JPS6366458A - クロマトグラフイ−用充填剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、水に対し親和性を有し、水を溶出液とするゲ
ルパーミェーションクロマトグラフィー用充填剤、特に
高速液体クロマトグラフィー用充填剤として有用なりロ
マトグラフィー用充填剤に関する。

（従来の技術） ゲルパーミェーションクロマトグラフィー（以下、ＧＰ
Ｃと略す）は、充填剤が充填されたカラムを用い、充填
剤のポアサイズより小さい分子サイズの成分は、大′き
さに応じて充填剤のボア内へ浸透し、大きい成分は充填
剤のボア外を素通りする原理を利用して、分子サイズの
大きい成分から順次分離溶出する液体クロマトグラフィ
ーの一種である。

排除限界分子！　（ＭＬｉ−）とは、充填剤のボア内に
入れない分子の下限の分子量を示し、この値以上の分子
量を有する成分は、実質的に同じ溶出容量を持つので、
分離できない、そのため、ＧＰＣによる分析は、Ｍ、、
以下の成分について行われる。

従来、液体クロマトグラフィー用充填剤としては、■ス
チレンと架橋性単量体ジビニルベンゼンの共重合体ゲル
、■アクリル酸エステル系車量体と架橋性単量体ポリア
ルキレングリコールのポリアクリル酸エステルの共重合
体ゲル（特開昭５５−９９０６８号公１）　、■ポリビ
ニルアルコールをエピクロルヒドリンで架橋したゲル（
特開昭５２−１３８０７７号公報）、■酢酸ビニルとト
リアリルイソシアヌレートの共重合体ゲルを加水分解し
たポリビニルアルコールゲル（特開昭５７−３０９４５
号公報）、■アクリル酸エステル系単量体又はアクリル
アミドと架橋性単量体メチレンビスアクリルアミドの共
重合体ゲル、■デキストランをエピクロルヒドリンで架
橋したゲル（特公昭４７−２１４０５号公＠）、■シリ
カゲルやガラス等の無機系ゲルを化学修飾したもの等が
知られている。

（発明が解決しようとする問題点） 上記■のゲルは、有機溶媒を溶出液とする液体クロマト
グラフィーでは優れた充填剤となり得るが、水とのなじ
みが良くないため、水を溶出液とする場合には使用でき
ない。上記した■、■及び■のゲルは、若干疎水性が残
っているため、被分離物質に疎水性があると、疎水性吸
着を起こし、ＧＰＣ分離を行う場合には都合が悪い。上
記した■及び■のゲルは、疎水性ではないが、機械的強
度に乏しく、高圧がかかる高速液体クロマトグラフィー
用充填剤として用いることはできない。

上記した■のゲルは疎水性でなく、機械的強度もあるが
、アルカリに弱く、耐久性に劣るという欠点があった。

本発明者らは、このような従来技術の問題点を解決する
ため鋭意研究を行い、親水性で、高速液体クロマトグラ
フィーに適用でき、耐久性が良く、しかもＭ　Ｌ　ｉ　
１ｋを蛋白質や水溶性高分子の分離に有効な範囲に任意
に調整でき、充填カラムにした際の較正曲線が直線に近
い（１≦α。１８／α１１≦３．５）、水を溶出液とし
たＧＰＣ用充填剤を提供することを目的とする。

（問題点を解決するための手段） 本発明は、一般式（Ｉ）： 〔式中、Ｒ１はＨ又はＣＨ３を表し、ｎは２〜４の整数
を表し、ｍは０，１又は２を表し、ｍ＋ｎは４である〕
で示される化合物と一般式（■）　：〔式中、Ｒ２及び
Ｒコは、それぞれ独立してＨ又はＣＨ，を表し、ｌは１
〜３０の整数を表す〕で示される化合物を必須成分とす
る架橋多孔性共重合体粒子からなり、ＧＰＣにおけるＭ
　Ｌ　ｉ　ａｔが２×１０４以上であり、かつ較正曲線
の勾配αが１０”からＭ　Ｌ　１　＠の分子量範囲にお
いてα１１ 〔式中、α□。及びα、、ｆ７は、それぞれ前記分子量
範囲内でのαの最大値と最小値を示す〕の範囲内にある
ことを特徴とするクロマトグラフィー用充填剤に関する
。

