JPS63307875A - ハロサイアミンおよびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は細菌およびかび感染症の治療剤として有用な新
規化合物ハロサイアミンおよびその製造法に関する。ハ
ロサイアミンは分子内にブロム原子を有する化合物で、
海産動物ホヤから採取される。

従来の技術 海産動物ホヤからは種々の生理活性物質が得られている
が、これらのうち、分子内にブロム原子を含んでいる点
においては、ハロサイアミンはニーディストーマ（Ｅ　
ｕｄｉｓｔｏａ＋ａ）種の群体ホヤから単離されたβ−
カルボリン化合物と共通点を有する（第２８回天然有機
化合物討論会講演要旨集、演題Ｎｏ、　ｌ　６仙台、１
９８６年参照）。

日が解決しようとする課題 細菌あるいはかびなどによって惹起される疾病は化学療
法剤投与による治療法の発達によってかなり克服されて
いる。しかし、従来の薬物を長期あるいは大量に投与す
ることによる起因菌の変化（菌交代現象）あるいは耐性
菌の出現（耐性化現象）などが現在の感染症治療医学分
野で大きな問題となっている。これらの問題を克服する
ために、当分野では、常に新規骨格を有し、新しい生物
活性を示す化合物、あるいはそれらを合成するための中
間原料が求められている。

課題を解決するための手段 本発明者らは、海産動物ホヤ（Ｔ　ｕｎｉｃａｔｅ）の
生体防御作用について一連の研究を行ってきた。その結
果、ある種のホヤの体腔液細胞中に細菌およびかびに対
して抗菌活性を示す化合物が存在していることを認め、
これらを単離し、それらの物理化学的および生物学的諸
性質から、当該化合物が新規化合物であることを確かめ
、これらをハロサイアミン（ｈａｌｏｃｙａｍｉｎｅ）
　ＡおよびＢと称することとした。

本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに研究した
結果、本発明を完成するにいたった。

本発明は、（１）化合物ハロサイアミンＡ、Ｂまたはこ
れらの塩、および（２）海産動物ホヤの体腔液細胞から
ハロサイアミンＡおよび／またはＢを採取することを特
徴とする化合物ハロサイアミンＡ、Ｂまたはこれらの塩
の製造法である。

本発明で使用されるホヤは化合物ハロサイアミンを産生
あるいは蓄積する能力を有するホヤであればいずれのも
のでもよく、たとえば本邦産マボヤ（Ｈａｌｏｃｙｎｔ
ｈｉａ　ｒｏｒｅｔｚｉ）が挙げられる。その具体例と
しては、青森県陸奥湾で採取された自然生育もしくは養
殖のマボヤなどが挙げられる。

マボヤ体腔液細胞は、たとえば、以下のように処理して
採取される。マボヤを筋肉や内臓部分を傷付けないよう
カミソリで被のうの下部を切り落とし、吹き出した体腔
液をビーカーに集める。異個体から得られる体腔液を混
合すると細胞融解反応が起きるので、前記の処理は１個
体づつ別々に行われる。この体腔液を個体別に低速遠心
分離し、沈澱した細胞画分を得る。この方法は化合物の
大量採取のみならず、個体別の細胞内のハロサイアミン
などの分析、定量などにも適用されうるが、大量の化合
物を分離採取する時には、体腔液をそのまま次に述べる
抽出行程の原液として用いてもよい。

マボヤ体腔液細胞からハロサイアミンを採取するには天
然有機化合物を海産動物などから採取するのに通常使用
される分離手段が適宜利用される。

たとえば、ハロサイアミンは水溶性塩基性物質の性質を
示すので、まず体腔液細胞を水と混和する有機溶媒中に
加え、抗菌活性化合物を抽出し、細胞由来の蛋白質など
を除去する。得られた抽出液の有機溶媒を濃縮し、水溶
液を得る。この液を水と混和しない有機溶媒を用いる抽
出法に付すかあるいは適宜の担体に接触させて液中の有
効成分を吸着させ、ついで適宜の溶媒で有効物質を脱着
させ、分別採取する手段などが有効に利用される。

抽出法における有機溶媒としては水溶性物質を抽出し易
い極性溶媒が用いられる。また、クロマトグラフィーの
担体としてはシリカゲル、粉末セルロース、吸着性樹脂
など化合物の吸着性の差を利用、または陽イオン交換樹
脂、陽イオン交換セルロース、陽イオン交換セファデッ
クスなど化合物の官能基の差を利用、あるいはセファデ
ックス類など化合物の分子量の差を利用するものが有利
に用いられる。これら担体から目的とする化合物を溶出
するためには担体の種類、性質によって組み合わせが異
なるが、たとえば水溶性有機溶媒の含水溶液すなわち、
含水アセトン、含水アルコール類など、あるいは酸、ア
ルカリ、緩衝液もしくは無機あるいは有機塩を含む水溶
液などが適宜組み合わせて用いられる。

