JPH0716402B2 - 新規なキトサナ−ゼ生産菌 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は高活性なキトサナーゼを産生する新規なキトサ
ナーゼ生産菌に関するものである。

〔従来の技術〕

キトサンは、カニやエビの甲かく中に含まれるアミノ糖
からなる多糖類の１種であるキチンの脱アセチル化物で
ある。そして、キトサンはユニークな特性を有すること
から最近注目されており、例えば、金属の選択的吸着
剤、有機材料用凝固剤、パッケイジングフィルム等に広
く利用可能である。さらに利用性を向上させるためにキ
トサンを加水分解して低分子のものにすることが行なわ
れている。キトサンの加水分解には酸素が使用されてい
る。例えば、1984年アカデミック プレス インコーポ
レーション（Academic Press Inc.）より発行された
“キチン，キトサンおよび関連酵素”（CHITIN,CHITOSA
N and RELATED ENZYMES）のP161〜P179には、土壌から
キトサンを分解する微生物〔バチルス サーキュランス
（Bacillus circulans）〕が単離され、該微生物は、キ
トサンを分解する酵素であるキトサナーゼを産生するこ
とが記載されている。

〔発明が解決しようとする問題点〕

本発明は、上記文献記載のバチルス サーキュランスが
産生するよりも高い活性を有するキトサナーゼを産生す
る新規微生物を提供することを目的とする。

〔問題点を解決するための手段〕 本発明者は、キトサナーゼ生産能を有する微生物を自然
界より広く検索した結果、今回本発明者によって単離さ
れた細菌がキトサナーゼを多量に産出し、かつ該キトサ
ナーゼが高活性を有することを見出し、本発明を完成し
たのである。

すなわち、本発明は、バチルス属に属するキトサナーゼ
生産菌バチルス サーキュランス（Bacillus circulan
s）LCC−１株を提供する。本発明で用いるバチルス サ
ーキュランスLCC−１株は、工業技術院微生物工業技術
研究所に昭和61年９月29日に微工研菌寄第8981号（FERM
Ｐ−8981）として寄託されているものであり、次に示
す菌学的性質を有する。

（ｉ）形態 大きさ0.6〜0.8×1.5〜2.0μｍのグラム陰性桿菌、周鞭
毛を有し、運動性を示し、好気性であり、楕円形の芽胞
を形成する。コロニー（集落）は全縁、円形、半レンズ
状から偏平状であり、表面は平滑でにぶい光沢があり、
粘稠、無色である。

（ii）生育状態 1.0％コロイダルキトサン、0.1％ペプトン、0.1％酵母
エキス、0.1％KH₂PO₄、0.05％MgSO₄・7H₂O及び1.5％寒
天含有（pH7.0）キトサン寒天平板培地中、28℃、96時
間培養すると、明確なコロニーを形成する。

（iii）生理学的性質 硝酸塩の還元：陽性 Ｖ−Ｐ反応：陰性 インドールの生成：生成せず 硫化水素生成：生成せず デンプンの加水分解：分解する ゼラチンの加水分解：分解する ウレアーゼ：陽性 オキシダーゼ：陽性 カタラーゼ：陽性 ５％NaCl存在下での生育：生育せず 生育の温度範囲:15〜42℃で生育し、25〜35℃で最も
良く生育する 生育のpH範囲:pH4〜11 これまでに、キトサナーゼを生産するバチルス・サーキ
ュランスに属する微生物として報告されているものは、
前記“キチン、キトサンおよび関連酵素”に記載されて
いるものだけである。この菌株をＡ株とすると、本発明
のLCC−１株は、次に示すように菌の大きさおよび運動
性の点でＡ株と明らかに区別できる。

また後述の如くキトサナーゼ生産性においてもＡ株とは
顕著に相違するので、LCC−１株をバチルス・サーキュ
ランスに属する新菌株であると結論した。

本発明の菌株は、昭和59年７月長野県清里村で採取され
た土壌から、次の方法により分離された。

コロイダルキトサン１％、ペプトン0.1％、KH₂PO₄0.1
％、MgSO₄・7H₂O 0.05％、寒天1.5％含有のキトサン寒
天平板培地（pH7.0）上で土壌試料の懸濁液を１白金耳
量画線し、これを28℃で96時間培養した後コロニーを採
取し、これを繰返して菌株を培養した。

