JP2019023176A

JP2019023176A - 転写因子活性促進剤および転写因子活性促進用食品組成物

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Publication number: JP2019023176A
Application number: JP2017143214A
Authority: JP
Inventors: 哉伊志嶺; Hajime Ishimine
Original assignee: OKINAWAKEN NOGYO KYODO KUMIAI; Clockwork Inc
Current assignee: OKINAWAKEN NOGYO KYODO KUMIAI; Clockwork Inc
Priority date: 2017-07-25
Filing date: 2017-07-25
Publication date: 2019-02-14

Abstract

【課題】シークワーサーの生理作用に関する新たな知見を提供し、もってシークワーサーの新たな用途を提供する。【解決手段】シークワーサー果実の粉末および／または抽出物を有効成分とする、転写因子活性促進剤および転写因子活性促進用飲食品組成物。本発明によれば、従来より食用とされてきたシークワーサー果実の粉末ないし抽出物を有効成分として、安全に、転写因子の活性を促進することができる。例えば、転写因子がＰＸＲおよび／またはＮｒｆ２である場合は、本発明により肝臓の解毒作用を増強することができる。【選択図】図４

Description

本発明は、シークワーサー果実の粉末および／または抽出物を有効成分とする転写因子活性促進剤および転写因子活性促進用食品組成物に関する。

シークワーサー（Citrus depressa）は、和名をヒラミレモンという柑橘類の植物である。琉球諸島および台湾に自生するほか、沖縄県では特産品として栽培されている。シークワーサーの利用形態としては、主に、果実が食用とされており、完熟果実をそのまま食したり、果汁を料理や飲料、菓子、調味料に加えるなどして使用されている。また、近年は、シークワーサーが種々の生理作用を有することが明らかになっており、健康食品や医薬部外品、化粧品などの原材料としても利用されている。

シークワーサーの生理作用としては、例えば、特許文献１には、種子油がコラーゲン合成促進作用ないしこれに基づくしわ・たるみの予防改善効果や保湿効果を有することが、特許文献２には、果皮の圧搾液が尿酸排泄促進作用を有することが、それぞれ開示されている。

特開２０１４−２２４０８８号特開２０１６−１５５８２５号

しかしながら、上記特許文献を鑑みても、シークワーサーの生理作用の解明や新規用途の開発は、未だ十分にはなされているとはいえない。本発明は係る課題を解決するためになされたものであって、シークワーサーの生理作用に関する新たな知見を提供し、もって新たな用途を提供し、シークワーサーの需要の拡大ないしシークワーサーの栽培や加工、販売等に係る事業の振興に資することを目的としている。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、シークワーサーの果実の粉末や抽出物が、広範囲にわたる転写因子の活性を促進することを見出し、下記の各発明を完成した。

（１）本発明に係る転写因子活性促進剤は、シークワーサー果実の粉末および／または抽出物を有効成分とする。

（２）本発明に係る転写因子活性促進用食品組成物は、シークワーサー果実の粉末および／または抽出物を有効成分とする。

（３）本発明において、転写因子は、ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体γ（ＰＰＡＲγ）、レチノイド受容体α（ＲＡＲα）、NF-E2 related factor 2（Ｎｒｆ２）、プレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）、エストロゲン受容体α（ＥＲα）およびエストロゲン受容体β（ＥＲβ）からなる群から選択されることが好ましい。

（４）本発明において、転写因子がＰＸＲおよび／またはＮｒｆ２である場合は、本発明に係る転写因子活性促進剤または転写因子活性促進用食品組成物は、肝臓の解毒作用を増強するために用いることができる。

（５）本発明において、転写因子がＰＰＡＲγである場合は、本発明に係る転写因子活性促進剤または転写因子活性促進用食品組成物は、ウイルスの増殖を抑制するために用いることができる。

（６）本発明において、転写因子がＥＲαおよび／またはＥＲβである場合は、本発明に係る転写因子活性促進剤または転写因子活性促進用食品組成物は、更年期障害を予防または改善するために用いることができる。

（７）本発明において、転写因子がＲＡＲαである場合は、本発明に係る転写因子活性促進剤または転写因子活性促進用食品組成物は、急性前骨髄球性白血病または皮膚疾患を予防または改善するために用いることができる。