またこれらのクロマトグラフィーによって得られた抗菌
性物質を含む粗物質を分収用高速液体クロマトグラフィ
ーに付し、精製品を得る事も行われる。

さらに詳しくは、細胞から有効成分を抽出するための有
機溶媒としてはたとえばアセトン、メタノール、エタノ
ールなどが有利に用いられ、この抽出液は減圧上濃縮さ
れて、水溶液を与える。水溶液はアルカリ性たとえばｐ
Ｈ７ないし１１好ましくはｐＨ８ないし９．５に調整さ
−れ、有機溶媒たとえばｎ−ブタノール、１ｓｏ−ブタ
ノールあるいはアミルアルコールなどの抽出法に付され
る。抽出液は水洗後濃縮され、残渣はｐＨ２ないし５好
ましくはｐＨ２、５ないし４．０のリン酸緩衝液などに
溶解される。溶解液中の抗菌性物質は次に記載するクロ
マトグラフィー法により精製される。担体として陽イオ
ン交換樹脂たとえばアンバーライ）ＩＲＣ−５０あるい
はＣＧ−５０（ローム・アンド・ハース社製、米国）な
どを用いると溶液中の抗菌性物質は吸着され、塩類ある
いは酸含有の水溶液あるいは緩衝液などで溶出される。

あるいは陽イオン交換分子ふるい性樹脂たとえばＣＭ−
セファデックス（ファルマシア・ファイン・ケミカルズ
社製、スウェーデン）などの担体に抗菌性物質を吸着せ
しめ、塩類あるいは酸含有の水溶液あるいは緩衝液など
によって溶出させることが出来る。また、吸着性樹脂た
とえばダイヤイオンＨＰ−２０あるいは５Ｐ−２０７（
三菱化成工業株式会社製）、アンバーライトＸＡＤ−Ｉ
Ｉ（ローム・アンド・ハース社製、米国）などが有利に
用いられ、有効成分はメタノールあるいはアセトンなど
と水あるいは希酸溶液との混合溶媒で溶出される。

分画された溶出区分は濃縮、凍結乾燥などの工程を経て
、粉末化される。かくして得られた粉末の純度が悪い場
合、さらに精製するためには高速液体クロマトグラフィ
ー法（ＨＰＬＣ）が有利に利用される。用いられる担体
としてはたとえばＴＳＫゲル（東洋曹達株式会社製）、
ＹＭＣゲル（山村化学研究新製）などが挙げられ、移動
層としてはメタノールあるいはアセトニトリルなどと無
機塩含有水溶液あるいは緩衝液などとの混合液が用いら
れる。なおハロサイアミンは鉱酸たとえば塩酸、硫酸、
リン酸などあるいは有機酸たとえば蟻酸、酢酸、修酸な
どの塩として単離される。

このようにして、塩の形で単離されたハロサイアミン塩
を、常套手段により遊離形のハロサイアミンとすること
もでき、また該遊離形の化合物を常套手段により上記と
同様の塩の形にすることもできる。

