを分離する。より具体的には、本明細書の実施例１の記載に従って、本発明の破骨細胞形成抑制剤または骨吸収関連疾患の予防および治療剤に用いる上記の環状ペプチドを得ることができる。また、上記の環状ペプチドは、亜麻仁油にも含有され、同様に得ることができる。このようにして得られた上記の環状ペプチドは、濃縮して用いてもよく、また、凍結乾燥等の方法によって粉末として用いてもよい。
破骨細胞形成抑制剤
本発明の破骨細胞形成抑制剤は、強い破骨細胞形成抑制作用を有する。破骨細胞形成抑制活性の測定は、当業者に公知の方法で評価することができる。例えば、骨髄ミエロイド系細胞から破骨細胞への分化を抑制する作用に基づいて評価をすることができる。参考として、本願実施例に記載した方法をあげることができる。
上記の有効成分である環状ペプチドは、精製品または粗精製品として単独で破骨細胞形成抑制剤として使用することもでき、または溶媒や担体とともに破骨細胞形成抑制剤として使用することが可能である。溶媒または担体は、下記飲食料および／または医薬品としての使用を考えて、食品としてまたは医薬品として安全に使用できるものであることが好ましい。本発明の破骨細胞形成抑制剤は種々の用途を有し、例えば試験研究用、破骨細胞形成を抑制するための飲食料、医薬組成物としての使用が例示される。
本発明の破骨細胞形成抑制剤における有効成分の含量には特に制限はないが、例えば全重量基準で０．０００１％〜１％となるように含み、好ましくは０．００１％〜０．１％である。ただし、本発明の破骨細胞形成抑制剤に用いる有効成分は食品に由来するため、安全性が非常に高く、含有量に実質的上限はない。
骨吸収関連疾患の予防または治療剤
上記有効成分は破骨細胞分化抑制作用を有し、骨吸収疾患、主に骨粗鬆症や大腿頸部骨折の予防または治療に用いることができる。また、骨吸収関連疾患である関節リウマチ、糖尿病、慢性腎不全などのリン代謝異常における骨量減少や骨強度低下、さらには多発性骨髄腫、悪性リンパ腫、家族性骨ページェット病あるいは歯周病への治療効果も期待される。
上記の有効成分である環状ペプチドは、精製品または粗精製品として単独で骨吸収関連疾患の予防または治療剤として使用することもでき、または溶媒や担体とともに骨吸収関連疾患の予防または治療剤として使用することが可能である。溶媒または担体は、下記飲食料および／または医薬品としての使用を考えて、食品としてまたは医薬品として安全に使用できるものであることが好ましい。本発明の骨吸収関連疾患の予防または治療剤は種々の用途を有し、例えば試験研究用、破骨細胞形成を抑制するための飲食料、医薬組成物としての使用が例示される。
本発明の骨吸収関連疾患の予防または治療剤における有効成分の含量には特に制限はないが、例えば全重量基準で０．０００１％〜１％となるように含み、好ましくは０．００１％〜０．１％である。ただし、本発明の骨吸収関連疾患の予防または治療剤に用いる有効成分は食品に由来するため、安全性が非常に高く、含有量に実質的上限はない。
飲食料
本発明の破骨細胞形成抑制剤、または骨吸収関連疾患の予防または治療剤は、それら所望の効果を有する飲食料の形態とすることができる。飲食料の好ましい例は、日常的に摂取する飲食料、例えば、緑茶、麦茶、ウーロン茶、紅茶、コーヒー、スポーツドリンク、飲料水、調味料、ドレッシングである。しかし飲食料は通常食するものであればよく、清涼飲料、カクテル、ビール、ウイスキー、焼酎、ワイン、清酒、味付け米、加工食品、インスタント食品、レトルト食品、チョコレート、生クリーム、洋菓子、乳製品、健康食品、サプリメント等であってもよい。
飲食料の形態においては、有効成分の摂取量が１食あたり例えば０．１ｍｇ〜１０ｇとなるように含まれるが、０．５ｍｇ〜５ｇの範囲が好ましい。ただし、本発明の破骨細胞形成抑制剤等に用いる有効成分は食品に由来するため、安全性が非常に高く、含有量に実質的上限はない。
医薬組成物
本発明の破骨細胞形成抑制剤、または骨吸収関連疾患の予防または治療剤は、所望の効果を有する医薬組成物としても使用できる。好ましい薬剤は、経口投与される薬剤であり、その例として、ドリンク剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、キャンデー、ドロップ剤等があげられる。薬剤には、有効成分を、１回服用量当たり０．１ｍｇ〜１０ｇ、好ましくは０．５ｍｇ〜５ｇの量で含む。
本発明の医薬組成物は、用いる有効成分は食品に由来するため、安全性が非常に高く、長期間にわたって服用しても安全である。したがって、骨粗鬆症の防止または解消のために、日常的に服用することも可能である。
本発明を以下の実施例により、さらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
亜麻仁からは 1959 年に Kaufmann らによって Cyclolinopeptide A と命名された環状ペプチドが報告されており、現在に至るまでアナログ体の合成、計算学的手法を用いたコンホメーション解析、X 線結晶構造解析など様々な角度から研究が行われている。また生理活性に関しても、細胞保護作用、イオノフォア作用なども報告されているが、近年免疫抑制作用を有することも明らかとされた。そこでこのアマ科の漢方生薬である亜麻仁について未だ報告されていない環状ペプチドがあるのではないかと考えた。
