TW202227114A

TW202227114A - Ｔｇｒ５活化用組成物

Info

Publication number: TW202227114A
Application number: TW110138683A
Authority: TW
Inventors: 船木亜由太
Original assignee: 日商三得利控股股份有限公司
Priority date: 2020-10-20
Filing date: 2021-10-19
Publication date: 2022-07-16
Also published as: WO2022085602A1; JPWO2022085602A1

Abstract

本發明之目的係提供具有TGR5活化作用，且包含對TGR5之選擇性高的物質作為有效成分之TGR5活化用組成物。本發明有關含有月見草種子萃取物作為有效成分之TGR5活化用組成物。

Description

ＴＧＲ５活化用組成物

本發明有關TGR5活化用組成物等。

TGR5(跨膜G蛋白-偶聯受體(Transmembrane G protein-coupled Receptor 5)係G蛋白質偶聯膽汁酸受體，於骨骼肌、褐色脂肪組織等之多種組織中被發現。作為TGR5之活體內配體已知有膽汁酸。血液中之膽汁酸經由與TGR5結合使細胞內信號活化，發揮抗肥胖、降血糖作用等。專利文獻1中記載大豆皂苷等具有TGR5活化作用。 [先前技術文獻] [專利文獻]

專利文獻1：日本特開2016-27012號公報

[發明欲解決之課題]

受體之激動劑化合物期望對於標的之受體的選擇性高。係因為選擇性低時，由於容易與標的以外之受體結合，故不易充分獲得所需效果，容易產生副作用等問題。針對TGR5，謀求具有TGR5活化作用，且對TGR5之選擇性高之物質。專利文獻1中並未檢討TGR5活化劑對TGR5之選擇性。

本發明之目的在於提供具有TGR5活化作用，且包含對於TGR5之選擇性高的物質作為有效成分之TGR5活化用組成物。且本發明之目的在於提供月見草種子萃取物用以製造TGR5活化用組成物之用途及月見草種子萃取物用以使TGR5活化之用途。 [用以解決課題之手段]

本發明人鑒於上述問題進行積極研究之結果，發現月見草種子萃取物具有TGR5活化作用，而且對於TGR5之選擇性高。

亦即，雖非限定於此，本發明有關以下之TGR5活化用組成物。 [1] 一種TGR5活化用組成物，其係含有月見草種子萃取物作為有效成分。 [2] 如上述[1]之TGR5活化用組成物，其係飲食品、化妝料、醫藥品、準醫藥品或飼料。 [3] 一種月見草種子萃取物之用途，其係用以製造TGR5活化用組成物。 [4] 一種月見草種子萃取物之用途，其係用以活化TGR5。 [發明效果]

依據本發明，提供具有TGR5活化作用，且包含對TGR5之選擇性高的物質作為有效成分之TGR5活化用組成物。本發明之TGR5活化用組成物藉由含有月見草種子萃取物作為有效成分，而具有TGR5活化作用，且對於TGR5之選擇性高。本發明中使用之月見草種子萃取物係自古以來即作為食品原料而可攝取之成分，就安全性高而可連續攝取之方面亦為有利。且，依據本發明，可提供月見草種子萃取物用以製造TGR5活化用組成物之用途及月見草種子萃取物用以使TGR5活化之用途。

本發明之TGR5活化用組成物含有月見草種子萃取物作為有效成分。本發明中，TGR5(跨膜G蛋白-偶聯受體5)較佳為人類TGR5 (hTGR5)。月見草種子萃取物具有活化TGR5之作用(激動劑作用)。月見草種子萃取物具有使TGR5活化，使細胞內cAMP濃度上升之作用。月見草種子萃取物具有對TGR5之選擇性高的特徵。

月見草被歸類為月見草屬(學名：Oenothera)，作為已知之代表種為裂葉月見草(學名：Oenothera laciniata)、月見草(學名：Oenothera striata)、柳葉月見草(學名：Oenothera biennis)、黃花月見草(學名：Oenothera erythrosepala)等。本發明中使用之月見草種類未特別限制，可為1種，亦可為2種以上。其中，較佳為柳葉月見草。