この様にして得た菌株を、ペプトン１％、酵母エキス１
％、NaCl0.5％、寒天1.5％（pH7.2）の寒天平板培地中2
8℃で４日間培養した後、４℃にて保存し、１箇月ごと
に新しい培地に植継ぎ保存した。

次に本発明の菌株から生産されるキトサナーゼの理化学
的性質を次に示す。

作用：キトサンに作用して、これをendo型に分解する。

作用pH範囲:4〜９（至適pH6.2） pH安定性:37℃で60分処理した場合pH5〜７において80％
以上の残存活性を示す。

至適温度:pH6.2において、コロイダルキトサンを基質と
した場合45℃付近にある。

温度安定性：コロイダルキトサンを基質で、pH6.2にお
いて、０〜50℃、30分間処理で80％以上の残存活性を示
す。

等電点:pH5付近 尚、本発明で得られるキトサナーゼは培養濾液中に存在
するので、キトサンを分解させる際、遠心分離操作によ
る上清液をそのまま使用してもさしつかえないが、キト
サナーゼを単離する場合は、上記理化学的性質を考慮し
て種々の方法を適宜組合せることによって行うことがで
きる。具体的には、硫安分画法、エタノール分画法、透
析法、イオン交換クロマト法、核酸除去法、限外濾過
法、電気泳動法、その他通常用いられている方法を用い
る。

〔発明の効果〕

本発明の菌株、バチルスサーキュランスLCC−１株を培
養すると、キトサナーゼを多量に産生し、かつ培養物か
ら高活性のキトサナーゼを得ることができる。

〔実施例〕

次に実施例により本発明を説明する。

先ず、グルコース１％、ペプトン１％、酵母エキス１％
の培地を1N−NaOHでpH7.0に調整し、その80mlを500ml坂
口フラスコに分注し滅菌した。次に、保存培地からバチ
ルスサーキュランスLCC−１株（FERM Ｐ−8981）を一
白金耳量接種して28℃で24時間培養した。

本培養はキトサン１％、ペプトン0.1％、酵母エキス0.1
％、KH₂PO₄0.1％、MgSO₄・7H₂O 0.05％、１−プロパノ
ール0.2％の培地（pH7.0）を80mlづつ別の500ml坂口フ
ラスコに分注し滅菌後、前培養液1mlを接種し、28℃で4
8時間振盪培養した。この操作を繰返し菌を馴化した。

培養終了後、10000rpm,4℃にて10分間遠心分離し上清液
を粗キトサナーゼ液として採取した。

この粗キトサナーゼ液を適宜希釈し、該希釈液0.5mlに
対し１％キトサン液（pH6.2）1.5ml及び0.1Mマレイン酸
緩衝液（pH6.2）0.5mlを加え37℃で20分間反応（キトサ
ンを加水分解）させた。

反応終了後、沸騰水に浸して反応を停止させ、反応液中
の全還元糖を定量することにより、粗キトサナーゼ液の
キトサナーゼ活性を測定した。すなわち、0.5M Na₂CO₃
水溶液１に0.5gのフェリシアン化カリウムを溶解させ
た液3mlと反応液サンプル1mlを共栓付き試験管に入れて
混合し、さらに純水2mlを加え沸騰湯浴中に15分間浸漬
した。

その後、冷却し、420nmにおける吸光度を測定した。得
られた値を用い、グルコサミンを標準物質として作成し
た検量線からキトサナーゼ活性を定量した。

尚、キトサナーゼ活性１単位（Unit）は、上記の条件
下、１分間に１μモルのグルコサミンに相当する還元糖
を生成するのに必要な酵素量とした。

培養結果を次に示す。

馴化回数 最大キトサナーゼ活性 １回 10（U/ml） ３回 20 ５回 35 ８回 40 上記活性は、従来の技術の項で述べた文献記載の細菌
“バチルス・サーキュランスＡ株”が産生した酵素のキ
トサナーゼ活性１〜2U/mlに比べて、極めて高いことが
わかる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】バチルス属に属するキトサナーゼ生産菌バ
   チルスサーキュランス（Bacillus circulans）LCC−１
   株（微工研菌寄第8981号）。