JPWO2006049234A1

JPWO2006049234A1 - ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体（ｐｐａｒ）活性化剤、ならびにそれを用いた医薬、サプリメント、機能性食品および食品添加物

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Publication number: JPWO2006049234A1
Application number: JP2006542437A
Authority: JP
Inventors: 貴生佐々木
Original assignee: Arkray Inc
Current assignee: Arkray Inc
Priority date: 2004-11-08
Filing date: 2005-11-04
Publication date: 2008-05-29
Anticipated expiration: 2025-11-04
Also published as: US20070213282A1; US9573919B2; EP1829542B1; CN104306367A; EP1829542A4; EP1829542A1; JP5473191B2; JP2013163684A; JP2013163685A; CN101052391A; WO2006049234A1

Abstract

副作用の問題がなく、長期間摂取可能であり、特有の風味がないペルオキシソーム増殖剤応答性受容体（ＰＰＡＲ）活性化剤を提供する。ノビレチンをＰＰＡＲ活性化剤として使用する。ノビレチンは、優れたＰＰＡＲ活性および優れたアディポネクチン分泌促進効果を有し、柑橘類果実、特に、沖縄特産のシイクワシャー（ＣｉｔｒｕｓｄｅｐｒｅｓｓａＨＡＹＡＴＡ）に多量に含まれており、柑橘類果実は長年食されてきたことから、安全性に問題がなく、しかもカロリーが低いので、長期間摂取可能である。また、ノビレチンは、無味無臭なので、食品に添加しても、その食品特有の風味を害することがないため、食品に添加して摂取可能である。

Description

本発明は、ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体（ＰＰＡＲ）活性化剤、ならびにそれを用いた医薬、サプリメント、機能性食品および食品添加物に関する。

糖尿病の発症には、インスリン分泌低下とインスリン抵抗性の二つが関与しているといわれている。最近、日本人において、糖尿病患者が増えているが、インスリン分泌低下は遺伝的要素が大きいため、糖尿病患者増加の主原因ではなく、インスリン抵抗性が主原因と考えられている。これは、日本人の食生活が欧米化して脂肪摂取量が増えたことや、その他、運動不足、肥満、ストレスが原因であると言われている。インスリン抵抗性の発生のメカニズムは、脂肪細胞の肥大化に起因することが最近の研究で分かっている。すなわち、脂肪細胞が肥大化すると、ＴＮＦ−αおよび遊離脂肪酸（ＦＦＡ）が分泌され、これらが筋肉細胞や肝臓細胞での糖の取り込みを阻害すると共に、インスリンの働きを促進するアディポネクチンの分泌が抑制され、この結果、インスリン抵抗性が生じる。

一方、インスリン抵抗性の研究において、核内受容体であるＰＰＡＲを活性化すると、インスリン抵抗性の改善に効果があることが分かっている。ＰＰＡＲには、α、σ、γの３つのタイプと、いくつかのサブタイプが知られている。ＰＰＡＲαは、主として肝臓細胞に発現し、その他、心筋細胞や消化管細胞にも発現が認められ、脂肪酸酸化、ケトン体生成、アポリポタンパク質の生成などに関与している。ＰＰＡＲσは、組織特異性が認められず、体全体に発現しているが、大腸がん細胞での発現が顕著である。ＰＰＡＲγは、γ１型とγ２型の２つのサブタイプに分類でき、γ１型は、脂肪組織、免疫系組織、副腎、小腸で発現し、γ２型は、脂肪細胞で特異的に発現しており、脂肪細胞の分化誘導や脂肪合成に重要な役割を担っている。

このように、ＰＰＡＲは、インスリン抵抗性の改善に大きく関わっており、加えて、高インスリン血症、２型糖尿病、その他、肥満、高血圧、高脂血症および動脈硬化の改善にも関わっていると言われている。このような観点から、ＰＰＡＲを活性化する物質について研究され、例えば、フィブラート系化合物、チアゾリジン誘導体、脂肪酸、ロイコトリエンＢ４、インドメタシン、イブプロフェン、フェノプロフェン、１５−ｄｅｏｘｙ−Δ−１２，１４−ＰＧＪ２のような合成物質系のＰＰＡＲ活性化剤が知られている。しかしながら、合成物質系のＰＰＡＲ活性化剤は、長期摂取による副作用の問題があり、日常生活で摂取してインスリン抵抗性等の疾病を予防若しくは改善するのには不向きである。この他、天然成分由来のＰＰＡＲ活性化剤として、ウコンに含まれるクルクミンや、油脂の一種であるモノアシルグリセロール、お茶などに含まれるカテキン類などの天然物質が、ＰＰＡＲ活性化剤として報告されている（例えば、特許文献１参照）。しかしながら、天然成分由来のものであっても油脂などはカロリーが高いため、継続的に摂取することには問題がある。また、日常的に摂取するためには、食品等に添加して摂取することが理想的であるが、天然成分由来のものは独特の風味を有するものも多く、このようなものは食品等に添加するには不向きである。
特開２００２−８０３６２号公報