本発明によれば、従来より食用とされてきたシークワーサー果実の粉末ないし抽出物を有効成分とすることから、安全に、転写因子の活性を促進することができる。また、本発明によれば、転写因子の活性促進という、シークワーサーの新たな用途が提供されることから、シークワーサーの需要の拡大に資することができ、ひいてはシークワーサーの栽培や加工、販売等に係る事業の振興に資することができる。

シークワーサー果実の１００％エタノール抽出物、５０％エタノール抽出物および水抽出物を種々の濃度で添加して培養した細胞における、各種転写因子の活性値を示す表である。シークワーサー果実の１００％エタノール抽出物、５０％エタノール抽出物および水抽出物を種々の濃度で添加して培養した細胞における、ＰＰＡＲγの活性値を示す棒グラフである。シークワーサー果実の１００％エタノール抽出物、５０％エタノール抽出物および水抽出物を種々の濃度で添加して培養した細胞における、ＲＡＲαの活性値を示す棒グラフである。シークワーサー果実の１００％エタノール抽出物、５０％エタノール抽出物および水抽出物を種々の濃度で添加して培養した細胞における、Ｎｒｆ２の活性値を示す棒グラフである。シークワーサー果実の１００％エタノール抽出物、５０％エタノール抽出物および水抽出物を種々の濃度で添加して培養した細胞における、ＰＸＲの活性値を示す棒グラフである。シークワーサー果実の１００％エタノール抽出物、５０％エタノール抽出物および水抽出物を種々の濃度で添加して培養した細胞における、ＥＲαの活性値を示す棒グラフである。シークワーサー果実の１００％エタノール抽出物、５０％エタノール抽出物および水抽出物を種々の濃度で添加して培養した細胞における、ＥＲβの活性値を示す棒グラフである。

以下、本発明に係る転写因子活性促進剤および転写因子活性促進用食品組成物について詳細に説明する。

本発明に係る転写因子活性促進剤および転写因子活性促進用食品組成物は、シークワーサー果実の粉末および／または抽出物を有効成分とする。

本発明において、「果実」とは、果肉（さのう）や果皮、じょうのう膜、果しん、種子といった、果実を構成する物（果実構成物）のうちの、少なくともいずれかをいう。すなわち、「果実の粉末／抽出物」は、果肉のみ、果皮のみ、じょうのう膜のみ、果しんのみあるいは種子のみの粉末または抽出物であってもよく、２種類以上の果実構成物の粉末または抽出物であってもよく、果実全体の粉末または抽出物であってもよい。

シークワーサー果実の粉末は、例えば、果実を乾燥させた後に粉砕、もしくは粉砕した後に乾燥すること、または乾燥と粉砕とを同時に行うことにより得ることができる。
ここで、果実の粉砕は、例えば、フードプロセッサーやミキサーなどの粉砕機、あるいは乳鉢および乳棒などを用いて行うことができる。
また、果実の乾燥は、例えば、凍結乾燥、通風乾燥、加熱乾燥、マイクロ波減圧乾燥、遠赤外線減圧乾燥などを行うことができる。ここで、凍結乾燥を行う際の予備凍結温度や乾燥時棚加熱温度、乾燥時間、通風乾燥を行う際の乾燥温度や乾燥時間、加熱乾燥を行う際の乾燥温度や乾燥時間、マイクロ波減圧乾燥を行う際の圧力や出力、乾燥時間、乾燥時品温、遠赤外線減圧乾燥を行う際の圧力やヒーター温度、乾燥時間、乾燥時品温などの諸条件は、果実の量、果実構成物の別、前処理の有無、必要とする乾燥粉末の品質などに応じて適宜設定することができる。

