JPWO2005020996A1

JPWO2005020996A1 - リピド・リッチ・プラークの安定化方法及び破裂予防方法

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Publication number: JPWO2005020996A1
Application number: JP2005513426A
Authority: JP
Inventors: 公幸渋谷; 秀之小林; 康展吉中
Original assignee: Kowa Co Ltd
Current assignee: Kowa Co Ltd
Priority date: 2003-08-29
Filing date: 2004-08-19
Publication date: 2007-11-01
Also published as: WO2005020996A1; EP1666038A1; CN100438872C; RU2358734C2; CN1845737A; EP1666038A4; AU2004267972A1; RU2006110035A; AU2004267972B2; US20110015206A1; US20070004749A1; US7884106B2; CA2535920A1; NZ544803A; KR20060111898A; CA2535920C

Abstract

本発明は、２−［４−［２−（ベンズイミダゾール−２−イルチオ）エチル］ピペラジン−１−イル］−Ｎ−［２，４−ビス（メチルチオ）−６−メチル−３−ピリジル］アセトアミド、又はその酸付加塩若しくはこれらの水和物の有効量を、リピド・リッチ・プラークを有する患者に投与することを特徴とする、リピド・リッチ・プラークの安定化方法及び破裂防止方法を提供する。本発明によれば、粥状動脈硬化病巣の病変であるプラークのなかでも、不安定で破裂しやすいリピド・リッチ・プラーク中のマクロファージの占有率を減少せしめ、同時に、コラーゲンの占有率を増加させることにより、プラークの破裂を防止し安定化させることが可能である。

Description

本発明は、粥状動脈硬化病変部におけるリピド・リッチ・プラークの安定化方法及び破裂予防方法に関する。詳細には、２−［４−［２−（ベンズイミダゾール−２−イルチオ）エチル］ピペラジン−１−イル］−Ｎ−［２，４−ビス（メチルチオ）−６−メチル−３−ピリジル］アセトアミド、その酸付加塩又はこれらの水和物の有効量を投与することに基づく、プラーク病変部におけるマクロファージ集簇抑制及びコラーゲン増加による、リピド・リッチ・プラークの安定化方法及び破裂予防方法に関する。

近年、生活水準向上に伴うライフ・スタイルの変化、即ち、高カロリー、高コレステロール食の摂取、運動不足、肥満、社会の複雑化によるストレス、人口の高齢化等により動脈硬化性疾患が急増している。これら動脈硬化性疾患のリスクファクター（危険因子）は、喫煙、肥満、高血圧、高尿酸血症、糖尿病、高脂血症などと幾つかに分類されるが、中でも高トリグリセリド、低ＨＤＬ（ＨＤＬ：高比重リポタンパク質）、高ＬＤＬ（ＬＤＬ：低比重リポタンパク質）等の高脂血症に関心が集まり、特に高コレステロールの低下は薬物療法の対象として重点が置かれ、これまでに様々な治療がなされている。とりわけ、高コレステロール血症に対して最も大きな成果をあげている治療薬としては、コレステロール生合成の律速酵素であるＨＭＧ−ＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ：３−ヒドロキシ−３−メチルグリタリル−コエンザイムＡ）還元酵素を阻害する薬剤（スタチン）が挙げられる。スタチンを用いたコレステロール低下療法は、高脂血症に起因する種々の動脈硬化性疾患、例えば、心筋梗塞及び脳梗塞等に具体的な成果を挙げている。特に急性心筋梗塞を始めとする冠動脈疾患については４Ｓ（ＳｃａｎｄｉｎａｖｉａｎＳｉｍｖａｓｔａｔｉｎＳｕｒｖｉｖａｌＳｔｕｄｙ）やＷＯＳ（ＣＯＰＳ）（ＷｅｓｔｏｆＳｃｏｔｌａｎｄＣｏｒｏｎａｒｙＰｒｅｖｅｎｔｉｏｎＳｔｕｄｙ）などの大規模疫学試験の成績が発表され、５年間にわたる生存率の改善において、その有効性が実証されている。しかしながら、これらシンバスタチン（Ｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎ：特許文献１）、プラバスタチン（Ｐｒａｖａｓｔａｔｉｎ：特許文献２）に代表されるスタチン製剤は効果があると言っても、その冠動脈疾患イベントの発症率に対する改善率はせいぜい３０％程度に過ぎず、医療の現場では決して満足できる状況にはない。さらにスタチンによる薬効発現機序として、体内のコレステロール生合成阻害と同時に、肝臓におけるコレステロールの低下に伴うＬＤＬレセプターの発現増強の結果として、増加したＬＤＬレセプターが血中ＬＤＬの取り込みを促進し、血漿中総コレステロール濃度の低下をもたらすことが知られている。それ故に、家族性コレステロール血症（ＦＨ）のようにＬＤＬレセプターが欠損したホモ及びヘテロ患者では、ＬＤＬコレステロールの低下は充分に期待できないという問題がある。また、高トリグリセリド血症を合併する患者に対し、フィブレート系薬剤とスタチンの併用投与は横紋筋融解現象が起こることが知られ、最近、それが深刻な副作用として販売中止に至ったセリバスタチン（Ｃｅｒｉｖａｓｔａｔｉｎ：特許文献３）の例もある。このような背景から血漿中総コレステロール濃度の低下に連動した抗動脈硬化作用ではなく、動脈硬化病変部位に対して直接作用し治癒できる薬剤が魅力的であり期待も寄せられている。