後記実施例１で得られたハロサイアミンＡ・１／２リン
酸塩およびハロサイアミンＢ　−１／２リン酸塩の物理
化学的性状はつぎの通りである。

（ａ）ハロサイアミンＡ・１／２リン酸塩（１）外観：
無色固体 （２）比旋光度、　［α］　６＠　＋　５°±３°（Ｃ
０，５，ＭｅＯＨ）（３）分子量測定値：　ｍ／ｚ　６
１０および６１２（ＭＨ″″）（Ｓ　Ｉ　−ＭＳ法によ
る）（Ｍは遊離体の分子量を表わす。） （４）分子式：　Ｃ＊ｔＨ＊＠ＮｔＯｓＢｒ、ｌ／２Ｈ
ｓＰ０４（５）元素分析値：試料は五酸化リン上、５０
℃で６時間減圧乾燥（０，５モルの水分を含むとして計
算）（％） 実測値　　　　　　　　計算値 Ｃ，４８，５±２．ＯＧ、４８．５１ Ｈ，４，７±１．０　　　　Ｈ，４，６ＯＮ、　　１４
．２±１．５　　　　Ｎ、１４．６７０、　　　　　　
　　　　　０．　１７．９５Ｐ、　　　２．０±１．５
　　　　Ｐ、　　　２．３２Ｂｒ、１１．１±２．ＯＢ
ｒ、１１．９５（６）紫外部（ＵＶ）吸収スペクトル：
メタノール中、下記の吸収を示す。第１図参照 λａ＋ａｘ２０３±３　ｎｍ（Ｅ　’％＝９８５±１０
０）ｃｘ １％− ２３２±３　ｎｍ　（Ｅ　１ｃｘ　　５４８±１００）
１％ および２８２±３　ｎｕ（Ｅ　１ｏ、＝　３５８±１０
０）（７）赤外部（ＩＲ）吸収スペクトル：　ＫＢｒ中
、下記の主な吸収を示す（波数）。第２図参照３４００
，１６６０，１５３５，１２６０゜１１１０．１０４０
，９００，８００，５７０（Ｃ肩−１） （８）　′３Ｃ核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトル：１０
０ＭＨｚ、δｐｐｍ　、重メタノール中、下記のシグナ
ルが認められる。

１７４．７（ｓ）、　１７４．０（ｓ）、　１６９．４
（ｓ）。

１４８．３（ｓ）、　１４５．３（ｓ）、　１３８．４
（ｓ）。

１３６．６（ｄ）、　１３４．２（ｓ）、　１２９．６
（ｓ）。

１２７．２（ｓ）、　１２５．５（ｄ）、　１２３．６
（ｄ）。

１２１．７（ｄ）、　１２１．０（ｄ）、　１１９．８
（ｄ）。

１１８．２（ｄ）、　１１７．３（ｄ）、　１１６．４
（ｓ）。

１１６．４（ｄ）、１１５．３（ｄ）、１１１．４（ｓ
）。

１０５．６（ｄ）、５６．５（ｄ）、、５５．３（ｄ）
。

４４．２（ｔ）、３８．０（ｔ）、３１．９（ｔ）（た
だし、Ｓ：シングレツト、ｄ：ダブレット、ｔニトリプ
レット、ｑ：カルチットを表わす）（９）薄層クロマト
グラフィー（ＴＬＣ）：担体ニジリカゲル・プレート６
０Ｆ−２５４（メルク社製、西独）、 展開溶媒；ｎ−ブタノール；酢酸：水（２：１：１）Ｒ
ｆ＝０．５２ （１０）高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）：カ
ラム：　ＯＤＳ、ＹＭＣパックＡ、３１２（山村化学研
究新製）、 移動相：２８％アセトニトリル１０．０１Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ３、０）、 流速：　２ｍ１２／ｆｆ１ｉｎ Ｒｔ＝　４　、１　（ｍｉｎ） （１１）呈色反応： 陽性・・・エールリッヒ（酸性）、ボーリー、ニンヒド
リン反応および過マンガン酸カリウム陰性・・・グレー
グ・リーバツク、ドラーゲンドルフ反応、 （１２）アミノ酸分析：（試料を６ＮＨＣＱ中、１１０
℃で、１５時間加水分解）、既知アミノ酸としてＨｉｓ
およびＧｌｙが検出された。

（１３）溶解性： 可溶：水、ジメチルスルフォキサイド。

メタノール 難溶：酢酸エチル、ジエチルエーテル （１４）酸性、中性、塩基性の区別：中性（遊離体は塩
基性）。

（ｂ）ハロサイアミンＢ・１／２リン酸塩（１）外観：
無色固体 （２）比旋光度：［α］ら５＋６３°±１０”　（ＣＧ
、４９８゜ＭｅＯＨ） （３）分子量測定１ｊｉ：　ｍ／ｚ　６５４および６５
６（ＭＨつ（４）分子式：　Ｃ＊５Ｉ（ｓｔＮｔｏａＢ
ｒ−１／２ＨｓＰ　０４（５）元素分析値：（３モルの
水分を含むとして計算）（％） 実測値　　　　　　　　計算値 Ｃ，４６，１±２．ＯＣ，４５，９８ Ｈ，４，９±１．０　　　Ｈ，５，２６Ｎ、　　１２．
３±１．５　　　Ｎ、　　１２．９４０、　　　　　　
　　　　０．　２３．２３Ｐ、　　　２．０±１．５　
　　Ｐ、　　　２．０４Ｂｒ、１０．８±２．ＯＢｒ、
　　１０．５５（６）ＵＶ吸収スペクトル：メタノール
中、下記の吸収を示す。第３図参照 λｍａｘ２０３±３ｎｍ（Ｅ１％＝７８５±１００）ｌ
ｃ肩 ２３２±３　ｎｍ（Ｅ　１ｃ’ｓ　＝４２８±１００）
および２８２±３　ｎｍ（Ｅ　’％−２７６±１００）
ａｇ− （７）ＩＲ吸収スペクトル：　ＫＢｒ中、下記の主な吸
収を示す（波数）。第４図参照 ３４００．１６６５，１５４０，１４５５゜１２６０．
１１１５，１０４０，９００゜８１０、．５３０（Ｇｘ
一つ （８）　１３ＣＮＭＲスペクトルニ ー　　１００ＭＨｚ、６１２ｍ５重メタノール中、下記
のシグナルが認められる。

