KR20090083939A

KR20090083939A - 데옥시폴리올 탈수소효소 생산능을 가진 미생물 및 그 이용 방법

Info

Publication number: KR20090083939A
Application number: KR1020097012896A
Authority: KR
Inventors: 겐 이즈모리; 겐지 모리모토; 고로 다카타; 마사아키 도쿠다; 요시오 쓰지사카; 게이 다케시타; 게이지 쓰사키; 가즈히로 오쿠마
Original assignee: 고쿠리츠다이가쿠호우징 카가와다이가쿠; 마쓰다니가가꾸고오교가부시끼가이샤; 고도카이샤 기쇼토 세이산 기쥬츠 겐큐쇼
Priority date: 2006-11-20
Filing date: 2007-03-27
Publication date: 2009-08-04
Also published as: KR101348327B1; EP2096164A1; EP2096164B1; EP2096164A4; US20100167350A1; WO2008062570A1; JPWO2008062570A1; US8530222B2; JP5344466B2

Abstract

본 발명은 데옥시폴리올 탈수소효소 생산능을 가진 미생물을 제공한다. 해결 수단: C2 및 C3 위치에 리비톨 또는 L-이디톨과 동일한 구조를 포함하는 데옥시폴리올 탈수소효소 생산능을 가진 엔테로박터 속의 미생물인 엔테로박터 sp. IK7(기탁번호 NITE BP-271). C2 및 C3의 위치에 리비톨 또는 L-이디톨과 동일한 구조를 포함하는 데옥시폴리올 함유 용액에, 본 발명의 미생물의 배양에 의해 수득되는 데옥시폴리올 탈수소효소를 포함하는 배양물 또는 데옥시폴리올 탈수소효소를 작용시키고, 상기 데옥시폴리올의 산화에 의해 대응되는 데옥시케토스를 생성하고, 이를 채취하는 것을 특징으로 하는 데옥시케토스의 제조 방법. 데옥시폴리올은1-데옥시-D-알리톨이며, 대응되는 데옥시케토스는 1-데옥시-L-프시코스이다. 또는, 데옥시폴리올은 L-람니톨이며, 대응되는 데옥시케토스는 1-데옥시-L-프럭토스이다.

Description

데옥시폴리올 탈수소효소 생산능을 가진 미생물 및 그 이용 방법{MICROORGANISM CAPABLE OF PRODUCING DEOXY POLYOL DEHYDROGENASE AND UTILIZATION OF THE SAME}

본 발명은 데옥시폴리올 탈수소효소 생산능을 가진 미생물 및 그 이용 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 데옥시폴리올 탈수소효소 생산능을 가진 엔테로박터 속의 미생물에 의해 생산되는 효소를 사용하여 데옥시폴리올을 산화하여 대응되는 데옥시케토스를 생성시키고, 이를 채취하는 것을 포함하는 데옥시케토스의 제조 방법, 및 채취된 데옥시폴리올에 관한 것이다.

탄소수가 6개인 단당(헥소스)은 전부 34가지의 종류가 있으며, 이중 알도스가 16 종류, 케토스가 8 종류, 당 알코올이 10 종류이다. 일반적으로, 자연계에 다량으로 존재하는 알도스는 D-글루코스, D-갈락토스, D-만노스, D-리보스, D-크실로스, L-아라비노스로 6 종류이며, 그 이외의 알도스는 희소당으로 정의된다. 케토스는 D-프럭토스가 존재하고 있으며, 다른 케토스는 희소당이라고 할 수 있다. 그외 케토스로서는 D-타가토스(tagatose), D-프시코스(psicose), D-소르보스(sorbose), L-프럭토스, L-프시코스, L-타가토스, L-소르보스를 들 수 있다. 또한, 당 알코올은 단당의 환원에 의해 생성되는데, 자연계에서는 D-소르비톨이 비교 적 많은 편이며, 그 이외의 것은 양적으로는 적기 때문에, 이것들도 희소당이라고 할 수 있다. 이러한 각종 희소 당질에 대해 수요가 생기고 있어, 이들 당질의 안정적인 제조 방법의 확립이 요구되고 있다.