本発明は、このような事情に鑑みなされたもので、副作用の問題がなく、長期摂取可能であり、しかも食品等に添加しても問題のないＰＰＡＲ活性化剤の提供を、その目的とする。

前記目的を達成するために、本発明のＰＰＡＲ活性化剤は、ノビレチンを含むことを特徴とする。

本発明者は、前記課題を解決するために、天然成分のＰＰＡＲ活性化剤について一連の研究を重ねたところ、柑橘類果実、特に沖縄地方特産のシイクワシャー（学名：ＣｉｔｒｕｓｄｅｐｒｅｓｓａＨＡＹＡＴＡ）に含まれるノビレチンンが、ＰＰＡＲの活性化作用を有することを見出し、本発明に到達した。すなわち、ノビレチンを多く含むシイクワシャーは、長年食用されてきており、その安全性は確認されている。また、ノビレチンは、カロリーが低く、この点で糖尿病患者や肥満患者等が長期摂取しても問題がない。そして、ノビレチンは、無味無臭であるため、食品等に添加しても、その食品独特の風味を損なうことがないため、食品に添加して長期に渡って日常的に摂取することも可能となる。したがって、本発明により、ノビレチンがＰＰＡＲを活性化することにより、脂肪の燃焼を促進させ、ＴＮＦ−αおよび遊離脂肪酸の分泌を抑制し、かつアディポネクチンの分泌を促進させるから、脂肪細胞の状態を正常化でき、インスリン抵抗性を改善でき、その他、高インスリン血症、２型糖尿病、高血圧、高脂血症、動脈硬化および肥満などの症状を改善できる。なお、これは、人に限られず、その他動物にも有効である。

図１は、本発明の一実施例において、ノビレチンのＰＡＡＲγリガンド活性を示すグラフである。図２は、本発明のその他の実施例において、ノビレチンによるアディポネクチンｍＲＮＡ発現量の増加を示すグラフである。図３は、本発明のさらにその他の実施例において、ノビレチンによる糖尿病改善効果を示すグラフである。

本発明のＰＰＡＲ活性化剤において、活性化されるＰＰＡＲは、ＰＰＡＲαおよびＰＰＡＲγのいずれかでもよいが、好ましくは双方である。なお、本発明のＰＰＡＲ活性化剤は、ノビレチン以外の他の成分を含んでいてもよい。前記他の成分としては、例えば、各種添加剤があり、この他、ノビレチン以外の他のＰＰＡＲ活性化剤等がある。

前述のように、ノビレチンは、ＰＰＡＲ活性化作用を有するため、本発明のＰＰＡＲ活性化剤は、例えば、脂肪細胞におけるＴＮＦ−αおよび遊離脂肪酸の分泌の抑制作用、アディポネクチンの分泌の促進作用および肝臓細胞における脂肪のβ酸化促進作用を有する。また、本発明のＰＰＡＲ活性化剤は、脂肪細胞のアポトーシス、分化および小型化の少なくとも一つを誘導する。

本発明のＰＰＡＲ活性化剤において、使用するノビレチンは、特に制限されないが、例えば、柑橘類由来のものが使用でき、好ましくは沖縄特産果実として知られるシイクワシャー由来のものである。シイクワシャーの果汁には、ノビレチンが多く含まれているので、これをそのまま使用してもよく、また、柑橘類から単離精製したものや市販品を使用してもよい。

つぎに、本発明の医薬は、インスリン抵抗性、高インスリン血症、２型糖尿病、高血圧、高脂血症、動脈硬化および肥満からなる群から選択される少なくとも一つの疾病の予防若しくは治療のための医薬であって、前記本発明のＰＰＡＲ活性化剤を含む医薬である。本発明の医薬は、本発明のＰＰＡＲ活性化剤以外に、例えば、その他のＰＰＡＲ活性剤および各種添加剤等を含んでいても良い。本発明の医薬において、具体的な剤形としては、例えば、錠剤、細粒剤（散剤を含む）、カプセルおよび液剤（シロップ剤を含む）等があげられる。本発明の医薬は、各剤形に適した添加剤や基材等を適宜使用し、日本薬局方等に記載された通常の方法に従い製造できる。また、投与経路としては、特に制限されず、例えば、経口投与および非経口投与があげられ、前記非経口投与としては、例えば、口腔内投与、気道内投与、直腸内投与、皮下投与、筋肉内投与および静脈内投与等があげられる。本発明の医薬において、ノビレチンの１日あたりの投与量が、例えば、１０ｍｇ以上となるようにノビレチンを含んでいればよく、好ましくは２０ｍｇ以上である。

