JPWO2005063233A1

JPWO2005063233A1 - 肝癌予防及び治療用組成物

Info

Publication number: JPWO2005063233A1
Application number: JP2005516676A
Authority: JP
Inventors: 一三矢ヶ崎; 豊三浦; 大樹三浦; サンティ，リスト; サアリネン，ニイナ
Original assignee: Tokyo University of Agriculture and Technology NUC
Current assignee: Tokyo University of Agriculture and Technology NUC
Priority date: 2003-12-26
Filing date: 2004-12-24
Publication date: 2007-07-19
Also published as: CN1893939A; US20070117864A1; WO2005063233A1; CN1893939B; KR20060115383A

Abstract

本発明は、肝癌予防及び治療用組成物を提供するものであり、本発明は、エンテロラクトン（ＥＮＬ）又はその植物リグナン前駆体であって、肝癌の増殖抑制作用を有する化合物を有効成分として含むことを特徴とする肝癌予防及び治療用組成物、エンテロラクトン（ＥＮＬ）又はその植物リグナン前駆体であって、肝癌の増殖抑制作用を有する化合物及び薬学的に許容される担体成分から成ることを特徴とする肝癌予防及び治療用薬剤、及びエンテロラクトン（ＥＮＬ）又はその植物リグナン前駆体であって、肝癌の増殖抑制作用を有する化合物を機能性成分として食品素材に配合したことを特徴とする機能性食品素材、に関する。

Description

本発明は、新規肝癌予防及び治療用組成物に関するものであり、更に詳しくは、エンテロラクトン（ＥＮＬ）又はその植物リグナン前駆体を有効成分として含む肝癌予防及び治療用薬剤及びこれらの成分を機能性成分として含む機能性食品に関するものである。本発明は、肝癌の予防及び治療用の医薬品及びそれに関連する機能性食品の技術分野において、植物の根、葉、茎、種子、果実等に広く存在するリグナンの哺乳動物体内における主な代謝産物であるエンテロラクトン（ＥＮＬ）の高い肝癌の増殖抑制作用を利用した新規肝癌予防及び治療用薬剤、制癌剤、及び新規機能性食品等を提供するものとして有用である。

リグナンは、フェニルプロパノイド単位からなるフェノール化合物であり、これらは少量ながらも、植物の根、葉、茎、種子、果実といったあらゆる部分に分布している。リグナンはエストロゲンと同様に腸肝循環し、尿中にグルクロニド抱合体又は硫酸塩抱合体として放出される（非特許文献１）。このリグナンを多く含む亜麻又は亜麻子のリグナンである〔ｓｅｃｏｉｓｏｌａｒｉｃｉｒｅｓｉｎｏｌｄｉｇｌｙｃｏｓｉｄｅ（ＳＤＧ）〕は、ｄｉｍｅｔｈｙｌｂｅｎｎｚ〔ａ〕ａｎｔｈｒａｃｅｎｅ（ＤＭＢＡ）に起因するラット乳がん細胞の悪性化を阻止する報告があり（非特許文献２、３、４、５）、また、リグナンを含むライ麦の摂取が、前立腺がんを早期に予防するという報告もある（非特許文献６、７）。しかし、リグナンの肝癌に対する作用についてはこれまで研究報告例はない。

Axelson M, Setchell KD, The excretion of lignans in rats -- evidence for an intestinal bacterial source for this new group of compounds. FEBS Lett. 1981 Jan 26;123(2):337-42. Serraino M, Thompson LU. The effect of flaxseedsupplementation on early risk markers for mammary carcinogenesis. Cancer Lett. 1991 Nov;60(2):135-42. Serraino M, Thompson LU. The effect of flaxseed supplementation on the initiation and promotional stages of mammary tumorigenesis. Nutr Cancer. 1992;17(2):153-9. Thompson LU, Seidl MM, Rickard SE, Orcheson LJ, Fong HH. Antitumorigenic effect of a mammalian lignan precursor from flaxseed. Nutr Cancer. 1996;26(2):159-65. Thompson LU, Rickard SE, Orcheson LJ, Seidl MM. Flaxseed and its lignan and oil components reduce mammary tumor growth at a late stage of carcinogenesis. Carcinogenesis. 1996 Jun;17(6):1373-6. Landstrom M, Zhang JX, Hallmans G, Aman P, Bergh A, Damber JE, Mazur W, Wahala K, Adlercreutz H. Inhibitory effects of soy and rye diets on the development of Dunning R3327 prostate adenocarcinoma in rats. Prostate. 1998 Aug 1;36(3):151-61. Zhang JX, Hallmans G, Landstrom M, Bergh A, Damber JE, Aman P, Adlercreutz H. Soy and rye diets inhibit the development of Dunning R3327 prostatic adenocarcinoma in rats. Cancer Lett. 1997 Mar 19;114(1-2):313-4.