이들 당질의 제조 방법은 유기 화학적 방법 또는 생화학적 수단에 의해서도 행할 수 있다. 생화학적 수단으로서 행해지고 있는, 효소에 의한 당질 변환 방법에 관한 것으로서, 특허 문헌 1에는, 리비톨을 NAD+ 공존하에 D-리불로스로 산화하고, D-리불로스를 NADH 공존하에 리비톨로 환원하는 상기 리비톨 탈수소효소와 그 제조 방법, 이를 생산하는 미생물 엔테로박터 아글로메란스(Enterobacter aglomerans) 221e(FERMBP-4700), 및 상기 효소 또는 상기 효소 활성을 가진 미생물을 사용한 케토스 또는 당 알코올의 제조 방법에 관한 발명이 개시되어 있다.

특허 문헌 1: 일본 특허출원 공개 1996-56659호 공보

발명의 공개

발명이 해결하려고 하는 과제

공업적으로 당질을 제조함에 있어서, 가능한 적은 종류의 효소를 이용하여, 가능한 많은 종류의 당질을 제조하는 방법을 확립할 필요성이 강하게 요구되고 있어, 가능한 많은 종류의 당질에 작용하는 효소, 특히, 당 알코올 탈수소효소에 주목하여, 이 효소를 생산하는 미생물을 광범위하게 검색할 필요가 있었다. 그래서, 본 발명은, 많은 종류의 당질에 작용하는 새로운 데옥시폴리올 탈수소효소를 생산하는 미생물을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 본 발명의 목적은, 기질인 데옥시폴리올이 포함된 용액에 작용시켜, 대응되는 데옥시케토스로 생성시킴으로써 많은 종류의 희소 당질을 용이하게 제조하고자 하는 것이다.

보다 구체적으로, 본 발명은, L-람니톨의 1-데옥시-L-프럭토스로의 변환, 또는 1-데옥시 D-알리톨의 1-데옥시-D-프시코스로의 변환에 관여하는 신규한 데옥시폴리올 탈수소효소를 생산하는 미생물, 상기 효소 또는 상기 효소 활성을 가진 미생물을 사용하는 데옥시케토스의 제조 방법, 및 신규한 데옥시케토스를 제공하는 것을 목적으로 한다.

과제를 해결하기 위한 수단

본 발명은, 이하의 (1) - (5)의 데옥시폴리올 탈수소효소 생산능을 가진 미생물을 요지로 한다.

(1) C2 및 C3 위치에 리비톨 또는 L-이디톨과 동일한 구조를 포함하는 데옥시폴리올 탈수소효소 생산능을 가진 엔테로박터 속 미생물.

(2) 엔테로박터 에어로게네스(Enterobacter aerogenes) 속인, (1)의 미생물.

(3) 엔테로박터 속 균체 IK7(기탁번호 NITE BP-271)인, (1) 또는 (2)의 미생물.

(4) 상기 데옥시폴리올이 1-데옥시 D-알리톨인, (1), (2) 또는 (3)의 미생물.

(5) 상기 데옥시폴리올이 L-람니톨인, (1), (2) 또는 (3)의 미생물.

본 발명은, 이하의 (6) - (10)의 데옥시케토스의 제조 방법을 요지로 한다.

(6) C2 및 C3 위치에 리비톨 또는 L-이디톨과 동일한 구조를 포함하는 데옥시폴리올 함유 용액에, (1) 내지 (4) 중 어느 하나의 미생물의 배양에 의해 수득되는 데옥시폴리올 탈수소효소를 포함하는 배양물 또는 데옥시폴리올 탈수소효소를 작용시켜, 상기 데옥시폴리올의 산화에 의해 대응되는 데옥시케토스를 생성시키고, 이를 채취하는 것을 특징으로 하는 데옥시케토스의 제조 방법.

(7) 고정화 데옥시폴리올 탈수소효소를 작용시키는 것인, (6)의 데옥시케토스의 제조 방법.

(8) 상기 데옥시폴리올이 1-데옥시 D-알리톨이며, 대응되는 데옥시케토스가 1-데옥시-D-프시코스인, (6) 또는 (7)의 데옥시케토스의 제조 방법.

(9) 상기 데옥시폴리올이 L-람니톨이며, 대응되는 데옥시케토스가 1-데옥시-L-프럭토스인, (6) 또는 (7)의 데옥시케토스의 제조 방법.