シークワーサー果実の抽出物は、例えば、抽出溶媒にシークワーサーの果実を加えて、一定の時間、振盪、転倒混和、攪拌などすることにより得ることができる。
ここで、抽出溶媒に加えるシークワーサー果実には、あらかじめ、洗浄、凍結乾燥、粉砕、破砕、凍結、冷蔵、乾燥、脱脂などの何らかの前処理を施してもよい。
また、抽出溶媒は、水、親水性有機溶媒、疎水性有機溶媒またはこれらの２種以上からなる混合物のいずれであってもよい。水は、精製、殺菌、滅菌、ろ過、浸透圧調整、緩衝化、加熱などの処理が施されていてもよく、例えば、純水、水道水、冷水、熱水のほか、生理的食塩水、リン酸緩衝液なども用いることができる。また、親水性有機溶媒としては、メタノール、エタノール、ブチルアルコール、グリセリン、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコールなどのアルコール、アセトン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、１，４−ジオキサン、ピリジン、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、酢酸などを用いることができる。また、疎水性有機溶媒としては、ヘキサン、シクロヘキサン、四塩化炭素、クロロホルム、ジクロロメタン、１，２−ジクロロエタン、ジエチルエーテル、酢酸エチル、ベンゼン、トルエン、ｎ−ヘキサン、イソオクタンなどを用いることができる。
また、抽出温度は、必要な抽出物の濃度、抽出溶媒の種類、シークワーサー果実の前処理の有無、抽出時間などに応じて適宜設定することができ、例えば、室温（１℃〜３０℃）でもよく、室温以下に冷却してもよく、室温以上に加熱してもよい。
抽出時間もまた、必要な抽出物の濃度、抽出溶媒の種類、シークワーサー果実の前処理の有無、抽出温度などに応じて適宜設定することができ、例えば、１〜数時間、一晩、一昼夜、数日間などとすることができる。

このようにして得られた抽出物は、必要に応じて精製、濾過、濃縮、乾燥、減圧乾燥などしてもよい。すなわち、本発明に係るシークワーサー果実の抽出物の形態は、固体、液体、半固体などのいずれであってもよい。

なお、本発明において、シークワーサーの果実は、果皮が青い「青切り」のものであってもよく、果皮が黄色い熟したものであってもよい。

転写因子は、プロモーターやエンハンサーといった転写調節領域のＤＮＡに結合し、ＤＮＡ遺伝情報のＲＮＡへの転写を促進あるいは抑制するタンパク質の一群である。すなわち、転写因子は、ＤＮＡに結合して、特定の遺伝子（標的遺伝子）の発現を制御する機能を有する。

本発明において、「転写因子の活性を促進する」とは、「転写因子が標的遺伝子の転写調節領域のＤＮＡに結合することを促進すること」、あるいは「転写因子が標的遺伝子の転写調節をすることを促進すること」をいう。なお、本明細書において、「促進」は「増強」、「増進」、「向上」、「強化」などと交換可能に用いられる。

本発明において、転写因子の活性を促進する態様としては、例えば、本発明の有効成分が、転写因子のリガンド結合ドメインに直接結合することにより転写因子のリガンドとして機能して転写因子の活性を促進する態様や、本発明の有効成分とは別に存在するリガンドと転写因子との結合を促進することにより転写因子の活性を促進する態様を挙げることができる。

本発明に係る転写因子は、上記機能を有するタンパク質である限り特に限定されないが、具体的には、例えば、ｐ４５ＮＦ−Ｅ２、NF-E2 related factor 1（Ｎｒｆ１）、NF-E2 related factor 2（Ｎｒｆ２）、NF-E2 related factor 3（Ｎｒｆ３）、BTB and CNC homology 1（Ｂａｃｈ１）およびBTB and CNC homology 2（Ｂａｃｈ２）などのＣＮＣ転写因子群や、ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体γ（ＰＰＡＲγ）、レチノイド受容体α（ＲＡＲα）、プレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）、エストロゲン受容体α（ＥＲα）およびエストロゲン受容体β（ＥＲβ）などの核内受容体を挙げることができる。

ＣＮＣ転写因子群は、カルボキシル末端側に、ＤＮＡ結合に必要な塩基性領域と二量体形成に必要なロイシンジッパー構造と（ｂ−Ｚｉｐ構造）を持つ一群の転写因子である。

Ｎｒｆ２はＣＮＣ転写因子群に属する転写因子である。Ｎｒｆ２のノックアウトマウスでは、肝臓におけるグルタチオン−Ｓ−転移酵素（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ＧＳＴ）の発現が低下することから（Biochem J.、２００２年、第３６５巻、第４０５−４１６頁）、ＧＳＴはＮｒｆ２の標的遺伝子であり、Ｎｒｆ２により上方制御されていることが報告されている（Trends in Biochemical Sciences.、２００８年、第３４巻、第４号、１７６−１８８頁）。

ここで、哺乳動物のＧＳＴは、特に肝臓に多く存在しており、毒素・薬物・代謝産物などの生体にとって不要な物質とグルタチオンとの結合（グルタチオン抱合）を触媒する酵素である。係るグルタチオン抱合体は腎臓で更なる代謝を受け、最終的に体外へ排出される（宮本徹、「グルタチオンＳ−転移酵素の構造と機能」、東京農大農学集報、２０１３年、第５７巻、第４号、ｐ．２４７−２６０；平塚明、「肝薬物代謝の最近の進歩５．グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ」、肝臓、第４２巻、第６号、ｐ．３０２−３０８）。

