JPWO2008062570A1 - デオキシポリオール脱水素酵素産生能を有する微生物およびその利用 - Google Patents
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Abstract
課題：デオキシポリオール脱水素酵素産生能を有する微生物の提供。解決手段：Ｃ２およびＣ３の位置がリビトールまたはＬ−イディトールと同一構造のデオキシポリオール脱水素酵素産生能を有するエンテロバクターに属する微生物。エンテロバクター属菌体ＩＫ７（寄託番号ＮＩＴＥ Ｐ−２７１）である。Ｃ２およびＣ３の位置がリビトールまたはＬ−イディトールと同一構造のデオキシポリオール含有溶液に、本発明の微生物の培養によって得られたデオキシポリオール脱水素酵素を含む培養物またはデオキシポリオール脱水素酵素を作用させて、該デオキシポリオールを酸化して対応するデオキシケトースを生成させ、それを採取することを特徴とするデオキシケトースの製造方法。デオキシポリオールが１−デオキシ−Ｄ−アリトールであり、対応するデオキシケトースが１−デオキシ−Ｌ−プシコースである。あるいは、デオキシポリオールがＬ−ラムニトールであり、対応するデオキシケトースが１−デオキシ−Ｌ−フラクトースである。
Description
本発明は、デオキシポリオール脱水素酵素産生能を有する微生物およびその利用に関し、より詳細には、デオキシポリオール脱水素酵素産生能を有するエンテロバクターに属する微生物産生酵素を用いてデオキシポリオールを酸化して対応するデオキシケトースを生成させ、それを採取するデオキシケトースの製造方法、並びに採取されたデオキシポリオールに関する。
炭素数が６つの単糖（ヘキソース）は全部で３４種類あり、アルドースが１６種類、ケトースが８種類、糖アルコールが１０種類ある。一般に自然界に多量に存在するアルドースとしてはＤ- グルコース、Ｄ- ガラクトース、Ｄ- マンノース、Ｄ- リボース、Ｄ- キシロース、Ｌ- アラビノースの６種類あり、それ以外のアルドースは希少糖と定義される。ケトースとしては、Ｄ- フラクトースが存在しており、他のケトースは希少糖といえる。他のケトースとして、Ｄ- タガトース、Ｄ- プシコース、Ｄ- ソルボース、Ｌ- フラクトース、Ｌ- プシコース、Ｌ- タガトース、Ｌ- ソルボースが挙げられる。また糖アルコールは単糖を還元してできるが、自然界にはＤ- ソルビトールが比較的多いがそれ以外のものは量的には少ないので、これらも希少糖といえる。このような各種希少糖質の需要が起こりつつあり、これら糖質の安定な製造方法の確立が望まれている。
これら糖質の製造方法は、有機化学的手法または生化学的手段によっても行うことができる。生化学的手段として行われている、酵素による糖質変換方法に関し、特許文献１には、リビトールをＮＡＤ+共存下でＤ- リブロースに酸化し、Ｄ- リブロースをＮＡＤＨ共存下でリビトールに還元する該リビトール脱水素酵素とその製造方法、それを産生する微生物エンテロバクター アグロメランス（Enterobacter aglomerans）221e（ＦＥＲＭ ＢＰ−４７００）、並びに該酵素又は該酵素活性を有する微生物を用いるケトース又は糖アルコールの製造方法に関する発明が開示されている。
工業的に糖質を製造する上で、できるだけ少ない種類の酵素の利用により、できるだけ多種類の糖質を製造する方法の確立が強く望まれており、できるだけ多種類の糖質に作用する酵素、とりわけ、糖アルコール脱水素酵素に着目して、その酵素を産生する微生物を広く検索する必要がある。そこで、本発明は、多種類の糖質に作用する新規デオキシポリオール脱水素酵素を産生する微生物を提供することを目的とする。また、本発明の目的は、基質であるデオキシポリオールを含有する溶液に作用させ、対応するデオキシケトースを生成させることにより多種類の希少糖質を容易に製造することができることである。
より具体的には、本発明は、Ｌ- ラムニトールから１−デオキシ-Ｌ- フラクトースへの変換、または１- デオキシＤ- アリトールから１−デオキシ-Ｄ- プシコースへの変換に関わる新規デオキシポリオール脱水素酵素を産生する微生物、並びに該酵素又は該酵素活性を有する微生物を用いるデオキシケトースの製造方法、並びに新規デオキシケトースの提供を目的とする。