実施例１．抽出・単離・構造解析
試料として日華油脂株式会社より購入した飼料用圧抽亜麻仁粕 (30kg) を Hexane で加温抽出した後、MeOH にてさらに加温抽出し、Hexane 移行画分と MeOH 移行画分の 2 つの画分を得た。
まず、ここで得られたMeOH 移行画分を Diaion HP-20 を用いて、溶媒系 H2O-MeOH で分離し、100% MeOH 溶出画分を、引き続きシリカゲルカラムクロマトグラフィー（CHCl3-MeOH）、ODS カラム（H2O-MeCN、40-60％ MeCN）を用いた逆相系 HPLC で順次分離・精製を行った結果、9 種類のペプチド性化合物 Cyclolinopeptide A (1, 691.2 mg, 0.0023%)、B (2, 52.7 mg, 0.00018%)、C (3, 1106.2 mg, 0.0037%)、D (4, 456.4 mg, 0.0015%)、E (5, 1747.2 mg, 0.0058%)、F (6, 245.0 mg, 0.00082%)、G (7, 729.0 mg, 0.0024%)、H (8, 50.3 mg, 0.00017%)、I (9, 21.9 mg, 0.00007%) を得た。また、Hexane 移行画分に関しても同様の操作を行い、Cyclolinopeptide A (1, 226.0 mg, 0.0075%)、J (10, 806.0 mg, 0.0027%)、K (11, 214.0 mg, 0.00071%) を得た。
各化合物は機器分析データを基にペプチド性化合物であることが示唆されたことから、加水分解後にアミノ酸分析を行い、含有アミノ酸の組成を決定した。アミノ酸分析は、以下の手順で行った。
単離・精製したA(1)-K(11)それぞれ1mg を 6N HCl （4% チオグリコール酸添加)、110 ℃で 24 時間加水分解した後溶媒を留去し、得られた残査を0.02N HCl 1 ml に溶解し、アミノ酸分析装置 (Hitachi L-8500 Amino Acid analyzer) を用いて分析した。
Marfey 法によるアミノ酸の絶対立体配置の決定は、以下の手順で行った。単離、精製したA(1)-K(11)それぞれ1mg を 6N HCl（4% チオグリコール酸添加)、110 ℃で 24 時間加水分解した後溶媒を留去し、得られた残査を精製水 100 ml に溶解した。これにMarfey 試薬(1-fluoro-2,4-dinitrophenyl-5-L-alanineamide) 1.0 mg / acetone 100 ml と 1M NaHCO3 17 ml を加え、30-40 ℃で 1 時間インキュベーションした。反応混合物を室温まで冷却した後、2M HCl を 15 ml 加えた。これを濃縮し、 DMSO 0.5 ml に溶解しサンプルとした。調製したサンプルをHPLC にて分析し、上記の方法で誘導化した標準アミノ酸サンプルとの保持時間を比較することにより、アミノ酸の絶対配置を決定した。
HPLC 条件---- 溶媒 10-80% MeOH (80 分間、グラジュエント) / 50mM TEAP (triethylammonium phosphate) buffer (pH 3.2)、流速 : 1 ml/min、測定波長 : 340 nm。
Marfey 試薬により誘導化した標準アミノ酸の保持時間(min) は次の通りである。
L-Pro (42.5), D-Pro (47.7), L-Met (51.4), D-Met (63.5), L-Val (52.9), D-Val (65.6), L-Trp (56.3), D-Trp (64.4), L-Phe (58.8), D-Phe (69.7), L-Ile (60.3), D-Ile (72.6), L-Leu (61.7), D-Leu (73.3)。
Marfey 試薬により誘導化した A(1)の加水分解物の保持時間(min) は次の通りである。
L-Pro (42.4), L-Val (52.8), L-Phe (58.7), L-Ile (60.2), L-Leu (61.6)
Marfey 試薬により誘導化したB(2)の加水分解物の保持時間 (min) は次の通りである。
L-Pro (42.5), L-Met (51.5), L-Val (53.0), L-Phe (58.7), L-Ile (60.2), L-Leu (61.6)
Marfey 試薬により誘導化したC(3)の加水分解物の保持時間(min) は次の通りである。
L-Pro (42.3), L-Met (51.2), L-Val (52.9), L-Phe (59.0), L-Ile (60.5), L-Leu (61.8)
Marfey 試薬により誘導化した D(4)の加水分解物の保持時間 (min) は次の通りである。
L-Pro (42.6), L-Met (51.5), L-Trp (56.4), L-Phe (58.1), L-Ile (60.5), L-Leu (61.8)
Marfey 試薬により誘導化した E(5)の加水分解物の保持時間 (min) は次の通りである。