用以獲得月見草種子萃取物之月見草種子的萃取方法未特別限制，可藉由植物成分之萃取所用之通常萃取方法獲得。萃取方法可適當設定，萃取條件亦未特別限制。例如，較佳於室溫或加溫下以溶劑萃取月見草種子(萃取溶劑)而獲得月見草種子萃取物。月見草種子萃取物之調製中，原料的月見草種子可直接用於萃取步驟，亦可粉碎、切斷或乾燥後用於萃取步驟。本發明中月見草種子萃取物可為直接萃取月見草種子之萃取物，亦可為自將月見草種子粉碎、切斷或乾燥者萃取之萃取物。較佳係自將月見草種子粉碎、切斷或乾燥者之萃取物。

且，作為用以自月見草種子萃取月見草種子萃取物之萃取溶劑，若可萃取月見草種子萃取物，則未特別限制。用於調製月見草種子萃取物之萃取溶劑可適當選擇，可使用於萃取月見草種子成分中通常使用者。作為萃取溶劑，舉例為例如水；甲醇、乙醇、丙醇、丁醇等之碳數1~5之1元醇；乙二醇、丙二醇、1,2-丁二醇、1,3-丁二醇、1,4-丁二醇、2,3-丁二醇、甘油等之碳數2~5之多元醇；丙酮、甲基乙基酮等之酮；乙酸甲酯、乙酸乙酯等之酯；四氫呋喃、乙醚、二乙醚等之鏈狀及環狀醚；聚乙二醇等之聚醚；角鯊烷等。該等可單獨使用，亦可使用組合2種以上之混合溶劑(混合液)。作為碳數1~5之1元醇，較佳為碳數1~4者，更佳為碳數2~4者，又更佳為乙醇。作為碳數2~5之多元醇，較佳為碳數2~4之2元或3元醇，更佳為2元醇，又更佳為1,3-丁二醇。其中，作為萃取溶劑，較佳為水、碳數1~5之1元醇、碳數2~5之多元醇、該等之2種以上之混合溶劑，更佳為水、碳數2~4之1元醇或其水溶液、碳數2~4之2元醇或其水溶液，又更佳為水、乙醇、乙醇水溶液、1,3-丁二醇、1,3-丁二醇水溶液，特佳為水、乙醇水溶液或1,3-丁二醇水溶液。一態樣中，乙醇水溶液及1,3-丁二醇水溶液較佳乙醇或1,3-丁二醇濃度為10~98體積%，更佳為30~90體積%，又更佳為30~70體積%。作為本發明之月見草種子萃取物，可適當使用上述溶劑萃取物。

萃取時可添加酸或鹼，調整萃取溶劑之pH。萃取後，較佳自萃取液去除月見草種子殘差(萃取後之月見草種子)。自萃取液去除月見草種子殘渣之方法未特別限制，舉例為過濾、離心分離等之習知分離手段。

作為月見草種子萃取物之萃取方法之一例可使用例如以下方法。將月見草種子或乾燥物細碎，按重量計添加0.1~30倍量之萃取溶劑，常壓下，於室溫較佳萃取10分鐘~15天，更佳30分鐘~10天，又更佳1小時~7天，或於萃取溶劑之沸點附近較佳萃取10分鐘~1天(更佳10分鐘~2小時)後進行過濾獲得濾液。萃取時，可靜置，亦可進行適當攪拌。且，所得濾液(月見草種子萃取物)可直接作為月見草種子萃取物，亦可根據需要予以稀釋、濃縮或乾燥等。

本發明中，藉由萃取所得之月見草種子萃取液可直接作為月見草種子萃取物使用。且，只要不損及本發明效果，亦可藉由習知方法予以稀釋、濃縮或乾燥，作成稀釋液、濃縮物或粉末，亦可調製為糊狀使用。作為乾燥方法舉例為例如冷凍乾燥、噴霧乾燥等。此外，關於上述月見草種子萃取物、其濃縮物及乾燥粉末等，在不損及本發明效果之範圍內，可根據需要，進一步進行除臭、脫色等之純化。此等純化方法可任意選擇通常手段而進行。本發明中之月見草種子萃取物，包含以如上述萃取方法所得之各種溶劑萃取液、其稀釋液、其濃縮物或其乾燥粉末、該等之純化物。且，萃取物亦可藉與萃取溶劑不同之溶劑稀釋或溶解而使用。本發明之組成物中所含之月見草種子萃取物有時亦可自從月見草種子獲得月見草油之製造步驟中所得之壓榨粕，藉由上述萃取方法萃取。作為萃取溫度未特別限制，例如可於常溫下萃取，亦可於70℃以上之溫度萃取。