本発明のゲルは、水を溶出液とするＧＰＣ用充填剤とし
て用いた時に蛋白質や水溶性高分子などを測定するため
に、Ｍ　Ｌ　ｉ　ｍが２Ｘ１０’以上である＊ＭＬｉＭ
が２Ｘ１０’未満である場合には、測定可能な物質がペ
プチドや水溶性オリゴマーに制限されるので好ましくな
い。

Ｍ目、は、自体公知の任意の方法で求めることができる
。例えば、縦軸に分子量既知の水溶性高分子（プルラン
等）の分子量の対数を、横軸に溶出容量を目盛ったグラ
フにプロットして得られる較正曲線の縦軸に平行な線と
それに続く負の勾配を持った直線の交点から求める。

較正曲線の勾配αは、較正曲線上で隣接する実測２点を
直線で結び、その直線についてそれぞれαｉ、を下記″
の（イ）式で求める： 〔式中Ｍ、及びＭ、は、それぞれプルラン等の水溶性高
分子のサンプルの既知分子量を表し、Ｖ　ｌ　ｉ及びＶ
Ｒｊは、それぞれ分子ｆＭｉ及びＭｊの水溶性高分子の
サンプルの溶出容量を表し、■、はカラムの空容積を表
す〕。

本発明において、α、□とαｍｉｙ＋は、各々排除限界
分子量以下の較正曲線を求める際に用いる標準物質の分
子量の異なるサンプルを６点以上測定し、各点を結んだ
直線のうち最大の傾斜と最小の傾斜を意味する。ただし
、標準物質を２種（例えばプルランとポリエチレングリ
コール）使用する場合は、各種の物質について３点以上
測定する。

αを求める際の実測２点は、同じ試料種によるものでな
ければならない。また、（イ）式の中でαｉｊを求める
際に溶出容量の差（■□−Ｖｉｊ）をカラムの空容積（
Ｖ、）で割るのは、カラムサイズの影響を無くすためで
あり、比（例えばα□、／α１１１１１　）を求める際
には、■、＝１としてよい。

本発明の充填剤の較正曲線は、傾斜した部分の直線性が
良い、つまり傾斜した部分のαの最大値（α、、□）と
αの最小値（α、ｉ１）の比が少なくとも１０”からＭ
　１　ｉ　ｔａの分子量範囲で下記（ロ）式の範囲内に
あることが必要である： αｓｉｎ α□Ｘ／αｍｉ＋ｓが３．５より大きい場合には、勾配
の急なところと、ゆるやかなところの分離性能の差が大
きくなりすぎるため、好ましくない。

排除限界分子量以下の較正曲線の直線性は、分離に使用
されるボア（細孔）の分布状態を反映するので、直線性
の良い較正曲線を示すゲルは、ボアが均一に分布してい
るものと考えられる。

Ｍ　Ｌ　ｉ　ｍ及びαは、いずれも充填剤に固有の物性
値であるが、測定条件によって多少影響を受けることが
あるので、好ましい測定条件を示すと、以下の通りであ
る。

カラム：ステンレス類、内径８〜１２難及び長さ３０〜
５０ｃＩ１１ 溶出液：イオン交換水 試料：　分子量既知のプルラン、ポリエチレングリコー
ル、エチレングリコール 流量：０．５〜２．０　ｍｌ　／分 温度二　室温（恒温が好ましい） 検出方法：示差屈折計 本発明の充填剤の粒径は、特に制限されないが、粒径が
小さすぎると、カラムに均一に充填するのが困難になり
、大きすぎると、分離能が低下するので、使用し易い粒
径範囲（例えば８〜１２μｍ）にふるい分は等、公知の
方法で調整して用いるのか好ましい。