L-Pro (42.5), L-Met (51.5), L-Val (52.9), L-Phe (58.9), L-Ile (60.4), L-Leu (61.7)
Marfey 試薬により誘導化した F(6)の加水分解物の保持時間 (min) は次の通りである。
L-Pro (42.5), L-Met (51.5), L-Val (52.9), L-Trp (56.2), L-Phe (58.7), L-Leu (61.8)
Marfey 試薬により誘導化したG(7)の加水分解物の保持時間 (min) は次の通りである。
L-Pro (42.3), L-Met (51.6), L-Trp (56.3), L-Phe (58.8), L-Ile (60.4), L-Leu (61.8)
Marfey 試薬により誘導化したH(8)の加水分解物の保持時間 (min) は次の通りである。
L-Pro (42.5), L-Met (51.5), L-Trp (56.4), L-Phe (58.8), L-Ile (60.4), L-Leu (61.8)
Marfey 試薬により誘導化したI(9)の加水分解物の保持時間 (min) は次の通りである。
L-Pro (42.4), L-Met (51.6), L-Trp (56.3), L-Phe (58.7), L-Val (53.0), L-Leu (61.9)
Marfey 試薬により誘導化したJ(10)の加水分解物の保持時間 (min.) は次の通りである。
L-Pro (42.3), L-Met (51.4), L-Val (52.9), L-Phe (58.9), L-Ile (60.2), L-Leu (61.7)
Marfey 試薬により誘導化したK(11)の加水分解物の保持時間 (min.) は次の通りである。
L-Pro (42.5), L-Val (52.8), L-Phe (58.7), L-Ile (60.3), L-Leu (61.8), L-Met (51.5)
2 次元 NMR を用い各々のアミノ酸を帰属した後、HMBC によるロングレンジ相関およびNOE 相関から、その構造を決定した。化合物 J (11) についてNMR により構造解析した例および各化合物の物性値を下に示す。
Cyclolinopeptide A (1)
無色針状結晶、mp. 243℃、[α] D -111.1゜(c 0.23, MeOH)、IR (KBr) νmax 3332 (NH) and 1668 (amide C=O) cm-1、UV (MeOH) λmax 275 (ε209) and 218 (ε10050) nm。FAB MS m/z 1039.7 (M+H)+、HR-FABMS m/z 1040.6562 [(M+H) +, calcd for C57H86N9O9 1040.6549]。
Cyclolinopeptide B (2)
白色粉末、[α]D -104.1゜(c 0.20, MeOH)、IR (KBr) νmax 3436 (NH) and 1659 (amide C=O) cm-1、UV (MeOH) λmax 267 (ε243.3) and 218 (ε10578) nm。FAB MS m/z 1057.5 (M+H)+、HR-FABMS m/z 1058.6031 [(M+H)+, calcd for C56H84N9O9S 1058.6113]。
Cyclolinopeptide C (3)
白色粉末、[α] D -109.7゜(c 0.21, MeOH)、IR (KBr) νmax 3329 (NH), 1663 (amide C=O) and 1029 (sulfoxide) cm-1、UV (MeOH) λmax 268 (ε245) and 218 (ε11000) nm。FAB MS m/z 1073.8 (M+H)+、HR-FABMS m/z 1074.6039 [(M+H)+, calcd for C56H84N9O10S 1074.6062]。
Cyclolinopeptide D (4)
白色粉末、[α] D -75.0゜(c 0.20, MeOH)、IR (KBr) νmax 3332 (NH), 1657 (amide C=O) and 1029 (sulfoxide) cm-1、UV (MeOH) λmax 280 (ε4631.0) and 229 (ε10072) nm。FAB MS m/z 1063.8 (M+H)+、HR-FABMS m/z 1064.5682 [(M+H)+, calcd for C57H78N9O9S 1064.5643]。
Cyclolinopeptide E (5)
白色粉末、[α] D -75.5゜(c 0.20, MeOH)、IR (KBr) νmax 3314 (NH), 1657 (amide C=O) and 1028 (sulfoxide) cm-1、UV (MeOH) λmax 267 (ε303) and 218 (ε8690) nm。FAB MS m/z 976.9 (M+H)+、HR-FABMS m/z 977.5491 [(M+H)+, calcd for C51H77N8O9S 977.5534]。
Cyclolinopeptide F (6)