月見草種子萃取物可藉由上述萃取方法獲得，亦可為市售品。作為月見草種子萃取物之市售品之例，除了月見草種子萃取物-P(粉末，ORYZA油化(股))、月見草種子萃取物-WSPS(水溶性粉末，ORYZA油化(股))以外，作為將月見草種子萃取物粉末溶解於水及1,3-丁二醇之混合溶劑者，舉例為月見草種子萃取物LC(商品名，ORYZA油化(股))、LUNA WHITE B(商品名，ICHMARU PHARCOS(股))等。

結合對TGR5具有活化(激動劑)作用之物質時，細胞內之環狀AMP(cAMP)濃度增加。經由cAMP濃度升高，使標的基因之轉錄活化，發揮各種作用。TGR5之活化可藉由利用報導基因分析之活性評價或TGR5發訊下游之基因表現解析而確認。一態樣中，本發明之TGR5活化用組成物可用以使細胞內cAMP濃度上升。

已報導TGR5活化時，促進肌肉細胞之分化，在骨骼肌特異地使TGR5高表現之小鼠，肌量(肌肉量)增加(Sasaki等人., J. Biol. Chem. (2018) 293(26), 10322-10332)。因此TGR5之活化導致肌量增加。藉由增加肌量，獲得肌力增加、肌量減少抑制、肌力降低抑制等之效果。且因此等效果，而例如可維持肌量、維持肌力、使減少的肌量或肌力恢復。又，TGR5之活化於例如骨骼肌或褐色脂肪細胞中，經由細胞內cAMP濃度上升使線粒體活性上升，導致促進熱產生、改善能量代謝、脂肪酸氧化增加。因此，經由TGR5之活化，獲得促進熱產生、預防或改善肥胖等之效果。又藉由肌量增加、線粒體活性上升，可期待運動機能提高、持久力提高、抑制疲勞等效果。

TGR5於腸道內分泌細胞之L細胞中之活化促進糖代謝。因此經由TGR5之活化，可獲得降血糖效果。又已報導膽汁酸經由TGR5之活化而亢進胃腸道運動，並基於此發揮改善便秘之作用(Alemi等人., Gastroenterology. 2013 Jan；144(1)：145-154)。除上述以外，亦報導TGR5活化抑制了酒精性脂肪肝(Iracheta-Vellve A等人., Hepatol Commun. 2018年10月15日；2(11)：1379-1391)。本發明之TGR5活化用組成物係藉由活化TGR5，可期待發揮如上述之作用。

月見草種子萃取物，經由TGR5之活化，可期待發揮例如肌量增加、肌力增加、肌量減少抑制或肌力降低抑制、運動機能提高、持久力提高、疲勞抑制、預防或改善初衰弱、衰弱、肌少症、運動障礙症候群等之肌量或肌力降低之狀態或疾病、預防或改善肥胖、降血糖、促進熱產生、改善能量代謝、胃腸道運動亢進、預防或改善酒精性脂肪肝、預防或改善代謝症候群等之效果。本發明之TGR5活化用組成物，藉由活化TGR5，可使用以例如獲得上述效果。一態樣中，本發明之TGR5活化用組成物可使用以例如肌量增加、肌力增加、肌量減少抑制或肌力降低抑制；可用以提高運動機能或提高持久力等。一態樣中，本發明之TGR5活化用組成物可使用以例如抑制疲勞、預防或改善初衰弱、衰弱、肌少症、運動障礙症候群等之肌量或肌力降低之狀態或疾病、預防或改善肥胖、降血糖、促進熱產生、改善能量代謝、胃腸道運動亢進、預防或改善酒精性脂肪肝、預防或改善代謝症候群等。本發明中，預防包括預防發病、延遲發病、降低發病率、降低發病風險等。改善狀態或疾病，包含使對象自狀態或疾病恢復、減輕狀態或疾病之症狀、使狀態或疾病症狀好轉、延遲狀態或疾病之進展，亦包含預防等。