粒径の測定法にも、特に制限はなく、例えばコールタ−
カウンター法により測定することができる。

次に、本発明の充填剤の代表的製造法を説明する。

本発明の充填剤は、一般式（Ｉ）： 〔式中、Ｒ１はＨ又はＣＨ，を表し、ｎは２〜４の整数
を表し、ｍは０．１又は２を表し、ｍ＋ｎは４である〕
で示される化合物と一般式（■）：〔式中、Ｒ２及びＲ
３は、それぞれ独立してＨ又はＣＨ３を表し、ｌは１〜
３０の整数を表す〕で示される化合物を水と混和しない
非反応性有機溶媒の存在下に水性懸濁重合させることに
よりクロマトグラフィー用充填剤を製造する方法におい
て、−ｍ式（１）で示される化合物及び一般式（Ｉｆ）
で示される化合物を、前者／後者の重量比で４７１〜３
／７の範囲の割合にすることによって得ることができる
。

本発明に用いられる一般式（Ｉ）の化合物としては、ペ
ンタエリドリフトジアクリレート、ペンタエリドリフト
トリアクリレート、ペンタエリドリフトテトラアクリレ
ート、ペンタエリドリフトジメタクリレート、ペンタエ
リドリフトトリメタクリレート、ペンタエリドリフトテ
トラメタクリレートが挙げられ、これらの一種又は二種
以上を使用できる。これらの化合物は、平均した場合に
、前記一般式（Ｉ）中のｎが２．５以上になるように二
種以上併用して使用するのが機械的強度を向上させる上
で好ましい。

本発明における一般式（ｎ）の化合物としては、エチレ
ングリコール又はポリエチレングリコールのモノアクリ
レート又はモノメタクリレート及びこれらのメチルエー
テルがある。一般式（ＩＩ）において、βが大きすぎる
と、水と混和しない非反応性有機溶媒との相溶性が低下
するため、得られるクロマトグラフィー用充填剤の細孔
の調整が困難になる。−瓜式（ＩＩ）において、ｌは１
〜３０の整数、好ましくは５〜１５の整数である。これ
らも一種又は二種以上使用することができる。

−ａ式（１）で示される化合物と一般式（ＩＩ）で示さ
れる化合物は、前者が多すぎると架橋度が増加し、機械
的強度は上がるが、疎水性になり、後者が多すぎると、
親水性は向上するが、架橋度が減少し、機械的強度が低
下するため、重量比で前者／後者が４／１〜３／７の範
囲になるように使用されるが、耐圧性と親水性が厳密に
要求される場合には、２／１〜２／３の範囲になるよう
に使用されるのが特に好ましい。

また、必要に応じて他のビニル系単量体を全ビニル系単
量体に対して１０重景％以下で使用してもよい。他のビ
ニル系単量体が多すぎると、クロマトグラフィー用充填
剤の親水性が阻害されやすくなる。

他のビニル系単量体としては、アクリル酸系単量体及び
その他のビニル系単量体を使用することができる。

アクリル酸系単量体としては、アクリル酸、メタクリル
酸及びこれらの誘導体がある。誘導体としては、アクリ
ル酸メチル、アクリル酸エチル、アクリル酸ブチル、ア
クリル酸ラウリル等のアクリル酸アルキルエステル、メ
タクリル酸メチル、メタクリル酸エチル、メタクリル酸
ブチル、メタクリル酸ラウリル等のメタクリル酸アルキ
ルエステル、アクリル酸２−ヒドロキシプロピル、アク
リル酸ヒドロキシブチル等のアクリル酸ヒドロキシアル
キルエステル、トリメチロールプロパン、トリメチロー
ルエタン等の多価アルコールのアクリル酸モノエステル
、ジエステル又はトリエステル、ポリプロピレングリコ
ールモノアクリレート等のポリアルキレングリコールの
アクリル酸モノエステル、ジエステル又はトリエステル
、メククリル酸２−ヒドロキシプロピル、゛メタクリル
酸ヒドロキシブチル等のメタクリル酸ヒドロキシアルキ
ルエステル、トリメチロールプロパン、トリメチロール
エタン等の多価アルコールのメタクリル酸モノエステル
、ジエステル又はトリエステル、ポリエチレングリコー
ルモノアクリレート、ポリプロピレングリコールモノメ
タクリレート等のポリアルキレングリコールのメタクリ
ル酸モノエステル又はジエステル、ジエチルアミノエチ
ルアクリレート等のジアルキルアミノアルキルアクリレ
ート、ジエチルアミノエチルメタクリレート等のジアル
キルアミノアルキルメタクリレート、アクリルアミド、
メタクリルアミド、グリシジルアクリレート、グリシジ
ルメタクリレート等、更に上記のアクリル酸ヒドロキシ
アルキル、上記のメタクリル酸ヒドロキシアルキル、上
記の多価アルコールのアクリル酸モノエステル、上記の
多価アルコールのメタクリル酸モノエステル、上記のポ
リアルキレングリコールのアクリル酸モノエステル及び
上記のポリアルキレングリコールのメタクリル酸モノエ
ステルのメチルエーテル、エチルエーテル、プロピルエ
ーテル、ブチルエーテル、ペンチルエーテル等のアルキ
ルエーテル等がある。トリス（β−ヒドロキシエチル）
イソシアヌレートのアクリル酸モノエステル、ジエステ
ル又はトリエステル、同様のメタクリル酸のモノエステ
ル、ジエステル又はトリエステルも使用できる。