一方、粥状動脈硬化病巣の主病変であるプラークは、コレステロールとそのエステルで満たされた脂質コアと、細胞外マトリックスと呼ばれる線維性物質で構成されている。それらプラークの中でも、脂質やマクロファージ等の炎症性細胞が豊富で薄い線維性被膜に覆われているリピド・リッチ・プラークは「不安定なプラーク」とも呼ばれ、破裂しやすく、破裂するとプラーク内容物が血流に暴露され血栓形成を促進する。その結果、不安定狭心症、急性心筋梗塞、虚血性突然死などの急性冠状動脈症候群（Ａｃｕｔｅｃｏｒｏｎａｒｙｓｙｎｄｒｏｍｅ：ＡＣＳ）等に至るとされており（非特許文献１）、実際、ＡＣＳでの死亡症例の責任病変を検討した結果、その約７５％はプラークの破裂に伴う血栓形成によるものであったことが知られている（非特許文献２）。血管の狭窄度、即ち、プラークの大きさに着目すると、心筋梗塞の責任病変となっていたのは、多くが狭窄率５０％未満の血管部位であったことが明らかとなった（非特許文献２）。この事実は、プラーク破裂に至る原因はプラークの大きさではなく質に依存していることを示唆している。

プラーク破裂の直接的な原因としては、多量に集簇したマクロファージが分泌するマトリックス・メタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）の関与が疑われ、ＭＭＰが線維性コラーゲンを分解し線維性被膜を菲薄化・脆弱化すると考えられている。さらにマクロファージは、組織因子の発現を通じ破裂部位での血栓形成を促進することも報告されている（非特許文献３）。

従って、ＡＣＳへの対処としては「不安定なプラーク」の破裂を防ぐことが重要と考えられる。そのためにはマクロファージの機能阻害又はマクロファージの集簇そのものを阻害する、あるいは、線維性コラーゲンの分解阻止又はコラーゲン含量増加により線維性皮膜を強化する方法が考えられる。故に急性冠症候群の予防・治療には、血漿中総コレステロール濃度の低下に伴うプラークの退縮効果もさることながら、むしろマクロファージの集簇を阻害しコラーゲンを増加させ、その結果、リピド・リッチ・プラークを安定化させる薬剤がより望ましいことになる。

懸かる事情を鑑み、スタチンとは異なる作用機序を有するコレステロール低下薬として、アシルコエンザイムＡ：コレステロールＯ−アシルトランスフェラーゼ（ＡＣＡＴ）阻害剤が注目されている。

これまでにＡＣＡＴ阻害剤を用いてプラークの退縮効果を見ている報告は多数あるが、いずれも著しい血漿中総コレステロール濃度の低下を伴っており、果たして直接的なプラーク縮小作用を有していたのか否か定かではなく、それらのデータの解釈には混乱をもたらしてきた（非特許文献４、非特許文献５）。

しかし、最近、血漿中総コレステロール濃度に影響を与えずにプラーク退縮効果を示すＡＣＡＴ阻害剤が幾つか報告されている。例えば、日本国公開特許公報第２００２−２５５８０８号（特許文献４）はプラーク退縮剤としてのＡＣＡＴ阻害剤が開示されており、国際公開第ＷＯ０１／０３４１２７号公報（特許文献５）ではプラーク中のマクロファージ蓄積低下並びにＭＭＰの発現低下をもたらすＡＣＡＴ阻害剤が開示されている。しかし、これらの報告はいずれもプラーク縮小作用については言及しているものの、プラークの安定化に寄与する重要な因子の一つである線維性コラーゲン（非特許文献６）の増減については何ら触れられていない。この中で検討されている化合物（アバシミベ、以下ＣＩ−１０１１と表記する。）はプラークの縮小作用は示すものの、線維性コラーゲンを増加させるような、安定化を示唆する所見はない。

以上からも明らかなように、従来のＡＣＡＴ阻害剤とは異なり、血漿中総コレステロール濃度の変動に影響を与えることなく独立にプラークにおけるマクロファージの占有率を減少せしめ、且つ、コラーゲンの占有率を増加させる作用を有し、プラークの破裂を防止し、仮に破裂してもマクロファージの拡散を招かないようにするＡＣＡＴ阻害剤は、未だ知られていない。

米国特許第４，４４４，７８４号米国特許第４，３４６，２２７号米国特許第５，１７７，０８０号日本国公開特許公報第２００２−２５５８０８号国際公開第ＷＯ０１／０３４１２７号公報Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２６（４）：２４２−５０．１９９２Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ９２（３）：６５７−７１．１９９５Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０２：１４０−５２．２０００Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｒｕｇｓ４：３５３−３８７．１９９５ＤｒｕｇＤｉｓｃｏｖｅｒｙＴｏｄａｙ３：１９−２５．１９９８Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．８６：１０１−８．２０００