つぎに、本発明のサプリメントは、インスリン抵抗性、高インスリン血症、２型糖尿病、高血圧、高脂血症、動脈硬化および肥満からなる群から選択される少なくとも一つの疾病の予防若しくは改善のためのサプリメントであって、前記本発明のＰＰＡＲ活性化剤を含むサプリメントである。本発明のサプリメントは、本発明のＰＰＡＲ活性化剤以外に、例えば、その他のＰＰＡＲ活性剤、各種添加剤およびその他のサプリメント等を含んでいてもよく、前記その他のサプリメントとしては、例えば、ビタミンＣなどの各種ビタミン類、アミノ酸およびオリゴ糖等があげられる。本発明のサプリメントの形態は、特に制限されず、例えば、錠剤、細粒剤（散剤を含む）、カプセルおよび液剤（シロップ剤を含む）等があげられる。本発明のサプリメントにおいて、ノビレチンの含有量は、前記医薬と同様である。

つぎに、本発明の機能性食品は、インスリン抵抗性、高インスリン血症、２型糖尿病、高血圧、高脂血症、動脈硬化および肥満からなる群から選択される少なくとも一つの疾病の予防若しくは改善のための機能性食品であって、前記本発明のＰＰＡＲ活性化剤を含む機能性食品である。本発明の機能性食品は、本発明のＰＰＡＲ活性化剤以外に、例えば、その他のＰＰＡＲ活性剤および各種添加剤等を含んでいてもよい。なお、本発明の機能性食品の形態は、特に制限されず、例えば、麺類、菓子類および機能性飲料等があげられる。

つぎに、本発明の食品添加剤は、インスリン抵抗性、高インスリン血症、２型糖尿病、高血圧、高脂血症、動脈硬化および肥満からなる群から選択される少なくとも一つの疾病の予防若しくは改善のための食品添加物であって、前記本発明のＰＰＡＲ活性化剤を含む食品添加物である。本発明の食品添加剤は、本発明のＰＰＡＲ活性化剤以外に、例えば、その他のＰＰＡＲ活性剤および各種添加剤等を含んでいてもよい。本発明の食品添加剤の形態は、特に限定されないが、例えば、液状、ペースト状、粉末状、フレーク状および顆粒状等があげられる。また、本発明の食品添加剤は、飲料用を含む。

つぎに、本発明のＰＰＡＲ活性化方法は、ノビレチンによりＰＰＡＲを活性化する方法である。前記ノビレチンを、例えば、脂肪細胞等に接触させることによりＰＰＡＲを活性化することがより好ましい。

本発明のＰＰＡＲ活性化方法において、使用するノビレチンは、前記本発明のＰＰＡＲ活性化剤に使用するものと同様であり、例えば、柑橘類由来のものが使用でき、好ましくは沖縄特産果実として知られるシイクワシャー由来のものである。前述のように、シイクワシャーの果汁には、ノビレチンが多く含まれているので、これをそのまま使用してもよいし、柑橘類から単離精製したものや市販品を使用してもよい。

つぎに、本発明の疾病の予防、治療または改善方法は、哺乳動物におけるインスリン抵抗性、高インスリン血症、２型糖尿病、高血圧、高脂血症、動脈硬化および肥満からなる群から選択される少なくとも一つの疾病の予防、治療または改善方法であって、ノビレチンを投与することを含む方法である。ノビレチンの一日あたりの投与量は、例えば、１０ｍｇ／日以上であり、好ましくは２０ｍｇ／日以上である。前記哺乳動物としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタおよびサル等があげられる。

つぎに、本発明のキットは、インスリン抵抗性、高インスリン血症、２型糖尿病、高血圧、高脂血症、動脈硬化および肥満からなる群から選択される少なくとも一つの疾病の予防または治療のためのキットであって、
ａ）ノビレチン、
ｂ）インスリン抵抗性、高インスリン血症、２型糖尿病、高血圧、高脂血症、動脈硬化および肥満からなる群から選択される少なくとも一つの疾病の予防または治療に有用な第二の化合物を含む第二医薬組成物、および
ｃ）前記ノビレチンおよび前記第二医薬組成物を入れるための容器を含むキットである。