すなわち、Ｎｒｆ２の活性を促進して肝臓におけるＧＳＴの発現を促進することにより、肝臓の解毒作用を増強できることから、本発明に係る転写因子がＮｒｆ２である場合は、本発明の転写因子活性促進剤や転写因子活性促進用食品組成物は、肝臓の解毒作用を増強するために用いることができる。

核内受容体は、Ｎ末端ドメイン（Ａ／Ｂ領域）、ＤＮＡ結合ドメイン（Ｃ領域）、ヒンジドメイン（Ｄ領域）、リガンド結合ドメイン（Ｅ領域）およびＣ末端ドメイン（Ｆ領域）の６つのドメインからなる構造を有するタンパク質のスーパーファミリーである。

ＰＸＲは核内受容体に属する転写因子であり、ヒトでは主として肝臓や小腸で発現している。ＰＸＲは、シトクロムＰ４５０酵素（ＣＹＰ）を主要な標的遺伝子としている。
ここで、ＣＹＰは、肝臓に多く発現し、代謝産物や薬物等の多種類の生体異物を水酸化して解毒する酵素である。
従来より、ＰＸＲのリガンドは薬物代謝促進作用を有する医薬として用いられており、例えば、リファンピシンは、ＰＸＲに結合してＣＹＰ３Ａ４の発現を誘導することにより、薬物代謝促進作用を発揮する（Arch Toxicol、２００８年、第８２巻、第６６７−７１５頁）。
すなわち、ＰＸＲの活性を促進してＣＹＰの発現を促進することにより、肝臓の解毒作用を増強できることから、本発明に係る転写因子がＰＸＲである場合は、本発明の転写因子活性促進剤や転写因子活性促進用食品組成物は、肝臓の解毒作用を増強するために用いることができる。

ＰＰＡＲγもまた、核内受容体に属する転写因子である。ＰＰＡＲγは活性化されると、ＮＦ−ｋＢのＤＮＡへの結合を抑制することにより、エイズウイルス（ＨＩＶ−１）の増殖を抑制することが報告されている（ＡＩＤＳ、２００８年、第２２巻、第１３号、第１５３９−１５４９頁）。
さらに、ＰＰＡＲγは活性化されると、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の増殖を抑制することが報告されている（Biochm. Biophys. Res. Commun.、２０１０年、第３９６巻、第２号、第５０８−５１４頁）。
すなわち、ＰＰＡＲγの活性を促進することによりＨＩＶ−１やＨＢＶなどの種々のウイルスの増殖を抑制できることから、本発明に係る転写因子がＰＰＡＲγである場合は、本発明の転写因子活性促進剤や転写因子活性促進用食品組成物は、ウイルスの増殖を抑制するために用いることができる。

ＥＲαおよびＥＲβもまた、核内受容体に属する転写因子である。ＥＲαは、子宮、前立腺、卵巣（莢膜細胞）、精巣上体、骨、乳腺、脳、血管などに広く発現している。ＥＲβは、大腸、前立腺上皮、精巣、卵巣（顆粒膜細胞）、骨髄、唾液腺、血管内皮、脳などに発現している。ＥＲαおよびＥＲβは、生体内ではエストロゲンをリガンドとしており、エストロゲンが結合することにより、標的遺伝子の発現を制御する。標的遺伝子には、生殖機能の形成に関わるものや、骨や脂質代謝などの代謝に関わるものがある。ＥＲαやＥＲβのリガンドは、従来より更年期障害の予防・改善のための医薬として用いられている（生水真紀夫、エストロゲン作用の新知見、［ｏｎｌｉｎｅ］、2012年12月、富士製薬工業株式会社、［平成２９年７月１１日検索］、インターネット＜ＵＲＬ：https://www.fujipharma.jp/product/infertility/smartbook/vol15.pdf＞）。
すなわち、ＥＲαおよび／またはＥＲβの活性を促進することにより、更年期障害を予防または改善できることから、本発明に係る転写因子がＥＲαおよび／またはＥＲβである場合は、本発明の転写因子活性促進剤や転写因子活性促進用食品組成物は、更年期障害を予防または改善するために用いることができる。