本發明之TGR5活化用組成物亦可應用於任何治療用途(醫療用途)或非治療用途(非醫療用途)。所謂非治療係不包含醫療行為即人工手術、治療或診斷之概念。本發明之TGR5活化用組成物可以例如飲食品、化妝料、醫藥品、準醫藥品、飼料等形態提供，但不限於此。本發明之TGR5活化用組成物其本身可為用於TGR5活性之飲食品、化妝料、醫藥品、準醫藥品、飼料等，亦可為調配該等而使用之添加劑等之製劑、原料。本發明之TGR5活化用組成物，作為一例可以劑之形態提供，但不限於本形態。該劑可直接作為組成物，或亦可作成含有該劑之組成物而提供。一態樣中，本發明之TGR5活化用組成物可為經口用組成物，亦可為非經口用組成物，較佳為經口用組成物。作為經口用組成物，舉例為飲食品、經口用醫藥品、經口用準醫藥品、飼料，較佳為飲食品。作為非經口用組成物，舉例為非經口用醫藥品、非經口用準醫藥品、化妝料等。

本發明之TGR5活化用組成物，只要不損及本發明效果，除上述月見草種子萃取物以外，可含有任何添加劑、任意成分。該等添加劑及成分可根據組成物形態加以選擇，可使用一般飲食品、化妝料、醫藥品、準醫藥品、飼料等中可使用者。任意添加劑或成分可使用1種，亦可組合2種以上使用。作為任意添加劑或成分之一例，舉例為製劑化中所調配之賦形劑、黏合劑、乳化劑、張力劑(等張劑)、緩衝劑、溶解輔助劑、防腐劑、安定化劑、抗氧化劑、著色劑、凝固劑、包衣劑、香料等。本發明之TGR5活化用組成物作成飲食品、化妝料、醫藥品、準醫藥品、飼料等時，其製造方法未特別限制，可藉由一般方法製造。

本發明之TGR5活化用組成物作成飲食品時，可於月見草種子萃取物中，調配飲食品可使用之成分(例如上述任意成分等之飲食品原料、根據需要使用之添加劑等)，而作成各種飲食品。飲食品未特別限制，可舉例為例如一般飲食品、保健食品、保健飲料、機能性顯示食品、特定保健食品、病人用飲食品、食品添加劑、該等之原料等。飲食品之形態亦未特別限制，可舉例為固體狀、半流體狀、流體狀等。飲食品亦可作成錠劑、包衣錠劑、細粒劑、顆粒劑、散劑、藥丸、膠囊劑、乾糖漿劑、口嚼劑等之經口用固形製劑；口服液劑、糖漿劑等之經口用液體製劑之各種製劑形態。

本發明之TGR5活化用組成物作成化妝料時，將月見草種子萃取物調配於化妝料中即可，可於月見草種子萃取物中調配化妝料可容許之載體、添加劑等。上述化妝料中，在不損及本發明效果之範圍，可適當含有化妝料容許之載體、添加劑等成分，例如水、醇類、油劑、界面活性劑、增黏劑、金屬皂、凝膠劑、粉體、螯合劑、水溶性高分子、皮膜形成劑、樹脂、包接化合物、抗菌劑、除臭劑、鹽類、pH調整劑、紫外線吸收劑、上述以外之源自動植物·微生物之萃取物、角質溶解劑、酶、激素類、其他維生素類、保濕劑、殺菌劑、抗炎劑、香料之等之1種或2種以上。化妝料可藉一般製造方法製造。例如將上述月見草種子萃取物與上述化妝料可使用之成分1或2種以上混合後，加工成期望形態而獲得。化妝料之製品形態未特別限制。

本發明之TGR5活化用組成物作成醫藥品或準醫藥品時，例如可於月見草種子萃取物中調配藥理學上容許之賦形劑等，作成各種劑型之醫藥品或準醫藥品。基於更充分獲得本發明效果之觀點，醫藥品或準醫藥品之投予形態可為經口投予，亦可非經口投予。基於更充分獲得本發明效果之觀點，投予形態較佳為經口投予。劑型只要為適於投予形態之劑型即可。作為經口醫藥品或經口準醫藥品之劑型，舉例為例如錠劑、包衣錠劑、細粒劑、顆粒劑、散劑、藥丸、膠囊劑、乾糖漿劑、口嚼劑等之經口用固形製劑；口服液劑、糖漿劑等之經口用液體製劑。作為非經口醫藥品或非經口準醫藥品之劑型，舉例為注射劑、滴注劑、軟膏劑、乳液劑、貼片劑、栓劑、經鼻劑、經肺劑(吸入劑)等。醫藥品亦可為非人類動物用醫藥。