より具体的には、本発明は、Ｌ- ラムニトールから１−デオキシ-Ｌ- フラクトースへの変換、または１- デオキシＤ- アリトールから１−デオキシ-Ｄ- プシコースへの変換に関わる新規デオキシポリオール脱水素酵素を産生する微生物、並びに該酵素又は該酵素活性を有する微生物を用いるデオキシケトースの製造方法、並びに新規デオキシケトースの提供を目的とする。
本発明は、以下の（１）〜（５）のデオキシポリオール脱水素酵素産生能を有する微生物を要旨とする。
（１）Ｃ２およびＣ３の位置がリビトールまたはＬ- イディトールと同一構造のデオキシポリオール脱水素酵素産生能を有するエンテロバクターに属する微生物。
（２）エンテロバクター アエロジェネスに属する（１）の微生物。
（３）エンテロバクター属菌体ＩＫ７（寄託番号NITE BP-271）である（１）または（２）の微生物。
（４）前記デオキシポリオールが１- デオキシＤ- アリトールである（１）、（２）または（３）の微生物。
（５）前記デオキシポリオールがＬ- ラムニトールである（１）、（２）または（３）の微生物。
（１）Ｃ２およびＣ３の位置がリビトールまたはＬ- イディトールと同一構造のデオキシポリオール脱水素酵素産生能を有するエンテロバクターに属する微生物。
（２）エンテロバクター アエロジェネスに属する（１）の微生物。
（３）エンテロバクター属菌体ＩＫ７（寄託番号NITE BP-271）である（１）または（２）の微生物。
（４）前記デオキシポリオールが１- デオキシＤ- アリトールである（１）、（２）または（３）の微生物。
（５）前記デオキシポリオールがＬ- ラムニトールである（１）、（２）または（３）の微生物。
本発明は、以下の（６）〜（１０）のデオキシケトースの製造方法を要旨とする。
（６）Ｃ２およびＣ３の位置がリビトールまたはＬ- イディトールと同一構造のデオキシポリオール含有溶液に、請求項１ないし４のいずれかの微生物の培養によって得られたデオキシポリオール脱水素酵素を含む培養物または、デオキシポリオール脱水素酵素を作用させて、該デオキシポリオールを酸化して対応するデオキシケトースを生成させ、それを採取することを特徴とするデオキシケトースの製造方法。
（７）固定化デオキシポリオール脱水素酵素を作用させる（６）のデオキシケトースの製造方法。
（８）前記のデオキシポリオールが１−デオキシＤ−アリトールであり、対応するデオキシケトースが１−デオキシ-Ｄ-プシコースである（６）または（７）のデオキシケトースの製造方法。
（９）前記のデオキシポリオールがＬ- ラムニトールであり、対応するデオキシケトースが１-デオキシ-Ｌ-フラクトースである（６）または（７）のデオキシケトースの製造方法。
（１０）Ｌ- ラムニトール含有溶液がＬ- ラムノースを還元して得られるＬ- ラムニトールを含む反応液である（９）のデオキシケトースの製造方法。
（６）Ｃ２およびＣ３の位置がリビトールまたはＬ- イディトールと同一構造のデオキシポリオール含有溶液に、請求項１ないし４のいずれかの微生物の培養によって得られたデオキシポリオール脱水素酵素を含む培養物または、デオキシポリオール脱水素酵素を作用させて、該デオキシポリオールを酸化して対応するデオキシケトースを生成させ、それを採取することを特徴とするデオキシケトースの製造方法。
（７）固定化デオキシポリオール脱水素酵素を作用させる（６）のデオキシケトースの製造方法。
（８）前記のデオキシポリオールが１−デオキシＤ−アリトールであり、対応するデオキシケトースが１−デオキシ-Ｄ-プシコースである（６）または（７）のデオキシケトースの製造方法。
（９）前記のデオキシポリオールがＬ- ラムニトールであり、対応するデオキシケトースが１-デオキシ-Ｌ-フラクトースである（６）または（７）のデオキシケトースの製造方法。
（１０）Ｌ- ラムニトール含有溶液がＬ- ラムノースを還元して得られるＬ- ラムニトールを含む反応液である（９）のデオキシケトースの製造方法。
本発明は、以下の（１１）および（１２）の新規化合物を要旨とする。
（１１）１-デオキシ-Ｌ- フラクトース。
（１２）Ｌ- ラムニトール含有溶液に、エンテロバクター属菌体ＩＫ７（寄託番号NITE BP-271）の培養によって得られたデオキシポリオール脱水素酵素能を持つ菌体を作用させて、Ｌ- ラムニトール酸化して生成させ採取したものである（１１）の１-デオキシ-Ｌ- フラクトース。