(10) L-람니톨 함유 용액이 L-람노스의 환원에 의해 수득되는 L-람니톨을 포함하는 반응액인, (9)의 데옥시케토스의 제조 방법.

본 발명은, 이하의 (11) 및 (12)의 신규 화합물을 요지로 한다.

(11) 1-데옥시-L-프럭토스.

(12) L-람니톨 함유 용액에, 엔테로박터 속 균체 IK7(기탁번호 NITE BP-271)의 배양에 의해 수득되는 데옥시폴리올 탈수소효소능을 가진 균체를 작용시켜, L-람니톨의 산화에 의해 생성시키고, 이를 채취한 것인, (11)의 1-데옥시-L-프럭토스.

본 발명을 실시하기 위한 최선의 형태

본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위하여, 가능한 많은 종류의 당질에 작용하는 효소, 특히, 당 알코올 탈수소효소에 주목하여, 이 효소를 생산하는 미생물을 광범위로 검색하였다. 그 결과, 가가와현 기타군 미키쵸의 하천 부지 토양에서 분리한 엔테로박터 에어로게네스 IK7 주(Enterobacter aerogenes IK7)가 엔테로박터 속에 속하는 신규한 미생물이며, 많은 종류의 폴리올에 작용하고, 동시에 데옥시알코올(데옥시폴리올)에도 작용하여 이를 산화함으로써, 데옥시케토스를 포함한 다수의 케토스를 생산한다는 것을 발견하였다. 즉, 본 산화 반응이 공업적으로 지금까지 용이하게 생산할 수 없었던 각종 케토스를 생산하는데 매우 유리하다는 것을 발견하여, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 균주로부터 추출한 16 SrRNA의 서열을 결정하여, 다른 미생물로부터 수득한 기존의 복수개의 16 SrRNA와 비교하였다. 이 데이터는 엔테로박터 에어로게네스 서열과 99%의 동일성을 보였다. 이 입증 자료와 표 1에 기재된 그 외 생리학적 특징을 기초로, 본 균주가 엔테로박터 에어로게네스라는 결론을 내렸다. 그리고, DNA 단편의 염기 서열의 결정은, 공지된 방법, 예를 들면, 생거 방법(Molecular Cloning, 제2권, 13.3 페이지, 1989년), PCR를 기초로 한 방법 등으로 행할 수 있다.

통상적으로, Beckman Coulter 사의 GenomeLab DTCS Quick Start Kit(형광 다이 데옥시 터미네이터를 포함하는 시퀀싱 키트) 등을 사용하여 반응을 행하고, Beckman Coulter 사의 자동 시퀀서(CEQ 8000 등)로 염기 서열을 결정한다.

(표 1)

그람염색 음성 운동성 없음 생육온도 37 ℃(4- 40 ℃에서 생육가능하지만, 37 ℃가 바람직함) 산소요구성 통성 혐기성이지만 산소를 제공하는 형태가 바람직함 형상 간균 우레아 분해성 음성 오르니틴 카르복실라제 양성 생육상태 콜로니 원형, 볼록형, 건조, 투명, 크림 백색

[배지]

(배양시 pH는 예컨대 5 - 9이며, 바람직하게는 6 - 8.5이다. 배양은 진탕 또는 통기 교반 등의 호기 조건 하에서 행한다.)

1. TSB(트립틱 소이프로스) 배지 1 - 2%

TSB: Becton, Dickinson Company 사 제품

2. 육류 엑기스 배지

(육류 엑기스(와코 순약공업 주식회사 제품) 0.5%, 폴리펩톤(와코 순약공업 주식회사 제품) 0.5%, 염화나트륨 0.5%, pH 7.0)

3. 효모 엑기스 배지

(효모 엑기스(와코 순약공업 주식회사 제품) 0.5%, 폴리펩톤 0.5%(와코 순약공업 주식회사 제품), 염화나트륨 0.5%, pH 7.0)

한천 배지의 경우에는, 한천을 최종 농도 2%로 첨가한다.