ＲＡＲαもまた、核内受容体に属する転写因子である。ＲＡＲαは、レチノイドがリガンドとして結合すると活性化する。ここで、レチノイドは、ビタミンＡの活性本体であるall-trans-retinoic acid（ＡＴＲＡ）と、それと同等の活性を示す化合物群の総称である。従来、ＡＴＲＡは急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）の分化誘導療法剤として用いられているほか、ＡＴＲＡの異性体や類似の活性を持つ合成化合物は、乾癬や角化症、重症のニキビなどの皮膚疾患の改善に用いられている（Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第２９巻、第３号、第１１４−１２６頁、２００６年）。
すなわち、ＲＡＲαを活性化することによりＡＰＬや皮膚疾患の予防または改善に有効であることから、本発明に係る転写因子がＲＡＲαである場合は、本発明の転写因子活性促進剤や転写因子活性促進用食品組成物は、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）や皮膚疾患を予防または改善するために用いることができる。

本発明において、転写因子の活性が促進されたか否かは、定法に従い確認することができ、そのような方法としては、例えば、ルシフェラーゼレポーターアッセイ（Ｃｅｌｌ、第８３巻、第８０３〜８１２頁、１９９５年）を挙げることができる。ルシフェラーゼレポーターアッセイでは、まず、下記（ａ）または（ｂ）のプラスミドを導入した培養細胞を準備する：
（ａ）ホタルルシフェラーゼ遺伝子の上流に標的遺伝子の転写調節領域を連結したレポータープラスミド、
（ｂ）ＧＡＬ４遺伝子のＤＮＡ結合ドメイン（Ｇａｌ４−ＤＢＤ）と転写調節因子のリガンド結合ドメインとのキメラタンパク質を発現するプラスミド、およびホタルルシフェラーゼ遺伝子の上流にＧａｌ４−ＤＢＤ応答配列を連結したレポータープラスミド。
続いて、係るプラスミドを導入した細胞に、本発明の有効成分を作用させた後、ホタルルシフェラーゼの発光強度を測定する。その結果、発光強度が増大すれば、本発明の有効成分により転写因子の活性が促進されたと判断することができ、発光強度が増大しなければ、転写因子の活性が促進されなかったと判断することができる。

本発明の転写因子活性促進剤は、有効成分をそのまま、あるいは医薬品や医薬部外品、食品添加剤、サプリメントなどの形態で、ヒトまたは動物に経口摂取させることにより使用することができる。また、有効成分を、医薬品や医薬部外品、化粧料などの形態で、ヒトまたは動物に非経口的に投与することにより使用してもよい。その他、有効成分を経腸栄養剤に添加して、これを、胃や小腸などの消化管に挿入したチューブを経由して経腸栄養法により投与する方法により使用してもよい。

本発明の転写因子活性促進剤を、医薬品や医薬部外品、サプリメントの形態で用いる場合、その剤型は、経口剤としては、例えば、顆粒剤、散剤、錠剤、シロップ剤、ドライシロップ剤、カプセル剤、溶剤、乳剤あるいは懸濁剤などの剤型にすることができる。また、非経口剤としては、例えば、吸入剤、坐剤などの経腸製剤、経鼻投与剤、液剤、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、コーティング剤、懸濁剤、塗布剤、噴霧剤、貼付剤、点滴剤、注射剤、ローション剤またはパップ剤などの剤型にすることができる。各剤型の製剤は、有効成分であるシークワーサー果実の粉末および／または抽出物に、慣用される添加剤、例えば、賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、界面活性剤、アルコール、水、水溶性高分子、甘味料、矯味剤、酸味料などを剤型に応じて配合し、当業者に公知の方法で製造することができる。

また、本発明の転写因子活性促進用食品組成物は、有効成分をそのまま、飲食物としてヒトまたは動物に摂取させることにより使用することができる。その他、各種の飲食物の通常の製造過程で有効成分を添加して使用することもできる。また、本発明の転写因子活性促進用食品組成物を動物に摂取させる場合は、動物飼料に添加して用いてもよい。すなわち、本発明の食品組成物は、ヒトを摂取対象とするものに限られず、ペットフードや家畜飼料などの動物を摂取対象とするものも含む。