つぎに、本発明の使用は、ＰＰＡＲ活性化剤の製造のためのノビレチンの使用である。

また、本発明の使用は、哺乳動物における本発明のインスリン抵抗性、高インスリン血症、２型糖尿病、高血圧、高脂血症、動脈硬化および肥満からなる群から選択される少なくとも一つの疾病の予防、治療または改善のためにノビレチンを投与することを含む使用である。ノビレチンの一日あたりの投与量および前記哺乳動物は、前述の通りである。

本発明の使用において、使用するノビレチンは、前記本発明のＰＰＡＲ活性化剤に使用するものと同様であり、例えば、柑橘類由来のものが使用でき、好ましくは沖縄特産果実として知られるシイクワシャー由来のものである。前述のように、シイクワシャーの果汁には、ノビレチンが多く含まれているので、これをそのまま使用してもよいし、柑橘類から単離精製したものや市販品を使用してもよい。

本発明の使用において、ノビレチンは、例えば、脂肪細胞におけるＴＮＦ−αおよび遊離脂肪酸の分泌抑制、脂肪細胞におけるアディポネクチンの分泌促進、肝臓細胞における脂肪のβ酸化促進等の作用を少なくとも一つを誘導する。また、本発明の使用において、ノビレチンは、例えば、脂肪細胞のアポトーシス、分化および小型化等の少なくとも一つを誘導する。

つぎに、本発明におけるノビレチンは、例えば、シイクワシャー等の柑橘類果実から以下のようにして製造できる。

まず、果実を、所望のサイズに裁断または粉砕する。使用する果実は、採取直後の生のものであってもよいし、乾燥した状態のものであってもよい。つぎに、裁断等した果実を、溶媒に浸漬して抽出物を得る。浸漬に使用する溶媒としては、例えば、水、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｔ−ブタノール等の低級アルコール類、アセトンなどのケトン類、ジエチルエーテル、石油エーテルなどのエーテル類、クロロホルム、ジクロロメタンなどの塩素系有機溶媒などがあげられ、これらは単独で使用してもよいし、２種類以上を併用してもよい。これらの中で、毒性等の観点から、水とエタノールの混合物若しくはエタノールを使用することが好ましい。溶媒の使用量は、特に制限されず、例えば、果実量１００重量部に対し、２００重量部〜１００００重量部の範囲である。抽出処理は、例えば、室温で行うことができるが、好ましくは４〜１２０℃の範囲、より好ましくは４０〜１００℃の温度条件である。抽出時間は、抽出温度等により適宜決定されるが、例えば、室温での抽出時間は、１〜１０日間であり、５０℃以上では１〜９６時間である。

つぎに、フィルターによるろ過等により、残渣から分離して抽出液を取り出す。この抽出液若しくはその乾燥物は、ノビレチンを含んでいるので、これをそのまま使用してもよい。また、後述のように、さらに精製してノビレチンの純度を高めて使用してもよい。

前記抽出物の精製は、例えば、適切な溶離液を用いたシリカゲルクロマトグラフィーにより行うことができる。前記溶離液としては、例えば、酢酸エチル、メタノール、イソプロピルエーテル、テトラヒドロフラン、ベンゼン、またはキシレンなどの溶媒と、ヘキサン、ヘプタン、クロロホルム、またはジクロロエタンなどの溶媒との、混合溶媒を使用することが好ましい。

下記に示すように、本実施例は、ノビレチンによるＰＰＡＲγの活性化を確認した例である。

まず、ＣＶ−１細胞（雄性アフリカミドリザル腎臓由来の培養細胞）を、２４穴培養プレートに０．２μｇ／ｗｅｌｌとなるように植え込み、３７℃、５％ＣＯ_２条件下で２４時間培養した。培地には、１０％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）、１０ｍｇ／ｍＬペニシリン・ストレプトマイシン溶液を含むＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅＭｅｄｉｕｍ：ＧＩＢＣＯ社）を用いた。つぎに、リポフェクトアミンシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、ｐＭ−ｈＰＰＡＲγとｐ４×ＵＡＳｇ−ｔｋ−ｌｕｃとを、培養したＣＶ−１細胞にトランスフェクションした。なお、前記ｐＭ−ｈＰＰＡＲγは、ＧＡＬ４結合ドメインである１〜１４７残基とヒトＰＰＡＲγリガンド結合ドメインである２０４〜５０５残基とを含む融合タンパク質を発現するためのベクターであり、前記ｐ４×ＵＡＳｇ−ｔｋ−ｌｕｃは、ルシフェラーゼ遺伝子上流に、４コピーのＧＡＬ４結合ドメインのための上流活性化配列（ＵＡＳ）とチミジンキナーゼ遺伝子プロモータとを含むレポーター・プラスミドである。前記トランスフェクションを行った細胞を約２４時間培養し、ついで、前記細胞の培地を、種々濃度（０．１、１．０、１０および５０μＭ）のノビレチンまたは無処置対照用の培地に変え、さらに２４時間培養した。前記ノビレチンを含む培地は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解したノビレチンを培地に加えることにより調製し、無処置対照用の培地は、ＤＭＳＯのみを培地加えることにより調製した。培養後、前記細胞を溶解し、デュアル・ルシフェラーゼレポータージーンアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した（測定群）。