アクリル酸系単量体以外の一般式（１）又は（ｎ）で表
されるビニル系単量体と共重合させ得る他のビニル系単
量体としては、マレイン酸、フマール酸、イタコン酸及
びこれらのアクリル酸又はメタクリル酸誘導体と同様の
誘導体、ビニルピリジン、ビニルピロリドン、酢酸ビニ
ル、アクリロニトリル、スチレン又はクロロスチレン、
クロロメチルスチレン、ビニルトルエン、エチルビニル
ベンゼン、α−メチルスチレン、ジビニルベンゼン等の
スチレン誘導体等がある。

本発明において、水と混和しない非反応性有機溶媒とし
ては、オクタン、ノナン、デカン、ドデカン等の脂肪族
炭化水素、酢酸プロピル、酢酸ブチル、酢酸アミル、酢
酸ヘキシル等の脂肪酸エステル、ブチルアルコール、ア
ミルアルコール、ヘキサノール等のアルコール等が挙げ
られる。これらの一種又は二種以上を使用することがで
きる。

Ｍ　Ｌ　ｉ　ｆｆｉを蛋白質や水溶性高分子等の公認に
有効な範囲に調整したり、充填カラムにした際の較正曲
線が直線に近くなる（１≦αｍａｘ　／α□７≦３．５
）ように調整するためには、脂肪酸エステルと脂肪族ア
ルコール又は脂肪族炭化水素の徂み合わせが好ましい。

具体的には、酢酸ｎ−ブチルとイソアミルアルコール又
はｎ−オクタン等が挙げられる。

本明細書において、「水と混和しない」とは、室温で水
に対する溶解度が１０ｇ／１００ｇ水以下であることを
意味する。

これらは、単量体の総量（Ａ）及び水と混和しない非反
応性有機溶媒の使用量ｆｆｌ　（Ｂ）の比がＢ／Ａで１
／２〜３／ｌの範囲になるように使用されるのが好まし
い。充填剤の空隙率と耐圧性を考慮すると、４１５〜２
／１の割合で使用されるのが更に好ましい。非反応性有
機溶媒が少なすぎると、得られる充填剤を多孔性にし難
くなり、分離能が不足し、多すぎると、得られる粒子の
空隙率が大きくなり、耐圧性に乏しくなる。

本発明においては、一般式（Ｉ）で表される化合物及び
一般式（ｎ）で表される化合物を、非反応性有機溶媒の
存在下に水性媒体中で：脈濁重合させる。

このとき、非反応性有機溶媒の添加時期は、反応前にす
べて添加するか又は重合率が２０％に達するまでに添加
するのが好ましい。添加方法としては、分割して行って
もよい。