（１１）１-デオキシ-Ｌ- フラクトース。
（１２）Ｌ- ラムニトール含有溶液に、エンテロバクター属菌体ＩＫ７（寄託番号NITE BP-271）の培養によって得られたデオキシポリオール脱水素酵素能を持つ菌体を作用させて、Ｌ- ラムニトール酸化して生成させ採取したものである（１１）の１-デオキシ-Ｌ- フラクトース。
本発明により、多種類の糖質に作用する新規デオキシポリオール脱水素酵素を産生する微生物を提供することができる。また、本発明により、基質であるデオキシポリオールを含有する溶液に作用させ、対応するデオキシケトースを生成させることにより多種類の希少糖質を容易に製造することができる。より具体的には、本発明により、Ｌ- ラムニトールから１−デオキシ-Ｌ- フラクトースへの変換に関わる新規デオキシポリオール脱水素酵素を産生する微生物、並びに該酵素又は該酵素活性を有する微生物を用いるデオキシケトースの製造方法、並びに新規デオキシケトース（１-デオキシ-Ｌ- フラクトースなど）を提供することができる。
本発明者等は上記課題を解決するために、できるだけ多種類の糖質に作用する酵素、とりわけ、糖アルコール脱水素酵素に着目して、その酵素を産生する微生物を広く検索した。その結果、香川県木田郡三木町の河川敷土壌から分離したエンテロバクター アエロジェネス IK7株（Enterobacter aerogenes IK7）はエンテロバクター（Enterobacter）属に属する新規な微生物で、多種類のポリオールに作用すると同時に、デオキシアルコール（デオキシポリオール）にも作用して酸化することで、デオキシケトースを含む多くのケトースを生産することを見出した。すなわち、本酸化反応は工業的にこれまで容易に生産できなかった各種ケトースを生産する上で極めて有利であることを見出し、本発明を完成した。
本菌株から抽出された１６ＳｒＲＮＡを配列決定し、他の微生物から得た既知の複数の１６ＳｒＲＮＡと比較した。このデータはEnterobacter aerogenesからの配列に対し９９％の同一性を示した。このエビデンスならびに表１に記載のその他の生理学的特徴に基づき、本菌株がEnterobacter aerogenesに該当するものであるとの結論を得た。なおＤＮＡ断片の塩基配列の決定は、公知の方法、例えば、サンガー法(Molecular Cloning、第２巻、１３．３頁、１９８９年）、ＰＣＲをベースにした方法等によって行うことができる。
通常は、Beckman Coulter社のGenomeLab DTCS Quick Start Kit（蛍光ダイデオキシタミネーターを含有するシークエンシングキット）等を使って反応を行い、Beckman Coulter社の自動シークエンサー（CEQ 8000等）で塩基配列を決定する。
通常は、Beckman Coulter社のGenomeLab DTCS Quick Start Kit（蛍光ダイデオキシタミネーターを含有するシークエンシングキット）等を使って反応を行い、Beckman Coulter社の自動シークエンサー（CEQ 8000等）で塩基配列を決定する。
［培地］
（培養のｐＨは例えば５〜９であり、好ましくは６〜８．５である。培養は振とうあるいは通気撹拌などの好気条件下で行う。）
１．TSB（トリプティック ソイ ブロース）培地 １〜２％
ＴＳＢ：Becton, Dickinson Company製
２．肉エキス培地
（肉エキス（和光純薬工業(株)製）０．５％、ポリペプトン（和光純薬工業(株)製）０．５％、塩化ナトリウム０．５％、ｐＨ７．０）
３．酵母エキス培地
（酵母エキス（和光純薬工業(株)製）０．５％、ポリペプトン０．５％（和光純薬工業(株)製）、塩化ナトリウム０．５％、ｐＨ７．０）
寒天培地の場合は寒天を終濃度2％添加する。
（培養のｐＨは例えば５〜９であり、好ましくは６〜８．５である。培養は振とうあるいは通気撹拌などの好気条件下で行う。）
１．TSB（トリプティック ソイ ブロース）培地 １〜２％
ＴＳＢ：Becton, Dickinson Company製
２．肉エキス培地
（肉エキス（和光純薬工業(株)製）０．５％、ポリペプトン（和光純薬工業(株)製）０．５％、塩化ナトリウム０．５％、ｐＨ７．０）
３．酵母エキス培地
（酵母エキス（和光純薬工業(株)製）０．５％、ポリペプトン０．５％（和光純薬工業(株)製）、塩化ナトリウム０．５％、ｐＨ７．０）