白色粉末、[α] D -71.4゜(c 0.21, MeOH)、IR (KBr) νmax 3375 (NH), 1657 (amide C=O) and 1016 (sulfoxide) cm-1、UV (MeOH) λmax 280 (ε4467.6) and 228 (ε10648) nm。FAB MS m/z 1084.6 (M+H)+、HR-FABMS m/z 1084.5018 [(M+H)+, calcd for C55H74N9O10S2 1084.5000]。
Cyclolinopeptide G (7)
白色粉末、[α]D -66.6 ゜(c 0.20, MeOH)、IR (KBr) νmax 3364 (NH), 1657 (amide C=O) and 1015 (sulfoxide) cm-1、UV (MeOH) λmax 281 (ε4497.0) and 228 (ε9156) nm。FAB MS m/z 1097.6 (M+H)+、HR-FABMS m/z 1098.5138 [(M+H)+, calcd for C56H76N9O10S2 1098.5157]。
Cyclolinopeptide H (8)
白色粉末、[α] D -87.7゜(c 0.15, MeOH)、IR (KBr) νmax 3422 (NH), 1653 (amide C=O) and 1029 (sulfoxide) cm-1、UV (MeOH) λmax 281 (ε4211.6) and 229 (ε8786) nm。FAB MS m/z 1081.6 (M+H)+、HR-FABMS m/z 1082.5201 [(M+H)+, calcd for C56H76N9O9S2 1082.5207]。
Cyclolinopeptide I (9)
白色粉末、[α]D -60.6゜(c 0.20, MeOH)、IR (KBr) νmax 3383 (NH), 1657 (amide C=O) and 1027 (sulfoxide) cm-1、UV (MeOH) λmax 281 (ε4518.4) and 228 (ε10110) nm。FAB MS m/z 1068.2 (M+H)+、HR-FABMS m/z 1068.5110 [(M+H)+, calcd for C55H74N9O9S2 1068.5051]。
Cyclolinopeptide J (10)
白色粉末、[α]D -49.3゜(c 0.15, CHCl3)、IR (NaCl) νmax 3298 (NH), 1653 (amide C=O) and 1134 (sulfone) cm-1、UV (MeOH) λmax 264 (ε1612.9) and 219 (ε11419) nm。FAB MS m/z 993.5 (M+H)+、HR-FABMS m/z 993.5536 [(M+H)+, calcd for C51H77N8O10S 993.5483]。
Cyclolinopeptide K (11)
白色粉末、[α]D -71.4゜(c 0.03, MeOH)、IR (NaCl) νmax 3427 (NH), 1648 (amide C=O) and 1135 (sulfone) cm-1、UV (MeOH) λmax 265 (ε664.0) and 213 (ε16480) nm。FAB MS m/z 1090.6 (M+H)+、HR-FABMS m/z 1090.5962 [(M+H)+, calcd for C56H84N9O11S 1090.6011]。
Figure 2015114817
各アミノ酸の絶対配置の決定には Marfey 法を適用し、その結果から構成アミノ酸は全て L 体であることが明らかとなった。また、直鎖ペプチドへの変換後に、エドマン分解法を用いたプロテインシークエンサーの配列解析を行い、その構造を確認した。さらに、化合物１、２の配座解析を行い結晶中と溶液中のコンホメーションを明らかにした。
亜麻仁より単離構造決定した環状ペプチド Cyclolinopeptide A(1) - K(11)の構造を表１に示す。
Figure 2015114817
下に、化合物Cyclolinopeptide J(10) とCyclolinopeptide E(5)の構造式を示す。
Figure 2015114817
Figure 2015114817
単離した環状ペプチドはCyclolinopeptide A以外は Met 残基を有しており、特に化合物 10 と 11 は Met 残基が Msn として存在していた。また、他の Met 含有化合物も化合物 2 を除いて全て酸化された状態（Mso）で存在しており、Met 残基の酸化状態が進行しているものほど高収量であったことから、生薬として新鮮なものほどこの関係は異なった様相を示すと考える。すなわち、天然物として、これらはMetとして存在しており、Mso, Msn 残基は、酸化反応によって生成した化合物である可能性がある。
実施例２．誘導体の合成
Cyclolinopeptide E(5) (5 mg)をTFA（400μL）で溶かし、0°Cまで冷やした後、50μL ６N塩酸および50μL Et2Sを加えた。1時間後に10 ｍL 飽和NaHCO3で反応を停止し、10 ｍL CHCl3で３回分配した。得られたCHCl3画分をNa2SO4で脱水した後、CHCl3画分を濃縮し、化合物１２（5 ｍｇ）を得た。