上記実状に鑑み、本発明者らは鋭意研究した結果、国際公開第ＷＯ９８／５４１５３号公報の実施例３２として開示されている２−［４−［２−（ベンズイミダゾール−２−イルチオ）エチル］ピペラジン−１−イル］−Ｎ−［２，４−ビス（メチルチオ）−６−メチル−３−ピリジル］アセトアミド（以下、化合物１と表記する）、その酸付加塩又はこれらの水和物が、血漿中総コレステロール濃度の変動に著しい影響を与えることなくプラークにおけるマクロファージの占有率を減少せしめ、コラーゲンの占有率を増加させること、即ち、リピド・リッチ・プラークの安定化作用を示唆する所見を見出し、本発明を完成するに至った。なお、ここで化合物１についてのマクロファージ選択的なＡＣＡＴ阻害剤及びそれらを調製する方法は、国際公開第ＷＯ９８／５４１５３号公報に開示されており、それらは、参照により本明細書に組み込まれる。開示されている化合物の用途は、高コレステロール血症及び粥状動脈硬化症の治療であり、さらにはマクロファージ（選択的）泡沫化抑制剤について記載されているが、プラーク安定化作用については何ら記載されていない。

従って、本発明は、化合物１、又はその酸付加塩若しくはこれらの水和物の有効量を、リピド・リッチ・プラークを有する患者に投与することを特徴とする、粥状動脈硬化病巣におけるリピド・リッチ・プラークの安定化方法及び破裂予防方法を提供するものである。また、本発明は、化合物１、又はその酸付加塩若しくはこれらの水和物を有効成分とする、リピド・リッチ・プラークの安定化剤及び破裂予防剤を提供するものである。また、本発明は、化合物１、又はその酸付加塩若しくはこれらの水和物、及び薬学上許容される担体を含有してなる、リピド・リッチ・プラークの安定化作用を有する医薬組成物を提供するものである。また、本発明は、リピド・リッチ・プラークの安定化剤及び破裂予防剤を製造するための、化合物１、又はその酸付加塩若しくはこれらの水和物の使用（ｕｓｅ）を提供するものである。

本発明は、化合物１、又はその酸付加塩若しくはこれらの水和物の有効量を、リピド・リッチ・プラークを有する患者に投与することを特徴とする、プラークの破裂に伴う血栓形成の防止方法を提供するものである。また、本発明は、化合物１、又はその酸付加塩若しくはこれらの水和物を有効成分とする、プラークの破裂に伴う血栓形成の防止剤を提供するものである。また、本発明は、化合物１、又はその酸付加塩若しくはこれらの水和物、及び薬学上許容される担体を含有してなる、プラークの破裂に伴う血栓形成の防止作用を有する医薬組成物を提供するものである。また、本発明は、プラークの破裂に伴う血栓形成の防止用製剤の製造のための、化合物１、又はその酸付加塩若しくはこれらの水和物の使用（ｕｓｅ）を提供するものである。

また、本発明は、化合物１、又はその酸付加塩若しくはこれらの水和物の有効量を、リピド・リッチ・プラークを有する患者に投与することを特徴とする、急性冠動脈症候群の予防及び／又は治療方法を提供するものである。また、本発明は、化合物１、又はその酸付加塩若しくはこれらの水和物を有効成分とする、急性冠動脈症候群の予防及び／又は治療剤を提供するものである。また、本発明は、化合物１、又はその酸付加塩若しくはこれらの水和物、及び薬学上許容される担体を含有してなる、急性冠動脈症候群の予防及び／又は治療作用を有する医薬組成物を提供するものである。また、本発明は、急性冠動脈症候群の予防及び／又は治療用製剤の製造のための、化合物１、又はその酸付加塩若しくはこれらの水和物の使用（ｕｓｅ）を提供するものである。

また、本発明は、化合物１、又はその酸付加塩若しくはこれらの水和物の有効量を、リピド・リッチ・プラークを有する患者に投与することを特徴とする、急性心筋梗塞の予防及び／又は治療方法を提供するものである。また、本発明は、化合物１、又はその酸付加塩若しくはこれらの水和物を有効成分とする、急性心筋梗塞の予防及び／又は治療剤を提供するものである。また、本発明は、化合物１、又はその酸付加塩若しくはこれらの水和物、及び薬学上許容される担体を含有してなる、急性心筋梗塞の予防及び／又は治療作用を有する医薬組成物を提供するものである。また、本発明は、急性心筋梗塞の予防及び／又は治療用製剤の製造のための、化合物１、又はその酸付加塩若しくはこれらの水和物の使用（ｕｓｅ）を提供するものである。

また、本発明は、化合物１、その酸付加塩又はこれらの水和物の有効量を、リピド・リッチ・プラークを有する患者に投与することを特徴とする、不安定狭心症の予防及び／又は治療方法を提供するものである。また、本発明は、化合物１、又はその酸付加塩若しくはこれらの水和物を有効成分とする、不安定狭心症の予防及び／又は治療剤を提供するものである。また、本発明は、化合物１、又はその酸付加塩若しくはこれらの水和物、及び薬学上許容される担体を含有してなる、不安定狭心症の予防及び／又は治療作用を有する医薬組成物を提供するものである。また、本発明は、不安定狭心症の予防及び／又は治療用製剤の製造のための、化合物１、又はその酸付加塩若しくはこれらの水和物の使用（ｕｓｅ）を提供するものである。

