JPS6394971A - 新規なキトサナ−ゼ生産菌 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は高活性なキトサナーゼを産生ずる新規なキトサ
ナーゼ生産菌に関するものである。

〔従来の技術〕

キトサンは、カニやエビの甲かく中に含まれるアミノ糖
からなる多糖類の１種であるキチンの脱アセチル化物で
ある。そして、キトサンはユニークな特性を有すること
から最近注目されており、例えば、金属の選択的吸着剤
、有機材料用凝固剤、パッケイジングフィルム等に広く
利用可能である。

さらに利用性を向上させるためにキトサンを加水分解し
て低分子のものにすることが行なわれている。キトサン
の加水分解には酵素が使用されている。例えば、１９８
４年アカデミツク　プレスインコーポレーシーａ　ン（
Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　Ｉｎｃ、）より発行さ
れた“キチン、キトサンおよび関連酵素”（ＣＨＩＴＩ
Ｎ、ＣＨＩＴＯ５ＡＮ　ａｎｄ　ＲＥＬＡＴＥＤ　ＥＮ
ＺＹＭＥＳ）　　のＰ１６１〜Ｐ１７９には、土壌から
キトサンを分解する微生物〔バチルス　サーキュランス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）　）が単離
され、該微生物は、キトサンを分解する酵素であるキト
サナーゼを産生ずることが記載されている。

〔発明が解決しようとする問題点〕

本発明は、上記文献記載のバチルス　サーキュランスが
産生ずるよりも高い活性を有するキトサナーゼを産生ず
る新規微生物を提供することを目的とする。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者は、キトサナーゼ生産能を有する微生物を自然
界より広く検索した結果、今回本発明者によって単離さ
れた細菌がキトサナーゼを多量に産出し、かつ該キトサ
ナーゼが高活性を有することを見出し、本発明を完成し
たのである。

すなわち、本発明は、バチルス属に属するキトサナーゼ
生産菌バチルス　サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　
ｃｉｒｃｕｌａｎｃｅ）　　ＬＣＣ−１株を提供する。

本発明で用いるバチルス　サーキュランスＬＣＣ−１株
は、工業技術院微生物工業技術研究所に昭和６１年９月
２９日に微工研菌寄第８９８１号（ＦＥＲＭ　　Ｐ−８
９８１）として寄託されているものであり、次に示す菌
学的性質を有する。

（ｉ）形　　態 大きさ０．６〜０．８　Ｘ　１．５〜２．０μｍのダラ
ム陰性桿菌、周鞭毛を有し、運動性を示し、好気性であ
り、楕円形の芽胞を形成する。コロニー（集落）は金縁
、円形、半レンズ状から偏平状であり、表面は平滑でに
ぷい光沢があり、粘稠、無色である。

（ｉｉ＞生育状態 １．０％コロイダルキトサン、０．１％ペプトン、０．
１％酵母エキス、０．１％に８２ＰＯ，，０，０５％Ｍ
ｇＳＯ４・７Ｈ２０及び１．５％寒天含有（ｐ！１７．
０）キトサン寒天平板培地中、２８℃、９６時間培養す
ると、明確なコロニーを形成する。

（へ）生理学的性質 ■硝酸塩の還元　　　：陽　　性 ■Ｖ−Ｐ反応　　：陰　性 ■インドールの生成　：生成せず ■硫化水素生成　　　：生成せず ■デンプンの加水分解二分解する ■ゼラチンの加水分解：分解する ■ウレアーゼ　　：陽　性 ■オキシダーゼ　　　：陽　　性 ■カフラーゼ　　：陽　性 ［Ｆ］５％ＮａＣＩｔ存在下での生育：生育せず■生育
の温度範囲＝１５〜４２℃で生育し、２５〜３５℃で最
も良く生育する ■生育のｐＨ範囲　　　：ｐ８４〜１１これまでに、キ
トサナーゼを生産するバチルス・サーキュランスに属す
る微生物として報告されているものは、前記“キチン、
キトサンおよび関連酵素”に記載されているものだけで
ある。この菌株をＡ株とすると、本発明のＬＣＣ−１株
は、次に示す５ように菌の大きさおよび運動性の点でＡ
株と明らかに区別できる。

Ａ　株　　　ＬＣＣ−１株 また後述の如くキトサナーゼ生産性においてもＡ株とは
顕著に相違するので、ＬＣＣ−１株をバチルス・サーキ
ュランスに属する新菌株であると結論した。

本発明の菌株は、昭和５９年７月長野県清里村で採取さ
れた土壌から、次の方法により分離された。

コロイダルキトサン１％、ペプトン０．１％、ＫＨ２Ｐ
Ｏ，０，１％、Ｍｇ５Ｏ＜、７Ｌ０　０．０５％、寒天
１．５％含有のキトサン寒天平板培地（ｐｔ１７．０＞
上で土壌試料の懸濁液を１白金耳量画線し、これを２８
℃で９６時間培養した後コロニーを採取し、これを繰返
して菌株を培養した。

この様にして得た菌株を、ペプトン１％、酵母エキス１
％、ＮａＣ４２０，５％、寒天１．５％（ｐＨ７，２）
の寒天平板培地中２８ｔ：で４日間培養した後、４℃に
て保存し、１箇月ごとに新しい培地に植継ぎ保存した。