このような状況の中で、本発明者らは、上記従来技術に鑑みて、リグナン及びその代謝産物の各種化合物の肝癌に対する作用について種々研究を重ねた結果、松の木由来のリグナンであるハイドロキシマタイレシノール（ＨＭＲ）の哺乳動物体内における主な代謝産物であるエンテロラクトン（ＥＮＬ）が高い肝癌増殖抑制作用を有することを見出し、更に研究を重ねて、本発明を完成するに至った。本発明は、新規肝癌予防及び治療用組成物、肝癌予防及び治療用薬剤、及び機能性食品を提供することを目的とするものである。

上記課題を解決するための本発明は、以下の技術的手段から構成される。
（１）エンテロラクトン（ＥＮＬ）又はその植物リグナン前駆体であって、肝癌の増殖抑制作用を有する化合物を有効成分として含むことを特徴とする肝癌予防及び治療用組成物。
（２）エンテロラクトン（ＥＮＬ）又はその植物リグナン前駆体であって、肝癌の増殖抑制作用を有する化合物及び薬学的に許容される担体成分から成ることを特徴とする肝癌予防及び治療用薬剤。
（３）エンテロラクトン（ＥＮＬ）又はその植物リグナン前駆体であって、肝癌の増殖抑制作用を有する化合物を機能性成分として食品素材に配合したことを特徴とする機能性食品素材。
（４）エンテロラクトン（ＥＮＬ）又はその植物リグナン前駆体であって、肝癌の増殖抑制作用を有する化合物を機能性成分として含むことを特徴とする機能性食品。
（５）前記食品が、栄養補助食品、栄養剤、治療用食品、栄養補助食品、又は健康食品であることを特徴とする前記（４）に記載の機能性食品。

次に、本発明について更に詳細に説明する。
本発明は、エンテロラクトン（ＥＮＬ）又はその植物リグナン前駆体を有効成分として含むことを特徴とする肝癌予防及び治療用組成物、特に、肝癌予防及び治療用薬剤、及び機能性食品、に係るものである。本発明で有効成分として使用されるエンテロラクトン（ｅｎｔｅｒｏｌａｃｔｏｎｅ，ＥＮＬ）は、ママリアンリグナン（ｍａｍｍａｌｉａｎｌｉｇｎａｎｓ）の一種として知られている植物リグナン代謝産物であり、例えば、松の木由来の植物リグナンであるハイドロキシマタイレシノール（ｈｙｄｒｏｘｙｍａｔａｉｒｅｓｉｎｏｌ，ＨＭＲ）の主な代謝産物として知られている。本発明では、好適には、このエンテロラクトンが使用されるが、これに制限されるものではなく、その植物リグナン前駆体を使用することが可能である。

本発明では、上記植物リグナン前駆体として、エンテロジオール（ｅｎｔｅｒｏｄｉｏｌ，ＥＮＤ）、マタイレシノール（ｍａｔａｉｒｅｓｉｎｏｌ，ＭＲ）、セコイソラリシレシノール（ｓｅｃｏｉｓｏｌａｒｉｃｉｒｅｓｉｎｏｌ，ＳＥＣＯ）、セコイソラリシレシノールジグリコシド（ｓｅｃｏｉｓｏｌａｒｉｓｉｒｅｓｉｎｏｌｄｉｇｌｙｃｏｓｉｄｅ，ＳＤＧ）、シリンガレシノール（ｓｙｒｉｎｇａｒｅｓｉｎｏｌ）、アークチゲニン（ａｒｃｔｉｇｅｎｉｎ）、ラリシレシノール（ｌａｒｉｃｉｒｅｓｉｎｏｌ）、ピノレシノール（ｐｉｎｏｒｅｓｉｎｏｌ）、セサミン（ｓｅｓａｍｉｎ）が用いられる。これらの植物リグナン前駆体は、腸内細菌により、所定の代謝経路を経てその代謝産物である、エンテロラクトンに変換され、エンテロラクトンの有する肝癌増殖抑制作用を発揮する。

植物リグナン前駆体は、生体内で腸内細菌によって、その代謝産物のエンテロラクトンへと変換される。例えば、代謝の過程で、ＳＤＧは、糖がとれてＳＥＣＯとなり、このＳＥＣＯはＥＮＤを経てＥＮＬへと変換される。ＭＲは直接ＥＮＬへ変換される。従来、松の木由来のリグナンとして知られているハイドロキシマタイレシノールをヒトに投与することにもとづく、ヒトの血清中のエンテロラクトン又はハイドロキシマタイレシノールのほかの代謝産物の濃度を増加させる方法によって、ヒトの癌、ある種の非癌性ホルモン依存性疾患及び／又は心疾患の予防をもたらす方法等が報告されている（特表２００２−５４１１５８号公報）。

しかし、そこで、実際に検討されているのは、例えば、癌については、乳癌、前立腺癌及び結腸癌についてのみであり、肝癌については何も検討されていない。すなわち、従来、ハイドロキシマタイレシノールをヒトに投与することにもとづく、ヒトの血清中のエンテロラクトン又はハイドロキシマタイレシノールのほかの代謝産物の濃度を増加する方法が肝癌増殖抑制作用を有するかどうかは未知であった。