本発明方法において使用するための好適な重合開始剤と
しては、過酸化ベンゾイル、過酸化ジクロロベンゾイル
、ジクミルペルオキシド、ジー第３−ブチルペルオキシ
ド、２，５−ジ（ペルオキシベンゾエート）ヘキシン−
３，１，３−ビス（第３ブチルペルオキシイソプロピル
）ベンゼン、過酸化ラウロイル、第３ブチルペルアセテ
ート、２．５−ジメチル−２，５−ジ（第３ブチルペル
オキシ）ヘキシン−３，２，５−ジメチル−２゜５−ジ
（第３ブチルペルオキシ）ヘキサン及び第３ブチルペル
ベンゾエート、メチルエチルケトンペルオキシド、メチ
ルシクロヘキサノンペルオキシド等の有機過酸化物、ア
ゾビス−イソブチロニトリル及びジメチルアゾジイソブ
チレート等のアゾ系化合物があり、これらの一種又は二
種以上を使用できる。この使用量はビニル系単量体の種
類及び得られる重合体の口約とする分子量により決めら
れるものであるが、好ましくはビニル系単量体に対して
０．１〜４．０重量％使用される。

また、本発明において、分散剤として難溶性燐酸塩、水
溶性高分子保護コロイド等を重合系に添加することがで
きる。

難溶性燐酸塩としては、燐酸三カルシウム、燐酸マグネ
シウム等がある。高分子保護コロイドとしては、ポリビ
ニルアルコール、アルキルセルロース、ヒドロキシアル
キルセルロース、カルボキシアルキルセルロース等の水
溶性セルロース誘導体、ポリアクリル酸ナトリウム等が
ある。難溶性燐酸塩は、重合系に存在する物質全量に対
して０．０１重量％以上、水溶性高分子保護コロイドは
１〜０．００１重量％の範囲で使用されるのが好ましい
。

その他、陰イオン系界面活性剤、硫酸すｌ−ＩＪウム、
塩化ナトリウム等の水溶性無機塩等の助剤を使用するこ
とができる。

ビニル系単量体、非反応性有機溶媒、分散剤、重合開始
剤及び必要に応じて助剤は、これらを予め混合して又は
各々別々に水性媒体に添加して分散させる。この場合、
よく分散させるために、ホモミキサー等により高速攪拌
するのが好ましく、この高速攪拌は、重合初期まで行う
ことができる。

これ以後の重合は、プロペラ攪拌機等を用いる普通の攪
拌下に行われる。

なお、水性媒体は、前記単量体及び前記非反応性有機溶
媒の総量に対して１〜５０重量倍使用するのが好ましい
。この場合、水性媒体としては、水が使用されるが、懸
濁系の安定性を阻害しない範囲で水溶性有機溶媒を溶解
して含む水を使用してもよい。

本発明により得られるクロマトグラフィー用充填剤は、
水を溶出液としたＧＰＣ用充填剤として使用するのに好
適である。

（実施例） 次に、実施例に基づいて本発明を詳述するが、本発明は
これに限定されるものではない。

実施例１ メトキシポリエチレングリコールメタクリ−レート（ポ
リエチレングリコールの平均重合度９：商品名ＮＫ−エ
ステルＭ−９Ｇ、新中村化学工業■製）４８ｇ、ペンタ
エリドリフトジアクリレート３重量％、ペンタエリドリ
フトトリアクリレート５５重量％及びペンタエリドリフ
トテトラアクリレート４２重量％から成る混合物〔一般
式（１）中のｎは、平均３．３９である〕７２ｇ、酢酸
ブチル１００ｇ、ｎ−オクタン７ｇ、水１４５０−１１
０重量％燐酸三カルシウム水懸濁液５５０−、メチルセ
ルロース１．５ｇ並びにアゾビスイソブチロニトリル０
．６ｇを混合し、ホモミキサーを使用して高速攪拌下（
６０００〜８０００ｒ、ｐ、ｍ、）に７０℃で反応を進
めた。その後、プロペラ攪拌機を備えた容器に移して８
０〜９０℃で６時間、攪拌速度３００ｒ、ｐ、ｍ、で反
応させ、有機溶媒及び水に不溶な多孔性架橋重合体粒子
を得た。粒度は、１〜３０μｍであった。