Cyclolinopeptide Ｆ(6) (5 mg)をTFA（900μL）で溶かし、0°Cまで冷やした後、10μL ６N塩酸および100μL Et2Sを加えた。1時間後に10 ｍL 飽和NaHCO3で反応を停止し20 ｍL CHCl3で３回分配した。得られたCHCl3画分をNa2SO4で脱水した後、CHCl3画分を濃縮し、反応生成物を得た。得られた生成物は逆相系HPLC（Shiseido Capcell Pak C18 MGIII 10 mm i.d. x 250 mm, 溶媒系: H2O-MeCN 60分で60:40 から 30:70 までのグラジエント、流速 4 mL/min, UV/vis 検出 210 nm）を用いて分離・精製を行った結果、化合物１３（0.8 mg）、１４ （1.0 mg）およびcyclolinopeptide Ｉ（0.9 mg）を得た。Cyclolinopeptide G (5 mg）に関しても同様の反応条件および精製法を用いて、化合物１５（1.3 mg）、１６ （1.3 mg）およびcyclolinopeptide H（0.9 mg）を得た。
Figure 2015114817
実施例３．活性評価
骨髄細胞の調製
雄性ICRマウス(4-8週齢)から大腿骨・脛骨を摘出した。10% ウシ胎児血清および100 U/mL penicillin G、100 μg/mL streptomycinを加えたmodified essential medium-α (MEM α) 10 mL中に、シリンジおよび21G注射針を用いて骨髄細胞をフラッシュアウトした。1200 rpm、室温にて、5分間遠心分離し、上清を除去した後、ACK lysing buffer [0.15 M NH4Cl、1.0 mM KHCO3、0.1 mM Na2EDTA (pH 7.3)]を5 mL加え、5分間の溶血処理を行った。15 mLのMEMαを加え、セルストレイナーを用いてcell debrisを除去した。1200rpm、室温にて、5分間遠心分離し、上清を除去した後、10 mLのMEMαで細胞を懸濁した。
各実験で用いた骨髄細胞とは、上記のように溶血処理後にcell debrisを除いた細胞を示す。
ＴＲＡＰ活性の測定
単離した骨髄細胞を1.5x105cells/100 μL/wellの条件で96 well plateに播種し、macrophage colony-stimulating factor (M-CSF)を最終濃度40 ng/mLとなるように加えた。播種後24時間で、各種アマペプチドおよび対照薬物（ポジティブコントロール：curcumin、ネガティブコントロール：DMSO)を各種濃度で添加し、その後、分化因子としてRANKLを最終濃度40 ng/mLとなるように添加した。この際、培養液の全体量はRANKLとサンプルの添加により200μlとなり、前日に加えたM-CSFの最終濃度は20 ng/mLとなる。
RANKLを誘導3日後に培養液を捨て、0.5%Triton-X100を含む酒石酸緩衝液[50 mM sodium tartrate dihydrate、0.1 M sodium acetate (pH 5.4)]を125 mL加えて細胞を溶解させた後、20 mM AS-BIリン酸を15 μL加えて撹拌後、37℃でインキュベートした。保温1時間後にEx 405 nm/Em 505-520 nmの条件でAS-BI の蛍光を測定し、蛍光値をTRAP活性とした（参考文献：J Bone Miner Res. 2001: 788-793.Naphthol-ASBI phosphate as a preferred substrate for tartrate-resistant acid phosphatase isoform 5b. Janckila AJ, Takahashi K, Sun SZ, Yam LT.) 。
破骨細胞分化誘導操作を行った細胞を氷冷したphosphate-buffered saline (PBS) (137 mM NaCl、2.7 mM KCl、8.1 mM Na2HPO4・12H2O、1.5 mM KH2PO4) で3回洗浄し、0.9% NaClを含む10% ホルマリンで20分間固定した。細胞を精製水で3回洗浄し、TRAP染色液 [0.01% Naphthol AS-BI phosphate、0.06% Fast red ITR salt、50 mM sodium tartrate dihydrate、0.1 M sodium acetate (pH 5.4)]を用いて37℃、20分間インキュベートすることでTRAP陽性細胞を発色させた。
骨髄マクロファージの培養
アマペプチドの作用を解析する上では、多種の細胞が含まれる骨髄細胞を用いた破骨細胞分化誘導系は不向きである。そこで破骨細胞の前駆細胞となる骨髄マクロファージのみを単離し、各種の遺伝子発現、タンパク発現およびタンパク質リン酸化の検討に用いた。
マウス大腿骨より調製した骨髄細胞(8x107cells)を100 mmペトリディッシュに播種し、100 ng/mL M-CSFを加え、37℃、5% CO2の環境下で3日間培養した。ディッシュ底面に付着した細胞を1 mM EDTAを含む0.1% trypsinで処理し、得られた細胞を骨髄マクロファージとして各種実験に用いた。