本発明で使用される上記エンテロラクトン（ＥＮＬ）及びその植物リグナン前駆体は、いずれも公知の化合物であり、例えば、エンテロラクトン（ＥＮＬ）については、市販品を使用することが可能であり、また、公知の方法で合成することができる。本発明は、有効成分のエンテロラクトン（ＥＮＬ）を直接ヒトに投与する方法の他、有効成分として、その植物リグナン前駆体を直接ヒトに投与する方法を包含しており、本発明では、これらの方法に適合した医薬組成物がその発明の範囲に含まれる。本発明の組成物としては、例えば、有効量の上記有効成分を濃縮した液体又は固体材料からなる組成物が例示される。本発明の医薬組成物では、これらの有効成分の他に、例えば、薬学的に許容される担体等の任意の成分を配合して製剤化することができ、その方法及び薬剤の形態等は特に制限されない。また、本発明では、上記有効成分を機能性成分として所定量添加して、例えば、食品添加物、栄養補助食品、栄養剤、治療用食品、栄養補給食品、健康食品等の任意の種類及び形態の機能性食品素材、機能性食品を製造することができる。

本発明では、例えば、医薬組成物に配合する有効量のエンテロラクトン（ＥＮＬ）として１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重が例示されるが、これらに制限されるものではない。また、機能性食品に配合する上記有効成分の配合量等は目的とする食品の種類等に応じて任意に設計することができる。更に、天然由来の体内代謝産物であるエンテロラクトン（ＥＮＬ）、またその前駆体である植物リグナンの生体に対する安全性等は、これまで多くの論文で確認されている。

従来、ヒトの血清中のエンテロラクトン又はハイドロキシマタイレシノールのほかの代謝産物の濃度を増加させる方法によって、ヒトの癌、非癌性ホルモン依存性疾患及び／又は心疾患の予防方法等が報告されているが、実際に、検討されているのは、癌については、乳癌、前立腺癌及び結腸癌の特定の癌についてのみであり、それ以外の癌への有効性については全く未知であった。本発明では、実際に、従来、未検討であったエンテロラクトン等の肝癌への影響について試験を行なった結果、その有効性が実証されたものであり、エンテロラクトン等の肝癌に対する有効性は、本発明者らの実施した格別の実験によってはじめて実証されたものである。当該技術分野においては、ある成分が、例えば、乳癌、前立腺癌、結腸癌へ有効であるとしても、該成分が同様に、肝癌にも有効であるとは限らず、それらを解明するには、格別の実験が必要とされるのが実情であり、エンテロラクトン等の肝癌への有効性が実証されていない状況では、エンテロラクトン等の肝癌増殖抑制作用を予期することは困難である。本発明は、従来のヒトの一部の癌の予防方法の選択発明を構成するものであることが明らかである。

本発明により、（１）肝癌の増殖抑制作用を有する新規肝癌予防及び治療用組成物、肝癌予防及び治療用医薬組成物、及び機能性食品を提供することができる、（２）植物リグナン由来の代謝産物であるエンテロラクトンを有効成分とする新しい制癌剤等を提供することができる、（３）この化合物は、低用量で高い肝癌増殖抑制作用を有する、（４）この化合物は、肝癌性脂質代謝異常も改善できる、という効果が奏される。

次に、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明は、以下の実施例によって何ら限定されるものではない。

本実施例では、肝癌細胞の増殖と浸潤に対するＥＮＬの作用を解析（Ｉｎｖｉｔｒｏ／Ｅｘｖｉｖｏ）するために、ＥＮＬを用いて、ＡＨ１０９Ａ細胞に対する抗腫瘍作用の検討を行った。
１．材料及び方法
（１）材料
本実施例で使用したＥＮＬの化学構造式を化１に示した。

（２）肝癌細胞の培養
ラット腹水肝癌ＡＨ１０９Ａ細胞（東北大学加齢医学研究所（仙台））は、Ｄｏｎｒｙｕ系雄ラット（ＮＲＣ榛名、群馬）の腹腔内に継続的に移植し続けることで維持した。ラットの腹水が充分に蓄積した時点で腹水からＡＨ１０９Ａ細胞を精製した。精製は、腹水を１０００ｒｐｍ（１９０×ｇ）、４℃で１０分間遠心分離した後、上清を除去し、溶血緩衝液〔０．１６ＭＮＨ_４Ｃｌ：０．１７ＭＴｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎ＝９：１、ｐＨ７．２（すべてＷａｋｏＰｕｒｅＣｈｅｍｉｃａｌＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，ＯｓａｋａＪａｐａｎから購入）〕を同量加え、ピペッティングして懸濁した後、氷中に約２０分間放置して赤血球を破壊することにより行った。

更に、１０００ｒｐｍ（１９０×ｇ）、４℃で１０分間遠心分離後の上清を除去して血球を取り除く作業を２回行い、リン酸緩衝液〔Ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅ（−）（ＰＢＳ（−））ＮａＣｌ８ｇ、ＫＣｌ０．２ｇ、ＫＨ₂ ＰＯ₄ ０．２ｇ、Ｎａ₂ ＨＰＯ₄ ・１２Ｈ₂ Ｏ２．９ｇ（すべてＷａｋｏＰｕｒｅＣｈｅｍｉｃａｌＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，ＯｓａｋａＪａｐａｎから購入）をＭＱ水１Ｌに溶解し、ｐＨ７．４に調整したもの〕にて２回洗浄した。精製されたＡＨ１０９Ａ細胞は、１０％牛血清（ＣＳ，ＪＲＨＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ，Ｌｅｎｅｘａ，ＫＳ，ＵＳＡ）を含むＥａｇｌｅＭＥＭ培地（ＮＩＳＳＵＩＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＣＯ，ＬＴＤ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で、細胞培養用６ｃｍｄｉｓｈ（ＮＵＮＣ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）に１×１０⁶ 個となるように播種し、培養した。ＣＳは使用前に５６℃で３０分間、水浴中にて非働化を行ったものを用いた。