このようにして得られた粒子をふるい分けして８〜１２
μｍの粒度とし、これを水に分散させてスラリー状とし
てから直径１０．７ｔｉ、高さ３００鶴のステンレスカ
ラムに充填した。このカラムを用いて多糖類のプルラン
、エチレングリコール及びポリエチレングリコールの測
定を行った。測定条件としては、移動相（溶出液）に水
を使用し、流量を１．　Ｏｍｌ　／分及び温度を２５℃
とし、検出器には示差屈折計を使用した。プルランとエ
チレングリコール及びポリエチレングリコールの分子量
と溶出容量の関係を示した較正曲線を第１図に示す。第
１図中、プロット１〜７は、順次、プルランＰ８００　
（分子量７．５８Ｘ１０’）、プルランＰ４００　（分
子１３．３８　Ｘ　１０’）、フルランＰ２００　（分
子量１．９４　Ｘ　１０’）、フルランＰ１００（分子
量９．５４ｘｌＯ’）、プルランＰ５０（分子量４．６
７Ｘ１０’）、プルランＰ２０　（分子量２．０８ｘｌ
Ｏ’）及びプルランＰ１０（分子量１．２ｘｌＯ’）（
これらはいずれも昭和電工側製品の商品名〕のプロット
であり、符号８〜１３は、順次、ポリエチレングリコー
ル６０００　（分子量６０００）、ポリエチレングリコ
ール４０００（分子量４０００）、ポリエチレングリコ
ール２０００　（分子量２０００）、ポリエチレングリ
コール６００（分子量６００）、ポリエチレングリコー
ル２００　（分子量２００）及びエチレングリコールの
プロットを示す。

第１図で得られた較正曲線はＭＩｉ＋＋＋　２　Ｘ　１
０　’で（ｘ―ａ真／αｍ直、＝２．２８であった。

また、市販の標準蛋白質（千ログロブリン、牛血清アル
ブミン、チトクロームＣ）及びクレアチニンの混合物の
分離分析を行った。測定条件としては、移動相（溶出液
）にｐｌｉｌの１／１５Ｍ燐酸緩衝液に０．２Ｍの食塩
を加えた溶出液を使用し、流量を１．０＋ｄ／分及び温
度を２５℃とし、検出器はＵＶ検出器（２５０鶴ｍ）を
使用した。得られたクロマトグラムを第２図に示す。

第２図中、ピーク１４〜１７は、順次、千ログロブリン
、牛血清アルブミン、チトクロームＣ及びクレアチニン
のピークを示す。

更に、塩酸及び水酸化ナトリウムを使用してｐＨを調整
した溶出液を用いてカラムの性能に及ぼす影響を調べた
が、ｐ）１２〜１０の範囲で測定時の圧力や理論段数等
のカラム性能に大きな差はなかった。

実施例２ ＮＫ−エステルＭ−９Ｇ４８ｇ、ペンタエリトリットジ
アクリレート３重量％、ペンタエリドリフトトリアクリ
レート５１重量％及びペンタエリドリフトテトラアクリ
レート４６重量％から成る混合物〔一般式ＣＩ）中のｎ
は、平均して３．４３である〕７２ｇ、酢酸ｎ−ブチル
１００ｇ及びｎ−オクタン４ｇを使用した以外は、実施
例１と同様にして反応させ、有機溶媒及び水に不溶な液
体クロマトグラフィー用充填剤を得た。粒度は１〜３０
μｍであった・ 更に、実施例１と同様にふるい分は後、カラムに充填し
、プルランとエチレングリコール及びポリエチレングリ
コールの分子量と溶出容量の関係を示した較正曲線を第
３図に示す。第３図中、プロット１８〜２７は、順次、
プルランＰ８００、プルランＰ４００、プルランＰ２Ｏ
０，７’ルランＰ５０．プルランＰ　ｉ　Ｏ％ポリエチ
レングリコール６０００、ポリエチレングリコール２０
００、ポリエチレングリコール６００、ポリエチレング
リコール２００．エチレングリコールのプロットである
。

第３図で得られた較正曲線はＭｔｚｍ　５　Ｘ　１０　
’で、α□Ｘ／αヵｉ、％＝　２．２４であった。

また、市販の標準蛋白質（チログロブリン、牛血清アル
ブミン、チトクロームＣ）の混合物の分離分析を行った
。分析条件は、上記充填剤を使用すること以外、実施例
１と同様に行った。この結果を第４図に示す。第４図中
、ピーク２８〜３０は、順次、チログロブリン、牛血清
アルブミン及びチトクロームＣのピークである。