本發明之TGR5活化用組成物作成飼料時，可於月見草種子萃取物中調配飼料可使用之成分作成飼料。作為飼料，舉例為例如牛、豬、雞、綿羊、馬等中所用之家畜用飼料；兔子、豚鼠、大鼠、小鼠等使用之小動物用飼料；狗、貓、小鳥等使用之寵物食品。

本發明之TGR5活化用組成物中之月見草種子萃取物之含量未特別限制，可根據該組成物之形態等適當設定。本發明之組成物中之月見草種子萃取物(乾燥物換算)之含量，例如於該組成物中較佳為0.001重量%以上，更佳為0.01重量%以上，又更佳為0.05重量%以上，且較佳為10重量%以下，更佳為5重量%以下。一態樣中，月見草種子萃取物(乾燥物換算)之含量於組成物中較佳為0.001~10重量%，更佳為0.01~5重量%，又更佳為0.05~5重量%。上述含量於含有2種以上不同種類之月見草種子萃取物時，係該等之合計含量。

本發明之TGR5活化用組成物可根據其形態以適當方式攝取或投予。本發明之TGR5活化用組成物較佳經口攝取(經口投予)。本發明之組成物的投予量(也可稱為攝取量)未特別限制。本發明之TGR5活化用組成物之投予量只要為獲得TGR5活性效果之量(有效量)即可，只要根據投予形態、投予方法、對象之體重等適當設定即可。較佳為經口投予或經口攝取。

一態樣中，本發明之TGR5活化用組成物以人類(成人)為對象經口攝取或投予時，月見草種子萃取物(乾燥物換算)之投予量係每天以體重60kg計，較佳為1mg以上，更佳為10mg以上，又更佳為100mg以上，且較佳為1000mg以下，更佳為500mg以下，又更佳為300mg以下。一態樣中，月見草種子萃取物(乾燥產物)之投予量，若為人類(成人)，則每天以體重60kg計，較佳為1~1000mg，更佳為10~500mg，又更佳為100~300mg。上述量較佳為一天一次以上，例如一天一次或分數次(例如2~3次)予以攝取或投予。一態樣中，上述量之月見草種子萃取物較佳對人類經口攝取或投予。一態樣中，本發明之組成物可對於人類，以每60公斤體重，每1天攝取或投與上述量之月見草種子萃取物而使用。上述總投予量，於使用2種以上月見草種子萃取物時，係該等之合計量。

本發明之TGR5活化用組成物較佳係持續攝取或投予者。月見草種子萃取物藉由持續攝取或投予，而期待提高上述效果。一態樣中，本發明之TGR5活化用組成物較佳持續1週以上，更佳4週以上，又更佳8週以上，特佳12週以上攝取或投予。

投予或攝取本發明之TGR5活化用組成物之對象(以下簡稱投予對象)較佳為哺乳動物(人類或非人類哺乳動物)，更佳為人類。作為本發明之投予對象，較佳為需要或希望TGR5活化之對象。且作為本發明之投予對象，亦舉例為需要或希望增加肌量、增加肌力、抑制肌量減少或抑制肌力降低之對象；需要或希望提高運動機能或提高持久力之對象等。作為此等對象，舉例為例如中高齡者、需要或希望預防或改善衰弱、運動障礙症候群或肌少症之對象、運動員等。中高齡者例如為40歲以上的人。一態樣中，中高齡者中，作為對象較佳為老年人。老年人例如為60歲以上或65歲以上的人。本發明之組成物可基於藉由例如增加肌量、增加肌力、抑制肌量減少或抑制肌力降低而可期待預防或改善之症狀或疾病之預防等之目的，亦可用於健康人。

本發明之TGR5活化用組成物亦可於包裝、容器或說明等標示用途、有效成分種類、上述效果、使用方法(例如攝取方法、投予方法)等之1或2者以上。亦可對本發明之TGR5活化用組成物標示TGR5活化作用或基於該等作用而具有之作用的主旨。一態樣中，本發明之TGR5活化用組成物中，作為該等標示，可附加例如選自由「抑制肌肉減少」、「維持肌肉」、「增加肌肉」、「改善肌肉」、「抑制肌力下降」、「維持肌力」、「增加肌力」、「改善肌力」、「支援產生肌肉之力」、「改善步行機能」、「維持步行機能」、「改善運動機能」、「維持運動機能」、「維持因年齡增長而衰退之肌肉」及「維持因年齡增長而衰退之肌力」所成之群之1或2者以上之標示。