본 발명자들이 분리한 IK7주는 엔테로박터 속에 속하는 신규 미생물이며, 일본국 독립 행정법인 제품 평가 기술 기반 기구 특허 미생물 기탁 센터 일본국 지바현 기사라즈시 가즈사 카마타리 2-5-8에 2006년 10월 19일에 기탁하였고, 2006년 11월 9일에 수탁 번호(NITE P-271)로서 수탁증을 발행받았다. 상기 균주는, 카가와현 기타군 미키쵸를 흐르는 하천의 토양으로부터 분리된 것이다. 이번 국제 출원할 때에 원기탁(NITE P-271)을 상기 원기탁한 국제 기탁 당국에 이관 청구 하여, 20O7년 3월 22일에 상기 국제 기탁 당국으로부터 원기탁에 대한 수탁증(NITE BP-271)을 발행받았다.

본 발명에서는, 상기 균주 뿐만 아니라 엔테로박터 속에 속하며 당 알코올 탈수소효소 생산능을 가진 다른 균주나 이들의 변이주 등도 적절하게 사용할 수 있다.

본 발명의 미생물 배양에 사용하는 배지는, 미생물을 생육시킬 수 있으며 본 발명의 당 알코올 탈수소능을 생성할 수 있는 것이라면, 합성 배지 및 천연 배지 중 어느 것이라도 사용가능하다. 탄소원으로서는, 예를 들면, 알도스, 케토스, 당 알코올, 글리세롤 등으로 선택되는 1종 또는 2종 이상이 적절하게 선택된다. 질소원으로서는, 예를 들면, 암모늄염, 질산염 등의 무기 질소 화합물, 및, 예를 들면, 요소, 콘 스티프 리커(Corn Steep Liquor), 카세인, 펩톤, 효모 엑기스, 육류 엑기스 등의 유기 질소 함유물이 사용된다. 또한, 무기 성분으로서는, 예를 들면, 칼슘염, 마그네슘염, 칼륨염, 나트륨염, 인산염 등이 적절하게 사용된다.

배양 조건은, 미생물이 생육할 수 있으며, 본 발명의 효소를 생산할 수 있는 온도가 적합하며, 통상, 약 4 - 40 ℃, 바람직하게는, 약 20 - 37 ℃에서, pH 약 5 - 9, 바람직하게는, 약 6 - 8.5로부터 선택되는 조건에서 호기적으로 수행한다.

본 발명의 미생물은, C2 및 C3 위치에 리비톨 또는 L-이디톨과 동일한 구조를 포함하는 데옥시폴리올을 탈수소 반응하는 효소 활성을 생산할 수 있는 엔테로박터 속의 미생물이다. 엔테로박터 에어로게네스에 속하는 미생물, 보다 구체적으로는 엔테로박터 속 균체 IK7(기탁번호 NlTE BP-271)가 바람직한 것으로서 예시된다. 본 발명의 미생물은 1- 또는 6-데옥시헥시톨의 2번 위치를 탈수소화하여 1- 또는 6-데옥시헥시톨을 생산하는, 폴리올 탈수소효소 활성을 가지고 있다.

본 발명의 엔테로박터 속 미생물이 나타내는 당 알코올 탈수소 활성은, 기질로서 알리톨, 리비톨, L-람니톨, L-소르비톨, L-만니톨을 비롯하여, 2번 탄소에 결합된 알코올기(H-C-OH)가 D-글리세로 배위인 다양한 당 알코올을 산화함으로써, 케토기(C=O)를 가지고 있는 다양한 케토스를 생산하는데 이용할 수 있다. 따라서, 1종의 미생물을 사용하여 다양한 당질을 생산할 수 있게 되어, 공업적으로 매우 유리하다.

예를 들면, 기질로서 L-람니톨을 산화하여 1-데옥시-L-프럭토스를 생산할 수 있으며, 이것은 신규 화합물이다. 또한, L-트레이톨(threitol), D-트레이톨도 마찬가지로 산화하여 L-에리스로스, D-에리스로스를 생산한다는 것을 HPLC를 통해 확인하였다. 이는 탄소수 4의 케토스의 새로운 제조 방법이다(표 2 참조).

상기 효소 활성을 가지는 미생물을 이용할 때, 당 알코올로부터 케토스를 생성하는 반응을 위해서는 호기적 조건, 예를 들면, 산소, 공기 등을 통기 교반하면 되고, 또 케토스로부터 당 알코올을 생성하는 반응에서는 혐기적 조건, 예를 들면, 질소, 불활성 가스 등의 환경으로 유지하면 된다.