１７０．５（ｓ）、　１７３．８（ｓ）、　１６９．８
（ｓ）。

１４６．３（ｓ）、　１４５．３（ｓ）、　１３８．４
（ｓ）。

１３６．０（ｄ）、　１３３．８（ｓ）、　１２９．４
（ｓ）。

１２７．１（ｓ）、　１２５．５（ｄ）、　１２３．７
（ｄ）。

１２１．７（ｄ）、　１２１．０（ｄ）、　１１９．９
（ｄ）。

１１８．４（ｄ）、　１１７．４（ｄ）、　１１　Ｂ、
５（ｓ）。

１１６．４（ｄ）、１１５．４（ｄ）、１１１．４（ｓ
）。

１０５．８（ｄ）、６７．８（ｄ）、６０．１（ｄ）。

５６．６（ｄ）、５４．９（ｄ）、３７．９（ｔ）。

２９．３（ｔ）、　１９．８（ｑ） （９）ＴＬＣ：ハロサイアミンＡと同じ条件下Ｒｆ’＝
０．４９ （１Ｇ）ＨＰＬＣ：ハロサイアミンＡと同じ条件下Ｒｔ
＝３．８（ｍｉｎ） （１１）呈色反応：ハロサイアミンＡと同じ（１２）ア
ミノ酸分析：既知アミノ酸としてＨｉｓおよびＴｈｒが
検出された。

（１３）溶解性：ハロサイアミンＡと同じ（１４）酸性
、中性、塩基性の区別：ハロサイアミンＡと同じ。

また、ハロサイアミンＡおよびＢの構造は以下の式で表
わされることが判明した。

ハロサイアミンＡ Ｈ ハロサイアミンＢ Ｈ 式中、（Ｌ）は光学活性のとき、その炭素原子の立体配
置を示す。

次に、ハロサイアミンの生物学的性状について記載する
。

まず、ハロサイアミンＡおよびＢ（共に１／２リン酸塩
）の抗菌スペクトルを第１表に示す。

第　ｌ　表注１ 注１　培地として、バクト・アンティビオティック・メ
ディウム３（ディフコ・ラボラトリーズ社製、米国）；
１７．５９．バクト・イースト・エキストラクト（ディ
フコ・ラボラトリーズ社製、米国）；　５．Ｏｇ、バク
ト・アガー（ディフコ・ラボラトリーズ社製、米国）；
２０ｇ、蒸留水；　　ｌ　０００ｘ１２（ｐＨ無調整）
を用い、接種菌液として約１０＠コロニー・フォーミン
グ・ユニット（ＣＦ　Ｕ）／ｘｃを用いた。

注２　寒天希釈法による最小発育阻止濃度性３　拡散法
における阻止円直径（試料濃度は１０００μ９／酎） またハロサイアミンＡ　−１／２リン酸塩の抗かびスペ
クトルを第２表に示す。

第２表注１ 注１　サブロー　（Ｓ　ａｂｏｕｒａｕｄ）培地、２８
℃、２日間培養 注２　寒天希釈法による最小発育阻止濃度さらに、ハロ
サイアミンＡ・１／２リン酸塩のマウスを用いた急性毒
性は腹腔内投与による１００ｎ／に９の投与量で全く認
められなかった。

これらのデータから明らかなようにハロサイアミンＡ、
Ｂおよびその塩は抗細菌性、抗かび性などの抗菌性を示
し、哺乳動物に対する毒性が低い。

したがってハロサイアミンＡ、Ｂおよびその塩は哺乳動
物の細菌およびかび感染症の治療に用いることが出来る
。たとえばハロサイアミンＡまたはその塩をハロサイア
ミンＡとして約０．１ないし１　ｗ／ｖ％の濃度で蒸留
水に溶解した液剤、または１９あたりハロサイアミンＡ
として約１ないし１００ｏ、好ましくは約１０ないし５
０π９含有する軟膏剤として、上記哺乳動物の手、足、
顔面などに塗布することにより、これらの部位の殺菌、
殺かび、消毒に用いることが出来る。