（３）肝癌細胞の増殖能測定
ＡＨ１０９Ａ細胞の増殖能は、ＤＮＡへ取り込まれた〔³ Ｈ〕ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ（２０Ｃｉ／ｍｍｏｌ，ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＮｕｃｌｅａｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＵＳＡ）の放射能を測定することにより（Yagasaki K., Tanabe T., Ishihara K., and Funabiki R., (1992) Modulation of the proliferation of cultured hepatoma cells by urea cycle-related amino acids. In: Murakami, H., Shirahata S., and Tachibanana H., (ed.) Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects. Vol. 4 (pp. 257-263). Kluwer Academic Publisher, Dordrecht/Boston London）評価した。

すなわち、組織培養用４８穴プレート（Ｎｕｎｃ）にＡＨ１０９Ａ細胞を１穴あたり２．５×１０⁴ 個となるように播種し、各実験培地を加え最終的に１穴あたり４００μｌとして２０時間培養した後、各穴に０．１５μＣｉ／ｗｅｌｌとなるように〔³ Ｈ〕ｔｈｙｍｉｄｉｎｅを添加し、ＣＯ₂ インキュベーター内でさらに４時間培養した。その後、１Ｍａｓｃｏｒｂｉｃａｃｉｄ（ＷａｋｏＰｕｒｅＣｈｅｍｉｃａｌＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）を５０μｌ／穴添加し、各穴の培地をそれぞれマルエムチューブ（ＭａｒｕｅｍｕＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎＣｏ．，Ｌｔｄ．）に回収し、４８穴プレートをＰＢＳ（−）で２回洗浄し、その洗浄液もマルエムチューブに回収した。１５００ｒｐｍ（４００×ｇ）４℃で５分間遠心分離し、上清を吸引除去した。

プレートについては４００μｌの１０％ＴＣＡで２回洗浄し、その洗浄液についてはマルエムチューブに回収して再度３０００ｒｐｍ（１５００×ｇ）、４℃、５分間遠心分離し、上清を除去した。４８穴プレート、マルエムチューブに残った細胞は０．２ＮＮａＯＨ／０．１％ＳＤＳをそれぞれ１５０μｌ、５０μｌずつ添加し、３７℃のインキュベーター内に３０分間放置し、細胞を完全に溶解した。細胞溶解液は４８穴プレート、マルエムチューブの両者を合わせてミニバイアルへ移し、ＮＴシンチレーター〔トルエン７００ｍｌ、ノニオン３００ｍｌ、ＤＰＯ４ｇ〕を５ｍｌ添加し、更に１５０μｌの１ＮＨＣｌを添加し、良く振り混ぜて、液体が透明になったことを確認し、液体シンチレーションカウンター（ＬＳ６５００；Ｂｅｃｋｍａｎ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）で放射能を測定した。対照値を１００とした時の割合（％）を求め、これを増殖能の指標とした。

（４）肝癌細胞の浸潤能測定
浸潤能測定法は、ＡｋｅｄｏらによるＩｎｖｉｔｒｏｉｎｖａｓｉｏｎａｓｓａｙ法（Akedo H, Shinkai K, Mukai M, Mori Y, Tateishi R, Tanaka K, Yamamoto R, Morishita T. Interaction of rat ascites hepatoma cells with cultured mesothelial cell layers: a model for tumor invasion. Cancer Res. 1986 May;46(5):2416-22 ）を一部改変して行った（Miura Y., Shiomi H., Sakai F., and Yagasaki K. 1997 Assay systems for screening food components that have anti-proliferative and anti-invasive activity to rat ascites hepatoma cells: In vitro and ex vivo effects of green tea extract. Cytotechnology 23： 127-132 ）。

ラットより初代培養した腸間膜由来中皮細胞（Ｍ−ｃｅｌｌ）がコンフルエントな単層を形成するまで７〜１０日培養した後、各実験培地３ｍｌに交換し、ＡＨ１０９Ａ細胞を２．４×１０⁴ 個となるように中皮細胞上に重層し静かに攪拌後、ＣＯ₂ インキュベーター内で培養した。２４時間後にＰＢＳ（−）にて洗浄し、０．２５％ｇｌｕｔａｌａｌｄｅｈｙｄｅ／ＰＢＳ（−）で細胞を固定した。中皮細胞層下に潜り込んだＡＨ１０９Ａ細胞の細胞数及びコロニー数をｄｉｓｈ１枚につき無作為に選んだ２ｍｍ四方区画を１０ヶ所数え、これらを１ｃｍ² あたりに換算した数の平均値を浸潤能の指標とした。