본 발명에서는, 데옥시폴리올 함유 용액에, 본 발명의 미생물의 배양에 의해 수득되는 데옥시폴리올 탈수소활성을 가진 미생물을 작용시켜, 상기 데옥시폴리올의 산화에 의해 대응되는 데옥시케토스를 생성시킨다.

또한, 미생물을 톨루엔으로 처리하거나, 공지된 방법으로 고정화하거나 하여 사용할 수도 있다. 반응 온도는, 효소가 실활하지 않는 온도, 예를 들면, 4 - 50 ℃, 바람직하게는 10 - 40 ℃에서 반응하면 된다. 반응 시간은 효소 반응의 진행 상태에 따라 적절하게 선택할 수 있으며, 통상, 기질 고형물 g 당 약 0.1 - 100 단위의 효소 사용량으로, 약 0.1 - 100 시간이다.

이렇게 하여 수득되는 반응액에는, 통상, 당 알코올과 케토스 둘다가 포함되어 있다. 반응액은, 통상적인 방법을 통해, 여과, 원심분리 등으로 불용물을 제거한 후, 활성탄으로 탈색, H형, OH형 이온 교환 수지로 탈염하고, 농축하고, 시럽상 제품으로 제조하거나, 건조하여 분말상 제품으로 제조하거나, 또는 결정성 당질로 결정 제품으로 제조할 수도 있다. 필요에 따라, 또한 고도로 정제할 수도 있다. 예를 들면, 이온 교환 컬럼 크로마토그래피에 의한 분획, 활성탄 컬럼 크로마토그래피에 의한 분획, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피에 의한 분획, 알칼리 처리에 의한 케토스의 분해 제거 등의 방법으로, 고순도의 당질을 수득하는 것도 용이하다. 이렇게 수득되는 각종 당질은 시약은 물론, 감미료, 품질 개량제 등으로서 식품공업에, 원재료, 중간체 등으로서 의약품 공업, 화학공업 등의 많은 용도에 유용하게 이용할 수 있다.

발명의 효과

본 발명에 의해, 많은 종류의 당질에 작용하는 신규한 데옥시폴리올 탈수소효소를 생산하는 미생물을 제공할 수 있다. 또한, 본 발명에 의해, 기질인 데옥시폴리올을 함유하는 용액에 작용시켜, 대응되는 데옥시케토스를 생성시킴으로써 많은 종류의 희소 당질을 용이하게 제조할 수 있다. 보다 구체적으로는, 본 발명에 의해, L-람니톨의 1-데옥시-L-프럭토스로의 변환과 관련있는 신규한 데옥시폴리올 탈수소효소를 생산하는 미생물, 상기 효소 또는 상기 효소 활성을 가진 미생물을 사용하는 데옥시케토스의 제조 방법, 및 신규한 데옥시케토스(1-데옥시-L-프럭토스 등)를 제공할 수 있다.

도 1은 기질인 L-람니톨의 HPLC 분석 결과이다.

도 2는 엔테로박터 속 균체 IK7(기탁번호 NITE BP-271)를 기질 L-람니톨와 작용시킨 후, 생성되는 1-데옥시-L-프럭토스의 HPLC 분석 결과이다.

도 3은 정제한 1-데옥시 L-프럭토스의 ¹³C NMR 분석 결과이다.

본 발명의 상세한 내용을 실시예를 들어 설명한다. 본 발명은 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 (당 알코올 탈수소능을 가진 미생물의 제조)

탄소원으로서 당 알코올, 글리세롤 등을 사용하여 액체 배지를 제조(최적 배지는 2% TSB를 베이스로 하여 탄소원으로서 1% D-만니톨을 포함함)하고, 500 m1 용량의 삼각 플라스크에 100 m1씩 넣어 가열 멸균(121 ℃에서 15분)한 다음, 여기에 엔테로박터 에어로게네스 IK7(기탁번호 NITE BP-271)을 접종하고, 37 ℃에서 24시간 동안 120 rpm으로 진탕 배양하여, 당 알코올 탈수소효소를 다량 포함하는 미생 물 균체를 제조하였다.