実施例３ ＮＫ−エステルＭ−９Ｇ５６ｇ、ペンタエリドリフトジ
アクリレート３重量％、ペンタエリドリフトトリアクリ
レート５１重量％及びペンタエリドリフトテトラアクリ
レート４６重量％から成る混合物〔一般式（Ｉ）中のｎ
は、平均して３．４３である〕　６４ｇ、酢酸ｎ−ブチ
ル１１０ｇ及びイソアミルアルコール７０ｇを使用した
以外は、実施例１と同様にして反応させ、有機溶媒及び
水に不溶な液体クロマトグラフィー用充填剤を得た。

粒度は１〜３０ｐｍであった。

更に、実施例１と同様にふるい分は後、カラムに充填し
、プルランとエチレングリコール及びポリエチレングリ
コールの分子量と溶出容量の関係を示した較正曲線を第
５図に示す。第５図中、プロット３１〜４０は、順次、
プルランＰ１００、プルランＰ５０．プルランＰ２０、
プルランＰ１０、ポリエチレングリコール６０００．ポ
リエチレングリコール４０００、ポリエチレングリコー
ル２０００．ポリエチレングリコール６００１ポリエチ
レングリコール２００及びエチレングリコールのプロッ
トである。

第５図で得られた較正曲線はＭＬｉ＋＊　６　Ｘ　Ｉ　
Ｑ　’で、α１．Ｘ／α、、１Ｉ＝１．５９であった。

また、市販の標準蛋白質（牛血清アルブミン、β−ラク
トグロブリン、チトクロームＣ）及びβ−アラニンの混
合物の分離分析を行った。測定条件としては、移動相（
溶出液）にｐＨ７の１／１５Ｍ燐酸緩衝液に０．２　Ｍ
の食塩を加えた溶出液を使用し、流量を１．０ｄ／分及
び温度を２５℃とし、検出器はＵＶ検出器（２５０ｎｍ
）を使用した。

得られたクロマトグラムを第６図に示す。

第６図中、ピーク４１〜４４は、順次、牛血清アルブミ
ン、β−ラクトグロブリン、チトクロームＣ及びβ−ア
ラニンのピークを示す。

比較例１ ＮＫ−エステルＭ−９Ｇ２４ｇ、ペンタエリドリフトジ
アクリレート３重量％、ペンタエリドリフトトリアクリ
レート５１重量％及びペンタエリドリフトテトラアクリ
レート４６重量％から成る混合物〔一般式（１）中のｎ
は、平均して３．４３である〕９６ｇを使用した以外は
、実施例１と同様に反応させて、有機溶媒及び水に不溶
な液体クロマトグラフィー用充填剤を得た。粒度は１〜
３０μｍであった。

更に実施例１と同様にふるい分けした後、カラムに充填
し、プルラン、エチレングリコール及びポリエチレング
リコールを用い、較正曲線を求めたところ、ポリエチレ
ングリコール２０００以上の分子量を持つものが吸着し
てしまい、較正曲線を求めることができなかった。

比較例２ Ｎ　Ｋ−エステルＭ−９Ｇ９６ｇ、ペンタエリドリフト
ジアクリレート３重量％、ペンタエリドリフトトリアク
リレート５１重量％及びペンタエリドリフトテトラアク
リレート４６重量％から成る混合物〔一般式（Ｉ）中の
ｎは、平均して３．４３である〕２４ｇ、酢酸ｎ−ブチ
ル１１０ｇ及びイソアミルアルコール７０ｇを使用した
以外は、実施例１と同様に反応させて、有機溶媒及び水
に不溶な液体クロマトグラフィー用充填剤を得た。粒度
は１〜３０μｍであった。