前記測定群と同様に、コントロール群としてｐＭ−ｈＰＰＡＲγの代わりにｐＭ（ｐＭ−ｈＰＰＡＲγにおいてＧＡＬ４結合ドメインである１〜１４７残基を含むが、ＰＰＡＲγリガンド結合ドメインである２０４〜５０５残基を含まないベクター）を用いて測定した。各サンプルについて、測定群及びコントロール群の発光強度の平均値（ｎ＝４）の比（測定群／コントロール群）を算出し、無処置対照に対する相対ルシフェラーゼ活性をサンプルのＰＰＡＲγリガンド結合活性とした。この結果を下記表１および図１のグラフに示す。

前記表１および図１から分かるように、ノビレチンによって、ＰＰＡＲγの活性が向上し、その活性は、ノビレチンの濃度が高くなるにつれて、有意に高くなった。

下記に示すように、本実施例は、ノビレチンによるアディポネクチンの分泌促進効果を確認した例である。

（前駆脂肪細胞の分化誘導）
まず、以下の２種類の培地を準備した。
１．分化誘導培地（０．２５μＭ：ＤＥＸ、０．５ｍＭ：ＭＩＸ、１０μｇ／ｍＬ：インスリン／１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ）
ＤＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ製）５００ｍＬに、ＦＢＳ（ウシ胎仔血清（ＧＩＢＣＯ製））を５５ｍＬ加え、１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭを調製した。これに、１ｍＭＤＥＸ（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）／ＤＭＳＯ（ナカライ製）を１３８．７５μＬ、１０ｍｇ／ｍＬインスリン／ＰＢＳ（ＳＩＧＭＡ製）を５５５μＬ加えた。なお、インスリン／ＰＢＳは、予めＰＢＳに１ＮＨＣｌを加え、インスリンが溶ける程度に酸性にした後、インスリンを溶解させた。ＭＩＸ（３−Ｉｓｏｂｕｔｙｌ−１−ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ）（ナカライ製）を、０．５ｍＭとなるように、使用する直前に必要な量の前記培地に加えることにより、分化誘導培地を調製した。ＭＩＸは非常に溶けにくいため、まず少量の９９．５％エタノールに溶解させた後、１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭに加えた。このとき９９．５％エタノールは最終濃度が、１％を越えないようにした。
２．分化促進培地（５μｇ／ｍＬ：インスリン／１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ）
１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ５５５ｍＬに、１０ｍｇ／ｍＬインスリン／ＰＢＳを２７７．５μＬ加え、分化促進培地を調製した。

つぎに、培養前駆脂肪細胞３Ｔ３−Ｌ１を解凍し、１００ｍｍディッシュにまき、３Ｔ３−Ｌ１が、約８０％コンフルエントに達するまで培養した。約８０％コンフルエントに達したディッシュ１枚分の１０Ｔ１／２を６ウェルプレート１枚に継代し、３Ｔ３−Ｌ１が６ウェルプレートにおいてコンフルエントに達するまでさらに培養した後、分化誘導培地に培地交換し、分化誘導させた。４８時間後、分化促進培地に培地交換し、以降２日おきに分化促進培地で培地交換した。分化誘導開始７日後、セパゾールＲＮＡＩｓｕｐｅｒ（ナカライ製）を用いてｍＲＮＡを抽出し、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ^（ＴＭ）を用いて、脂肪細胞分化初期の指標である３６Ｂ４、ａＰ２およびアディポネクチンのｍＲＮＡ発現量の測定を行った。