各種のRT-PCRおよびウェスタンブロッティング（WB）については、骨髄マクロファージを20 ng/mLのM-CSF存在下2x104cells/cm2 の密度で培養後し、RANKLを40 ng/mLを添加した。
評価結果
1. アマペプチドの破骨細胞分化抑制作用
アマから単離した環状ペプチドcyclolinopeptide−A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, Kの11種およびCL-FとGの還元体5種の計16種類のペプチドについて、その破骨細胞分化抑制活性を比較した。結果を表３に示す。尚、上記の通り、ポジティブコントロールとしてcurcumin、ネガティブコントロールとしてDMSOを用いた。DMSOを用いた系では抑制活性はなかった。
Figure 2015114817
天然体の11種および５種の誘導体全てに、コントロールと比較して活性が認められた。天然より単離したcyclolinopeptide−AからKの11種については、cyclolinopeptide-Jの抑制活性が最も強く、そのIC50は10 nMであった。cyclolinopeptide-Jの細胞毒性については、IC50の1000倍である10 μMにおいても有意な増殖抑制は認められなかった。
天然体の11種の中では、cyclolinopeptide-B, D, F, G, H, Iに中程度の抑制活性が認められた。
以上の結果から、環状ペプチドの作用機序については天然体の中で最も強いcyclolinopeptide−Jについて解析した。
cyclolinopeptide-Jの破骨細胞分化抑制の機序
RT-PCRにより各種破骨細胞マーカー遺伝子の発現を検討した結果、20 nMのcyclolinopeptide-Jの添加により、RANKLで誘導されるマーカー遺伝子の発現は抑制された。
また、破骨細胞のマスター転写因子であるNFAFc1のタンパク発現をウエスタンブロッティングにより確認した結果、RANKL添加後48時間で認められるNFAFc1の発現が抑制されていた。これらの結果は、cyclolinopeptide-Jの作用がRANKLによる破骨細胞分化シグナルの初期に作用していることが示唆された。
そこで、NFAFc1を誘導する因子のうち、c-fosの発現とNF-κBのシグナルについて検討した。c-fosの発現はRANKL添加後30分から認められ、24時間においても遺伝子発現の誘導亢進が認められたが、cyclolinopeptide-Jを添加したサンプルでは、検討したすべての時間においてc-fosの発現が抑制された。一方、NF-κB活性化の指標となるIκBのリン酸化と分解は、cyclolinopeptide-Jを添加しても全く影響を受けず、コントロール群と同様の経時変化を示した。したがって、cyclolinopeptide-JはRANKLが活性化する細胞内シグナルのうちc-fosを介したシグナルを選択的に抑制すると考えられる。
本発明の破骨細胞分化抑制剤により、骨吸収疾患、主に骨粗鬆症や大腿頸部骨折の予防または治療に有用な組成物を提供することが可能となる。また、本発明により、骨吸収関連疾患である関節リウマチ、糖尿病、慢性腎不全などのリン代謝異常における骨量減少や骨強度低下、さらには多発性骨髄腫、悪性リンパ腫、家族性骨ページェット病あるいは歯周病への治療効果が期待される。
また、本発明の破骨細胞分化抑制剤は、アマ由来の成分であるため、安全性が高く、有用である。

Claims (13)

  1. アマ由来の環状ペプチドを有効成分として含む破骨細胞分化抑制剤。
  2. ８または９アミノ酸からなる環状ペプチドの一種以上を有効成分として含む破骨細胞分化抑制剤。
  3. 有効成分が、
    cyclo (-Pro-Pro-Phe-Phe-Leu-Ile-Ile-Leu-Val-)、
    cyclo (-Pro-Pro-Phe-Phe-Val-Ile-Met-Leu-Ile-)、
    cyclo (-Pro-Pro-Phe-Phe-Val-Ile-Mso-Leu-Ile-)、
    cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Ile-Mso-Leu-Leu-)、
    cyclo (-Pro-Leu-Phe-Ile-Mso-Leu-Val-Phe-)、
    cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Val-Mso-Leu-Mso-)、
    cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Ile-Mso-Leu-Mso-)、
    cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Ile-Mso-Leu-Met-)、
    cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Val-Met-Leu-Mso-)、
    cyclo (-Pro-Leu-Phe-Ile-Msn-Leu-Val-Phe-)、
    cyclo (-Pro-Pro-Phe-Phe-Val-Ile-Msn-Leu-Ile-)、