寒天培地の場合は寒天を終濃度2％添加する。
本発明者らが単離したＩＫ７株は、Enterobacter属に属する新規微生物であり、日本国独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター 日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８に２００６年１０月１９日に国内寄託し、２００６年１１月９日に受託番号（ＮＩＴＥ Ｐ−２７１）として受託証が発行されている。上記菌株は、香川県木田郡三木町を流れる河川土壌から単離されたものである。このたび国際出願をするに際し、原寄託（ＮＩＴＥ Ｐ−２７１）を上記の原寄託をした国際寄託当局に移管請求をし、２００７年３月２２日に該国際寄託当局より原寄託についての受託証（ＮＩＴＥ ＢＰ−２７１）が発行された。
本発明では、上記菌株のみならず、エンテロバクター属に属し、糖アルコール脱水素酵素産生能を有する他の菌株やこれらの変異株なども適宜使用することができる。
本発明の微生物の培養に用いる培地は微生物が生育でき、本発明の糖アルコール脱水素能を産生するものであればよく、合成培地及び天然培地のいずれでもよい。炭素源としては、例えば、アルドース、ケトース、糖アルコール、グリセロールなどから選ばれる１種又は２種以上が適宜選ばれる。窒素源としては、例えば、アンモニウム塩、硝酸塩などの無機窒素化合物、及び、例えば、尿素、コーン・スティープ・リカー、カゼイン、ペプトン、酵母エキス、肉エキスなどの有機窒素含有物が用いられる。また、無機成分としては、例えば、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩などが適宜用いられる。
培養条件は、微生物が生育し、本発明の酵素を産生する温度が適しており、通常、約４〜４０℃、望ましくは、約２０〜３７℃、ｐＨ約５〜９、望ましくは、約６〜８．５から選ばれる条件で好気的に行われる。
本発明の微生物は、Ｃ２およびＣ３の位置がリビトールまたはＬ- イディトールと同一構造のデオキシポリオールを脱水素する酵素活性の産生能を有するエンテロバクターに属する微生物である。エンテロバクター アエロジェネスに属する微生物、より具体的にはエンテロバクター属菌体ＩＫ７（寄託番号NITE BP-271）が好ましいものとして例示される。本発明の微生物は、１−または６−デオキシヘキシトールの２の位置を脱水素して１−または６−デオキシヘキシトールを生産するポリオール脱水素酵素活性を産生する。
本発明のエンテロバクターに属する微生物が産生する糖アルコール脱水素活性は、基質として、アリトール、リビトール、Ｌ- ラムニトール、Ｌ- ソルビトール、Ｌ- マンニトールをはじめ、第２位の炭素に結合するアルコール基（Ｈ−Ｃ−ＯＨ）がＤ- グリセロ配位を有する多種の糖アルコールを酸化することで、ケト基（Ｃ＝Ｏ）を有している多種のケトースを生産することに利用できる。従って、１種の微生物を用いて多種の糖質を産生できることとなり、工業的に極めて有利である。
例えば、基質として、Ｌ- ラムニトールを酸化することで１-デオキシ-Ｌ- フラクトースを生産でき、これは新規化合物である。また、Ｌ- スレイトール、Ｄ- スレイトールを同様に酸化することでＬ- エリスルロース、Ｄ- エリスルロースを生産することをHPLCを用いて確認した。これらは炭素数４のケトースの新たな製造方法である（表２参照）。
例えば、基質として、Ｌ- ラムニトールを酸化することで１-デオキシ-Ｌ- フラクトースを生産でき、これは新規化合物である。また、Ｌ- スレイトール、Ｄ- スレイトールを同様に酸化することでＬ- エリスルロース、Ｄ- エリスルロースを生産することをHPLCを用いて確認した。これらは炭素数４のケトースの新たな製造方法である（表２参照）。
該酵素活性を有する微生物では、糖アルコールからケトースへの反応には、好気的条件、例えば、酸素、空気などを通気撹拌すればよく、またケトースから糖アルコールへの反応には、嫌気的条件、例えば、窒素、不活性ガスなどの環境に保てばよい。
本発明では、デオキシポリオール含有溶液に、本発明の微生物の培養によって得られたデオキシポリオール脱水素活性を有する微生物を作用させて、該デオキシポリオールを酸化して対応するデオキシケトースを生成させる。