次に本発明の菌株から生産されるキトサナーゼの理化学
的性質を次に示す。

作　　　用　：　キトサンに作用して、これをｅｎｄｏ
型に分解する。

作用ｐｌ（範囲　：　４〜９（至適ＰＨ６，２）ｐ）１
安゛定性　：　３７℃で６０分処理した場合ｐＨ５〜７
において８０％以上の残 存活性を示す。

至適温度　：　　ｐＨ６，２において、コロイダルキト
サンを基質とした場合４５℃ 付近にある。

温度安定性　：　コロイダルキトサン基質で、ｐＨ６，
２において、０〜５０℃、 ３０分間処理で８０％以上の残 存活性を示す。

等電点：ｐＨ５付近 尚、本発明で得られるキトサナーゼは培養濾液中に存在
するので、キトサンを分解させる際、遠心分離操作によ
る上清液をそのまま使用してもさしつかえないが、キト
サナーゼを単離する場合は、上記理化学的性質を考慮し
て種々の方法を適宜組合せることによって行うことがで
きる。具体的には、硫安分画法、エタノール分画法、透
析法、イオン交換クロマト法、核酸除去法、限外濾過法
、電気泳動法、その他通常用いられている方法を用いる
。

〔発明の効果〕

本発明の菌株、バチルスサーキュランスＬＣＣ−１株を
培養すると、キトサナーゼを多量に産生じ、かつ培養物
から高活性のキトサナーゼを得ることができる。

〔実施例〕

次に実施例により本発明を説明する。

先ス、グルコース１％、ペプトン１％、酵母エキス１％
の培地をＩ　Ｎ　−ＮａＯＨでｐＨ７，０１，：調整し
、その８０−を５００ｍ１坂ロフラスコに分注し滅菌し
た。次に、保存培地からバチルスサーキュランスＬＣＣ
−１株（ＦＥＲＭ　　Ｐ−８９８１）を−白金耳量接種
して２８℃で２４時間培養した。

本培養はキトサン１％、ペプトン０．１％、酵母エキス
０，１％、ＫＨ２ＰＯ，０，１％、Ｍｇ５Ｏ，・７Ｈ２
００，０５％、１−プロパツール０．２％の培地（ｐ）
Ｉ７．０）を８０ｍ１づつ別の５００ｍｊｌ！坂ロフラ
スコに分注し滅菌後、前培養液１　ｍｌを接種し、２８
℃で４８時間振盪培養した・。この操作を繰返し菌を馴
化した。

培養終了後、１００００ｒｐｍ、　４℃にて１０分間遠
心分離し上清液を粗キトサナーゼ液として採取した。

この粗キトサナーゼ液を適宜希釈し、該希釈液０．５艷
に対し１％キトサン液（ｐＨ６，２）　１．５　ｒｎｌ
及び０．１Ｍ７レイン酸緩衝液（ｐＨ６，２）　０．５
　ｒｒｄ！を加え３７℃で２０分間反応（キトサンを加
水分解）さぜた。

反応終了後、沸謄水に浸して反応を停止させ、反応液中
の全還元糖を定量することにより、粗キトサナーゼ液の
キトサナーゼ活性を測定した。すなわち、０．５　Ｍ　
Ｎａ２ＣＯ３水溶液１βに０．５ｇのフェリシアン化カ
リウムを溶解させた液３ｍｌ’と反応液サンプル１−を
共栓付き試験管に入れて混合し、さらに純水２ｍｌを加
え沸ｌテ湯浴中に１５分間浸漬した。

その後、冷却し、４２０ｎｍにおける吸光度を測定した
。得られた値を用い、グルコサミンを標準物質として作
成した検量線からキトサナーゼ活性を定量した。

尚、キトサナーゼ活性１単位（［１ｕｉｔ）は、上記の
条件下、１分間に１ｇモルのグルコサミンに相当する還
元糖を生成するのに必要な酵素量とした。

培養結果を次に示す。

馴化回数　　　最大キトサナーゼ活性 １回　　　　　１０　　（Ｕ／ｍｊり ３回　　　　　２０ ５回　　　　　３５ ８回　　　　　４０ 上記活性は、従来の技術の項で述べた文献記載の細菌“
バチルス・サーキュランスＡ株”が産生じた酵素のキト
サナーゼ活性１〜２１／−に比べて、極めて高いことが
わかる。

手続補正書 ６２．４．ｉ６ １、事件の表示　　　昭和６１年特許願第２４２７４３
号２、発明の名称　　　新規なキトサナーゼ生産菌３、
補正をする者 事件との関係　　出願人 名称　（６７６）ライオン株式会社 ４、代理人 ５、補正命令の日付　　自　　　発 １、　特許請求の範囲を別紙のとおり訂正する。

２、　明細書第３頁下から４行目の”ｃｉｒｃｕｌａｎ
ｃｅ　”を「ｃｉｒｃｕｌａｎｓ　Ｊと訂正する。

３、　同第１０頁１０行の“Ｕｕｉｔ”をｒＵｎｉｔ　
Ｊと訂正する。

特許請求の範囲 バチルス属に属するキトサナーゼ生産菌バチルスサーキ
ュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）　
　ＬＣＣ−１株（微工研菌寄第８９８１号）。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. バチルス属に属するキトサナーゼ生産菌バチルスサーキ
   ュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｉｒｃｕｌａｎｃｅ）
   ＬＣＣ−１株（微工研菌寄第８９８１号）。