    cyclo (-Pro-Leu-Phe-Ile-Met-Leu-Val-Phe-)、
    cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Val-Met-Leu-Met-)、
    cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Val-Mso-Leu-Met-)、
    cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Ile-Met-Leu-Met-)、および
    cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Ile-Met-Leu-Mso-)
    からなる群から選択される環状ペプチドの一種以上である、請求項２記載の破骨細胞分化抑制剤。
  4. 有効成分が
    cyclo-(Pro-Pro-Phe-Phe-Leu-Ile-Ile-Leu-Val)、
    cyclo-(Pro-Phe-Phe-Trp-Ile-Mso-Leu-Leu)、
    cyclo-(Pro-Phe-Phe-Trp-Val-Mso-Leu-Mso)、
    cyclo-(Pro-Phe-Phe-Trp-Val-Met-Leu-Mso)、および
    cyclo-(Pro-Leu-Phe-Ile-Msn-Leu-Val-Phe)からなる群から選択される環状ペプチドの一種以上である、請求項３記載の破骨細胞分化抑制剤。
  5. 有効成分がcyclo-(Pro-Leu-Phe-Ile-Msn-Leu-Val-Phe)である、請求項４記載の破骨細胞分化抑制剤。
  6. アマ由来の環状ペプチドを有効成分として含む骨吸収関連疾患の予防または治療剤。
  7. ８または９アミノ酸からなる環状ペプチドの一種以上を有効成分として含む骨吸収関連疾患の予防または治療剤。
  8. 有効成分が、cyclo (-Pro-Pro-Phe-Phe-Leu-Ile-Ile-Leu-Val-)、
    cyclo (-Pro-Pro-Phe-Phe-Val-Ile-Met-Leu-Ile-)、
    cyclo (-Pro-Pro-Phe-Phe-Val-Ile-Mso-Leu-Ile-)、
    cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Ile-Mso-Leu-Leu-)、
    cyclo (-Pro-Leu-Phe-Ile-Mso-Leu-Val-Phe-)、
    cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Val-Mso-Leu-Mso-)、
    cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Ile-Mso-Leu-Mso-)、
    cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Ile-Mso-Leu-Met-)、
    cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Val-Met-Leu-Mso-)、
    cyclo (-Pro-Leu-Phe-Ile-Msn-Leu-Val-Phe-)、
    cyclo (-Pro-Pro-Phe-Phe-Val-Ile-Msn-Leu-Ile-)、
    cyclo (-Pro-Leu-Phe-Ile-Met-Leu-Val-Phe-)、
    cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Val-Met-Leu-Met-)、
    cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Val-Mso-Leu-Met-)、
    cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Ile-Met-Leu-Met-)、および
    cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Ile-Met-Leu-Mso-)
    からなる群から選択される環状ペプチドの一種以上である、請求項７記載の骨吸収関連疾患の予防または治療剤。
  9. 有効成分が
    cyclo-(Pro-Pro-Phe-Phe-Leu-Ile-Ile-Leu-Val)、
    cyclo-(Pro-Phe-Phe-Trp-Ile-Mso-Leu-Leu)、
    cyclo-(Pro-Phe-Phe-Trp-Val-Mso-Leu-Mso)、
    cyclo-(Pro-Phe-Phe-Trp-Val-Met-Leu-Mso)、および
    cyclo-(Pro-Leu-Phe-Ile-Msn-Leu-Val-Phe)からなる群から選択される環状ペプチドの一種以上である、請求項８記載の骨吸収関連疾患の予防または治療剤。