また、微生物をトルエン処理したり、公知の方法で固定化したりして用いることも随意である。反応温度は、酵素が失活しない温度、例えば、４〜５０℃、望ましくは１０〜４０℃で反応すればよい。反応時間は、酵素反応の進行具合により適宜選択すればよく、通常、基質固形物グラム当たり約０．１〜１００単位の酵素使用量で、０．１〜１００時間程度である。
このようにして得られる反応液には、通常、糖アルコールとケトースの両者を含有している。反応液は、常法により、濾過、遠心分離などして不溶物を除去した後、活性炭で脱色、Ｈ型、ＯＨ型イオン交換樹脂で脱塩し、濃縮し、シラップ状製品にすることも、乾燥して粉末状製品にすることも、更には、結晶性糖質を結晶製品に仕上げることも随意である。必要ならば、更に高度な精製をすることも随意である。例えば、イオン交換カラムクロマトグラフィーによる分画、活性炭カラムクロマトグラフィーによる分画、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる分画、アルカリ処理によるケトースの分解除去などの方法で高純度の糖質を得ることも容易である。このようにして得られる各種糖質は、試薬はもとより、甘味料、品質改良剤などとして食品工業に、原材料、中間体などとして医薬品工業、化学工業など多くの用途に有利に利用できる。
本発明の詳細を実施例で説明する。本発明はこれらの実施例によってなんら限定されるものではない。
［糖アルコール脱水素能を有する微生物の製造］
炭素源として、糖アルコール、グリセロールなどを用いて液体培地を調製（最適な培地は２％TSBをベースとし炭素源として１％Ｄ- マンニトールを含有）し、５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌずつ入れ、加熱滅菌（１２１℃、１５分）後、これにエンテロバクター エアロジェネスIK7（寄託番号NITE BP-271）を植菌し、３７℃、２４時間、１２０ｒｐｍで振とう培養して糖アルコール脱水素酵素を多く含む微生物菌体を製造した。
炭素源として、糖アルコール、グリセロールなどを用いて液体培地を調製（最適な培地は２％TSBをベースとし炭素源として１％Ｄ- マンニトールを含有）し、５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌずつ入れ、加熱滅菌（１２１℃、１５分）後、これにエンテロバクター エアロジェネスIK7（寄託番号NITE BP-271）を植菌し、３７℃、２４時間、１２０ｒｐｍで振とう培養して糖アルコール脱水素酵素を多く含む微生物菌体を製造した。
［基質特異性］
実施例１の方法で調製した糖アルコール脱水素酵素活性を有する微生物を用いて各種糖アルコールを基質にケトースへの酸化活性を測定した。
各種の糖アルコールを１％含有する５０ｍMグリシンNaOH緩衝液（ｐH１１）に菌体（濃度 ６００nmの吸光度として３０相当）で、３７℃で１−２４時間振とうした。表２は、転換に用いた基質、生産物、反応時間およびその転換率をまとめて示した。これらの基質から生産されるケトースをイオン交換カラムクロマトグラフィーによって単離し、高速液体クロマトグラフィーによって確認した結果を表２にまとめた。
個々のポリオールによって、転換が全て進むもの、一部が進むものなどがあるため一概に全体の相対的な活性を明確な比較としては示すことはできない。しかし、この結果が示すように、アリトールは約２時間で１００％がＤ- プシコースへと転換され、Ｌ- ラムニトールは約１２時間、そしてＬ- タリトール、Ｌ- マンニトールは、２４時間で１００それぞれ、１−デオキシＬ- フラクトースおよびＬ- ラムニュロース、Ｌ- タガトース、Ｌ- フラクトースとＤ- ソルボースの混合物、Ｌ- フラクトースへ１００％の転換率で酸化される。その他のポリオールも表２に示したように、リビトールからＤ- リブロースへ、また、Ｌ- スレイトールからＬ- エルスルロースなどにも酸化できる能力を持っている。
実施例１の方法で調製した糖アルコール脱水素酵素活性を有する微生物を用いて各種糖アルコールを基質にケトースへの酸化活性を測定した。