一態樣中，本發明之TGR5活化用組成物中，可附加例如「抗肥胖」、「預防肥胖」、「改善肥胖」、「減低腰圍直徑」、「維持腰圍直徑」、「維持苗條身體」、「抑制身體脂肪堆積」、「減少體脂肪」、「抑制內臟脂肪堆積」、「減少內臟脂肪」、「抑制肝臟中脂肪堆積」、「減少肝臟中之脂肪」、「減少體重」、「減量」、「節食」、「脂肪燃燒」、「脂肪消耗」、「脂質代謝」、「線粒體機能」、「熱產生」、「基礎代謝」、「代謝機能」、「代謝力」、「預防代謝症候群」、「改善代謝症候群」等1或2者以上之機能標示。且另一態樣中，本發明之TGR5活化用組成物中，可附加例如「抑制餐後血糖值上升」、「使餐後血糖值穩定上升」、「降低血糖值」、「對於應留意血糖值者」、「對於應留意餐後血糖值者」、「改善血糖值容易上升之體質」等之1或2者以上之標示。

本發明亦包含以下之活化TGR5之方法、用以活化TGR5之用途。一種活化TGR5之方法，係投予月見草種子萃取物。一種月見草種子萃取物之用途，其係用以活化TGR5。上述方法可為治療方法，亦可為非治療方法。上述用途可為治療用途，亦可為非治療用途。對於對象投予月見草種子萃取物時，可使對象中之TGR5活化。月見草種子萃取物可使用於以對象中之TGR5活化。上述方法及用途中，只要使用可獲得期望作用之量(亦可稱為有效量)之月見草種子萃取物即可。月見草種子萃取物、對象、投予方法、投予量、該等之較佳態樣等與上述TGR5活化用組成物相同。月見草種子萃取物可直接投予，亦可作成含有其之組成物投予。例如可投予上述之本發明之TGR5活化用組成物。

本發明亦包含用以製造TGR5活化用組成物的月見草種子萃取物之用途。TGR5活化用組成物及其較佳態樣與上述相同。 [實施例]

以下藉由實施例更詳細說明本發明，但並非因此限制本發明之範圍。

＜實施例1＞藉由螢光素分析評價受驗物質之TGR5活化作用。該評價系係以TGR5下游之訊號之cAMP效應元件結合蛋白(CREB)之轉錄活化而判定人類TGR5(hTGR5)之活化者。由於隨著細胞內cAMP濃度增加，CREB對CRE之結合被活化，並誘導螢光素酶基因之轉錄，故CREB之活化可藉由螢光素酶活性之定量而評價。

又，為了評價受驗物質對TGR5之選擇性，除了強制表現hTGR5之細胞(亦稱為hTGR強制表現細胞)外，亦針對使與hTGR5一樣之G蛋白質偶聯型受體的胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)受體(GLP1R)替代hTGR5而強制表現之細胞(亦稱為hGLP1R強制表現細胞)進行螢光素酶分析。hGLP1R強制表現細胞不表現hTGR5。 GLP1R及TGR5均為G蛋白質偶聯型受體，GLP1R活化時，細胞內cAMP上升。若藉由添加受驗物質使hTGR5強制表現細胞中螢光素酶活性上升，則判斷為該物質具有TGR5活化作用。且，將受驗物質添加於hTGR5強制表現細胞及GLP1R強制表現細胞中，hTGR5強制表現細胞中螢光素酶活性上升相對於GLP1R強制表現細胞中螢光素酶活性之上升越大，可說是受驗物質對TGR5之選擇性越高。

(表現載體之製作) 按以下順序製作hTGR表現載體(pTGR5)。作為源自人類之TGR5基因鹼基序列，參照NM_001077191，設計編碼人類TGR5之人工基因，合成DNA。對真核生物用表現載體pcDNA3.1(+)(Invitrogen(註冊商標)，Thermo Fisher Scientific公司製)，使用該載體之選殖位點BamHI、EcoRI，插入所合成之DNA而製作hTGR表現載體(質體)。轉形宿主使用E. coli K12(dam+dcm+ tonA)調製質體。所構築之hTGR表現載體稱為pTGR5。