さらに、本発明は、化合物１、又はその酸付加塩若しくはこれらの水和物の有効量を、リピド・リッチ・プラークを有する患者に投与することを特徴とする、末梢動脈閉塞症の予防及び／又は治療方法を提供するものである。また、本発明は、化合物１、又はその酸付加塩若しくはこれらの水和物を有効成分とする、末梢動脈閉塞症の予防及び／又は治療剤を提供するものである。また、本発明は、化合物１、又はその酸付加塩若しくはこれらの水和物、及び薬学上許容される担体を含有してなる、末梢動脈閉塞症の予防及び／又は治療作用を有する医薬組成物を提供するものである。また、本発明は、末梢動脈閉塞症の予防及び／又は治療用製剤の製造のための、化合物１、又はその酸付加塩若しくはこれらの水和物の使用（ｕｓｅ）を提供するものである。

図１は、雄性ＡｐｏＥ（ＡｐｏＥ：アポＥ）ノックアウトマウスに化合物１（１００ｍｇ／ｋｇ）、ＣＩ−１０１１（１００ｍｇ／ｋｇ）または溶媒を１日２回、１２週間経口投与した時の、血漿中総コレステロール濃度を示す図である。図２は、雄性アポＥノックアウトマウスに化合物１（１００ｍｇ／ｋｇ）、ＣＩ−１０１１（１００ｍｇ／ｋｇ）または溶媒を１日２回、１２週間経口投与した後、摘出した大動脈起始部標本をビクトリアブルー・ＨＥ（ＨＥ：ヘマトキシリン・エオジン）染色して測定したプラーク断面積を示す図である。図３は、雄性アポＥノックアウトマウスに化合物１（１００ｍｇ／ｋｇ）、ＣＩ−１０１１（１００ｍｇ／ｋｇ）または溶媒を１日２回、１２週間経口投与した後、摘出した大動脈起始部標本をＡｚａｎ（Ａｚａｎ：アザン）染色した結果を示す図である。図４は、雄性アポＥノックアウトマウスに化合物１（１００ｍｇ／ｋｇ）、ＣＩ−１０１１（１００ｍｇ／ｋｇ）または溶媒を１日２回、１２週間経口投与した後、摘出した大動脈起始部標本をマクロファージ免疫化学染色した結果を示す図である。図５は、雄性アポＥノックアウトマウスに化合物１（１００ｍｇ／ｋｇ）、ＣＩ−１０１１（１００ｍｇ／ｋｇ）または溶媒を１日２回、１２週間経口投与した後、摘出した大動脈起始部標本をＳｉｒｉｕｓＲｅｄ（ＳｉｒｉｕｓＲｅｄ：シリウスレッド）染色した結果を示す図である。図６は、雄性アポＥノックアウトマウスに化合物１（１００ｍｇ／ｋｇ）、ＣＩ−１０１１（１００ｍｇ／ｋｇ）または溶媒を１日２回、１２週間経口投与した後、摘出した大動脈起始部のマクロファージ免疫化学染色標本を画像解析し、マクロファージ占有率を求めた結果を示す図である。図７は、雄性アポＥノックアウトマウスに化合物１（１００ｍｇ／ｋｇ）、ＣＩ−１０１１（１００ｍｇ／ｋｇ）または溶媒を１日２回、１２週間経口投与した後、摘出した大動脈起始部のシリウスレッド染色標本を画像解析し、コラーゲン占有率を求めた結果を示す図である。

本発明者らは、アポＥノックアウトマウスを用い、ＡＣＡＴ阻害剤投与による血漿中総コレステロール濃度並びに血管病変に与える影響について検討した。

血漿中総コレステロール濃度に与える影響の検討では、雄性アポＥノックアウトマウスに化合物１（１００ｍｇ／ｋｇ）、ＣＩ−１０１１（１００ｍｇ／ｋｇ）または溶媒を１日２回、１２週間経口投与し、血漿中総コレステロール濃度を測定した。結果を図１に示す。図１の縦軸は血漿中総コレステロール濃度（ｍｇ／ｄＬ）を表す。図１に示すように、対照群に対して化合物１投与群並びにＣＩ−１０１１投与群はいずれも有意な血漿中総コレステロール濃度低下を示したが、その程度は化合物１が僅かであるのに比べ、ＣＩ−１０１１では顕著であることが判明した。

また、血漿脂質の評価と同時に大動脈起始部を摘出しパラフィン包埋の後連続切片を作成し、ビクトリアブルー・ヘマトキシリン・エオジン染色、アザン染色、マクロファージ免疫組織化学染色（抗ＣＤ１１ｂ抗体）及びシリウスレッド染色を行った。

まず、ビクトリアブルー・ヘマトキシリン・エオジン染色標本を用いて内弾性板を光学顕微鏡で解析し、プラーク断面積を特定した結果を図２に示す。図２の縦軸はプラーク断面積（ｍｍ^２）を表す。図２に示すように、対照群に対して化合物１投与群では、殆ど面積は変化しなかったが、ＣＩ−１０１１投与群では有意にプラーク断面積が減少した。

次に、アザン染色の結果を図３に示す。図３に示すように、対照群は、内膜の表層側は薄い赤に染色される泡沫化マクロファージから大部分成っており、深層には青く染色される細胞外マトリックスが僅かに認められた。さらに、プラーク中には、コレステロールクラフトと呼ばれる針状の白く抜けた部分が多く認められた。これに対して、化合物１投与群ではプラークの断面積は対照群と変わらなかったが、プラークは僅かな細胞成分と、それを取り巻く多くの細胞外マトリクスから成っていた。ＣＩ−１０１１投与群では、プラーク断面積は対照群と比較して小さかったが、プラークの大部分は赤く染色されたマクロファージから成っており、青く染色される細胞外マトリックスは乏しかった。