本発明の有効成分をヒトや動物に対して用いる場合の有効成分の使用量（経口摂取量あるいは非経口投与量）は、使用形態、症状、使用対象者の年齢などによって変化し得るが、例えば、大人では、固形分換算で１日あたり約０．１〜２０００ｍｇ／ｋｇ体重程度、約１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重程度、約２〜２００ｍｇ／ｋｇ体重程度などとすることができる。係る使用量は、１日１回に限らず、複数回に分割して使用してもよい。

以下、本発明に係る転写因子活性促進剤および転写因子活性促進用食品組成物について、実施例に基づいて説明する。なお、本発明の技術的範囲は、これらの実施例によって示される特徴に限定されない。

＜実施例１＞シークワーサー果実の粉末および抽出物の調製
（１）粉末
沖縄県産のシークワーサーの生果実（青切り）を定法に従って凍結乾燥した後、フードプロセッサーを用いて粉末化し、シークワーサー果実の粉末を得た。

（２）１００％エタノール抽出物
本実施例１（１）の粉末１００ｍｇに対して、１００％（ｖ／ｖ）エタノールを１ｍＬの割合で加えた後、室温で３時間振盪した。続いて、孔径０．２μｍのメンブレンフィルターで濾過して濾液を回収した後、常温で減圧乾燥して乾固物を得た。続いて、乾固物を４００ｍｇ／ｍＬとなるようジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、これを１００％エタノール抽出物とした。粉末６５０ｍｇから、１ｍＬの１００％エタノール抽出物が得られた。

（３）５０％エタノール抽出物
１００％（ｖ／ｖ）エタノールを５０％（ｖ／ｖ）エタノールに代えて、本実施例１（２）に記載の方法により５０％エタノール抽出物を調製した。粉末９５０ｍｇから、１ｍＬの５０％エタノール抽出物が得られた。

（４）水抽出物
本実施例１（１）の粉末２００ｍｇに対して滅菌水１ｍＬの割合で滅菌水を加え、４℃で一晩振盪した。その後、遠心分離を行って上清を回収した。続いて、上清を孔径０．２μｍのメンブレンフィルターで濾過して濾液を回収し、これを水抽出物とした。粉末２００ｍｇから、１ｍＬの水抽出物が得られた。

＜実施例２＞転写因子活性促進作用の評価
シークワーサー果実の１００％エタノール抽出物、５０％エタノール抽出物および水抽出物について、ルシフェラーゼレポーターアッセイにより、転写因子に対する活性促進作用を評価した。評価対象の転写因子は、ＰＰＡＲγ、ＲＡＲα、Ｎｒｆ２、ＰＸＲ、ＥＲαおよびＥＲβとした。

（１）細胞の準備
具体的には、まず、アフリカミドリザル腎由来細胞株であるＣＶ−１細胞およびヒト肝ガン細胞株であるＨｅｐＧ２細胞を、それぞれ２×１０^５個／ウェルとなるよう６ウェルプレートに播種し、１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ培地）中で１日間培養した。

次に、ＰＰＡＲγ、ＲＡＲα、ＰＸＲ、ＥＲαおよびＥＲβについては、ＧＡＬ４遺伝子のＤＮＡ結合ドメイン（Ｇａｌ４−ＤＢＤ）と各転写因子のリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）とのキメラタンパク質を発現するキメラタンパク質発現プラスミドを用意した。また、ホタルルシフェラーゼ遺伝子の上流にＧａｌ４−ＤＢＤの応答配列を連結したレポータープラスミド（ｐＧａｌ４−Ｌｕｃ）を用意した。また、ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子の上流に遺伝子構成的発現プロモーターであるＣＭＶまたはＳＶ４０を連結した２種類の内部標準プラスミド（ｐＧＬ４．７５ｈＲｌｕｃ−ＣＭＶおよびｐＧＬ４．７３ｈＲｌｕｃ−ＳＶ４０）を用意した。キメラタンパク質発現プラスミド、レポータープラスミドおよび内部標準プラスミドを重量比１：０．９：０．１の割合で混合して混合プラスミド液を調製した。

一方、Ｎｒｆ２については、ホタルルシフェラーゼ遺伝子の上流に、Ｎｒｆ２の標的遺伝子の一つであるＧＳＴＡ２のプロモーター領域を連結したレポータープラスミド（ＧＳＴＡ２−Ｌｕｃ）を用意した。また、内部標準プラスミドとして、ｐＧＬ４．７３ｈＲｌｕｃ−ＳＶ４０を用意した。レポータープラスミドおよび内部標準プラスミドを重量比１．９：０．１の割合で混合して混合プラスミド液を調製した。