CRE反應性螢光素酶表現載體(pCRE/Luc)係使用Promega公司製之pGL4.29 [luc2P/CRE/Hygro]。該質體係保持與cAMP效應元件(CRE)連結之螢光素酶基因的載體。

將pTGR5及pCRE/Luc之2個質體導入大腸桿菌JM109中，培養轉形之大腸桿菌，純化實驗足夠量之質體。純化之質體與轉形所用之質體一起以複數限制酶進行處理，藉由電泳比較其酶處理片段，確認為相同模式，而確認經純化之質體維持與原本載體相同構造(結果未顯示)。以下實驗中，使用上述純化之質體。

(hTGR5強制表現細胞之製作) 以下試驗中，DMEM(杜爾克氏改質鷹氏培養基)使用DMEM(高葡萄糖)(富士軟片和光純藥(股)製)。PBS(磷酸鹽緩衝食鹽水)使用TAKARA-BIO股份有限公司製者。將HEK293細胞(人類胎兒腎細胞株，ATCC：CRL-2828)於DMEM-10%FBS(於DMEM中添加10%胎牛血清(FBS)(Funakoshi(股)製))中，使用T75燒瓶進行繼代培養。去除培養基，以PBS(-)溶液10mL洗淨細胞。於細胞中添加1mL胰蛋白酶液(0.25%胰蛋白酶-EDTA(Nacalai Tesque(股)製)以PBS溶液稀釋10倍者)，靜置約30秒，剝下細胞後添加10mL培養基回收細胞。將回收之細胞移至50mL離心管中，以室溫1000rpm離心3分鐘。所得顆粒以2mL培養基解開，將其一部分以0.2%之台盼藍(Trypan blue)稀釋10倍，使用血球計算盤測量細胞數。於新的T75燒瓶中，以使細胞數為6×10 ⁶個/25mL之方式分注培養基及細胞懸浮液，於培養箱內(37℃，5%CO ₂)中培養22小時左右，本細胞用於導入質體。

對HEK293細胞導入質體係按以下順序進行。於1.5mL試管中取入X-tremeGENE(註冊商標)(Roche公司製)45μL，於室溫添加OptiMEM(註冊商標)碘還原血清培養基(Thermo Fisher SCIENTIFIC公司製)705μL，快速倒轉混合兩次後，藉由將液倒轉旋轉獲得X-tremeGENE稀釋液。於室溫靜製5分鐘後，將質體(hTGR5表現載體(pTGR) (5μg)及CRE反應性螢光素酶表現載體(pCRE/Luc)(5μg))添加於上述X-tremeGENE稀釋液(750μL)中，快速倒轉混合2次後，倒轉旋轉，於室溫靜置25分鐘。於此25分鐘內，將上述接種有HEK293細胞之F75燒瓶的培養基置換為15mL的DMEM+5%FBS(無抗生素)。於室溫靜置25分鐘後，將上述添加有質體之X-tremeGENE稀釋液765μL小心地添加(滴加)於燒瓶中之HEK293細胞中，小心混合，於37℃、5%CO ₂條件下培養5小時。去除培養基，以PBS(-)溶液10mL洗淨細胞。於細胞中添加1mL胰蛋白酶液(0.25%胰蛋白酶-EDTA以PBS溶液稀釋10倍者)，放置約30秒，剝下細胞後添加10mL培養基回收細胞。將回收之細胞移至50mL離心管中，於室溫1000rpm離心3分鐘。所得顆粒於2mL培養基中解開，其一部分以0.2%台盼藍稀釋10倍，使用血球計算盤測量細胞數。將細胞懸浮於種細胞培養基(DMEM (不含FBS，包含青黴素/鏈黴素(富士軟片和光純藥(股)製))中，以75μL/孔播種於96孔白色透明板(Corning公司，Corning 96孔白色透明底平底細胞培養表面處理聚苯乙烯微孔板)中，於培養箱內(37℃，5%CO ₂)培養，作成hTGR5強制表現細胞。