（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ^（ＴＭ）によるｍＲＮＡの定量）
ｔｏｔａｌＲＮＡの抽出と定量
前記６ウェルプレートから培地を除去し、各ウェルに１ｍＬずつセパゾールＲＮＡＩｓｕｐｅｒ（ナカライ製）を加え、ピペッティングを数回繰り返すことにより細胞を分散させた。この液を１．５ｍＬのチューブに移し、室温で５分間放置した後、クロロホルムを２００μＬ加え、Ｖｏｒｔｅｘでよく撹絆し、室温で３分間放置した。４℃に冷却し、１２０００×ｇで１５分間遠心した。フェノール層（下層、黄色）と水層（上層、無色）との界面を乱さないように注意しながら、水層のみを別のチューブ（容量１．５ｍＬ）へ移した。この際、中間に浮いているタンパク質を取らないようにした。前記チューブにイソプロパノールを５００μＬ加えて混和し、室温で１０分間放置した。４℃に冷却し、１２０００×ｇで１０分間遠心し、上清約１ｍＬを除去した。この沈殿に７５％エタノールを１ｍＬ加えて撹拌して沈殿を十分に懸濁した後、４℃に冷却し、１２０００×ｇで１０分間遠心し、上清を除去した。得られた沈殿（ｔｏｔａｌＲＮＡ）を乾燥させた後、２０μＬのｎｕｃｌｅａｓｅｆｒｅｅｗａｔｅｒに溶かし、ＮａｎｏＤｒｏｐ（スクラム製）によりｍＲＮＡの濃度を測定した。

逆転写
抽出し、測定したｍＲＮＡ溶液を、ｍＲＮＡ濃度が１μｇ／μＬになるように調製した。８連チューブ（容量０．２ｍＬ）に、ＯｌｉｇｏｄＴプライマー１μＬと前記ＲＮＡ溶液１０μＬとを添加した。ＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒにおいて、前記混合液を７０℃で１０分間インキュベートし、ＲＮＡの高次構造を破壊して氷上に移し、一分以上放置した後、以下のような試薬を順に加えた。

ＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒで、４２℃で５分間プレインキュベートした後、逆転写酵素を１μＬ添加し、チューブの内容物をピベッティングでよく混合した。ＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒで、４２℃で５０分間、さらに７０℃で１５分間インキュベートした後、氷上で冷やし、軽く遠心して反応液をチューブの底に集め、−２０℃で凍結保存しておいた。なお、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ^（ＴＭ）測定に使用する場合は、その都度１０倍希釈して用いた。

ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ^（ＴＭ）測定
以下の操作は全てクリーンベンチ内で行った。発現量を測定する遺伝子の断片が入ったプラスミド溶液５ｍＬを、０．６５ｍＬのチューブに加え、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ^（ＴＭ）ＤＮＡＭａｓｔｅｒＳＹＢＲＧｒｅｅｎに付属の水４５ｍＬで１０倍に希釈した。この作業を繰り返し、１０^２、１０^３、１０^４、１０^５、１０^６、１０^７および１０^８倍の希釈溶液を作製した。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ^（ＴＭ）ＣｅｎｔｒｉｆｕｇｅＡｄａｐｔｅｒに専用キャピラリーを、ピンセットを用いてセットし、前記試薬を１８μＬずつ分注した。さらに、ネガティブコントロールとして水、スタンダードとして７段階の希釈溶液、ならびに測定用サンプルのｃＤＮＡの１０倍希釈液をそれぞれ２μＬずつ添加した後、ピンセットを用いて蓋をした。５０００ｒｐｍ、４℃で１０秒間遠心した後、キャピラリーをカルーセルに装填してチャンバーにセットし、測定を行った。

ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ^（ＴＭ）の定量結果を用いて、各サンプルについて、３６Ｂ４のｍＲＮＡと、ａＰ２およびアディポネクチンのそれぞれのｍＲＮＡ発現量との比を算出した。その結果を、下記表３および図２のグラフに示す。

ノビレチンを添加した分化誘導培地で培養した脂肪細胞と、無処置対照の培地で培養した脂肪細胞とを比較した結果、ノビレチンを添加することにより、脂肪細胞におけるアディポネクチンの分泌が有意に増加した。したがって、ノビレチンは、アディポネクチン分泌促進効果を有するといえる。

本実施例は、自然発症糖尿病マウス（ＫＫＡ^ｙ）を用いて、ノビレチンの糖尿病改善効果を確認した例である。

まず、１２匹の自然発症糖尿病マウス（６週齢、雌）を、普通食で一週間予備飼育した。ついで、前記マウスを、平均体重が等しくなるように、コントロール群およびＮＯＢ群の２群に群分けした（ｎ＝６）。そして、コントロール群のマウスには、高脂肪食のみを摂取させ、ＮＯＢ群のマウスには、ノビレチンを０．０２％含有させた高脂肪食を摂取させた。摂取開始２７又は２８日後、これらのマウスから血清を採取した。なお、ノビレチンは、シイクワシャー抽出由来のものを使用した。