次に、マクロファージ免疫組織化学染色の結果を図４に示す。図４に示すように、対照群では特にプラークの表層側にマクロファージが豊富に認められたが、化合物１投与群ではマクロファージはまばらに存在するのみであった。一方、ＣＩ−１０１１投与群では、プラーク全体にマクロファージが豊富に存在していた。

さらに、シリウスレッド染色の結果を図５に示す。図５に示すように、対照群に比べ、化合物１投与群ではプラーク全体に密なコラーゲン線維が認められた。しかし、ＣＩ−１０１１投与群ではコラーゲン線維が対照群よりも少なかった。

図４から、画像解析法によりプラーク中のマクロファージ占有率を算出した結果を図６に示す。図６の縦軸はプラーク中のマクロファージ占有率（％）を表す。図６に示すように、マクロファージ占有率は、対照群に対して化合物１投与群では有意に減少した。一方、ＣＩ−１０１１投与群では有意な増加を示した。

図５から、画像解析法によりプラーク中のコラーゲン占有率を算出した結果を図７に示す。図７の縦軸は、プラーク中のコラーゲン占有率（％）を表す。図７に示すように、コラーゲン占有率は、対照群に対して化合物１投与群では有意に増加した。一方、ＣＩ−１０１１投与群では減少傾向を示した。

以上のことから、化合物１は、血漿中総コレステロール濃度の変動に大きな影響を与えることなく、プラークにおけるマクロファージの占有率を減少せしめ、且つ、コラーゲンの占有率を増加させる作用を有することが判明した。このように、化合物１はコラーゲンを増加させ、同時にマクロファージの占有率を減少させてプラークを安定化し破裂を防止することが図れる。

従って、本発明は、リピド・リッチ・プラークの安定化方法及び破裂予防方法に関する。詳細には、本発明は、化合物１、又はその酸付加塩若しくはこれらの水和物の１種又は２種以上からなる有効成分を含有してなる医薬組成物の有効量を、リピド・リッチ・プラークを有する患者に投与することを特徴とする、リピド・リッチ・プラークの安定化方法及び破裂予防方法を提供するものである。また、本発明は、化合物１、又はその酸付加塩若しくはこれらの水和物の１種又は２種以上からなる有効成分、及び薬学上許容される担体を含有してなる、リピド・リッチ・プラークの安定化作用及び破裂予防作用を有する医薬組成物を提供するものである。

本発明の化合物１又はその酸付加塩若しくはこれらの水和物は、リピド・リッチ・プラークのコラーゲンを増加させて、マクロファージの占有率を減少させることから、リピド・リッチ・プラークを安定化させ、その破裂を防止し、血栓の形成を防止することができる。従って、本発明は、血栓形成による血栓症、急性冠動脈症候群、急性心筋梗塞、不安定狭心症、末梢動脈閉塞症などの各種の血栓関連疾患の予防剤及び／又は治療剤、その医薬組成物、それを用いた予防及び／又は治療方法、その製造のための使用を提供するものである。

本発明のプラークの安定化作用を有する医薬組成物は、本発明の化合物１を有効成分とするものであり、経口剤又は非経口剤、例えば、経口剤、注射剤、坐剤、軟膏剤、貼付剤などとして、投与形態に適した組成物として、薬学的に許容される担体を配合し、当業者に公知の製剤方法により製造できる。また本発明では化合物１の酸付加塩、又は化合物１若しくはその酸付加塩の水和物を用いることもでき、酸付加塩及び水和物は常法により得ることができる。ここで、酸付加塩を形成する酸としては、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、臭化水素酸、沃化水素酸等の無機酸；酢酸、乳酸、コハク酸、酒石酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマール酸、クエン酸、アスコルビン酸、メタンスルホン酸、ベシル酸、トルエンスルホン酸等の有機酸などが挙げられる。本発明の化合物１、又はその酸付加塩若しくはこれらの水和物は、その１種を有効成分として使用することができるが、これらのなかの２種以上を混合して有効成分として使用することもできる。

経口用固形製剤を調製する場合は、例えば、前記化合物１、その酸付加塩又はこれらの水和物に賦形剤、必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤等を加えた後、常法により錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等を製造することができる。そのような添加剤としては、当該分野で一般的に使用されているものでよく、例えば、賦形剤としては、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、微結晶セルロース、珪酸等を、結合剤としては水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドン等を、崩壊剤としては乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖等を、滑沢剤としては精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコール等を、矯味剤としては白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸等を例示できる。

経口用液体製剤を調製する場合は、例えば、前記化合物１、その酸付加塩又はこれらの水和物に、必要に応じて矯味剤、緩衝剤、安定化剤、矯臭剤等を加えて常法により内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等を製造することができる。この場合矯味剤としては上記に挙げられたもので良く、緩衝剤としてはクエン酸ナトリウム等が、安定化剤としてはトラガント、アラビアゴム、ゼラチン等が挙げられる。