(hGLP1強制表現細胞之製作) 將表達人類GLP1受體(hGLP1R)基因之載體導入HEK293細胞，製作hGLP1R經強制表現之細胞。 hGLP1R表現載體使用GLP1R(NM_002062)人類未標記選殖株(ORIGENE公司)使用。該表現載體係預先將hGLP1R基因插入載體pCMV6-XL5中，具有表現hGLP1R之構造。除了替代hTGR5表現載體(pSTW01)而使用上述hGLP1R表現載體以外，以與上述相同方式將hGLP1R表現載體導入HEK293細胞，獲得hGLP1R強制表現細胞。

(螢光素酶活性之測定) 播種hTGR強制表現細胞培養24小時後，添加月見草種子萃取物(月見草萃取物-P(ORYZA油化(股)製))(終濃度：20μg/mL)，再培養5小時。月見草種子萃取物係溶解於二甲基亞碸(DMSO(Nacalai Tesque (股)製，最終濃度0.1%))後添加。且，替代月見草種子萃取物而添加DMSO (終濃度0.1%)作為陰性對照。培養後，以75μL/孔添加附屬於Dual-Glo(註冊商標)螢光素酶分析系統(Promega公司製)之Dual-Glo螢光酶分析試劑，於室溫保溫10分鐘後，使用多模態微孔板讀取機FlexStation 3(MOLECULAR DEVICES公司製)，測定發光強度。將發光強度設為螢光素酶活性。該評價系中，使用海腎螢光素酶作為內部標準。

為了評價對於hTGR5之選擇性，替代hTGR強制表現細胞，而使用hGLP1R強制表現細胞，以與上述同樣進行螢光素酶之發光測定。

替代月見草種子萃取物，作為陽性對照，將石膽酸(東京化成工業(股)製)溶解於DMSO並添加於hTGR強制表現細胞及hGLP1R強制表現細胞(終濃度3.3μM)，以上述方法測定發光強度。作為另一陽性對照，將牛磺石膽酸鈉鹽(富士軟片和光純藥(股)製)溶解於DMSO並添加於hTGR強制表現細胞及hGLP1R強制表現細胞中(終濃度3.3μM)，以上述方法測定發光強度。於hTGR5強制表現細胞及hGLP1R強制表現細胞中，與陰性對照(DMSO)相比，任一添加陽性對照之情況，均確認發光強度較強。

(結果) (TGR5活化作用) 添加有月見草種子萃取物之hTGR5強制表現細胞，比陰性對照，發光強度更有意義增強(陰性對照之2.0倍)，顯示月見草種子萃取物具有hTGR5活化作用。

(對hTGR5之選擇性) 評價月見草種子萃取物對TGR5之選擇性係藉由hTGR5強制表現細胞中之螢光素酶活性(hTGR5)相對於添加有月見草種子萃取物之hGLP1R強制表現細胞中之螢光素酶活性(hGLP1R)的比(hTGR5/ hGLP1R)而評價。

hTGR5強制表現細胞中之螢光素酶活性(hTGR5)相對於添加有月見草種子萃取物之hGLP1R強制表現細胞中之螢光素酶活性(hGLP1R)的比(hTGR5/hGLP1R)示於表1。該螢光素酶活性之比(hTGR5/ hGLP1R)越大，意指對hTGR5的選擇性越高。且，hTGR5強制表現細胞中之螢光素酶活性(hTGR5)相對於添加有作為陽性對照之石膽酸或牛磺石膽酸鈉鹽之hGLP1R強制表現細胞之螢光素酶活性(hGLP1R)活性的比(hTGR5/hGLP1R)示於表1。又，hTGR5強制表現細胞中之螢光素酶活性(hTGR5)相對於添加有作為陰性對照之DMSO之hGLP1R強制表現細胞中之螢光素酶活性(hGLP1R)的比(hTGR5/hGLP1R)示於表1。表1中「牛磺石膽酸」之記載表示「牛磺石膽酸鈉鹽」。

由以上顯示月見草種子萃取物具有TGR5活化作用。且月見草種子萃取物與陽性對照及陰性對照相比，顯示對於hTGR5之選擇性較高。

Claims

一種TGR5活化用組成物，其係含有月見草種子萃取物作為有效成分。
如請求項1之TGR5活化用組成物，其係飲食品、化妝料、醫藥品、準醫藥品或飼料。
一種月見草種子萃取物之用途，其係用以製造TGR5活化用組成物。
一種月見草種子萃取物之用途，其係用以活化TGR5。