（ＥＬＩＳＡによるアディポネクチン分泌量の測定）
酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）によるアディポネクチン分泌量の測定は、マウス／ラットアディポネクチンＥＬＩＳＡキット（商品名）（大塚製薬株式会社製）を用いて行った。なお、前記キットの構成は、以下の通りである。
洗浄用原液
検体希釈用原液
抗体プレート（抗マウスアディポネクチンポリクローナル抗体（ウサギ）固相プレート）
標準品８．０ｎｇ／ｍＬ（リコンビナントマウスアディポネクチン）
ビオチン標識抗体液（ビオチン標識抗マウスアディポネクチンポリクロナール抗体（ウサギ））
酵素標識ストレプトアビジン原液（ＨＲＰ標識ストレプトアビジン）
酵素標識ストレプトアビジン希釈液
基質液Ａ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）
基質液Ｂ（過酸化水素）
反応停止液

まず、以下の試薬および検体液を調製した。
洗浄液
前記洗浄用原液４０ｍＬに対して、精製水を９６０ｍＬの割合で混合し、２．８℃で保存した。
検体希釈液
前記検体希釈用原液５０ｍＬに対して、精製水を２００ｍＬの割合で混合し、２．８℃で保存した。
標準液
前記標準品８．０ｎｇ／ｍＬを、前記検体希釈液で２段階希釈し、４．０ｎｇ／ｍＬ、２．０ｎｇ／ｍＬ、１．０ｎｇ／ｍＬ、０．５ｎｇ／ｍＬおよび０．２５ｎｇ／ｍＬの濃度の標準液を調製した。
酵素標織ストレプトアビジン液
前記酵素標識ストレプトアビジン希釈液１２ｍＬに対して、前記酵素標識ストレプトアビジン原液を６０μＬの割合で混和した。
基質液
前記基質液Ｂ６ｍＬに対して、前記基質液Ａを６ｍＬの割合で混和した。
検体液
前記コントロール群および前記ＮＯＢ群の血清を、４万倍に希釈した。

検査に必要な前記抗体プレートのストリップだけを取り出した。前記洗浄液を、前記抗体プレートの各ウェルに約２００μＬずつ加えた後、プレートウォッシャーで各ウェルの液を完全に吸引除去した。この洗浄および吸引をもう一度繰り返した後、各濃度の標準液および希釈済みの各検体液を各ウェルにそれぞれ１００μＬずつ添加し、二連で測定した。なお、標準液は、測定およびプレートごとに必ず測定した。プレートシールで抗体をカバーし、室温で６０分間静置反応させた後、抗体プレートからプレートシールを取り除き、プレートウォッシャーでウェル中の液を完全に吸引除去した。続いて、洗浄液を各ウェルに約２００μＬずつ加え、速やかに吸引除去した。この洗浄と吸引とをさらに４回繰り返した。前記ビオチン標識抗体液を前記抗体プレートの各ウェルに１００μＬずつ添加した後、プレートシールで抗体をカバーし、室温で６０分間静置反応させた。前述と同様にして、同様にウェルの洗浄と吸引とを５回繰り返した。前記酵素標識ストレプトアビジン液を抗体プレートの各ウェルに１００μＬずつ添加した後、プレートシールで抗体をカバーし、室温で６０分間静置反応させた。前述と同様にして、同様にウェルの洗浄と吸引とを５回繰り返した。基質液を抗体プレートの各ウェルに１００μＬずつ添加し、室温で１５分間静置して反応させた後、反応停止液を抗体プレートの各ウェルに１００μＬずつ加え、プレートリーダーにより各ウェルの４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。前記吸光度の測定によりえられたアディポネクチンの分泌量の測定結果（平均値）を、下記の表４および図３のグラフに示す。

ノビレチンを摂取したＮＯＢ群の糖尿病マウスと、ノビレチンを摂取しなかったコントロール群の糖尿病マウスとにおいてアディポネクチン分泌量を比較した結果、ノビレチンの摂取により脂肪細胞におけるアディポネクチンの分泌量が有意に増加した。つまり、糖尿病罹患者がノビレチンを摂取することにより、アディポネクチンの分泌が促進されて脂肪細胞の状態が正常な状態となり、糖尿病が改善されることから、ノビレチンは、糖尿病改善効果を有するといえる。