それぞれの混合プラスミド液を、総ＤＮＡ量で１０μｇ／ｍＬとなるようＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地に加え、さらに遺伝子導入試薬Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥＨＰ（Ｒｏｃｈｅ）を１／５０量加えてプラスミド導入用培地を調製した。プラスミド導入用培地を１５分間静置した後、ＣＶ−１細胞またはＨｅｐＧ２細胞を播種した各ウェルに２００μＬずつ添加し、６時間培養することによって、プラスミドを導入した細胞（プラスミド導入細胞）を得た。プラスミド導入細胞における、細胞の種類および導入したプラスミドの組合せを表１に示す。

その後、プラスミド導入細胞にトリプシンを作用させて細胞を分散し、９６ウェルプレートに、ＣＶ−１細胞由来のものは１．６×１０^４個／ウェル、ＨｅｐＧ２細胞由来のものは２．０×１０^４個／ウェルとなるよう播種した。続いて、フェノールレッドを含まず、活性炭処理したＦＢＳを１０％（ｖ／ｖ）含むＤＭＥＭ培地（活性炭処理ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地）に培養液を交換した。

（２）ルシフェラーゼ発光強度の測定
実施例１（２）〜（４）のシークワーサー果実の１００％エタノール抽出物、５０％エタノール抽出物および水抽出物を、表２に示す濃度となるよう、活性炭処理ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地に添加して、試験物質含有培地を調製した。なお、表２において、括弧内には、各抽出物を得るために用いられたシークワーサー果実の粉末重量に相当する濃度（粉末相当濃度：ｍｇ／ｍＬ）を示す。また、１００％エタノール抽出物および５０％エタノール抽出物に対する陰性コントロールとして、ＤＭＳＯを終濃度０．５％（ｖ／ｖ）となるよう添加した活性炭処理ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を用意した。同様に、水抽出物に対する陰性コントロールとして、超純水を終濃度１０％（ｖ／ｖ）となるよう添加した活性炭処理ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を用意した。

本実施例２（１）のプラスミド導入細胞を播種したウェル内の培養液を、試験物質含有培地、または、ＤＭＳＯもしくは超純水を添加した活性炭処理ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地に交換して、ＣＯ_２インキュベーター中で４８時間培養した。その後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で細胞を洗浄し、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）およびプレートリーダー（Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｒ、ＡＢ−２３５０ＥＸ；ＡＴＴＯ）を用いてホタルルシフェラーゼおよびウミシイタケルシフェラーゼの発光強度を測定した。この実験を１サンプルにつき３つのウェルを用いて行い、サンプルごとに３つのウェルの発光強度の平均値を算出し、これを当該サンプルの発光強度の測定結果とした。

（３）活性値の算出
本実施例２（２）の測定結果について、次式１により、ホタルルシフェラーゼの発光強度をウミシイタケルシフェラーゼの発光強度で除して、内部標準補正値を算出した。
式１：内部標準補正値＝ホタルルシフェラーゼの発光強度／ウミシイタケルシフェラーゼの発光強度。
続いて、次式２により、試験物質含有培地を用いた場合の内部標準補正値を、ＤＭＳＯまたは超純水を添加した活性炭処理ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を用いた場合の内部標準補正値で除し、得られた値を活性値として定義した。
式２：活性値＝試験物質含有培地を用いた場合の内部標準補正値／ＤＭＳＯまたは超純水を添加した活性炭処理ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を用いた場合の内部標準補正値。

すなわち、活性値は、陰性コントロールの内部標準補正値を１．０として、これに対する、シークワーサー果実の各抽出物を培養液に添加した場合の内部標準補正値の相対比を示す。この活性値が２．０以上となる場合を「活性有り」と評価した。
各サンプルの活性値を図１に示す。なお、図１において、活性有りと評価されたものを網掛けで示す。また、活性値の棒グラフを、転写因子毎に図２〜７に示す。また、図１、図５および図７において、横棒線（−）は、細胞毒性が生じたため評価ができなかったことを示す。

図１および図２に示すように、ＰＰＡＲγに対しては、１００％エタノール抽出物を０．５％、５０％エタノール抽出物を０．２５％および０．５％、ならびに水抽出物を２．０％および５．０％の濃度で培養液に添加した場合に、活性値が２．０以上であった。すなわち、シークワーサー果実の１００％エタノール抽出物、５０％エタノール抽出物および水抽出物のいずれも、ＰＰＡＲγの活性を促進することが明らかになった。