  10. 有効成分がcyclo-(Pro-Leu-Phe-Ile-Msn-Leu-Val-Phe)である、請求項９記載の骨吸収関連疾患の予防または治療剤。
  11. 骨吸収関連疾患が骨粗鬆症である、請求項６〜１０のいずれか一項記載の骨吸収関連疾患の予防または治療剤。
  12. 飲食料の形態である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の剤。
  13. 医薬組成物の形態である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の剤。
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KR101759725B1 (ko) 지골피추출물로부터 분리된 디하이드로파세익 애시드 쓰리프라임-오-베타-디-글루코피라노사이드를 포함하는 골다공증 예방 및 치료용 조성물
Kim et al. 6, 7, 4′‐Trihydroxyflavone inhibits osteoclast formation and bone resorption in vitro and in vivo
EP2407160B1 (en) Pharmaceutical composition for prevention and/or treatment of bone disease, functional food or health food comprising the composition, and pharmaceutical preparation comprising the composition as active ingredient
KR101656834B1 (ko) 콜포신 다로페이트를 포함하는 골 질환의 예방 또는 치료용 조성물
CN111356468A (zh) 包含黃漆木提取物作为有效成分的用于预防或治疗纤维化疾病的组合物
JPWO2015114817A1 (ja) 環状ペプチドを有効成分とする骨吸収関連疾患の治療又は予防剤
KR102292696B1 (ko) 파골세포 분화 억제용 풀무치 에탄올 추출물 및 이의 용도
JPWO2005063233A1 (ja) 肝癌予防及び治療用組成物
KR100740565B1 (ko) 파골세포 분화억제 효과를 가지는 황금 추출물 및 이를 포함하는 건강기능식품 조성물
KR102063962B1 (ko) 캄펜을 유효성분으로 함유하는 골다공증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
KR101502465B1 (ko) 고량강 추출물을 포함하는 골 관련 질환 또는 혈관 석회화의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
KR101305555B1 (ko) 신이 활성 화합물들을 유효성분으로 함유하는 골질환 예방 및 치료용 조성물
WO2018062895A1 (ko) 오스문드아세톤 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 골 질환 예방 또는 치료용 조성물
KR100718490B1 (ko) 파골세포 분화억제 효과를 갖는 대추 추출물 및 이를 포함하는 건강기능식품 조성물
KR101655554B1 (ko) 택사 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물을 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
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Meena et al. A novel approach for body weight management using a bacterial surfactin lipopeptide
KR102015488B1 (ko) 트리메틸피라진을 유효성분으로 함유하는 골다공증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
KR20230079726A (ko) 풋귤 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 뼈 건강 개선용 조성물
KR101320975B1 (ko) 신이 활성 화합물들을 유효성분으로 함유하는 골질환 예방 및 치료용 조성물
KR102567725B1 (ko) 동과 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 뼈 건강 개선용 조성물
KR102161111B1 (ko) 리나로올을 유효성분으로 함유하는 골다공증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
JP7242042B2 (ja) 破骨細胞分化抑制剤並びに骨吸収性疾患の予防・治療・改善用の内服剤又は飲食品組成物
KR100690500B1 (ko) 조구등 추출물을 포함하는 혈관형성 촉진 및 골유합효과를 갖는 골절의 예방 및 치료용 조성물