注射剤を調製する場合は、例えば、前記化合物１、その酸付加塩又はこれらの水和物に、必要に応じてｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤等を添加し、常法により皮下、筋肉及び静脈内注射剤を製造することができる。この場合のｐＨ調製剤及び緩衝剤としてはクエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム等が挙げられる。安定化剤としてはピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸等が挙げられる。局所麻酔剤としては塩酸プロカイン、塩酸リドカイン等が挙げられる。等張化剤としては、塩化ナトリウム、ブドウ糖等が例示できる。

他の剤型においても公知の方法に準じて同様に製剤化することができる。かくして得られる本発明のプラークの安定化作用を有する医薬組成物は、粥状動脈硬化病変部におけるプラークの安定化、プラークの破裂に伴う血栓形成の防止、急性冠動脈症候群の予防及び／又は治療、急性心筋梗塞の予防及び／又は治療、不安定狭心症の予防及び／又は治療、末梢動脈閉塞症の予防及び／又は治療等に有効である。

本発明のプラークの安定化作用を有する医薬組成物の投与量は、患者の体重、年齢、性別、症状、投与形態及び投与回数等によって異なるが、通常は成人に対して、前記化合物１、その酸付加塩又はこれらの水和物として一日０．０１〜１０００ｍｇ、好ましくは０．１〜１００ｍｇを１回又は数回に分けて経口投与又は非経口投与するのが好ましい。

なお、米国特許出願６０／４９８，６１０明細書に記載された内容を、本明細書に全て取り込む。

以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

原発性に高脂血症を呈するアポＥノックアウトマウスを用い、以下の方法に従って薬物の抗動脈硬化作用を検討した。

（１）試験方法
１．供試動物
自家繁殖した雄性アポＥノックアウトマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−ＡｐｏＥ＜ｔｍ１Ｕｎｃ＞、ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏ^ＴＭ）を通常の条件下で飼育し、８週齢となった個体を試験に用いた。

２．供試薬物とその調製、及び投与方法・期間
化合物１（国際公開第ＷＯ９８／５４１５３号公報の実施例３２）及び比較薬物であるＣＩ−１０１１（国際公開第ＷＯ９４／２６７０２号公報の実施例５）は、それぞれの公報に記載された方法に従って合成した。化合物１、ＣＩ−１０１１共に、０．５％メチルセルロース（ＭＣ）水溶液に溶解（化合物１）又は懸濁（ＣＩ−１０１１）し、１００ｍｇ／ｋｇの用量とすべく、投与容量が体重１０ｇあたり０．１ｍＬになるように調製して用いた。なお、対照群（薬物未投与群）には、溶媒である０．５％メチルセルロース（ＭＣ）水溶液を用いた。調製した薬液は、１日２回経口投与し、１２週間（２０週齢まで）継続した（計３群、各群１５例）。

３．観察及び検査方法
Ａ．血漿中総コレステロール濃度
最終投与終了後、マウスを絶食した。翌朝、ペントバルビタールナトリウム麻酔下に開腹して腹部大静脈を露出させ、１ｍｌ採血した。採取した血液を３０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離して血漿を分取し、血漿中総コレステロール濃度を、コレステロールＥ−テストワコー（コレステロールオキシダーゼ・ＤＡＯＳ法）にて測定した。
Ｂ．組織学的評価
採血後開胸し、生理食塩液で心尖部より２０−Ｇ注射針を刺し、生理食塩液に続いて、４％パラホルムアルデヒドをそれぞれ灌流圧１２０ｃｍＨ_２Ｏで約５分間灌流して灌流固定後、心臓及び胸部大動脈を採取し、同固定液で一昼夜以上浸漬固定した。その後、ａｏｒｔｉｃｓｉｎｕｓ（大動脈起始部）を切り出し、パラフィン包埋した。連続切片を作製して、ビクトリアブルー・ヘマトキシリン・エオジン染色、アザン染色、マクロファージ免疫組織化学染色（抗ＣＤ１１ｂ抗体）及びシリウスレッド染色を行った。ビクトリアブルー・ヘマトキシリン・エオジン染色標本を用いて内弾性板を光学顕微鏡で特定し、プラーク断面積を解析した（ＷｉｎＲＯＯＦ，三谷商事株）。マクロファージ免疫組織化学染色標本を用いてマクロファージの面積を同様に測定し、プラーク全体の面積に対する割合（マクロファージ占有率）を計算した。また、シリウスレッド染色によりコラーゲンの面積を測定し、プラーク全体の面積中のコラーゲンの占める割合（コラーゲン占有率）を計算した。

４．統計学的解析及びデータ処理法
得られた結果は、平均値±標準誤差で示した。対照群と薬物投与群間の有意差検定は、ダンネット検定で行った。

（２）結果
Ａ．血漿中総コレステロール濃度
各群の血漿中総コレステロール濃度を図１に示す。対照群の血漿中総コレステロール濃度が６４１．８±２３．０ｍｇ／ｄＬであるのに対し、化合物１の１００ｍｇ／ｋｇ投与群では、血漿中総コレステロール濃度は５３５．０±２２．８ｍｇ／ｄＬであり、有意（Ｐ＜０．０１）ではあるものの弱い低下作用を示した。対してＣＩ−１０１１の１００ｍｇ／ｋｇ投与群では、血漿中総コレステロール濃度は３６０．３±１９．４ｍｇ／ｄＬであり、有意（Ｐ＜０．０１）で且つ化合物１よりも顕著な低下作用を示した。以上の結果より、試験した薬物いずれにおいても血漿中総コレステロール濃度の低下作用が見られたが、その作用はＣＩ−１０１１の１００ｍｇ／ｋｇ投与群にて顕著に現れることが判明した。