衷責赳 次に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する。

実施例１ マボヤ（個体数１０７）の被のう下部をカミソリで切り
落とし、ふき出した体腔液を１個体づつビーカーに集め
（約５０〜１　ｏ　Ｏｔｔｒ（１／個体）、低速遠心分
離（２５０Ｏｒｐｍ、　　１０分）に付した。得られた
沈澱物（約６０９）に、アセトン（１２０ｏ２）を加え
た。混合液を室温で３０分間撹拌後、シ濾過し、アセト
ン抽出液（１６Ｏｆｆ！２）を得た。抽出液に水を加え
た後、減圧下アセトンを留去し、最終的に５０訳ｅの水
溶液に調整した。抽出水溶液をｐＨ９に調整後ｎ−ブタ
ノール（２５１Ｑ；、Ｑ２）で抽出した。ｎ−ブタノー
ル抽出層を水洗後、濃縮、濃縮液に０゜１Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ３、１００ｍＱ）を加えた。リン酸溶液をダイ
アイオンＨＰ−２０（５０メツシュ以下、５０１１２）
のカラムクロマトグラフィーに付し、７０％アセトン水
で溶出した（２５０ｘ１２）。溶出液を濃縮、凍結乾燥
すると粗粉末が得られた。粗粉末を水に溶かし、ダイア
イオンＨＰ−２０（１００−２００メツシユ、３０１１
＋１２）のカラムクロマトグラフィーに付し、メタノー
ル：水（２：１０〜８：２）で溶出分画した。抗菌性が
検出された両分を集めて（２００ｘ（２）濃縮した。濃
縮液を分取用逆相系ＨＰＬＣ［カラム：　ＯＤＳ、ＹＭ
Ｃ−Ｐａｃｋ　５Ｈ３４３，５−１０、移動相：２２％
アセトニトリル１０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ３，０
）コに付し、溶出分画中の抗菌性物質が単一ピークを示
す両分を集めた。画分Ｉおよび■をそれぞれダイアイオ
ンＨＰ−２０のクロマトグラフィーに上り脱塩し、濃縮
、凍結乾燥、ハロサイアミンＡ　−１／２リン酸塩（８
２，３ｊ１９）およびハロサイアミンＢ・１／２リン酸
塩（２１，５１９）を得た。単一ピークを示さない両分
を集め、上記と同様の方法で処理し、ハロサイアミンＡ
　−１／２リン酸塩（２７，５ａ＋９）およびハロサイ
アミンＢ・１／２リン酸塩（２３ｍｇ）を得た。

え吸へ腹！ 本発明のハロサイアミンＡおよびＢは海産動物ホヤから
得られる新規化合物であり、ダラム陽性、陰性菌および
かびに有効であるので臨床用医薬品たとえば細菌および
かび感染症の治療剤として有用である。

【図面の簡単な説明】

第１図および第２図は化合物ハロサイアミンＡ・１／２
リン酸塩のＵＶおよびＩＲスペクトルを、第３図および
第４図は化合物ハロサイアミンＢ・１／２リン酸塩のＵ
ＶおよびＩＲスペクトルをそれぞれ示す。 特許出願人武田薬品工業株式会社 代理人　弁理士前　山　　葆ほか１名 第１図 膏３図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ［１］一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｘが水素のときＹは２−イミダゾリルメチルを
   （ハロサイアミンＡ）、Ｘが２−イミダゾリルメチルの
   ときＹは１−ヒドロキシエチルを（ハロサイアミンＢ）
   示し、（Ｌ）は光学活性のときその炭素原子の立体配置
   を示す］ で表わされるハロサイアミンＡ、Ｂまたはその塩。 ［２］海産動物ホヤの体腔液細胞からハロサイアミンＡ
   および／またはＢを採取することを特徴とする一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｘが水素のときＹは２−イミダゾリルメチルを
   （ハロサイアミンＡ）、Ｘが２−イミダゾリルメチルの
   ときＹは１−ヒドロキシエチルを（ハロサイアミンＢ）
   示し、（Ｌ）は光学活性のときその炭素原子の立体配置
   を示す］ で表わされるハロサイアミンＡ、Ｂまたはその塩の製造
   法。 ［３］体腔液細胞含有体腔液または分離した体腔液細胞
   を水混和性有機溶媒により抽出し、抽出液からハロサイ
   アミンＡおよび／またはＢを分取する前記第［２］項の
   製造法。