실시예 2 (기질 특이성)

실시예 1의 방법으로 제조한 당 알코올 탈수소효소 활성을 보이는 미생물을 사용하여, 각종 당 알코올을 기질로 케토스로의 산화 활성을 측정하였다.

각종 당 알코올을 1%로 포함하는 50 mM 글리신 NaOH 완충액(pH 11)에서, 균체(농도는 600 nm에서의 흡광도 30에 해당됨)를 37 ℃에서 1 - 24시간 동안 진탕하였다. 표 2에 전환에 사용한 기질, 생산물, 반응 시간 및 전환율을 총괄하여 나타내었다. 이들 기질로부터 생산되는 케토스는 이온 교환 컬럼 크로마토그래피에 의해 분리하고, 고속 액체 크로마토그래피로 확인하였고, 그 결과는 표 2에 나타내었다.

각각의 폴리올에 의해, 전환이 모두 진행된 것, 일부만 진행된 것 등이 있어, 통틀어 전체의 상대적인 활성을 명확하게 비교하여 나타내긴 어려웠다. 그러나, 이러한 결과로부터 나타난 바와 같이, 알리톨은 약 2시간 만에 100% D-프시코스로 전환되었고, L-람니톨은 약 12시간, L-탈리톨, L-소르비톨, L-만니톨은 24시간만에 100%로 각각 1-데옥시-L-프럭토스 및 L-람뉴로스, L-타가토스, L-프럭토스와 D-소르보스의 혼합물, L-프럭토스로 전환율 100%로 산화되었다. 그 외 폴리올도 표 2에 나타낸 바와 같이, 리비톨을 D-리프로스로, 또한 L-트레이톨을 L-에리스로스 등으로 산화할 수 있는 능력이 확인되었다.

(표 2)

기질 주 생산물 반응시간(h) 전환율(%) 알리톨 D-프시코스 2 100 L-람니톨 1-데옥시 L-프럭토스 및 L-람뉴로스 12 100 L-탈리톨 L-타가토스 24 100 L-소르비톨 L-프럭토스 및 D-소르보스 24 100 L-만니톨 L-프럭토스 24 100 L-이디톨 L-소르보스 24 92 L-아라비톨 L-크실로스 24 90 리비톨 D-리프로스 24 60 L-트레이톨 L-에리스로스 12 42 D-트레이톨 D-에리스로스 12 40 에리스리톨 D-에리스로스 12 38 자일리톨 자일로스 24 5

표 2의 결과에서 명확해진 바와 같이, 알리톨에 대해 가장 높은 활성을 나타내었다. 이들의 당 알코올에 작용하는 반응 양식에 대하여 검토한 결과, 이들 반응 양식은 공통적이었으며, 그 일예로 리비톨의 경우를 나타내면 화학식 1과 같다:

(화학식 1)

리비톨 D-리프로스

화학식 1에서 명백한 바와 같이, 본 발명의 균체는 각종 폴리올의 2번 탄소에 결합된 알코올기(H-C-OH)가 D-글리세로 배위인 당 알코올에 대해 강한 활성을 보인다. 2번 탄소에 결합된 알코올기가 L-글리세로 구조인 D-이디톨, D-만니톨 및 D-탈리톨에 대해서는 활성을 나타내지 않았다.

실시예 3 (당 알코올로부터 케토스의 제조)

실시예 1의 방법으로 제조한 당 알코올 탈수소효소 활성을 가지는 미생물을 사용하여, L-람니톨로부터 1-데옥시-L-프럭토스를 제조하였다.

(화학식 2)

L-람니톨 1-데옥시-L-프럭토스

배양을 종료한 후, 원심분리하고, 회수한 균체를 적당량의 1차 교환수로 2회 세정한 다음, 50 mM Tris-HCl(pH 9.0) 완충액으로 적당량 현탁하였다. 상기 배양량으로부터 수득할 수 있는 균체량에 대한 적절한 반응계는 다음과 같다.