以上のように、本発明のＰＰＡＲ活性化剤は、優れたＰＰＡＲ活性を有し、副作用の問題がなく長期間摂取することが可能であり、食品等に好ましく用いることができる。また、ノビレチンは、優れたアディポネクチン分泌促進効果等を有する。したがって、本発明のＰＰＡＲ活性化剤は、例えば、インスリン抵抗性、高インスリン血症、２型糖尿病、高血圧、高脂血症、動脈硬化および肥満などの疾病の予防若しくは改善のための医薬、サプリメント、機能性食品および食品添加物として使用できる。なお、これは、人に限られず、その他動物にも有効である。

Claims

ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体（ＰＰＡＲ）の活性化剤であって、ノビレチンを含むＰＰＡＲ活性化剤。
脂肪細胞において、ＴＮＦ−αおよび遊離脂肪酸の分泌の抑制ならびにアディポネクチンの分泌促進の少なくとも一つの作用を有し、肝臓細胞において、脂肪のβ酸化を促進する作用を有する請求の範囲１記載のＰＰＡＲ活性化剤。
脂肪細胞のアポトーシス、分化および小型化からなる群から選択される少なくとも一つを誘導する請求の範囲１記載のＰＰＡＲ活性化剤。
前記ノビレチンが、柑橘類果実由来のものである請求の範囲１記載のＰＰＡＲ活性化剤。
前記柑橘類が、シイクワシャー（ＣｉｔｒｕｓｄｅｐｒｅｓｓａＨＡＹＡＴＡ）である請求の範囲４記載のＰＰＡＲ活性化剤。
インスリン抵抗性、高インスリン血症、２型糖尿病、高血圧、高脂血症、動脈硬化および肥満からなる群から選択される少なくとも一つの疾病の予防若しくは治療のための医薬であって、請求の範囲１記載のＰＰＡＲ活性化剤を含む医薬。
インスリン抵抗性、高インスリン血症、２型糖尿病、高血圧、高脂血症、動脈硬化および肥満からなる群から選択される少なくとも一つの疾病の予防若しくは改善のためのサプリメントであって、請求の範囲１記載のＰＰＡＲ活性化剤を含むサプリメント。
インスリン抵抗性、高インスリン血症、２型糖尿病、高血圧、高脂血症、動脈硬化および肥満からなる群から選択される少なくとも一つの疾病の予防若しくは改善のための機能性食品であって、請求の範囲１記載のＰＰＡＲ活性化剤を含む機能性食品。
インスリン抵抗性、高インスリン血症、２型糖尿病、高血圧、高脂血症、動脈硬化および肥満からなる群から選択される少なくとも一つの疾病の予防若しくは改善のための食品添加物であって、請求の範囲１記載のＰＰＡＲ活性化剤を含む食品添加物。
ＰＰＡＲ活性化方法であって、ノビレチンによりＰＰＡＲを活性化するＰＰＡＲ活性化方法。
前記ノビレチンが、柑橘類果実由来のものである請求の範囲１０記載のＰＰＡＲ活性化方法。
前記柑橘類が、シイクワシャー（ＣｉｔｒｕｓｄｅｐｒｅｓｓａＨＡＹＡＴＡ）である請求の範囲１１記載のＰＰＡＲ活性化方法。
哺乳動物におけるインスリン抵抗性、高インスリン血症、２型糖尿病、高血圧、高脂血症、動脈硬化および肥満からなる群から選択される少なくとも一つの疾病の予防、治療または改善方法であって、ノビレチンを投与することを含む予防、治療または改善方法。
ＰＰＡＲ活性化剤の製造のためのノビレチンの使用。
前記ノビレチンが、柑橘類果実由来のものである請求の範囲１４記載の使用。
前記柑橘類が、シイクワシャー（ＣｉｔｒｕｓｄｅｐｒｅｓｓａＨＡＹＡＴＡ）である請求の範囲１５記載の使用。
哺乳動物におけるインスリン抵抗性、高インスリン血症、２型糖尿病、高血圧、高脂血症、動脈硬化および肥満からなる群から選択される少なくとも一つの疾病の予防、治療または改善のためにノビレチンを投与することを含む使用。
脂肪細胞において、ＴＮＦ−αおよび遊離脂肪酸の分泌の抑制ならびにアディポネクチンの分泌促進の少なくとも一つの作用を有し、肝臓細胞において、脂肪のβ酸化を促進する請求の範囲１７記載の使用。
脂肪細胞のアポトーシス、分化および小型化からなる群から選択される少なくとも一つを誘導する請求の範囲１７記載の使用。
前記ノビレチンが、柑橘類果実由来のものである請求の範囲１７記載の使用。
前記柑橘類が、シイクワシャー（ＣｉｔｒｕｓｄｅｐｒｅｓｓａＨＡＹＡＴＡ）である請求の範囲２０記載の使用。