Ｂ．組織学的評価
各群のビクトリアブルー・ヘマトキシリン・エオジン染色標本で測定したプラーク断面積を図２に示す。対照群のプラーク断面積が０．２３±０．０３ｍｍ^２であるのに対し、化合物１の１００ｍｇ／ｋｇ投与群では、プラーク断面積は０．２２±０．０３ｍｍ^２であり、変化は無かった。対してＣＩ−１０１１の１００ｍｇ／ｋｇ投与群では、プラーク断面積は０．０９±０．０１ｍｍ^２となり、化合物１と比較してプラーク断面積減少作用は強く且つ有意（Ｐ＜０．０１）に現れた。以上の結果より、ＣＩ−１０１１の１００ｍｇ／ｋｇ投与群において、プラーク断面積減少作用、すなわちプラークの縮小作用が見られることが判明した。

アザン染色及び、マクロファージ免疫組織化学染色及びシリウスレッド染色の結果を、それぞれ図３〜図５に示す。なおいずれも、図中下が外膜側に相当する。

アザン染色標本（図３）で、対照群は、内膜の表層側は大部分薄い赤に染まる泡沫化したマクロファージから大部分成っており、深層には青く染まる細胞外マトリックスが僅かに認められた。さらに、プラーク中には、コレステロールクラフトと呼ばれる針状の白く抜けた部分が多く認められた。これに対して、化合物１の１００ｍｇ／ｋｇ投与群では、プラークの断面積は対照群と変わらなかったが、プラークは僅かな細胞成分と、それを取り巻く多くの細胞外マトリクスから成っていた。ＣＩ−１０１１投与群では、プラーク断面積は対照群と比較して小さかったが、プラークの大部分はマクロファージから成っており、細胞外マトリックスは乏しかった。

マクロファージ免疫組織化学染色の結果を図４に示す。図４に示すように、対照群では特にプラークの表層側にマクロファージが豊富に認められたが、化合物１投与群ではマクロファージはまばらに存在するのみであった。一方、ＣＩ−１０１１投与群では、プラーク全体にマクロファージが豊富に存在していた。

シリウスレッド染色の結果を図５に示す。図５に示すように、対照群に比べ、化合物１投与群ではプラーク全体に密なコラーゲン線維が認められた。しかし、ＣＩ−１０１１投与群ではコラーゲン線維が対照群よりも少なかった。

図４から、画像解析法によりプラーク中のマクロファージ占有率を算出した結果を図６に示す。図６に示したように、マクロファージ占有率は、対照群では３３．２±２．２％であるのに対し、化合物１の１００ｍｇ／ｋｇ投与群では２０．０±１．７％と有意（Ｐ＜０．０１）に減少した。一方、ＣＩ−１０１１の１００ｍｇ／ｋｇ投与群では４４．０±２．７％と、有意（Ｐ＜０．０１）な増加を示した。

図５から、画像解析法によりプラーク中のコラーゲン占有率を算出した結果を図７に示す。図７に示したように、コラーゲン占有率は、対照群では９．６±１．１％であるのに対し、化合物１の１００ｍｇ／ｋｇ投与群では１４．９±１．０％と有意（Ｐ＜０．０５）に増加した。一方ＣＩ−１０１１の１００ｍｇ／ｋｇ投与群では７．０±０．９％と、減少傾向を示した。

図６及び図７より、化合物１の１００ｍｇ／ｋｇ投与群では、対照群に比して有意なマクロファージ占有率の低下及びコラーゲン占有率の増加が認められたのに対し、ＣＩ−１０１１の１００ｍｇ／ｋｇ投与群ではマクロファージ占有率の有意な増加及びコラーゲン占有率の低下傾向が見られた。即ち、同様なＡＣＡＴ阻害剤にして予想外にもプラークに対しては全く異なる作用が認められた。

以上、ＡＣＡＴ阻害作用に基づく血漿中総コレステロール濃度低下作用を有する化合物１及びＣＩ−１０１１について、アポＥノックアウトマウスを用いて血漿中総コレステロール濃度、大動脈におけるプラーク断面積及び組織学的評価を検討した。その結果、ＣＩ−１０１１は血漿中総コレステロール濃度を低下させる濃度においてプラーク断面積の減少、即ち、プラーク縮小作用という効果が見られるものの、マクロファージ占有率の増加並びにコラーゲン占有率の低下を示したことから、質的にはむしろプラークを不安定化させることが明らかとなった。一方、化合物１は血漿中総コレステロール濃度を僅かに低下させたのみで、プラーク縮小作用は見られなかったものの、マクロファージ占有率の減少並びにコラーゲン占有率の増加を示したことから、顕著なプラークの安定化作用を有することが明らかとなった。

本発明によれば、粥状動脈硬化病変部におけるリピド・リッチ・プラークの安定化方法及び破裂予防方法を提供することができる。詳細には、２−［４−［２−（ベンズイミダゾール−２−イルチオ）エチル］ピペラジン−１−イル］−Ｎ−［２，４−ビス（メチルチオ）−６−メチル−３−ピリジル］アセトアミド、又はその酸付加塩若しくはこれらの水和物の有効量を投与することに基づく、プラーク病変部におけるマクロファージ集簇抑制及びコラーゲン増加による、リピド・リッチ・プラークの安定化方法及び破裂予防方法を提供することができる。