（５）腸間膜由来中皮細胞（Ｍ−ｃｅｌｌ）の精製
Ｄｏｎｒｙｕ系雄ラット（４〜１０週齢）にネンブタールを５ｍｇ／０．１ｍｌ／１００ｇｂｏｄｙｗｅｉｇｈｔとなるように腹腔内注射することで麻酔した後、頚動脈を切断し血液を採取した。その後、ヒビテン液にて消毒した後、クリーンベンチ内で開腹し、腸間膜を一枚ずつ切り取りＰＢＳ（−）で洗い、１５ｍｌのＰＢＳ（−）に回収した。同量の０．５％ｔｒｙｐｓｉｎ／ＰＢＳ（−）を加え、３７℃で２０分間攪拌した。その後、１０％ＣＳ／ＭＥＭ培地５ｍｌを加え、ｔｒｙｐｓｉｎの反応を停止させ、駒込ピペットによりよくピペッティングした後、金属製メッシュで濾過した。濾液は１５００ｒｐｍ（４４０×ｇ）、４℃、１０分間遠心分離し、ＰＢＳ（−）により洗浄を行った。採取した細胞は、グリッド付き（２ｍｍ四方）６ｃｍｄｉｓｈに１．５〜２．０×１０⁵ 個となるように播種した。培地は１０％ＣＳ／ＭＥＭを用いて、採取した翌日とその後１日おきに培地交換を行った。

（６）Ｍ−ｃｅｌｌの増殖能測定
Ｍ−ｃｅｌｌがサブコンフルエントな状態に達するまで培養した後、ＰＢＳ（−）にて洗浄し、１ｍｌの０．１％ｔｒｙｐｓｉｎを添加し細胞を分散させた後、１０％ＣＳ／ＭＥＭでｔｒｙｐｓｉｎ反応を停止し、細胞を回収し、４８穴プレートに１．２５×１０⁵ ｃｅｌｌ／４００μｌ／穴となるように播種し、２４時間培養した。充分に細胞が接着していることを確認して、培地を除去し、サンプルを添加し、２０時間３７℃で培養した。各実験培地を加え、最終的に１穴あたり４００μｌとし、２０時間培養した後、各穴に〔³ Ｈ〕ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ（ＮＥＮ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）を０．１５μＣｉ／穴添加し、ＣＯ₂ インキュベーター内でさらに４時間培養した。その後は上記（３）に準じて増殖能の測定を行った。

（７）肝癌細胞の細胞周期解析
６．２５μＭと１２．５μＭのＥＮＬがＡＨ１０９Ａ細胞の細胞周期に与える影響を経時的に解析した。細胞培養用の６穴プレート（ＮＵＮＣ）にＡＨ１０９Ａ細胞を１穴あたり２．５×１０⁵ 個となるように播種し、３７℃、ＣＯ₂ インキュベーター内で０、２４及び４８時間培養した。それぞれの処理条件にて培養を行ったＡＨ１０９Ａ細胞を、２ｍｌサンプリングチューブ（日本ジェネティックス、東京）へ回収し、１０００ｒｐｍ（１９０×ｇ）、４℃で５分間遠心分離し、ＰＢＳ（−）にて２度洗浄を行った。その後、ＰＩ溶液［１ｍｇＰｒｏｐｉｄｉｕｍｉｏｄｉｄｅ（ＳＩＧＭＡ）／２０ｍｌ０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．１％Ｓｏｄｉｕｍｃｉｔｒａｔｅ（ＷａｋｏＰｕｒｅＣｈｅｍｉｃａｌＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）］を３００μｌ加え、遮光し氷中にて３０分間静置することで染色した。ＦｌｏｗＣｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＥＰＩＣＳＥＬＩＴＥＥＳＰ；Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｈｉａｌｅａｈ，ＦＬ，ＵＳＡ）でＣｅｌｌＣｙｃｌｅの解析を行った。

（８）ＡｎｎｅｘｉｎＶ／ＰＩ二重染色法を用いたＦｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙによるＡＨ１０９Ａ細胞のアポトーシス解析
解析はＡＮＮＥＸＩＮＶＦＩＴＣｋｉｔ（ＩＭＭＵＮＯＴＥＣＨ、Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いて行った。細胞培養用の６ｃｍｄｉｓｈ（ＮＵＮＣ）に実験培地を３ｍｌ添加し、ＡＨ１０９Ａ細胞を１×１０⁶ 個となるように播種し、３７℃、ＣＯ₂ インキュベーター内で０、３、６時間培養した。それぞれの処理条件にて培養を行ったＡＨ１０９Ａ細胞を回収し、１０００ｒｐｍ（９０×ｇ）、４℃で５分間遠心分離し、ＰＢＳ（−）にて１度洗浄を行った。その後、ｂｉｎｄｉｎｇｂｕｆｆｅｒを４９０μｌ加え、更にＰＩ溶液を５μｌとａｎｎｅｘｉｎＶＦＩＴＣを５μｌ加え、穏やかに混和した。遮光した氷中にて１０分間静置することで染色し、ＦｌｏｗＣｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＥＰＩＣＳＥＬＩＴＥＥＳＰ；Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｈｉａｌｅａｈ，ＦＬ，ＵＳＡ）でアポトーシスの解析を行った。

（８）統計処理
統計処理は、Ｏｎｅ−ｗａｙＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＶａｒｉａｎｃｅの後、Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒｍｕｌｔｉｐｌｅｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓｔｅｓｔを行った。