各種の糖アルコールを１％含有する５０ｍMグリシンNaOH緩衝液（ｐH１１）に菌体（濃度 ６００nmの吸光度として３０相当）で、３７℃で１−２４時間振とうした。表２は、転換に用いた基質、生産物、反応時間およびその転換率をまとめて示した。これらの基質から生産されるケトースをイオン交換カラムクロマトグラフィーによって単離し、高速液体クロマトグラフィーによって確認した結果を表２にまとめた。
個々のポリオールによって、転換が全て進むもの、一部が進むものなどがあるため一概に全体の相対的な活性を明確な比較としては示すことはできない。しかし、この結果が示すように、アリトールは約２時間で１００％がＤ- プシコースへと転換され、Ｌ- ラムニトールは約１２時間、そしてＬ- タリトール、Ｌ- マンニトールは、２４時間で１００それぞれ、１−デオキシＬ- フラクトースおよびＬ- ラムニュロース、Ｌ- タガトース、Ｌ- フラクトースとＤ- ソルボースの混合物、Ｌ- フラクトースへ１００％の転換率で酸化される。その他のポリオールも表２に示したように、リビトールからＤ- リブロースへ、また、Ｌ- スレイトールからＬ- エルスルロースなどにも酸化できる能力を持っている。
表２の結果からも明らかなように、アリトールに対して最も高い活性を示した。これらの糖アルコールに作用する反応様式について検討した結果、それらの反応様式は共通しており、その一例としてリビトールの場合を示すと化１のとおりである。
化１から明らかなように、本発明の菌体は各種ポリオールの第２位の炭素に結合するアルコール基（Ｈ−Ｃ−ＯＨ）がＤ- グリセロの配位を持つ糖アルコールに活性が強い。第２位の炭素に結合するアルコール基がＬ- グリセロの配位を持つＤ- イディトール、Ｄ- マンニトール及びＤ- タリトールには活性を示さない。
［糖アルコールからケトースの製造］
実施例１の方法で調製した糖アルコール脱水素酵素活性を有する微生物を用いてＬ- ラムニトールから１-デオキシ-Ｌ- フラクトースを製造した。
実施例１の方法で調製した糖アルコール脱水素酵素活性を有する微生物を用いてＬ- ラムニトールから１-デオキシ-Ｌ- フラクトースを製造した。
培養終了後、遠心分離し、回収した菌体を適当量の一次交換水で2回洗浄したのちに５０mM Tris-HCl (ｐＨ９．０)緩衝液で適当量に懸濁した。上記培養量から得られる菌体量から、適切な反応系は以下のようである。
反応条件（洗浄菌体反応）Ｌ字管（容量３０ｍｌ）を使用吸光度６００ｎｍの値が終濃度５０になるように菌体を上記緩衝液と糖液とに懸濁させることが望ましい。菌体の終濃度は０．１〜１００程度までは可能糖濃度である。Ｌ- ラムニトールの濃度は、０．１〜２０％まで転換できるが、１-デオキシＬ- フラクトースの転換率が最も高く、最適な濃度は１０％である。反応温度は３７℃が最適であるが、４〜４０℃まで可能である。酸化反応時に振とうする必要はないが、５０ｒｐｍ程度で振とうし好気的条件に保つことが望ましい。生成物の確認は得られる反応液を遠心分離して不溶物を除去し、上清を高速液体クロマトグラフィーで分析した。
反応条件（洗浄菌体反応）Ｌ字管（容量３０ｍｌ）を使用吸光度６００ｎｍの値が終濃度５０になるように菌体を上記緩衝液と糖液とに懸濁させることが望ましい。菌体の終濃度は０．１〜１００程度までは可能糖濃度である。Ｌ- ラムニトールの濃度は、０．１〜２０％まで転換できるが、１-デオキシＬ- フラクトースの転換率が最も高く、最適な濃度は１０％である。反応温度は３７℃が最適であるが、４〜４０℃まで可能である。酸化反応時に振とうする必要はないが、５０ｒｐｍ程度で振とうし好気的条件に保つことが望ましい。生成物の確認は得られる反応液を遠心分離して不溶物を除去し、上清を高速液体クロマトグラフィーで分析した。
［結果］
１８時間で最高の１-デオキシ-Ｌ- フラクトースが得られ、Ｌ- ラムニトールの約８０％が１-デオキシ-Ｌ- フラクトースが得られる。図１に、基質であるＬ- ラムニトールのHPLCによる分析結果を示す。リテンションタイム約２２分に見られるのがＬ−ラムニトールである。図２に、エンテロバクター属菌体ＩＫ７（寄託番号NITE P-271）を基質Ｌ- ラムニトールに作用させた後、生成した１-デオキシ-Ｌ- フラクトースのHPLC分析結果を示す。図３に精製した1-デオキシＬ- フラクトースの１３C NMRの分析結果を示す。