更に実施例１と同様にふるい分けした後、カラムに充填
を試みたが、圧力が高くなり、充填カラムは得られなか
った。

（発明の効果） 本発明によるクロマトグラフィー用充填剤は、水に対し
親和性があり、高速液体クロマトグラフィー用充填剤と
して充分な強度を有し、耐久性が良く、しかもＭ　Ｌ　
ｉ　ＩＳを蛋白質や水溶性高分子の分離に有効な範囲に
任意に調節でき、充填カラムにした際の較正曲線が直線
に近いクロマトグラフィー用充填剤であり、該クロマト
グラフィー用充填剤は、水を溶出液とするＧＰＣ用の充
填剤として有用であり、分離性能に優れている。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１における液体クロマトグラフィー分析
による較正曲線、第２図は実施例１における液体クロマ
トグラフィー分析によるクロマトグラム、第３図は実施
例２における液体クロマトグラフィー分析による較正曲
線、第４図は実施例２における液体クロマトグラフィー
分析によるクロマトグラム、第５図は実施例３における
液体クロマトグラフィー分析による較正曲線、第６図は
実施例３における液体クロマトグラフィー分析によるク
ロマトグラムを示す。 符号の説明 １・−・プルランＰ８００　（分子量７．５８ｘｌＯＳ
）２−プルランＰ４００　（分子量３．３８Ｘ１０’）
３−プルランＰ２Ｏ０（分子量１．９４Ｘ１０’）４−
プルランＰ１００　（分子量９．５４Ｘ１０’）５−・
・−プルランＰ５０　（分子量４．６７ｘｌＯ’）６・
・−プルランＰ２０　（分子量２．０８ｘｌＯ’）７−
プルランＰ１０（分子量１．２ｘｌＯ’）８−ポリエチ
レングリコール６０００ ９−・ポリエチレングリコール４０００１０−ポリエチ
レングリコール２０００１１−・・ポリエチレングリコ
ール６００１２・・−ポリエチレングリコール２００１
３−　　エチレングリコール １４−・チログロブリンのピーク １５・−生血端アルブミンのピーク １６−・チトクロームＣのピーク １７−クレアチニンのピーク １８−プルランＰ８００ １９・・−・プルランＰ４００ ２０−プルランＰ２Ｏ０ ２１・−・プルランＰ５０ ２２・−・プルランＰＩＯ ２３−ポリエチレングリコール６０００２４−　　ポリ
エチレングリコール２０００２５−　　ポリエチレング
リコール６００２６・−・ポリエチレングリコール２０
０２７−エチレングリコール ２８−・−チログロブリンのピーク ２９−・−生血端アルブミンのピーク ３０−・・チトクロームＣのピーク ３１−　・プルランＰ１００ ３２−・−・プルランＰ５０ ３３−・プルランＰ２Ｏ ３４−・プルランＰＩＯ ３５−・ポリエチレングリコール６０００３６−・ポリ
エチレングリコール４０００３７−・ポリエチレングリ
コール２０００３８−・−ポリエチレングリコール６０
０３９・−・−ポリエチレングリコール２００４０−エ
チレングリコール ４１−　　牛血清アルブミンのピーク ４２−・−β−ラクトグロブリンのピーク４３−・チト
クロームＣのピーク ４４−・β−アラニンのピーク

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、一般式（Ｉ）： ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） 〔式中、Ｒ＾１はＨ又はＣＨ＿３を表し、ｎは２〜４の
   整数を表し、ｍは０、１又は２を表し、ｍ＋ｎは４であ
   る〕で示される化合物と一般式（II）：▲数式、化学式
   、表等があります▼（II） 〔式中、Ｒ＾２及びＲ＾３は、それぞれ独立してＨ又は
   ＣＨ＿３を表し、ｌは１〜３０の整数を表す〕で示され
   る化合物を必須成分とする架橋多孔性共重合体粒子から
   なり、ゲルパーミエーションクロマトグラフィーにおけ
   る排除限界分子量が２×１０以上であり、かつ較正曲線
   の勾配αが１０＾２から排除限界分子量の分子量範囲に
   おいて、 １≦（α＿ｍ＿ａ＿ｘ／α＿ｍ＿ｉ＿ｎ）≦３．５〔式
   中、α＿ｍ＿ａ＿ｘ及びα＿ｍ＿ｉ＿ｎは、それぞれ前
   記分子量範囲内でのαの最大値と最小値を示す〕の範囲
   内にあることを特徴とするクロマトグラフィー用充填剤
   。