Claims

２−［４−［２−（ベンズイミダゾール−２−イルチオ）エチル］ピペラジン−１−イル］−Ｎ−［２，４−ビス（メチルチオ）−６−メチル−３−ピリジル］アセトアミド、又はその酸付加塩若しくはこれらの水和物の有効量を、リピド・リッチ・プラークを有する患者に投与することを特徴とする、リピド・リッチ・プラークの安定化方法及び破裂防止方法。
２−［４−［２−（ベンズイミダゾール−２−イルチオ）エチル］ピペラジン−１−イル］−Ｎ−［２，４−ビス（メチルチオ）−６−メチル−３−ピリジル］アセトアミド、又はその酸付加塩若しくはこれらの水和物、及び薬学上許容される担体を含有してなる、リピド・リッチ・プラークの安定化作用及び破裂防止作用を有する医薬組成物。
２−［４−［２−（ベンズイミダゾール−２−イルチオ）エチル］ピペラジン−１−イル］−Ｎ−［２，４−ビス（メチルチオ）−６−メチル−３−ピリジル］アセトアミド、又はその酸付加塩若しくはこれらの水和物の有効量を、リピド・リッチ・プラークを有する患者に投与することを特徴とする、リピド・リッチ・プラークの破裂に伴う血栓形成の防止方法。
２−［４−［２−（ベンズイミダゾール−２−イルチオ）エチル］ピペラジン−１−イル］−Ｎ−［２，４−ビス（メチルチオ）−６−メチル−３−ピリジル］アセトアミド、又はその酸付加塩若しくはこれらの水和物、及び薬学上許容される担体を含有してなる、リピド・リッチ・プラークの破裂に伴う血栓形成の防止作用を有する医薬組成物。
２−［４−［２−（ベンズイミダゾール−２−イルチオ）エチル］ピペラジン−１−イル］−Ｎ−［２，４−ビス（メチルチオ）−６−メチル−３−ピリジル］アセトアミド、又はその酸付加塩若しくはこれらの水和物の有効量を、リピド・リッチ・プラークを有する患者に投与することを特徴とする、急性冠動脈症候群の予防及び／又は治療方法。
２−［４−［２−（ベンズイミダゾール−２−イルチオ）エチル］ピペラジン−１−イル］−Ｎ−［２，４−ビス（メチルチオ）−６−メチル−３−ピリジル］アセトアミド、又はその酸付加塩若しくはこれらの水和物、及び薬学上許容される担体を含有してなる、急性冠動脈症候群の予防及び／又は治療作用を有する医薬組成物。
２−［４−［２−（ベンズイミダゾール−２−イルチオ）エチル］ピペラジン−１−イル］−Ｎ−［２，４−ビス（メチルチオ）−６−メチル−３−ピリジル］アセトアミド、又はその酸付加塩若しくはこれらの水和物の有効量を、リピド・リッチ・プラークを有する患者に投与することを特徴とする、急性心筋梗塞の予防及び／又は治療方法。
２−［４−［２−（ベンズイミダゾール−２−イルチオ）エチル］ピペラジン−１−イル］−Ｎ−［２，４−ビス（メチルチオ）−６−メチル−３−ピリジル］アセトアミド、又はその酸付加塩若しくはこれらの水和物、及び薬学上許容される担体を含有してなる、急性心筋梗塞の予防及び／又は治療作用を有する医薬組成物。
２−［４−［２−（ベンズイミダゾール−２−イルチオ）エチル］ピペラジン−１−イル］−Ｎ−［２，４−ビス（メチルチオ）−６−メチル−３−ピリジル］アセトアミド、又はその酸付加塩若しくはこれらの水和物の有効量を、リピド・リッチ・プラークを有する患者に投与することを特徴とする、不安定狭心症の予防及び／又は治療方法。
２−［４−［２−（ベンズイミダゾール−２−イルチオ）エチル］ピペラジン−１−イル］−Ｎ−［２，４−ビス（メチルチオ）−６−メチル−３−ピリジル］アセトアミド、又はその酸付加塩若しくはこれらの水和物、及び薬学上許容される担体を含有してなる、不安定狭心症の予防及び／又は治療作用を有する医薬組成物。
２−［４−［２−（ベンズイミダゾール−２−イルチオ）エチル］ピペラジン−１−イル］−Ｎ−［２，４−ビス（メチルチオ）−６−メチル−３−ピリジル］アセトアミド、又はその酸付加塩若しくはこれらの水和物の有効量を、リピド・リッチ・プラークを有する患者に投与することを特徴とする、末梢動脈閉塞症の予防及び／又は治療方法。
２−［４−［２−（ベンズイミダゾール−２−イルチオ）エチル］ピペラジン−１−イル］−Ｎ−［２，４−ビス（メチルチオ）−６−メチル−３−ピリジル］アセトアミド、又はその酸付加塩若しくはこれらの水和物、及び薬学上許容される担体を含有してなる、末梢動脈閉塞症の予防及び／又は治療作用を有する医薬組成物。