２．試験結果
（１）ＡＨ１０９Ａ細胞および正常細胞に対するＥＮＬの作用について
ＥＮＬは濃度依存的にＡＨ１０９Ａ細胞に対する浸潤抑制作用を示した。しかし、ＥＮＬの濃度が２５μＭ以上では、浸潤能測定系で用いるＭ−ｃｅｌｌに細胞毒性を示し、浸潤能の解析が不可能になってしまう為、１２．５μＭまでの濃度で解析を行った。更に、ＥＮＬは癌細胞であるＡＨ１０９Ａ細胞の増殖も強く抑制したので、正常細胞としてＭ−ｃｅｌｌを用いて、正常細胞の増殖に対する影響の検討も行い、比較した。その結果、ｉｎｖｉｔｒｏにおいてＥＮＬは濃度依存的にＭ−ｃｅｌｌの増殖を抑制したが、ＡＨ１０９Ａ細胞に対してはそれよりも強い効果を示し、濃度５０μＭではＡＨ１０９Ａ細胞の増殖をほぼ完全に抑制することが明らかとなった。そこで、この細胞増殖抑制は、細胞分裂が停止しているのか、細胞がアポトーシス又はネクローシスを起こしているのかという細胞増殖抑制機構を明らかにするため、ＰＩ染色による細胞周期の解析とａｎｎｅｘｉｎＶＦＩＴＣ／ＰＩによるアポトーシス誘導性の観察により、ＥＮＬのＡＨ１０９Ａ細胞に対する増殖抑制機構の検討を行った。

（２）細胞周期の解析について
図１に、解析結果を示した。ＥＮＬ０時間処理であるグラフのＡより、各濃度におけるＥＮＬ処理はＡＨ１０９Ａ細胞の細胞周期に影響はなかった。しかし、ＥＮＬ２４時間処理グラフＢより、０μＭ処理のコントロールに比較して、ＥＮＬ処理したものはＧ１期の割合が増加し、Ｓ期の割合が減少した。

（３）アポトーシスについて
解析結果を図２に示した。濃度６．２５μＭ及び１２．５μＭのＥＮＬによりＡＨ１０９Ａ細胞にアポトーシス誘導が起こるかどうかを経時的に検討した。０μＭのＥＮＬで３時間処理を行ったＡＨ１０９Ａ細胞において、第３象現は９０．７％、第４象現は６．２％、第２象現は２．５％であったが、６．２５μＭのＥＮＬで３時間処理を行ったＡＨ１０９Ａ細胞においては、第３象現は８８．１％、第４象現は８．４％、第２象現は２．８％であり、更に、１２．５μＭのＥＮＬで３時間処理を行ったＡＨ１０９Ａ細胞においては、第３象現は８６．１％、第４象現は１１．４％、第２象現は２．３％であり、ＥＮＬ処理をすることで、濃度依存的に生細胞の割合が減少し、アポトーシス初期細胞の割合が増加した。また、６時間処理を行ったＡＨ１０９Ａ細胞もほぼ同様の結果を示したが、加えて、二次的ネクローシス細胞の割合もやや増加した。

本実施例では、肝癌移植時のがん増殖・転移・高脂血症に対するＥＮＬの作用を解析（Ｉｎｖｉｖｏ）するために、実際にＥＮＬを摂取させて、担癌ラットモデルにおける、癌の増殖・転移、癌性悪液質に対する効果を検討した。
１．材料及び方法
（１）動物飼育
Ｄｏｎｒｙｕ系雄ラット（ＮＲＣ榛名、群馬）を４週齢で購入後、５連ケージで明期８：００〜２０：００、室温２２±１℃、相対湿度６０±５％の環境制御室内で６日間予備飼育を行った。最初の３日間は固形飼料（ＣＥ−２；ＣＬＥＡＪａｐａｎ，Ｔｏｋｙｏ）を、次の３日間は２０％ミルクカゼインを含む基本飼料（２０Ｃ）（表１）をガラス容器に入れ、水道水とともに自由摂取させた。予備飼育終了後、各群の体重が等しくなるように３群（１１頭／群）に分け、全ラットの背部皮下にＰＢＳ（−）に懸濁したＡＨ１０９Ａ細胞をラット１頭あたり１．０×１０⁷ 個移植した。それぞれの実験群には移植直後から、表２に示された飼料を摂取させた。

実験期間中、毎日の体重と食下量及び固型癌の大きさ（縦、横、高さの長さ）を測定した。屠殺当日は９：００に飼料を抜き取り、その４時間後から屠殺を行った。なお、この間も水は自由摂取させた。頚動脈から放血させて血液サンプルを採取するとともに、肝臓及び固型癌を摘出した。採取した血液は、約２時間室温で放置後、３０００ｒｐｍ（１７５０×ｇ）、４℃で１０分間遠心分離して血清を調製し、−２０℃に冷凍保存した。肝臓及び固型癌は氷冷生理食塩水で洗浄後、濾紙で拭き取り、総重量を測定した。更にステロイド排泄量測定のために移植後１９−２１日目の糞を採取し、−２０℃にて冷凍保存した。