반응 조건(세정 균체 반응) L자 관(용량 30 ml)을 사용하여, 흡광도 600 nm에서의 수치가 최종 농도 50이 되도록 균체를 상기 완충액과 당 용액에 현탁하는 것이 바람직하다. 균체의 최종 농도는 약 0.1 - 100까지가 가능한 당 농도이다. L-람니톨의 농도는 0.1 - 20%로 전환될 수 있으며, 1-데옥시 L-프럭토스의 전환율이 가장 높고, 최적 농도는 10%이다. 반응 온도는 37 ℃가 최적이지만, 4 - 40 ℃도 가능하다. 산화 반응시에는 진탕할 필요는 없지만, 50 rpm 정도로 진탕하여 호기적 조건을 유지하는 것이 바람직하다. 생성물의 확인은 수득되는 반응액을 원심 분리하여 불용물을 제거하고, 상청액을 고속 액체 크로마토그래피로 분석하여 실시한다.

(결과)

18시간만에 최대로 1-데옥시-L-프럭토스를 수득할 수 있어, L-람니톨의 약 80%로부터 1-데옥시-L-프럭토스를 수득할 수 있었다. 도 1에 기질인 L-람니톨의 HPLC 분석 결과를 나타내었다. 체류 시간 약 22분에 나타난 피크가 L-람니톨이다. 도 2는, 엔테로박터 속 균체 IK7(기탁번호 NITE BP-271)를 기질 L-람니톨과 작용시킨 후, 생성되는 1-데옥시-L-프럭토스를 HPLC 분석한 결과이다. 도 3은 정제한 1-데옥시 L-프럭토스의 ¹³C NMR 분석 결과이다.

실시예 4

(1-데옥시 L-만니톨의 산화에 의한 1-데옥시 L-프럭토스 생산)

엔테로박터 에어로게네스 lK7(기탁번호 NlTE BP-271)를 이용하는 미생물 반응을 통해, 6-디옥시 L-만니톨을 산화시켜 1-데옥시 L-프럭토스를 생산하였다.

(L-람노스(6-데옥시 L-만노스)의 환원 반응에 의한 6-데옥시 L-만니톨의 제조)

6-데옥시 L-만노스을 이용한 화학 반응에 의해, 6-데옥시 L-만니톨을 생산하였다.

(Raney 니켈을 촉매으로 한 환원 반응)

50% Raney 니켈(와코 순약공업 주식회사 제품) 10 g에 대하여, 20% NaOH 수용액을 100 g 첨가하였다. 첨가 후 90 ℃에서 1시간 가온하였다. 기포의 발생이 멈춰진 것을 확인한 후, 경사법(decantation) 의해 증류수로 촉매를 세정하였다. 세정은 세정액이 pH 9.2가 될 때까지 행하였다.

교반기, 온도계가 구비된 1 L 유리 자동멸균기에, 100 g의 6-데옥시 L-만노스를 포함하는 수용액 300 g에, 상기 방법에 의해 수득한 Raney 니켈 24 g을 가한 것을 첨가한 다음, 추가로 물을 가하여, 전체 반응액 양을 600 g으로 조정하였다. 이 때, 반응액의 pH를 7로 조정하기 위해, 탄산칼슘을 첨가하였다. 50℃의 온도에서, 12 kg/cm²(게이지압)의 수소압 하에, 700 rpm의 교반 속도를 유지하면서 반응을 수행하였다. 반응액의 분석은 HPLC로 수행하였다. 그 결과, 8시간의 반응으로 6-데옥시 L-만노스는 1%까지의 감소가 관찰되었으며, 6-데옥시 L-만니톨을 생산할 수 있었다.

(당 알코올 탈수소효소를 포함하는 균체의 제조)

멸균한 액체 배지(2% TSB(트립신 소이 브로스: Becton Dickinson company)를 기본으로 하여 탄소원으로서 1% D―만니톨을 포함함)에 엔테로박터 에어로게네스 IK7(기탁번호 NlTE BP-271)를 접종하고, 37 ℃에서 24시간 동안, 120 rpm로 진탕 배양하여, 당 알코올 탈수소효소를 다량 포함하는 미생물 균체를 제조하였다.

배양을 종료한 후, 원심분리하고, 회수한 균체를 적당량의 1차 교환수로 2회 세정한 후, 50 mM Tris-HCl(pH 9.0) 완충액으로 적당량 현탁하였다. 이 현탁액을 당 알코올 탈수소효소를 포함하는 균체 용액으로 하였다.