１８時間で最高の１-デオキシ-Ｌ- フラクトースが得られ、Ｌ- ラムニトールの約８０％が１-デオキシ-Ｌ- フラクトースが得られる。図１に、基質であるＬ- ラムニトールのHPLCによる分析結果を示す。リテンションタイム約２２分に見られるのがＬ−ラムニトールである。図２に、エンテロバクター属菌体ＩＫ７（寄託番号NITE P-271）を基質Ｌ- ラムニトールに作用させた後、生成した１-デオキシ-Ｌ- フラクトースのHPLC分析結果を示す。図３に精製した1-デオキシＬ- フラクトースの１３C NMRの分析結果を示す。
［1-デオキシＬ−マンニトールの酸化による1-デオキシＬ−フラクトースの生産］
エンテロバクター・エアロジェネスIK7（寄託番号NITE BP-271）を用いる微生物反応によって、６−デオキシＬ−マンニトールを酸化し１-デオキシＬ−フラクトースを生産した。
［Ｌ- ラムノース（６- デオキシ Ｌ- マンノース）の還元反応による６- デオキシＬ- マンニトールの製造］
６- デオキシＬ- マンノースを化学反応によって、６デオキシＬ- マンニトールを生産した。
［ラネーニッケルを触媒とした還元反応］
５０％ラネーニッケル（和光純薬工業（株）製）１０ｇに対し、２０％ＮａＯＨ水溶液を１００ｇ添加した。添加後９０℃、１時間の加温を行った。気泡の発生が止まったことを確認した後、デカンテーションにより蒸留水で触媒を洗浄した。洗浄は、洗浄液がｐＨ９．２になるまで行った。
撹拌器、温度計を備えた１Ｌガラスオートクレーブに、１００ｇの６- デオキシ Ｌ- マンノースを含む水溶液３００ｇに上記の方法により得られたラネーニッケル２４ｇを加えたものを添加した後、さらに水を加えて全反応液量を６００ｇに調整した。その際、反応液のｐＨを７に調整するため、炭酸カルシウムを添加した。５０℃に温度を、１２ｋｇ／ｃｍ２（ゲージ圧）に水素圧を、７００ｒｐｍに攪拌速度を保ち反応を行った。反応液の分析はＨＰＬＣを用いて行った。その結果、８時間の反応で６- デオキシ Ｌ- マンノースは１％まで減少がみられ、６- デオキシ Ｌ- マンニトールを生産することができた。
エンテロバクター・エアロジェネスIK7（寄託番号NITE BP-271）を用いる微生物反応によって、６−デオキシＬ−マンニトールを酸化し１-デオキシＬ−フラクトースを生産した。
［Ｌ- ラムノース（６- デオキシ Ｌ- マンノース）の還元反応による６- デオキシＬ- マンニトールの製造］
６- デオキシＬ- マンノースを化学反応によって、６デオキシＬ- マンニトールを生産した。
［ラネーニッケルを触媒とした還元反応］
５０％ラネーニッケル（和光純薬工業（株）製）１０ｇに対し、２０％ＮａＯＨ水溶液を１００ｇ添加した。添加後９０℃、１時間の加温を行った。気泡の発生が止まったことを確認した後、デカンテーションにより蒸留水で触媒を洗浄した。洗浄は、洗浄液がｐＨ９．２になるまで行った。
撹拌器、温度計を備えた１Ｌガラスオートクレーブに、１００ｇの６- デオキシ Ｌ- マンノースを含む水溶液３００ｇに上記の方法により得られたラネーニッケル２４ｇを加えたものを添加した後、さらに水を加えて全反応液量を６００ｇに調整した。その際、反応液のｐＨを７に調整するため、炭酸カルシウムを添加した。５０℃に温度を、１２ｋｇ／ｃｍ２（ゲージ圧）に水素圧を、７００ｒｐｍに攪拌速度を保ち反応を行った。反応液の分析はＨＰＬＣを用いて行った。その結果、８時間の反応で６- デオキシ Ｌ- マンノースは１％まで減少がみられ、６- デオキシ Ｌ- マンニトールを生産することができた。
［ 糖アルコール脱水素酵素を含む菌体の製造］
滅菌した液体培地（２％TSB（trypsin soy broth：Becton Dickinson company）をベースとし炭素源として１％Ｄ−マンニトール）にエンテロバクター・アエロジェネスIK7（寄託番号NITE BP-271）を植菌し、３７℃、２４時間、１２０ｒｐｍで振とう培養して糖アルコール脱水素酵素を多く含む微生物菌体を製造した。
培養終了後、遠心分離し、回収した菌体を適当量の一次交換水で2回洗浄したのちに５０mM Tris-HCl (ｐＨ９．０)緩衝液で適当量に懸濁した。（これを糖アルコール脱水素酵素を含む菌体溶液）とした。
滅菌した液体培地（２％TSB（trypsin soy broth：Becton Dickinson company）をベースとし炭素源として１％Ｄ−マンニトール）にエンテロバクター・アエロジェネスIK7（寄託番号NITE BP-271）を植菌し、３７℃、２４時間、１２０ｒｐｍで振とう培養して糖アルコール脱水素酵素を多く含む微生物菌体を製造した。