また、図１および図３に示すように、ＲＡＲαに対しては、１００％エタノール抽出物および５０％エタノール抽出物をそれぞれ０．１％、０．２５％および０．５％、ならびに水抽出物を１．０％、２．５％および５．０％の濃度で培養液に添加した場合に、活性値が２．０以上であった。すなわち、シークワーサー果実の１００％エタノール抽出物、５０％エタノール抽出物および水抽出物のいずれも、ＲＡＲαの活性を促進することが明らかになった。

また、図１および図４に示すように、Ｎｒｆ２に対しては、１００％エタノール抽出物および５０％エタノール抽出物をそれぞれ０．２５％および０．５％、ならびに水抽出物を２．５％および５．０％の濃度で培養液に添加した場合に、活性値が２．０以上であった。すなわち、シークワーサー果実の１００％エタノール抽出物、５０％エタノール抽出物および水抽出物のいずれも、Ｎｒｆ２の活性を促進することが明らかになった。

また、図１および図５に示すように、ＰＸＲに対しては、１００％エタノール抽出物を０．１％、０．２５％および０．５％、ならびに５０％エタノール抽出物を０．１％の濃度で培養液に添加した場合に、活性値が２．０以上であった。すなわち、シークワーサー果実の１００％エタノール抽出物および５０％エタノール抽出物のいずれも、ＰＸＲの活性を促進することが明らかになった。

また、図１および図６に示すように、ＥＲαに対しては、１００％エタノール抽出物および５０％エタノール抽出物をそれぞれ０．５％、ならびに水抽出物を５．０％の濃度で培養液に添加した場合に、活性値が２．０以上であった。すなわち、シークワーサー果実の１００％エタノール抽出物、５０％エタノール抽出物および水抽出物のいずれも、ＥＲαの活性を促進することが明らかになった。

また、図１および図７に示すように、ＥＲβに対しては、１００％エタノール抽出物を０．５％、５０％エタノール抽出物を０．２５％および０．５％、ならびに水抽出物を２．０％および５．０％の濃度で培養液に添加した場合に、活性値が２．０以上であった。すなわち、シークワーサー果実の１００％エタノール抽出物、５０％エタノール抽出物および水抽出物のいずれも、ＥＲβの活性を促進することが明らかになった。

以上の結果から、シークワーサー果実の抽出物は、その抽出方法に関わらず、ＰＰＡＲγ、ＲＡＲα、Ｎｒｆ２、ＰＸＲ、ＥＲαおよびＥＲβなどの広範囲の転写因子の活性を促進することが明らかになった。また、抽出方法に関わらず転写因子活性促進作用を有することから、抽出に用いたシークワーサー果実の粉末も、抽出物と同様に、転写因子活性促進作用を有すると考えられた。

Claims

シークワーサー果実の粉末および／または抽出物を有効成分とする転写因子活性促進剤。
転写因子が、ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体γ（ＰＰＡＲγ）、レチノイド受容体α（ＲＡＲα）、NF-E2 related factor 2（Ｎｒｆ２）、プレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）、エストロゲン受容体α（ＥＲα）およびエストロゲン受容体β（ＥＲβ）からなる群から選択される、請求項１に記載の転写因子活性促進剤。
転写因子がプレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）および／またはNF-E2 related factor 2（Ｎｒｆ２）であり、かつ、肝臓の解毒作用の増強に用いられることを特徴とする、請求項１に記載の転写因子活性促進剤。
転写因子がペルオキシソーム増殖剤応答性受容体γ（ＰＰＡＲγ）であり、かつ、ウイルス増殖抑制に用いられることを特徴とする、請求項１に記載の転写因子活性促進剤。
転写因子がエストロゲン受容体α（ＥＲα）および／またはエストロゲン受容体β（ＥＲβ）であり、かつ、更年期障害の予防または改善に用いられることを特徴とする、請求項１に記載の転写因子活性促進剤。
転写因子がレチノイド受容体α（ＲＡＲα）であり、かつ、急性前骨髄球性白血病または皮膚疾患の予防または改善に用いられることを特徴とする、請求項１に記載の転写因子活性促進剤。
シークワーサー果実の粉末および／または抽出物を有効成分とする転写因子活性促進用食品組成物。