제조한 당 알코올 탈수소효소 활성을 보이는 균체 용액을 사용하여, 1-데옥시 L-만니톨로부터 1-데옥시-L-프럭토스를 제조하였다.

L자 관(용량 30 ml)에, 50 mM Tris-HCl(pH 9.0) 완충액과 당 알코올 탈수소효소를 포함하는 균체 용액(최종 균체 농도는 흡광도 600nm에서의 값이 O.20임) 및1-데옥시 L-만니톨(최종 농도 10%)을, 흡광도 600nm에서의 O.D 50으로 조정하고, 37 ℃로 보온하면서 호기 조건이 되도록 가볍게 진탕하였다. 생성물의 확인은 수득되는 반응액을 원심분리를 통해 불용물을 제거한 다음, 상청액을 고속 액체 크로마토그래피로 분석하여 수행하였다.

18시간만에 1-데옥시-L―프럭토스를 최대로 수득할 수 있었으며, 1-데옥시 L―만니톨의 약 80%를 1-데옥시-L―프럭토스로 수득할 수 있었다.

상기한 바로부터 명백해진 바와 같이, 본 발명의 균체 IK7(기탁번호 NITE BP-271)는 다양한 당질 변환에 유리하게 이용할 수 있으며, 또한 희소 당질의 공업적 생산에 유리하게 이용할 수 있다. 본 발명에 의해, 종래에는 매우 입수하기 어려웠던 많은 종류의 희소 당질을 용이하게 제공할 수 있게 되어, 이로 인한 영향은 식품, 화장품, 의약품, 화학 공업 등 다방면에 이를 것으로 기대되어 그 공업적 의의는 매우 크다.

Claims

C2 및 C3 위치에 리비톨 또는 L-이디톨과 동일한 구조를 포함하는 데옥시폴리올 탈수소효소 생산능을 가진 엔테로박터 속 미생물.
제1항에 있어서, 엔테로박터 에어로게네스(Enterobacter aerogenes)에 속하는 것을 특징으로 하는 미생물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 엔테로박터 속 균체 IK7(기탁번호 NITE BP-271)인 것을 특징으로 하는 미생물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한항에 있어서, 상기 데옥시폴리올이 1-데옥시 D-알리톨인 것을 특징으로 하는 미생물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한항에 있어서, 상기 데옥시폴리올이 L-람니톨인 것을 특징으로 하는 미생물.
C2 및 C3 위치에 리비톨 또는 L-이디톨과 동일한 구조를 포함하는 데옥시폴리올 함유 용액에, 제1항 내지 제4항 중 어느 한항의 미생물을 배양하여 수득한 데옥시폴리올 탈수소효소를 포함하는 배양물 또는 데옥시폴리올 탈수소효소를, 작용 시켜, 상기 데옥시폴리올의 산화에 의해 대응되는 데옥시케토스를 생성시키고, 이를 채취하는 것을 특징으로 하는 데옥시케토스의 제조 방법.
제6항에 있어서, 고정화 데옥시폴리올 탈수소효소를 작용시키는 것을 특징으로 하는 데옥시케토스의 제조 방법.
제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 데옥시폴리올이 1-데옥시 D-알리톨이고, 대응되는 데옥시케토스가 1-데옥시 D-프시코스인 것을 특징으로 하는 데옥시케토스의 제조 방법.
제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 데옥시폴리올이 L-람니톨이고, 대응되는 데옥시케토스가 1-데옥시-L-프럭토스인 것을 특징으로 하는 데옥시케토스의 제조 방법.
제9항에 있어서, 람니톨 함유 용액이 L-람노스의 환원에 의해 수득되는 L-람니톨을 포함하는 반응액인 것을 특징으로 하는 데옥시케토스의 제조 방법.
1-데옥시-L-프럭토스.
제11항에 있어서, L-람니톨 함유 용액에, 엔테로박터 속 균체 IK7(기탁번호 NITE BP-271)를 배양하여 수득한 데옥시폴리올 탈수소효소를 포함하는 균체를, 작용시켜, L-람니톨의 산화에 의해 생성한 다음 이를 채취한 것인 것을 특징으로 하는 1-데옥시-L-프럭토스.