培養終了後、遠心分離し、回収した菌体を適当量の一次交換水で2回洗浄したのちに５０mM Tris-HCl (ｐＨ９．０)緩衝液で適当量に懸濁した。（これを糖アルコール脱水素酵素を含む菌体溶液）とした。
調製した糖アルコール脱水素酵素活性を有する菌体溶液を用いて1-デオキシＬ−マンニトールから１-デオキシ-Ｌ−フラクトースを製造した。
Ｌ字管（容量３０ｍｌ）に５０mM Tris-HCl (ｐＨ９．０)緩衝液と糖アルコール脱水素酵素を含む菌体溶液（最終菌体濃度は、吸光度６００ｎｍの値がＯＤ値で２０）と1-デオキシＬ−マンニトール（最終濃度１０％）を吸光度６００ｎｍの値がＯＤ値で５０になるように調整し、３７℃に保温して、好気条件になるように、軽く振とうした。生成物の確認は得られる反応液を遠心分離して不溶物を除去し、上清を高速液体クロマトグラフィーで分析した。
１８時間で最高の１-デオキシ-Ｌ−フラクトースが得られ、1-デオキシＬ−マンニトールの約８０％の１-デオキシ-Ｌ−フラクトースが得られた。
Ｌ字管（容量３０ｍｌ）に５０mM Tris-HCl (ｐＨ９．０)緩衝液と糖アルコール脱水素酵素を含む菌体溶液（最終菌体濃度は、吸光度６００ｎｍの値がＯＤ値で２０）と1-デオキシＬ−マンニトール（最終濃度１０％）を吸光度６００ｎｍの値がＯＤ値で５０になるように調整し、３７℃に保温して、好気条件になるように、軽く振とうした。生成物の確認は得られる反応液を遠心分離して不溶物を除去し、上清を高速液体クロマトグラフィーで分析した。
１８時間で最高の１-デオキシ-Ｌ−フラクトースが得られ、1-デオキシＬ−マンニトールの約８０％の１-デオキシ-Ｌ−フラクトースが得られた。
上記から明らかなように、本発明の菌体ＩＫ７（寄託番号NITE BP-271）は、多種の糖質変換に有利に利用される。希少糖質の工業生産に有利に利用することができる。本発明によって、従来極めて入手困難であった多種類の希少糖質を容易に提供できることとなり、それが与える影響は、食品、化粧品、医薬品、化学工業など多方面に及ぶことが期待され、その工業的意義は極めて大きい。
Claims (12)
- Ｃ２およびＣ３の位置がリビトールまたはＬ- イディトールと同一構造のデオキシポリオール脱水素酵素産生能を有するエンテロバクターに属する微生物。
- エンテロバクター アエロジェネスに属する請求項１の微生物。
- エンテロバクター属菌体ＩＫ７（寄託番号NITE BP-271）である請求項１または２の微生物。
- 前記デオキシポリオールが１- デオキシＤ- アリトールである請求項１、２または３の微生物。
- 前記デオキシポリオールがＬ- ラムニトールである請求項１、２または３の微生物。
- Ｃ２およびＣ３の位置がリビトールまたはＬ- イディトールと同一構造のデオキシポリオール含有溶液に、請求項１ないし４のいずれかの微生物の培養によって得られたデオキシポリオール脱水素酵素を含む培養物または、デオキシポリオール脱水素酵素を作用させて、該デオキシポリオールを酸化して対応するデオキシケトースを生成させ、それを採取することを特徴とするデオキシケトースの製造方法。
- 固定化デオキシポリオール脱水素酵素を作用させる請求項６のデオキシケトースの製造方法。
- 前記のデオキシポリオールが１- デオキシＤ- アリトールであり、対応するデオキシケトースが１- デオキシＤ- プシコースである請求項６または７のデオキシケトースの製造方法。
- 前記のデオキシポリオールがＬ- ラムニトールであり、対応するデオキシケトースが１-デオキシ-Ｌ- フラクトースである請求項６または７のデオキシケトースの製造方法。
- Ｌ- ラムニトール含有溶液がＬ- ラムノースを還元して得られるＬ- ラムニトールを含む反応液である請求項９のデオキシケトースの製造方法。
- １-デオキシ-Ｌ- フラクトース。
- Ｌ- ラムニトール含有溶液に、エンテロバクター属菌体ＩＫ７（寄託番号NITE BP-271）の培養によって得られたデオキシポリオール脱水素酵素を有する菌体を作用させて、Ｌ- ラムニトールを酸化して生成させ採取したものである請求項１１の１-デオキシ-Ｌ- フラクトース。
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