（２）固型癌の経時的変化の測定
固型癌の大きさは、縦、横、高さの長さを測定し、その値の総和を用いた。

（３）血清脂質レベルの測定
血中のＣｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ（Ｃｈ）及びＴｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ（ＴＧ）の濃度を測定した。測定はＴｏｔａｌｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ（Ｔ−Ｃｈ）レベル、リンタングステン酸沈殿法を用いてＶｅｒｙ−ｌｏｗ−ｄｅｎｓｉｔｙ−ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ＋ｌｏｗ−ｄｅｎｓｉｔｙ−ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ〔（ＶＬＤＬ＋ＬＤＬ）−Ｃｈ〕を沈殿させた上清画分であるｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ−ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＨＤＬ−Ｃｈ）レベル、及びＴＧレベルについて行った。（ＶＬＤＬ＋ＬＤＬ）−Ｃｈレベルは、Ｔ−ＣｈレベルとＨＤＬ−Ｃｈレベルの差とした。また、動脈硬化指数として、Ａｔｈｅｒｏｇｅｎｉｃｉｎｄｅｘ〔ＡＩ：（ＶＬＤＬ＋ＬＤＬ）−Ｃｈ／ＨＤＬ−Ｃｈ〕を算出した。

（４）血清過酸化脂質レベルの測定
ＬＰＯレベルは過酸化脂質−テストワコー（ＷａｋｏＰｕｒｅＣｈｅｍｉｃａｌＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）を用いて八木式蛍光法により、チオバルビツール酸反応物質（ＴＢＡＲＳ）を測定することにより求めた。

（５）肝臓中脂質レベルの測定
１）総脂質の抽出
脂質レベル測定のために肝臓からＦｏｌｃｈらの方法（FOLCH J, LEES M, SLOANE−STANLEY GH，A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. J. Biol. Chem. 226: 497-509，1957）によって、総脂質を抽出した。肝臓を約０．５ｇ精秤後、Ｍｅｔｈａｎｏｌ５ｍｌとともにポリトロン（ＴｙｐｅＰＴ１０／３５、Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）でホモジナイズし、Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ１０ｍｌを加えて攪拌し、一昼夜放置後、濾過し、残渣をＣｈｌｏｒｏｆｏｒｍ−ｍｅｔｈａｎｏｌ（２：１）混合液で更に洗浄後、両者をあわせて２５ｍｌとし、脂質抽出液とした。

２）総コレステロールレベルの測定
Ｃｈ含量はＺａｋ法（Zak B., Simple rapid microtechnic for serum total cholesterol. Am. J. Clin. Path. 27, 583-588, 1957）により測定した。脂質抽出液（２ｍｌ）をネジ口試験管に入れ、乾固後、５０％（ｗ／ｖ）水酸化カリウム−エタノール溶液３ｍｌを加えて４５℃、１時間けん化した。蒸留水３ｍｌを添加して希釈後、ｎ−ヘキサン３ｍｌを添加して振とうし、Ｃｈを抽出した。ヘキサン層２ｍｌを試験管に入れ、乾固後、０．０８％塩化第二鉄−酢酸溶液（塩化第二鉄１．３３ｇを酢酸に溶解し、１Ｌとする）２ｍｌ、硫酸２ｍｌを加えて攪拌し、放冷後、５６０ｎｍで吸光度をＣｈをＳｔａｎｄａｒｄとして測定した。

３）トリグリセリドレベルの測定
ＴＧレベルはＶａｎＨａｎｄｅｌ法（VAN HANDEL E. Suggested modifications of the micro determination of triglycerides. Clin. Chem. 7:249-51, 1961 ）により測定した。脂質抽出液を、ネジ口試験管に入れ、乾固後、Ｚｅｏｌｉｔｅ（ＷａｋｏＰｕｒｅＣｈｅｍｉｃａｌＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）０．５ｇ、Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ１０ｍｌを入れ振とうし、Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ（ＰＬ）を除去した。その後、濾過し、濾液２ｍｌをネジ付き試験管に入れ乾固した。０．４％（ｗ／ｖ）水酸化カリウム−エタノール溶液０．５ｍｌを加えて６５℃、２０分間けん化し、０．２Ｎ硫酸０．５ｍｌを加えて反応を停止した。沸騰湯浴中でＥｔｈａｎｏｌを除去した後、０．５％メタ過ヨウ素酸ナトリウム０．００５ｍｌを添加して酸化分解し、１０分後、５％亜硫酸水素ナトリウム０．０５ｍｌを添加して反応を停止した。これにクロモトロプ酸−硫酸溶液［クロモトロプ酸二水和物（ＤＯＪＩＮＤＯ，Ｋｕｍａｍｏｔｏ）２．２４ｇを蒸留水に溶解し、２００ｍｌとした後、２４Ｎ硫酸９００ｍｌを氷冷しながら添加する］を５ｍｌ加えて、沸騰湯浴中で３０分間加熱し、冷却後、５７０ｎｍでの吸光度をトリパルミチンをＳｔａｎｄａｒｄとして測定した。

（６）糞中ステロイドの測定
糞中ステロイド排泄量の測定は、ＮｅｕｔｒａｌＳｔｅｒｏｌ（ＮＳ）及びＢｉｌe ａｃｉｄ（ＢＡ）について行った。糞を６０℃で乾燥させ、乾燥重量を測定後、ミキサー及び乳鉢を用いて粉砕し、約１００ｍｇを精秤後、ネジ口試験管に入れ、４Ｎ水酸化カリウム１．５ｍｌ、エタノール１ｍｌを添加して７０℃で１時間けん化した。ｎ−ヘキサン３ｍｌを添加して振とうし、３０００ｒｐｍ（１７５０×ｇ）、１０分間遠心分離し、ｎ−ヘキサン層を試験管に移すことによってＮＳを抽出した。同じ操作を３回行った。その後、蒸留水２．５ｍｌを添加して、水酸化カリウム濃度を１．２Ｎに希釈し、１２１℃、３時間高圧処理（オートクレーブ）し、抱合ＢＡを脱抱合させた。

放冷後、塩酸０．８ｍｌを添加して溶液のｐＨを１にし、ジエチルエーテル３ｍｌを添加して振とうし、３０００ｒｐｍ（１７５０×ｇ）、１０分間遠心分離し、ジエチルエーテル層を試験管に移すことによってＢＡを抽出した。この操作も３回行った。ｎ−ヘキサン抽出液は乾固後、イソプロパノール０．４ｍｌ、１０％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００１．６ｍｌを添加してＮＳを溶解し、このうち０．２４ｍｌをサンプリングしてコレステロールＣ−テストワコーを用いて測定した。ジエチルエーテル抽出液は乾固後、メタノール２ｍｌを添加してＢＡを溶解し、このうち０．０２ｍｌをサンプリングして総胆汁酸−テストワコーを用いて、３α−ヒドロキシステロイド脱水素酵素を用いた酵素法により測定した。最終的に２日間に排出された総量で表した。

（７）統計処理
統計処理は、Ｏｎｅ−ｗａｙＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＶａｒｉａｎｃｅの後、Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒｍｕｌｔｉｐｌｅｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓｔｅｓｔで行った。

２．試験結果
固型癌の大きさを経時的に比較した結果を図３に示した。固型癌の形成は肝癌移植後５日目から見られ始めた。コントロール食群に比べて、ＥＮＬを摂取している群、特に１００ｐｐｍ摂取群では、肝癌移植後、７、８日目、更に、１８日目以降で、固型癌の成長が有意に抑制された。次に、表３に示されたとおり、がんを背部皮下に移植してから、２１日間で転移した腫瘍について比較したところ、癌転移したラットの割合はコントロール食群で１１頭中３頭の２７．３％であったが、ＥＮＬ食群では転移は観察されなかった。
更に、食下量、肝臓重量、過酸化脂質、そして肝臓中の脂質には、各群間における有意な差はなかったが、体重増加量においてはＥＮＬ１００ｐｐｍ摂取群で有意に増加し、また、固型癌重量においてはＥＮＬ摂取両群で、有意に低下した（表４）。

次に、図４に、血清中のコレステロール濃度をグラフとして表した。ＥＮＬ食群では、コントロール食群にくらべ、有意ではないものの、血清中のＨＤＬ−Ｃｈの上昇傾向がみられた。逆に、（ＶＬＤＬ＋ＬＤＬ）−ＣｈはＥＮＬ食群で、濃度依存的に有意に低下し、その結果、ＨＤＬ−Ｃｈと（ＶＬＤＬ＋ＬＤＬ）−Ｃｈの比であるＡＩ値も低下傾向を示した。次に、糞中の中性ステロール及び胆汁酸排泄を図５に示した。コントロール食群に比べ、ＥＮＬ食群では用量依存的に、中性ステロールと胆汁酸の排泄量が有意に増加した。

有効成分としてのエンテロラクトン（ＥＮＬ）と薬学的に許容される担体成分を所定量配合し、次いで、これを製剤することにより肝癌予防及び治療用組成物を製造した。

エンテロラクトン（ＥＮＬ）を有効成分とし、他に栄養成分を配合して肝癌増殖抑制作用を有する機能性食品を製造した。

以上詳述したように、本発明は、肝癌予防及び治療用組成物に係るものであり、本発明により、エンテロラクトンの肝癌に対する増殖抑制作用を利用した新しい肝癌予防及び治療用医薬組成物、及び機能性食品等を提供することができる。本発明により、肝癌予防及び治療用薬剤の他に、例えば、肝癌増殖抑制効果を発揮する、食品添加物、栄養補助食品、栄養剤、治療用食品、栄養補助食品、健康食品等の機能性食品素材、機能性食品を提供することができる。

図は、エンテロラクトンの細胞周期に対する影響を解析した結果を示す。図は、エンテロラクトンのアポトーシスに対する影響を解析した結果を示す。図は、固型癌の大きさを経時的に比較した結果を示す。図は、血清中のコレステロール濃度を示す。図は、糞中の中性ステロール及び胆汁酸排泄を示す。

Claims

エンテロラクトン（ＥＮＬ）又はその植物リグナン前駆体であって、肝癌の増殖抑制作用を有する化合物を有効成分として含むことを特徴とする肝癌予防及び治療用組成物。
エンテロラクトン（ＥＮＬ）又はその植物リグナン前駆体であって、肝癌の増殖抑制作用を有する化合物及び薬学的に許容される担体成分から成ることを特徴とする肝癌予防及び治療用薬剤。
エンテロラクトン（ＥＮＬ）又はその植物リグナン前駆体であって、肝癌の増殖抑制作用を有する化合物を機能性成分として食品素材に配合したことを特徴とする機能性食品素材。
エンテロラクトン（ＥＮＬ）又はその植物リグナン前駆体であって、肝癌の増殖抑制作用を有する化合物を機能性成分として含むことを特徴とする機能性食品。
前記食品が、栄養補助食品、栄養剤、治療用食品、栄養補助食品、又は健康食品であることを特徴とする請求項４に記載の機能性食品。